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Método directo de detección: el anticuerpo primario Método indirecto de detección: el anticuerpo primario sin
marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo
con el sustrato originando una señal detectable. secundario marcado se une al primario y reacciona con el
sustrato.
En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la
membrana, debe ir marcado con una enzima o sonda fluorescente; no obstante, este método no es muy utilizado por
diversas razones como posteriormente se puede ver en la tabla I. En el método indirecto, se añade primero un anticuerpo
primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo primario. Los tipos de marcaje son diversos y variados y entre ellos se encuentran la biotina,
las sondas fluorescentes como la fluoresceína o la rodamina, y las conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano
(HRP) o la fosfatasa alcalina.
Tabla I. Comparación de los métodos de detección directo e indirecto
Detección Directa
Desventajas • La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse disminuida debido al marcaje.
• El marcaje de los anticuerpos primarios es muy cara y difícil.
• No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo primario de un experimento a otro.
Detección Indirecta
Ventajas • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee numerosos epítopos a los que
puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la amplificación de la señal.
• Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados.
• No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el marcaje.
• Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo primario.
Desventajas • Puede producirse reacción cruzada con el anticuerpo secundario, con lo que se obtienen marcajes
inespecíficos.
• Es más lento ya que se necesita un paso extra de incubación.
Cuando se aplica un campo eléctrico, las proteínas migran fuera del gel de poliacrilamida hacia la superficie de la membrana
donde quedan fuertemente adheridas, por lo que la membrana resultante es una copia exacta del patrón de proteínas que
se tenia en el gel de poliacrilamida. La eficacia de la transferencia puede variar enormemente entre las diferentes proteínas
La peroxidasa de rábano es una proteína bastante más pequeña (40.000 Da de tamaño) que cataliza la oxidación de los
sustratos por el peróxido de hidrógeno, originando un producto coloreado, fluorescente o la liberación de luz como
producto. Su actividad óptima es a pH neutro y se inhibe por cianidas, sulfitas y azidas. Su gran estabilidad, bajo coste y
gran disponibilidad de sustratos hacen que sea la enzima de elección para la mayoría de las aplicaciones.
Sustratos cromogénicos.
Al igual que ocurre con el resto de componentes de un Western Blot, hay un gran número de sustratos disponibles
comercialmente y su elección depende, entre otros factores, de la enzima utilizada (AP o HRP), la sensibilidad deseada y el
método de detección o tipo de señal que se busque (colorimetría, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.).
Los sustratos cromogénicos son los más ampliamente utilizados y proporcionan el método de detección más barato y
sencillo; cuando estos sustratos entran en contacto con la enzima correspondiente, se transforman en productos insolubles
coloreados que precipitan sobre la membrana, por lo que no necesitan ninguna instrumentación especial para realizar la
visualización de los resultados. Para la HRP los sustratos más utilizados son el TMB (3,3’,5,5’-tetrametil-benzidina), el 4-CN
(4-cloro-1-naftol) y el DAB (tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobenzidina).
En la tabla III se comparan las propiedades de diferentes sustratos para Western Blot. Hay que destacar también que el
comportamiento de un determinado sustrato puede variar drásticamente dependiente del fabricante del mismo ya que, éste
se ve afectado por la concentración y pureza y por los aditivos y componentes del tampón que formen parte de la
formulación del mismo.
Tabla III. Características de los sustratos para Western Blot.
Dilución del Ac
Sustrato Medida ó color Sensibilidad Enzima
(Sol. stock 1mg/mL)
El TMB, con un peso molecular de 240,4 Da se utiliza más frecuentemente para los ELISAs; sin embrago, en presencia de
HRP y peróxido, se obtiene un producto soluble de color azul que puede precipitarse sobre una membrana; es adecuado
para aplicaciones en las que se requiere una elevada relación señal:ruido. El 4-CN tiene un peso molecular de 178,6 Da y no
es tan sensible ni estable como el TMB o el DAB pero su claro color azul púrpura diferente del resto de sustratos lo hace
ideal para trabajar con él en aplicaciones de doble marcaje. El DAB tiene un peso molecular de 214,1 Da y da un precipitado
insoluble de color marrón en presencia de peróxido y HRP; este color marrón puede intensificarse añadiendo metales como
el níquel, cobre, plata y cobalto, con lo que se incrementa su sensibilidad. Las ventajas individuales del 4-CN y el DAB se
suelen combinar en un solo sustrato mixto (sustrato CN/DAB) que tiene una sensibilidad excelente y da un precipitado negro
oscuro muy fácilmente visualizable.
Para la detección colorimétrica con HRP debe añadirse al sustrato peróxido y debido a su extremadamente corta vida útil a
la concentración que se utiliza, tradicionalmente se añade peróxido de hidrógeno al tampón, junto con el sustrato,
inmediatamente antes de su uso; como consecuencia de esto, los sustratos sólo suelen tener una vida media de unas pocas
horas.
El NBT tiene un peso molecular de 817,6 Da y pertenece al grupo de las sales de tetrazolio; después de su reducción, da un
precipitado de color azul púrpura insoluble en agua que tiene la gran ventaja de ser lineal y estable con la concentración a lo
largo de un enorme rango dinámico. El BCIP tiene un peso molecular de 433,6 Da y su hidrólisis por la AP origina un
precipitado de color azul púrpura que se deposita en las membranas de nylon o nitrocelulosa. Otra combinación ideal para el
Western Blot es la formada por el NBT y el BCIP ya que juntos originan un precipitado negro púrpura muy intenso con
mucha mayor sensibilidad que cualquiera de ambos sustratos por separado; otra ventaja de esta combinación de los dos
sustratos es que proporcionan bandas mucho más definidas y con mucho menos ruido de fondo. El Fast Red TR/AS-MX es
un sustrato muy sensible que proporciona un precipitado rojo intenso, por lo que es ideal en aplicaciones de doble marcaje
(en estos casos, es conveniente añadir la solución de Fast Red antes del sustrato de HRP para evitar la formación de
excesivo ruido de fondo); el precipitado suele desaparecer cuando la membrana se seca, pero reaparece cuando ésta se
rehidrata con agua.
Sustratos quimioluminiscentes.
El proceso de la quimioluminiscencia se define como la emisión de energía en forma de luz a partir de una sustancia, como
consecuencia de una reacción química. El luminol es uno de los sustratos más ampliamente utilizados y su oxidación en
presencia de peróxido, origina la formación de un producto en estado excitado llamado 3-aminoftalato, que al pasar a un
estado de energía menor, emite fotones de luz.
Los sustratos quimioluminiscentes han ganado en popularidad durante la última década ya que ofrecen numerosas ventajas
sobre los métodos tradicionales de detección, por lo que se han convertido en el método de detección de elección para la
mayoría de los laboratorios: