Practicasmicro Indust.2018

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN
DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
GUÍA DE
PRÁCTICA
MICROBIOLOGÍA
INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
DATOS DEL ALUMNO

Nombre del alumno …………………………………………………………................................……
Grupo………………………………………………………. Turno Calificación………………….
AREQUIPA-PERÚ-2018
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
GUÍA DE
PRÁCTICA
MICROBIOLOGÍA
INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
AREQUIPA-PERÚ-2018
3
PROLOGO
El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es

indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud
humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el
ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme

potencial para la elaboración de infinidad de productos útiles al
hombre, en la generación de procesos productivos con menor
contaminación del medio ambiente y con consumos de energía
muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones

genéticas para que puedan producir sustancias diversas de gran
necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que
a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos
bioprocesos.
El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para

su aplicación a diversas disciplinas del saber humano. La
presente Guía de Práctica de Mi9crobiologia Industrial se ha
desarrollado con el objeto de poner al interesado en el
conocimiento sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo
de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de
Ingeniería Química.
Los Autores
ÍNDICE
PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES…......................................................................6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA...................................................7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL.....................12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y
MORFOLOGIA DE HONGOS.........................................................17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO,
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN .............................31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ..................................................................36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS.............................................48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……............................................................................... 57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ...........................................................62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS.......................67
PRÁCTICA 10: AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE
DILUCIÓN EN PLACA....................................................................70
PRÁCTICA 11: OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia ........................................................................................ 70
PRÁCTICA 12: AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL.................................................................70
PRÁCTICA 13: AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium...................................81
PRÁCTICA 14: OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisae..........83
PRÁCTICA 15: DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION
FORMATIVA................................................................................... 86
FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRÁCTICAS ...............................................................................88
BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................102
5
Recomendaciones Generales
1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia,

después de este tiempo, no se permitirá al acceso al
laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y
abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de
éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas,
las mochilas deberán ser colocadas en los cajones de las
mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún
objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de
usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá
efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.
8. Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es
lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.
10. Si hay necesidad de llevar material biológico para la
realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo
contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo.
11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá
esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de
su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13. En caso de derramar material que contenga
microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar
diez minutos y de aviso al profesor.
14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe
colocarse en el sitio indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los
siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material
e iniciales del nombre del alumno.
16. Después de la incubación es necesario la esterilización del
material para eliminar microorganismos que pudieran
hacernos daño a nuestra salud.
17. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del
laboratorio.
18. Es obligación de cada equipo entregar todo el material
limpio.
INFORME DE PRACTICAS.
Cada sesión de laboratorio o práctica deberá tomarse como si se tratara de una

investigación; por lo tanto, el estudiante deberá haber estudiado previamente la teoría
correspondiente a la práctica, y se hará una explicación y discusión previa a la práctica.
REPORTE DE RESULTADOS.
Se deberá tener en cuenta la estructura del reporte: I. Introducción II. Objetivos, III.
Material y Método, IV. Resultados V. Discusión, VI. Referencias.
I.- Introducción.
En este punto el profesor tomará una prueba de entrada, cuya calificación quedará
registrada en la guía para la obtención del promedio final de prácticas.
La prueba versará sobre los siguientes temas:
- Resumen del marco teórico del tema.
- Objetivos de la práctica.
- Métodos a emplear y su relación con los objetivos planteados.
II. Resultados. Como producto de la observación posiblemente tendrá esquemas o

dibujos con notas, comentarios y anotaciones. Dichas anotaciones deberán hacer
referencias a estructuras características, modo de observación (con o sin microscopio,
lentes objetivo usados, origen del organismo u hábitat del que fue tomado). Organice sus
esquemas y notas de clase de acuerdo a lo que se le pide observar para alcanzar los
objetivos planteados en cada una de las prácticas. Una vez hecho eso, lo obtenido
constituye “Los Resultados” de su práctica o investigación. Preséntelos de manera clara y
ordenada.
7
III. Discusión ¿Alcanzó los objetivos planteados? ¿Entiende el significado de alcanzar
los objetivos? ¿Siente que ahora sabe algo que no sabía?, trate de explicar qué es ese
“algo”. ¿Siente que ahora tiene dudas que no existían? Diga a que se debe y como cree
que podría superarlas. ¿Siente que ahora sabe algo nuevo pero también tiene dudas
nuevas? Explíquese. No olvide nunca describir QUÉ USÓ y OBSERVÓ durante la
Práctica. Concluya todo lo que haya aprendido sobre el tema específico.
IV. Recomendaciones.
Indique, si el material usado fue el idóneo, si la observación fue la correcta, y que propone
para mejorar la practica u obtener mayores o mejores conclusiones.
V. Referencias. Si necesitó libros, artículos y páginas web para la práctica, debe hacer
referencia a ellos en el texto del reporte de resultados, aquí es donde debe escribir las
“citas bibliográficas”.
Consideraciones y ejemplos de cómo citar en un texto:
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a un solo autor se cita entre
paréntesis el primer apellido del autor y el año de la obra (Fujii, 1990), algunos autores
suelen utilizar ambos apellidos, en estos casos se separa con un guion medio (León-
Álvarez, 1996). Separar con una coma el apellido del año es opcional, lo importante es ser
consistente cada vez que se cita a lo largo del texto.
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a dos autores se cita a ambos
de la misma forma en que se describió arriba (Fujii & Sentíes, 2005; Fujii & Cordeiro-
Marino 1996).
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a más de dos autores se cita al
primer autor acompañado por el prefijo latino “et al.” (resaltado en letra cursiva ya que se
trata de un idioma distinto al idioma en que se está escribiendo el reporte) y seguido por el
año de la obra (Cassano et al., 2009; Machín-Sánchez et al., 2012).
• Si a lo largo del texto se hace referencia a diferentes obras de un mismo autor y año, se
cita al autor o autores de acuerdo al número como se explicó arriba, seguido del año y
junto a este una letra minúscula en orden ascendente de acuerdo al orden de aparición en
el texto para diferenciarlas (Dawson, 1954a; Dawson, 1954b; Tanaka & Chihara, 1980a;
Tanaka & Chihara 1980b; Tanaka & Chihara, 1980c).
Consideraciones y ejemplos de cómo escribir referencias bibliográficas.
Al escribir la referencia completa de una obra citada en el texto, se debe escribir el

apellido del autor o los autores (a diferencia de las citas, en la referencia completa se
enlista a todos los autores de la obra, aquí NUNCA se utiliza el prefijo “et al.”),
acompañado de las iniciales de su segundo apellido, en caso de autores hispanos, y
nombre(s). Al final de todos ellos el año de la obra, seguido por el título de la obra,
editorial o revista, volumen o edición, lugar de impresión y páginas.
Estos datos varían de acuerdo al tipo de publicación de la que se trate. Ejemplos: En caso
de libro:
- Bold, H.C. & M.J. Wynne. 1985. Introduction to the Algae. Structure and
Reproduction. Second Edition. Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N.J. En caso
de capítulo de libro:
- Coomans, R.J. & M.H. Hommersand. 1990. Vegetative growth and organization.
Chapter 12 (Pp: 275-304). In: K.M. Cole & Robert G. Sheath (Eds.) Biology of the
Red Algae. Cambridge University Press. Cambridge. En caso de tesis:
- Dreckmann, K.M. 1997. Evaluación taxonómica del género Gracilaria Greville
(Gracilariales, Rhodophyceae) en el Pacífico tropical mexicano. Tesis de Maestría,
Facultad de Ciencias, UNAM. México, D.F.
- En caso de artículo de revista:
- Norris, J.N. & S. Fredericq. 1990. Studies on cylindrical species of western Atlantic
Gracilaria (Gracilariales, Rhodophyceae): G. cylindrical Borgesen and G. blodgettii
Hervey. Journal of Phycologia 33: 420-433. En caso de página web:
- Dallwitz, M.J., T.A. Paine & E.J. Zurcher. (2000 onwards). Principles of interactive
keys. http://biodiversity.uno.edu/delta
9
1
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
 Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio

 Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
 Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
 Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su
función y el cuidado de cada uno de ellas.
 Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra
con todos los objetivos.
II. MARCO TEORICO
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que
tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las
personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biológicos
físicos, psicológicos y mecánicos.
2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD

Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente
en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no
previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas
precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro
del laboratorio
Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la
contaminación de una persona, evitando la exposición directa a sangre y
otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante
el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados
que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por
ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero
disminuyen las consecuencias de dicho accidente
2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR

- Barreras de protección
- Lavado de manos
- Desinfección y esterilización.
- Manejo de objetos punzo cortantes.
- Manejo y eliminación de desechos
- Ventilación e iluminación adecuadas
- Limpieza y desinfección de ambientes
2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN
1. La boca
• Comer, beber y fumar en el laboratorio.
• Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de
protección.
2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o
utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos
contaminados.
4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION

- Lavado de manos (antes y después)
- Guantes
- Mascarilla o barbijo
- Mandil
- Gorro
2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD

• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y
otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe
permanecer completamente cerrado.
• Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar
y al finalizar la sesión práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón:
– antes de realizar las actividades programadas
– antes de salir del laboratorio
– después de usar materiales contaminantes.
• Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo
lo indispensable.
• No comer, beber, fumar.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de
iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna
duda, diríjase al profesor.
• Usar mascarillas para casos indicados
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que
no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un
microscopio está en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada.
2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

11
1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo
porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo
2. Parte óptica del Microscopio:

- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo
Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador,
Diafragma
2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina
porque deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente
para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en
posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del
M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no
posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas
o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo
de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el
revólver hasta que haga “clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de
la platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si
tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al
fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la
máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje
ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la
laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la
derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el
condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz.
Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor
aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-
objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el
tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el
descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y
simultáneamente suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta
enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la
lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación
integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder
la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al
utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser
de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de
contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el
centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de
revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento
(45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con
el tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a
otro no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre
el riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el
elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el
objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para
que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego,
continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión
(100X) contacte con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente,
observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo
micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y
la lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol
isopropílico o metanol.
2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO

APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento
del objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe
conocer el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al
objetivo que se usa.
Diámetro del campo microscópico

Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150
13
Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con
objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera
parte del campo microscópico, concluiremos que la
célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.
2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la
platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del
Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el
enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del
objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse
los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar
escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el
“campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o
metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de
menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre
éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.
IV. CUESTIONARIO
1) ¿Señale las partes de un microscopio óptico

2) ¿A qué se denomina campo óptico?
3) ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
4) ¿Qué es el poder de resolución
5) Explique qué tipos de aberraciones se presentan en las lentes del
microscopio.
6) Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad.
7) ¿qué entiende por bioseguridad
8) Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
9) ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a
trabajar.
10) ¿Cómo promovería la cultura de bioseguridad?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
15
2
PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.

2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in
vivo”.
II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS

UNICELULARES
Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en
posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera
que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de
iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el
condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen
características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales
grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de
pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son
brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril
pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de
observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se
caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior
observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el
Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por
presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos
movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la
superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un
pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie
del “cáliz” está rodeada de cilios.
17
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno)
en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
Grafique la Observación y Resultados
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su
examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos.
Hay 2 tipos de técnicas:

a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un
porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un
cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una
excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación
con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada
durante un tiempo más largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello,
determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja
concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación,
mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin
provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la
finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación,
observación de huevos y quistes de parásitos.
EXAMEN EN FRESCO
Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca
una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un
cubreobjeto.
19
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una
gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la
ayuda del asa de kolle realizar una suspensión y colocar un
cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en
fresco o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones
fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas.
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar,

Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino,
Gérmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno
(l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa
de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o
sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras
internas propias de las células eucarióticas. Así, el citoplasma de las
procarióticas está rodeado por una membrana plasmática y una pared
celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear
21
ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en
contacto directo con el citoplasma. Además carecen de mitocondrias,
retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato de Golgi. Aunque, en
general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen
numerosas membranas llamadas tilacoides, que contienen clorofila y
pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la energía de la luz
solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).
OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio

óptico
Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)
Procedimiento Experimental
1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.

2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado.
3.Agregar una gota de agua
4.Colocar el cubreobjetos.
5.Observar al microscopio.
6.Dibujar lo observado indicando aumentos.
7.Indicar las diferentes estructuras observadas.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
V. CUESTIONARIO
- ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?

- ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
- ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
- Que tipos de células son las bacterias y cianobacterias.
- Que estructuras comunes presentan las cianobacterias
- Cuál es la importancia ecológica de las cianobacterias
- Que problemas causas la presencia de cianobacterias en plantas de
potabilización de agua.
- Por qué los arroceros fomentan el crecimiento de Azolla carolininiana en
los cultivos de arroz?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
23
3
PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
I. OBJETIVOS
- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes

procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras
microscópicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las
especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
en la industria.
II. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su

protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere
generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o
demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y
difieren uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a
la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de
los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C,
C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de
radicales cromóforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 μ m y 0.500 μ m de
espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 μ m (Lactobacillus). Las
paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células de
cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está
constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo
unidas por puentes peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de
ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos
fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa
están unidos a los grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas,

dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME),
con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antígeno
o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075
μ m.
2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas
directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir
de desarrollo de cultivos.
Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y

coloreada son:
a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos

líquidos o sólidos.
Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un
portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y
se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. Puede prepararse una suspensión del
material en una gota de solución salina colocada previamente en el
portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de platino.
b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las

estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo
posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de los
microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas
protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma
simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación
son: por el calor y alcohol en frío.
d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.
e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.
f. Secado. Se secará la preparación al aire.
CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES

La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los
cromóforos presentes.
25
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o
Básico, término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino,
si una parte de la molécula es aniónica o catiónica.
 Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza
ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta,
Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
 Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas,
tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de
contraste. Ej: ácido pícrico.
 Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante
ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
 Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua
y solubles en alcohol. Ej: Sudán III.
CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten

conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción
azul de metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para

poner de manifiesto las características de afinidad de los
microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción
ácido-alcohol resistente.
c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para

poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de
flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de
corpúsculos metacromáticos
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIÓN DE UN FROTIS

BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
3.1.PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Preparación del Frotis
- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo.

Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la
flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea
posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el
asa en posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el
centro de éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala
trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto
espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir
cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.
Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de
Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.
3.2.TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno

(solución acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de
platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.
TINCIÓN DE AZUL DE METILENO

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son así fácilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar
de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con
aceite de inmersión.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
TINCIÓN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo.
27
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos ni muy finos.
suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y
se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
3.3.COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración
de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la
pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución
débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza
química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el
cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico,
tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se
denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en
su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta
cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de
contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que
han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al
microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus
paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son así fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º =
20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0
g, Agua destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de
bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina
portaobjeto limpia.
suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de
que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la
superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien
con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con
agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la
superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no
arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más
o menos. También puede utilizar etanol comercial como
decolorante , en este caso dar más tiempo aproximadamente 1
minuto.
29
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con
agua de caño.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
MARCO TEORICO : TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas

conidiales, Morfología de los conidióforos, fiàlides y metulas, y en la
presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se
muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:
B. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la producción de enzimas que se emplean en la industria molinera y

panadera:
ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque
se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de
cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fúngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del
páncreas.
En la producción de enzimas que se aplican en la industria de alimentos

azucarados.
INVERTASA O SACARASA.
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar
invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que
actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa, y la alfa-
glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se
entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es
producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que
la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y
de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicación de enzimas en los detergentes

Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que
permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y períodos más cortos
de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actúan sobre los
materiales que constituyen las manchas, facilitando la remoción de estos
materiales y de forma más efectiva que los detergentes convencionales.
• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por
hidrólisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son
insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase
entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que
permitan la remoción de manchas de grasas a bajas temperaturas de
lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética ha
conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo.
Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logró producir en Aspergillus
otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos

extractivos Extracción de aceite. El uso de algunos preparados
celulolíticos en el proceso de extracción ha tenido un efecto positivo sobre
31
el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado
enzimático producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la
extracción del aceite de soya. En condiciones óptimas, el contenido de
aceite de soya extraíble (24.9 % en base seca) y el porcentaje de
recuperación del aceite de soya (99 %).
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con

actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa,
pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción de aceite a
partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de
porcentaje de aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de
ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a
57.1 %
Extracción de colorantes. La extracción de colorantes es otra aplicación

atribuida a algunos preparados enzimáticos.
Extracción de antioxidantes con preparados enzimáticos con actividades
mixtasmixtas
El preparado enzimático comercial Grindamyl pectinasa, con actividad
mixta principalmente pectinasa, pero ambién celulasa y hemicelulasa,
producido por Aspergillus niger, no sólo fue efectivo al aumentar la
extracción de los fenoles debido a la degradación de los polisacáridos
(celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la
cascara de uva, sino que mejoró también la actividad antioxidante de los
extractos fenólicos
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las
estructuras de la espora-cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos
de fíales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de
los fialides, con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi
siempre verdes.
La ramificación es una característica importante para identificar especie del
penicillium. Algunos son no ramificados y llevan simplemente un racimo.de
fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada
cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una
segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides.
Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman
monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una
corona radial ancha y blanca, a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37
°C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la
colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación
abundante. Olor aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y
generalmente el género más abundante de hongos en suelos. La ocurrencia
común de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular.
Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no
comestible o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que
demuestran el desarrollo de cualquier moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos
donde deteriora diferentes materiales de construcción, entre los que resaltan
el papel de decoración (crece bien en la cola empleada para su adhesión a las
paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera
(mayores en las áreas urbanas que en las rurales).
APLICACIONES DEL PENICILLLIUM

Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres
humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se
maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming producía 2 mg de
penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontró que otros
Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligió a Penicillium
chrysogenum como cepa súper productora de este antibiótico. Finalmente, la
selección de sucesivos mutantes súper productores y la mejora en las técnicas
de fermentación realizadas por la industria biotecnológica han hecho que
actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la producción
de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.
Incluye las siguientes especies:

 Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos
camembert y brie.
> Penicillium candida, ídem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistémica emergente
que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas
inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.
> Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort,
danish blue y recientemente también gorgonzola
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados

en suelo, fruta que se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan.
En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis
(phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas
especies son patógeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza
en la producción del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los
sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el
esporangio, y son genético idénticos a su padre, los zygospores se producen
después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
33
EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus
especies invaden lentamente los medios de cultivo.
EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios
de cultivo. En este Género los esporangióforos nacen en los nudos de los
estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre
rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de
ácidos láctico, cítrico, succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales:
su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se

desarrolle. Una forma típica o filamentosa, en medios sólidos y otra forma
atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios líquidos y
que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de
mostos azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas
(amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente

fermenta los azúcares formados en la hidrólisis anterior produciendo etanol
en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24
horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es
en síntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica
se emplea para la fabricación de amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar
el almidón y producir etanol, pero en menor proporción que otras especies,
por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentación alcohólica, en
cambio, en los últimos años se
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
A. MATERIAL
 Asa de kolle  Láminas portaobjetos
 Mechero  Láminas cubreobjetos
 Azul de lactofenol  Microscopio
B.MATERIAL BIOLOGICO
 Muestras de alimentos con hongos
 Cultivo de Aspergillus niger
 Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
C.1. Azul de lactofenol.

Fenol 20 g Glicerol 40 ml
Ácido láctico 20 g Agua destilada 20 ml
Disolver los componentes antes mencionados y después se agrega el

colorante.
Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodón 0.05g
Azul de metileno 0.05 g
Azul de cotton de Perrier 0.05 g
2. CULTIVOS
Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.

Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rápido
crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa Petri.
Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o negro con la madurez
a medida que se forman esporas.
2.1. AGAR SABOURAUD
A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos,
particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatológicas. Su bajo
pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar
presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
35
C. PREPARACION
I. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos

 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
B. ASPERGILLUS FUMIGATUS

 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
37
C. ASPEGILLUS FLAVUS

 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
D. PENICILLIUM

 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
 
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
........................................................... ...........................................................
a. RHYZOPUS

 
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
b. MUCOR

 
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
c. ABSIDIA

 
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
...................................................................... ......................................................................
39
V. CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL
1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?
2. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?

3. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
4. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las
bacterias?
5. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
6. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
7. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos
grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
8. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos
gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
9. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
10. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
11. Mencione tres razones por las que un microorganismo
grampositivo se observa gramnegativo.
12. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos
grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos
gramnegativos.
CUESTIONARIO: TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE HONGOS

1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el género Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscópicas
y microscópicas)?
4. Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
7. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
8. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del
Penicillium?
9. Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
10. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
11. Indique Ud. Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor,
Rhyzpopus y una Absidia?
12. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
4
PRÁCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y
esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de
microbiología industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para

el análisis microbiológico.
3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control

microbiológico de los alimentos.
II. MARCO TEÓRICO
El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los

mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues
de él dependerá el éxito del análisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.
2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de

calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado
primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas
sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los

efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por
oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena

peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la
aparente mayor estabilidad del organismo.
41
Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una
temperatura de 160-170ºC durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a

esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al
contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los
microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno

Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC
por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de
vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente

cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un
medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente
de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm 3
sobre la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se
produce también rupturas de cadena única en el ADN, y la pérdida de la
viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con
la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática,
como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la

membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de
260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es
resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas
por el tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN
ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a
temperaturas elevadas.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo

(100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la

acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello
puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para
materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de

presión y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios
de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por
calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma

cilíndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta
de:
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una

camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas,
electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a

través de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve
para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante
puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
II.3 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su

mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral de
alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método presenta
muchas dificultades técnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO
- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

- Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodón, gasa, tijeras
- Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente
- Autoclave
4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR
a)Preparación de tubos matraces
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben

llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben
cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos,
preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo
convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta
completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele
la forma de cono truncado, con el diámetro a la medida del
recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la
mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los
tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
43
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos
con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel
sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel
kraft y se amarra con hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparación.
b)Preparación para proteger las pipetas

- En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de
algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que
quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar
uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la
punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de
la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte
terminal de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y
se rompe el resto de papel sobrante.
- Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su
esterilización.
c)Preparación de las placas Petri

- Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las
placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa
poniéndose esta en el centro, se envuelve la placa tomándose dos
extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella,
los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos,
rematándose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa,
dándosele una apariencia de paquete de regalo.
4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear

con utensilios de vidrio o metal.
a)Procedimiento para la esterilización en horno

- Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
- Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase
calentando durante 60 minutos más.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta
60ºC. Abra la puerta del horno.
- El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color
marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que
el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido
indicará que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO
a)Procedimiento para la esterilización con autoclave

- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la
canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el
exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van
a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización,
como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la
temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de
goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los
sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
- Abrir la válvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor.
Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y
continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la
autoclave.
- Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los
sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura
ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá
regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el
tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula
de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del
autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la
canasta con los utensilios estériles.
45
V. CUESTIONARIO
1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos

ejemplos?
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales

antes del control microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en
funcionamiento el autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas

bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.
5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
5
PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que

pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más
corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de
cualquier medio de cultivo.
II. MARCO TEORICO
2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento

microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerirá una fuente de
energía y una fuente no energética como son las sales, factores de
crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su
desarrollo.
2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS

MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a
azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa,
maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del
almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO 2 hecho
que es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e,
incluso hidrocarburos como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como
fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados
diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
47
Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la
gelatina o incluso proteínas aún más complejas, como es el caso de los
extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que
corresponden a péptidos o polipéptidos dependiendo de su complejidad
pero en cualquier caso son también proteínas que están parcialmente
hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una
peptona pépsica de carne.
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar
la formación de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de
triptófano que posee este tipo de peptona. También es utilizada para
estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos
protozoos.
La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente
para hongos y ciertos gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco,
sales de amonio, aminoácidos, etc.
2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS

MICROROGANISMOS
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo
hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de
tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algún
aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma
de fosfato.
C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones
muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo
de su concentración pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso
del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de
microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de
Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del
Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si
lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta
además una serie de componentes definidos que no son capaces de
fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a
corresponder a algún tipo de aminoácido de bacterias muy exigentes o
incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido
nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y
grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina
(factor X) y está enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor
V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para
crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en “gotas de
mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del
complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia
bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento
bacteriano de los Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y
tipificación de pruebas bioquímicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
desarrollo de las bacterias Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de
anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos
Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentración de sales
biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a
muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese
microorganismo.
- Unas condiciones físico-químicas apropiadas. De acuerdo con ello, habría
que considerar:
A. TEMPERATURA ÓPTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorías
siguientes en función de los rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrófilos crecen bien a 0ºC y tienen una temperatura óptima o
inferior, la máxima es de 20ºC. Se aíslan del Ártico y Antártico. Pueden
crecer a 0ºC, aunque su temperatura óptima sea 20 a 30ºC y la máxima
de casi 35ºC. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefacción
de alimentos refrigerados.
49
- Los Mesófilos, crecen a una temperatura óptima de 20 a 45ºC, siendo la
mínima de 15 a 20ºC y la máxima de casi 45ºC. La mayoría de los
microorganismos pertenecen a esta categoría. Las bacterias patógenas
para el hombre suelen crecer a una temperatura óptima de 37ºC.
- Los termófilos, pueden crecer a una temperatura de 55ºC o superiores.
La temperatura mínima es normalmente de 45ºC y la óptima es de 55 a
65ºC. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberías de agua
caliente, aguas termales.
- Los Hipertermófilos, temperatura óptima de entre 80ºC y casi 113ºC, no
crecen por debajo de 55ºC. Microorganismos aislados en zonas calientes
del suelo marino.
RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Temperaturas cardinales (ºC)
Microorganismo Máxim
Mínima Óptima
a
Bacillus psichrophilus -10 23-24 28-30
Microcococcus cryophilus -4 10 24
Pseudomona fluorescens 4 25-30 40
Staphylococcus aureus 6.5 30-37 46
Enterococcus faecalis 0 37 44
Escherichia coli 10 37 45
Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38
Thermoplasma acidophilum 45 59 62
Bacillus stearthermophilus 30 60-65 75
Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85
Pyrococcus abyssi 67 96 102
Pyrodictium occultum 82 105 110
Pvrolobus fumarii 90 106 113
Candida scotti 0 4-15 15
Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40
Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para
su crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de
agua.
En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la
liofilización y cualquier método de deshidratación, sea un buen medio de
conservación.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH
óptimo de crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de
pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos
alterando la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas
y las proteínas transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como
consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradación de los
nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la fermentación
glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica
utilizando la bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice
el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo
para mantener el pH dentro de los límites fisiológicos.
EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Límite pH Límite
Microorganismo
inferior óptimo superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque
existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo
superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e
hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que permite que el agua
no penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a
concentraciones muy altas de cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados
sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente
el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del
Ambiente Microorganismo
Agua
1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos,
0.90 Jamón Basidiomycetes
0.85 Salami Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor,
0.80 Conservas Rhizopus
0.75 Lagos Staphylococus, Saccharomyces
51
salados Penicillum
0.70 Pescado Halobacterium, Aspergillus
0.60 salado Actinospora
Cereales, Aspergillus
dulces Saccharomyces
Chocolate Xeromyces
Leche
deshidratad
a
E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es
AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer,
pero lo hacen mejor en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis
pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo:
Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno
y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía
mediante la respiración aerobia y deben utilizar vías de fermentación o
respiración anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter,
que son MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno
atmosférico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de
Oxígeno.
2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes

clasificaciones. De acuerdo con esto y según criterios se podrían dividir en:
2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA
A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre
por encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el
aislamiento, purificación y visualización del crecimiento en colonias, así
como su posible identificación a través de medios específicos y
diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos
Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.
B. MEDIOS LÍQUIDOS
También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para
la realización de recuentos bacteriológicos por turbidimetría,
especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos
como: antibióticos, ácidos lácticos, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de
glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados
difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en
agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad
que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles para algunas
pruebas bioquímicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.
2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN
A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO

Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias
aisladas. Estos, según sea su composición, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de
los componentes básicos, uno o varios elementos, como por ejemplo caseína
soja, triptófano, etc., que facilitan el crecimiento de algún tipo de
microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el
microorganismo que buscamos.
A.2. MEDIOS SELECTIVOS

Son medios en cuya composición presentan componentes que impiden el
crecimiento de algún tipo bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composición sales biliares,
citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y
los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades
que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el
crecimiento de algunas bacterias y, lo que es más característico de este
medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias
que van a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y
específica, es decir, diferencial; por ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composición eosina y
azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y
algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias,
que según utilicen o no la lactosa darán lugar a una coloración
característica para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con
fines de aislamiento e identificación.
53
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de
utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, además si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o
desamina el aminoácido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de
utilizar el citrato como única fuente de carbono.
B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL

Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la
mayor parte de las bacterias. Su composición va a corresponder a una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales y agua. Dentro de los
medios generales más empleados tendríamos el caldo común, que está
compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sódico y
agua.
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS

Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las
cepas vivas durante períodos de tiempo relativamente largos
manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento.
Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para
mantener cepas durante meses.
2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN

A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTÉTICOS
C. MEDIOS SINTÉTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS
2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIÓN

A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SÓLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SÓLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LÍQUIDOS EN TUBO
III. MATERIALES Y REACTIVOS
d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml.
Baguetas. Balanza. Espátula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos
de ensayo.
e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac
Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .
4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad
que está indicada en la etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del
volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para
conseguir una suspensión homogénea, después incorporar el agua
restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado
adheridas a la pared interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para
conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al
agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente;
la solución es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y
pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en
caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar
en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad
del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido,
se colocan en la posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios
de cultivo: (Una vez que las placas de petri están esterilizadas,
procedemos a crear un medio sólido en ellas, en el cual poder
cultivar. Para ello calentamos el caldo preparado y le añadimos
el agaragar suficiente (15g/l) para conseguir un medio sólido.
Cuando tenemos preparada esta mezcla la vertimos en las
placas de petri y las cerramos para evitar que se contaminen
(siempre bajo un medio estéril, el cual se crea al encender una
llama).
 Agar nutritivo
 Agar Mac Conkey
 Agar EMB
 Agar Sabouraud
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
 Agar TSI
55
 Agar LIA
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
 Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
 Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar
seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y
en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo
tiempo limitado de conservación. Cuando no se indique otra cosa y
bajo condiciones adecuadas de conservación es de varios meses. Se
recomienda temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre
encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas
entre el cuerpo de la placa y la tapa.
4.5. COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE CADA UNO DE LOS

MEDIOS UTILIZADOS
AGAR NUTRITIVO
Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripción del Medio

Requerimiento Energético
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrógeno: _______________________
Requerimiento no Energético
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fósforo: ________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Según su proporción en agua

_________________________________________________________
Según su uso o utilización

_________________________________________________________
Según la composición
_________________________________________________________
Según su presentación
_________________________________________________________
AGAR MAC CONKEY
Composición
Peptona de caseína 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne
3.0 g.
Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro
de sodio 5.0 g
Agar – Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Fuente de azufre: _________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores inhibidores: _______________________

_________________________________________________________

_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composición
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g.
, peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg.,
sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0
g
Agua destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

57
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fósforo: _______________________
Iones metálicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona,
azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua
destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Fuente de azufre: _________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores inhibidores: ______________________
___________________________________________
___________________________________________
_____________________________________________
Según su presentación.
_____________________________________________
V. CUESTIONARIO
1. Defina Ud. los siguientes términos y mencione 1 ejemplo de
microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio
aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cuáles son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al función del agar-agar en los medios de cultivo?
4. ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores
bajos de aw?
5. ¿A qué se denomina medio sintético o definido? De 3 ejemplos.
6. ¿Qué es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. ¿Qué es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. ¿Qué es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una gráfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el
crecimiento microbiano, y clasifique en categorías diferentes según los
rangos de temperatura de su crecimiento (psicrófilos. Psicrótrofos,
mesófilos, termófilos, Hipertermófilos?
10. ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione
por lo menos 4.
11. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos.
12. ¿Qué medios diferenciales conoce? ¿Qué utilidades tienen?
13. ¿Qué es un medio selectivo y qué función tiene? Mencione por lo menos 3
y ¿qué sustancias se le agregan para que cumpla esa función?
14. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos microaerófilos?
16. ¿Para qué sirve utilizar un medio de cultivo semisólido? ¿Cómo se obtiene
la consistencia del agar blando?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
59
6
PRÁCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I. OBJETIVOS
- Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

- Saber llevar a cabo los diferentes métodos de siembra e inoculaciones.
- Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en
condiciones de asepsia y esterilidad.
II. MARCO TEORICO
Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito

previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto
inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los
siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de
los cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento
inicial para obtener cultivos puros.
2.1.SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en
medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen,
de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones óptimas
de temperatura y tiempo de inoculación, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a
partir de una muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran
superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el
medio, generen su progenie (cepa) por formación de colonias
separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá
características especiales, la morfología bacteriana será también
distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo
apropiado en tubo, que puede ser líquido o sólido.
Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios
especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioquímicas
y como resultado la identificación específica. Los trasplantes se
pueden realizar:
1. De líquido a sólido.
2. De líquido a líquido.
3. De sólido a sólido.
4. De sólido a líquido.
2.2.MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION

Existen los siguientes materiales:
 ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con
una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango
cilíndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos,

presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo diámetro es
más o menos específico es decir muchas asas son calibradas y
corresponden a un volumen determinado de siembra las más
utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
 HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su
extremo, únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por
picadura en medios semisólidos y sólidos.
 ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se
utiliza para extender el inóculo líquido previamente adicionado en la
placa, a través de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave,
aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y
prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
61
 HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que
esta sufra desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender
la muestra a través del hisopo en el medio de cultivo. Se suele
comercializar ya estéril listo para utilizar y desechables.
 PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de
vidrio, reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente
desechables. Pueden ser graduadas (contienen volúmenes
específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores
para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene
volúmenes graduados son muy utilizados en bacteriología y cuya
aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros
en un determinado medio de cultivo.
2.3.PREPAPACION DE INOCULOS
Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. Así pues, se debe partir, por un lado, de
un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentración adecuada de
microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicará distintos métodos para el

aislamiento mediante técnicas específicas, como es el caso de la
siembra por estrías en placa o por agotamiento, o la técnica de la
placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o
menos separado de los microorganismos. Es muy útil usar medios de
cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permitan el
crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De
esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser
aislada y desarrollada como puro.
 METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS

Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de
siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta
graduada o pipeta pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos
casos se homogenizará
2.4.PREPARACIÓN DE INÓCULOS
Si la muestra es sólida o semisólida se tomara siempre con asa de
siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta
graduada o pipera pasteur estéril en cantidad suficiente, y en ambos
casos se homogenizará posteriormente en el medio específico de
cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un

medio líquido se homogenizará y se dejará crecer a la temperatura
adecuada, que generalmente para organismos patógenos coincidirá
con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24
horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilización de
un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo
el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior
y de la cantidad de inóculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un

medio de cultivo sólido, se utilizara diferentes técnicas de siembra y
posteriormente se verificará el cultivo, ej. siembra por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se

adiciona a un medio liquido, se homogenizará la mezcla inicial por
agitación y se dejará crecer a una temperatura de 37ºC por 24 horas.
Es importante que los inóculos sean siempre jóvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se
añade a un medio sólido, se extenderá con el asa de Digrasky,
previamente estéril a través de toda la placa incubándose a a
temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren también
cultivos jóvenes.
Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina
estéril o caldo de cultivo base.
A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados

de microorganismos problema. En estos casos, los inóculos se
establecen en medios líquidos y el número de microorganismos se
recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos
con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de
Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de las cuales
tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada
tubo corresponderá a una determinada concentración de
microorganismos.
2.5.METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MÉTODOS DE

AISLAMIENTO)
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea
líquido o sólido se denomina siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se
denomina resiembra.
La siembra del inóculo puede realizarse en medio sólido o en medio
líquido.
2.5.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO SÓLIDO

Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
En primer lugar encendemos una llama, a la cual acercaremos el asa
de siembra y lo quemamos (hasta ponerse al rojo vivo) para poder
coger los microorganismos que deseamos cultivar en la placa sin
63
contaminar ésta. Una vez quemado el asa de siembra lo dejamos cerca
de la llama para que se enfríe un poco y evitar matar a los
microorganismos. Posteriormente acercamos el asa de siembra a la
muestra que vamos a sembrar, lo rozamos por ella y lo acercamos a la
placa en la que vamos a sembrarlos, la cual hemos abierto un poco.
Con el asa de siembra seguimos un camino en zig-zag desde el centro
al exterior de la placa, luego la giramos, hacemos lo mismo y volvemos
a repetir el proceso dos veces más
2.5.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la
superficie del medio sólido. Se va descargando gradualmente el
inóculo, para que en los últimos planos del medio queden escasas
células aisladas que en el ambiente nutritivo se irán multiplicando,
logarítmicamente hasta formar colonias puras.
Los métodos de aislamiento varían según el dispositivo de siembra y la
forma de distribuir el inóculo.
Cualquiera que sea el método ensayado, aprovechando el máximo de
superficie del medio se logra el aislamiento de mayor número de
cepas microbianas.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estrías.
- Siembra por difusión.
- Siembra por diseminación.
a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE

Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se
construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el
inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí
se realizará movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa
no tomándose en ningún momento nuevos inóculos y no levantándose
el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.
- ESTRIA MÚLTIPLE
Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente
estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la
placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta solo en la parte
superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa
repetiremos el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra
desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo
superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino
sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma
dirección se repite la operación hasta un total de cuatro o cinco veces,
que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa,
teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior
de la misma.
El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia
de que cada vez que se va arrastrando y separando más la muestra. Es
importante que para separar estas colonias se realice en cada estría
un flameado previo del asa de siembra.
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se
dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro
de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes
iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de
inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los
cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig -
zag. Realizamos la misma operación sin flamear el asa en todos los
demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos
arrastrando el microorganismo problema observándose en el último
cuadrante las colonias más aisladas o separadas.
- TECNICA DE LOS TRES GIROS

Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo
con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la
placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y
volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta
completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) ésta
técnica no es muy utilizada.
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY)

65
En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al
solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirán
para contaje de colonias.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de

medio a una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se
adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se
homogenizará la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril

y se dejará solidificar, la mezcla también se podría realizar en la
misma placa Petri, aunque la homogenización en este caso es más
difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de
CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a
determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY).

Consiste en adicionar al medio sólido, un inóculo que puede oscilar
entre 0,2 y 1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y
posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril.
Esta técnica se puede utilizar para el recuento de células viables,
antibíogramas, etc.
2.6.SIEMBRA DEL INÓCULO EN TUBO
a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO

Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado
una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo
de la superficie de ésta realizando movimientos ascendentes en zig -
zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es
utilizado para conservar cepas durante largos períodos, así como para
la realización de ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de
ureasa.
b. SIEMBRA POR PICADURA

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones
también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el
asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo
de esta y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de
medios de cultivo semisólidos ej. medio de oxidación - fermentación de
Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas.
Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado.
Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la
siembra por estría ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio
citrato entre otras.
2.7.CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y

TRANSFERENCIA CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la

obtención de cultivos puros, que están constituidos por una única
especie microbiana. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología
conlleve el uso de cultivos puros.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en

algún método de dilución. El método más útil y práctico es el
aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se
extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las
células individuales queden separadas una de otras. Cada célula
aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo
(o clon) puro puesto que las células que componen la colonia son la
progenie de una única célula original.
Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo:
1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada

procedente de un aislamiento en placa inicial debería dar lugar al
repetir la operación a colonias todas del mismo tipo, y cuya
morfología concuerda con la del aislamiento inicial.
2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una
colonia deberían mostrar un único tipo celular. Los métodos
diferenciales de tinción Gram, son útiles pare establecer que la
colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.
67
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos
puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones.
Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las
precauciones necesarias para prevenir la contaminación o de las
soluciones con microorganismos no deseados.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Material de Vidrio Otros materiales
- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 - Gradillas

x 100)
- Mechero Bunsen
- Placas petra
- Asas de siembra
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml
- Algodón
- Erlenmeyer
- Pinzas
Equipos
- Estufa 37ºC
- Autoclave
Reactivo y Medios de cultivo
- Medios de cultivo
 Agar Mc Conkey  Agar TSI, LIA (tubos pico de

flauta)
 Agar nutritivo
 Agar SIM (tubos fondo)
 Agar Saboraud
 Caldo SIM
IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS
4.1.SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE

DIGRASKY
Muestra: Inóculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.2.SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA

Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
69
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.3.TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características

____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
V. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?

2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada
transferencia?
3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una
transferencia?
4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del
tubo fuente o del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es
necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el
crecimiento bacteriano?
6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los
procedimientos de siembra?
7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la
incubación?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
71
7
PRÁCTICA
CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS
I. OBJETIVOS
- Aprender las diferentes características de la morfología colonial

utilizadas en la identificación de bacterias.
- Estudiar características culturales de crecimiento de los
microorganismos en medio sólido
- Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos
en medio líquido
II. MARCO TEÓRICO
GENERALIDADES:
Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura,

tamaño, consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y
cultivarlos en medios de cultivos apropiados según el tipo de microorganismo,
de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios sólidos y
líquidos.
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la

reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio
sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de
microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que
tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la
especie bacteriana que la forme.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes,
sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, además
de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y
propiedades inmunológicas de las bacterias para poder realizar una
identificación completa.
La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de
una célula individual pero es la característica de la masa celular. Así pues, por
ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula
individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se
deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande.
Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las
especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios
milímetros.
Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras

se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias
bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde
una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una
colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando
se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada

con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz
transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacterias saprófitas

en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los
microorganismos patógenos uno de los pigmentados más importantes es
Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se
aprecia en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares
muy pequeños para verse con luz transmitida.
III. MATERIALES Y EQUIPO
Se utilizarán las placas y tubos sembrados en la práctica anterior.

1 mechero Bunsen
2 asa bacteriológica
TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN

LA
SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO
73
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CONSISTENCIA (probarla con el asa)

Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan términos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento
producido
Difusible o no.
CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a través de la colonia)

Opaca: no permite el paso de luz
Traslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a través de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos
observados a través de la colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de
la
bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.
Película: Crecimiento casi continúo sobre el líquido
Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al
agitar
Crecimiento en caldo Nutritivo
Crecimiento en medio semisólido
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla, basándose en el
Texto, las figuras:
75
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevación
Superficie
Consistenci
a
Color
Luz
transmitida
Luz
reflejada
MEDIO SEMISÓLIDO
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qué método utilizaría para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo

puro, joven, injuriado y envejecido.
2. Por qué algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en
caldo una característica de forma de película.
3. ¿Cómo se visualiza el polisacárido extracelular y a qué bacteria puede
corresponder?
4. ¿Qué es la prueba de catalasa, cómo se realiza y qué utilidad tiene?
5. ¿Cómo se interpretan los resultados de una prueba de fermentación de
hidratos de carbono?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
77
8
PRÁCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I. INTRODUCCIÓN
Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales,

absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría
mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la
medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos
procedimientos se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya
que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión
bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en
el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la
medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz
monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la
longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una
suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica e
inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la
multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz
transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida
(absorbancia), ya que esta última es directamente proporcional al número
de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemáticamente de la
siguiente manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelómetro.
Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de

turbimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que
permite la realización de medidas sin necesidad de tomar muestras del
cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.
II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.

2) Realizar una curva de multiplicación bacteriana.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la célula
aumentan en cantidad, en la mayoría de organismos el crecimiento
continuo hasta que la célula se divide en dos nuevas células, proceso
denominado fisión binaria. Cada una de las células hijas recibe, un
cromosoma completo, copias de todas las macromoléculas, monómeros e
iones inorgánicos.
El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama

generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de
generación o tiempo de duplicación,na entre los microorganismos,
algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros
requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso días.
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO

Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes
de un cultivo que ha crecido a saturación, en el que se ha
determinado el número de células variables por minuto
periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva
de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases
fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los
microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos,
enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta
alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se
reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia
de la división celular y las nuevas células crecen en progresión
geométrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad
constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan
productos metabólicos tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una
población.
4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el
cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la
velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel
sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinación
Adaptación Divisón celular Acumulan metabolitos tóxicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos
Turbidez 0,75
viables/ml
Densidad óptica
8,0 Viables (densidad óptica)
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0 0,1
Tiempo
79
IV. PARTE EXPERIMENTAL
4.1 MATERIALES Y REACTIVOS

- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Caldo Luria Bertani estéril o Caldo nutritivo
- Jeringa descartable de 10 cc.
- Contómetro
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubación a 37ºC
- Microscopio
- Espectrofotómetro
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un

cultivo discontinuo (en un matraz en agitación) normalmente
experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de
latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de
muerte. Las células en fase de latencia, que proceden de una
alícuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio
nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a

crecer a un ritmo rápido. La duración de esta fase de latencia
depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inóculo, de la
temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y
nuevo, de la aireación, y de la concentración de toxinas que pueden
haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que
han entrado en la fase de crecimiento logarítmica (log) o
exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente, y a
diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la
mayoría de las células se hallan en el mismo estado fisiológico. La
velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de
nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un
cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo
medio de duplicación o tiempo de generación).
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo

y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de
crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el
cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las células no
están todas en el mismo estado fisiológico; algunas todavía se están
dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la
población total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor
parte de los nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa
al número de células que se producen, y el cultivo entra en la fase de
muerte.
Realización (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuación se deben
realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del
mechero.)
1. Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo
completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la
solución salina por agitación.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y
añadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo nutritivo prparado por
componentes, estéril.
81
3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación
(200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de
onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 %
de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Nutritivo estéril
antes de cada medida.
5. Recoger alícuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de
incubación y colocadas en refrigeración hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos,
colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de
ordenadas los de absorbancia.
VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con
medio de cultivo estéril?
2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de
multiplicación de una bacteria?
3. Identificar en la gráfica las fases del desarrollo microbiano.
4. Proponer otra técnica experimental de evaluación del crecimiento
microbiano.
83
VIII.OBSERVACIONES
IX. CONCLUSIONES
9
PRÁCTICA
CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS
I. OBJETIVO
Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de
contaje celular.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de
partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será
necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión
como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes

técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la
que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara
de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell
Coulter”.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando

métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por
ej. La cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje
celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión
a medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen
conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de
partículas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de
partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al

microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del
cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada
0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el
cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
85
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x
células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular
será:
Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones

marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de
16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido
tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su

uso en microscopía. En la imagen puedes observar una cámara de
Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de

estimar la cantidad de células microbianas, sin embargo, tiene algunas
limitaciones:
1) No se distinguen las células muertas de las células vivas.
2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y
posiblemente se omitan algunas células.
3) La precisión es difícil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha
teñido la muestra.
5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja
densidad. En el asa de bacterias, en una suspensión de células con
menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o ninguna
bacteria.
- Cultivo de E. coli - Cultivo de levadura
- Matraz - Pipetas
- Cámara del Neubauer -Pipeta Pasteur
- Estufa - Microscopio
IV. METODOLOGÍA
CARGANDO LA CÁMARA
Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña
cantidad de suspensión con una pipeta Pasteur. Deposita una gota
pequeña en la superficie pulida de la cámara de recuento cerca del
extremo del cubre. La suspensión entrará en la cámara por
capilaridad. Una cámara adecuadamente llenada contiene células
solo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento.
No debería sobrar fluido que cayera en los surcos.
V. CUESTIONARIO
1.- Investigue las características de:

Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje
celular, Otros métodos de recuento celular
2.- Indique como diferencia las células viables de células totales.
3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
87
10
PRÁCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE
DILUCIÓN EN PLACA
I. OBJETIVOS
Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de

diferentes fuentes de inóculo.
II. INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación

de colonias, la técnica por vaciado en placa es la más utilizada. La muestra en
cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles, se adiciona el medio
de cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra.
Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que
multiplicadas por el inverso de la dilución que corresponda permite estimar el
número de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente
con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y
tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referirá a determinado
grupo de microorganismos. Esta técnica permite la mayoría de las veces
cuantificar la contaminación en alimentos, medicamentos.
SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY).

Consiste en adicionar el medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y
1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se
extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar
para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.
TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION

Se dispondrá de un batería de tubos con medio de cultivo específico o agua
estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra liquida o sólida
en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inóculo que se añade en el
tubo inicial. Se agitará hasta homogenizar. Con la pipeta estéril se tomará una
cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos
la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la
dilución deseada. Con la dilución obtenida por ej. l0 -4 y 10-5 inocular en placas
de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente
estéril. Incubar a temperatura óptima de 24 horas y posteriormente recontar.
Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio
de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta
obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja
solidificar.
III. MATERIAL REACTIVOS
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de

tinción de Gram, Cajas Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodón, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGÍA
SIEMBRA POR DILUCION
Preparación de reactivos y medio de cultivo:

Solución isotónica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua
destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del
reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estériles hacer las diluciones en la solución isotónica estéril,
de acuerdo a la figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en
cajas de petri bajo condiciones estériles. Inocular de la misma manera con las
diluciones siguientes
Se realizará el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30°C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realización del reporte de la práctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de
30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y
no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el
número de colonias contadas se multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas
se multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por
el número de cuadros que ocupa la caja.
El número de colonias contadas deberá ser multiplicado por el inverso de la
dilución y considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al
volumen de la muestra).
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos
al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49
se reporta 49
Fig. 1
89
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la
preparación y dilución de muestras.
Pipetear a placas Petri estériles, alícuotas de 1 ml. A partir de las diluciones,
dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y
temperado a 45°C, mezclar rápidamente con movimientos vaivén y rotación de
la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posición invertida a 37 °C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos según:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre
30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmética de dos recuentos y multiplicar por el factor de
dilución utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios
mesofilos viables por gramo o mililitro, según el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores
que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y
computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la
relación de los dos recuentos
V. RESULTADOS
 Reportar el número de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de

TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos
y discutir.
 Presentar descripción de morfología de colonias y microscópica.
VI. CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el método de dilución para el

aislamiento de microorganismos.
2. Comparar el método de dilución con el de estría para el aislamiento de
microorganismos.
3. ¿Por qué el número de microorganismos es el resultado de multiplicar el
número de colonias por el inverso de la dilución?
4. ¿De los datos obtenidos en la práctica cuáles cree que sean congruentes
y cuáles no y porque?
5. ¿Por qué la incubación se realiza con las placas en posición invertida?
6. ¿Qué finalidad tienen las diluciones y donde se requerirán más
diluciones, en muestra fresca o procesada, por qué?
VII. OBSERVACIONES
VIII.CONCLUSIONES
91
11
PRÁCTICA
OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia trabeculata
I. OBJETIVO
 Aplicar técnicas de extracción de ácido alguinio a partir de algas.
 Aplicar técnicas de purificación de ácido alguinio a partir de algas.
II. INTRODUCCIÓN.
Existen variedades de algas pardas que producen ácido algínico, que es la base para
producir alginato de Sodio, Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata,
crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.
En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales

como: Macrocystis pyrifera, “sargazos” Lessonia trabeculata (“aracanto”,
“palo”) y Lessonia nigrescens (“aracanto negra”), en ambientes inter y
submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la
extracción, y b) mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen
disposiciones normativas, que en resumen, en la actualidad, prohíben la
actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N° 839- 2008-
PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas
varadas (RM N° 264-2009-PRODUCE).
III. MARCO TEÓRICO
En las algas pardas, el ácido algínico es uno de los principales

constituyentes de las paredes celulares, casi siempre se encuentra con otros
polisacáridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%), diferenciándose de
estas dos últimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse
asociado con varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El ácido algínico es un
polisacárido, de fórmula general: (C6H8O6)n, donde «n» se repite de 80 a 83
veces., y compuesto de ácido manurónico y ácido gulurónico unidos con
enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones
Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+
93
Fig… Moléculas constitutivas del ácido algínico.
El ácido algínico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio

iónico, formándose alginato de sodio, que es soluble y de fácil extracción.
Al ácido algínico y los alginatos son bastante higroscópicos y un secado
completo es muy lento, presentando una humedad de un 15-25%.
La viscosidad de una solución de alginato es una propiedad que depende o deriva
de su peso molecular del polisacárido, y de la relación de ácido manurónico a
ácido gulurónico (M/G).
Material de Laboratorio:
Termómetro, vasos de precipitación, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas,
pH-metro, papeles filtrantes, pipetas, embudos, etc.
Reactivos:
Ácido clorhídrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol,
etc.
Equipos:
Potenciómetro, balanza analítica, estufa graduada para baja temperatura.
1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un balón de vidrio

de 2 litros, con suficiente cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se
produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento de los tallos, el lavado
se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los líquidos no
den precipitado con solución diluida de nitrato de plata.
2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solución 0,2 N de
HCl, los cuales terminan cuando el líquido del lavado no da turbidez con
etanol.
Así se transforman los alginatos en ácido algínico (insoluble).
MCl HAlg HCl MAlg.
3.- Luego se corta la muestra en pequeños trozos, se agrega agua y se calienta
hasta 45 C por unos 10 minutos.
5.- Las muestras lavadas se tratan con una solución de Na 2CO3 al 10% en peso
(ajustando el pH a 9-10), se calienta hasta 70 °C agitando continuamente,
luego dejar en reposo por varias horas, conviene dejarlo hasta el día siguiente,
de tal modo que se macere. Durante la maceración, el ácido algínico se
somete a un tratamiento alcalino para solubilizar el extracto como alginato de
sodio, como resultado, la solución presentará un aspecto lechoso parduzco y
viscoso.
6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na 2CO3 al 2% a 70 ºC por 10
minutos, se filtra y el filtrado se agrega a la solución anterior y, si es
necesario, se vuelve a filtrar.
7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro.
Para blanquearlo o decolorarlo se agrega una solución de hipoclorito de sodio
al 5.25% en la proporción de 1/10 del volumen de los filtrados resultantes que
contiene el vaso de precipitado y se deja actuar por unos 10 minutos.
8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se determina el pH
inicial, luego se acidifica con HCl concentrado, agregando de 10 en 10 ml ,
midiendo su pH hasta llegar a pH=2:
20
.
2
0
.
2
H
Se observa la formación de una gran masa de precipitación blanquecina, que
se deposita en el fondo del recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de
tocuyo blanco, lavando el filtrado con ácido clorhídrico diluido.
9.- La purificación consiste en cambiar de fase el compuesto de interés para
eliminar con la otra fase los contaminantes, en este caso se precipitará con
cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes, en su gran mayoría,
en las aguas sobrenadantes.
2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl
10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza
mediante un lavado con NaClO. El alginato de calcio es de interés comercial
obtenido en forma purificada, a partir de él pueden obtenerse los restantes.
A continuación el alginato de Calcio se acidifica con ácido clorhídrico al 5%,
11.- para transformarse en ácido algínico, como se muestra en la siguiente
reacción:
CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl
12.- El ácido algínico se escurre y se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso
constante, por unas 5 horas, se enfría y se pesa.
El último producto buscado es el alginato de sodio el que se consigue desde la
solución ácida de ácido algínico por alcalinización con NaOH 5 N, como este
alginato es soluble en agua se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso
constante.
HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O
Aplicaciones del alginato:

• Alimenticias: Espesante, estabilizante o propiedades de suspensión en jugos
de fruta, salsa de ensaladas, milk shakes, salsas, cremas, cerveza, adornos
para postres. Propiedades gelificantes en alimentos para animales, relleno de
aceitunas, gelatinas. Control en fabricación de quesos, fabricación de helado,
cubiertas de frutas en postres.
• Farmacéuticas: Propiedades espesantes en jarabes, emulsiones, lociones,
cremas. Características de rápida hidratación en desintegración de tabletas,
controlador de irrigación de droga. Propiedades gelificantes en polvos de
impresión dental.
• Textiles: Propiedades gelificantes en gomas para impresión, propiedades de
limpieza, sistemas reactivos de tinta, sistemas de dispersión de tinta, inhibidor
de transporte fluido, baños de tinta.
95
• Otras: Propiedades de formación de película, interacción con silicatos,
electrodos de soldadura, sellado de conservas, barnices, cerámicas, pinturas
cremosas.
V. CUESTIONARIO
1. Explique la estructura química del alginato

2. Proponga métodos alternativos de purificación de alginato
3. Proponga un análisis químico del producto final para determinar la
composición y estructura del alginato
4. En cuanto a la capacidad gelificante de los alginatos, explique los
mecanismos de gelificacion interna y externa y su diferencia entre ellos.
VI. RESULTADOS
VII. OBSERVACIONES
VIII.CONCLUSIONES
97
12
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE
MICROORGANISMOS DE INTERÉS
INDUSTRIAL
I. OBJETIVOS
• Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para

la obtención de metabolitos de interés industrial.
• Aplicar técnicas de purificación de microorganismos aprendidas
previamente en microbiología general.
II. MARCO TEORICO
Las áreas de aplicación de la microbiología industrial son muy variadas, y de

ellas surge la importancia y el impacto que tiene esta disciplina en la
actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiología
industrial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades,
fundamentalmente por su aplicación en la producción de compuestos de
actividad farmacológica y de vacunas.
En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la
microbiología industrial, en la producción de bebidas, enzimas, saborizantes,
productos lácteos y muchas otras aplicaciones.
La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de
producción vegetal y animal, por un conjunto variado de procesos
microbiológicos.
El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación, o sea,
con la aplicación de microorganismos en la extracción de metales de
minerales de baja ley.
Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación
de microorganismos en la purificación de efluentes, aspecto fundamental para
el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el
microorganismo utilizado, para la elección del mismo se deben tener en
cuenta los criterios generales que se indican a continuación:
1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.

2. Su velocidad de crecimiento debería ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de
medios de cultivo de costo reducido.
5. Debe ser de fácil conservación por largos periodos de tiempo, sin pérdida
de sus características particulares.
6. Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, éste debería ser de alto
rendimiento y de fácil extracción del medio de cultivo.
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por

aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. En el
ámbito industrial, en general, cada firma posee su propia colección de
organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de técnicas
clásicas de mutación o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo
son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial
que representan. En algunos casos se dispone de organismos modificados
genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis,
degradación o biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto
significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no está
disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo,
plantas y desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo
en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son
de interés.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podrían encontrar
organismos adaptados a la degradación de estos productos químicos; o en
larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la
técnica elegida para el mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento
directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre tratamiento de la
muestra.
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos
 Asa.
 Hisopos estériles.
 Bolsas plásticas 1 l.
 Cuchillo.
 Caja Petri con agar nutritivo.
 Caja Petri con agar papa dextrosa.
 Caja Petri con agar YPD con 10 % de
 Aceite de oliva.
 Incubadora.
 Mechero.
 Balanza.
Las muestras que se analizarán son tierra, queso y piña.

Procedimiento para tierra
1. Pesar 10 g de tierra y mezclar con 90 ml de solución salina estéril
dentro de una bolsa de plástico; homogeneizar durante 1 minuto.
99
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la
técnica de estrías, para tener colonias aisladas.
3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C.
Procedimiento para queso
1. Pesar 10 g de queso y mezclar con 90 ml de solución salina estéril
dentro de una bolsa de plástico; homogeneizar durante 1 minuto.
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la
técnica de estrías, para tener colonias aisladas.
Procedimiento para la piña
1. Mojar un hisopo con solución salina estéril y frotar la superficie de la
piña con él.
2. Descargar el hisopo sobre un tercio de la superficie de la caja de
cultivo y estriar la descarga con un asa calibrada para tener colonias
aisladas.
Procedimiento para identificar los microorganismos de interés
industrial
Dependiendo del uso que se esté buscando para los microorganismos y la
industria donde se emplearán, será el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarán levaduras con actividad lipasa o esterasa,
para eso se inocularán diferentes colonias por picadura en la
superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observará un halo
transparente, resultado de la actividad lipasa positiva.
2. También en el queso se buscarán bacterias del genero Lactobacillus
ácido-lácticas, con potencial para ser utilizadas para la preparación
de yogur. Se efectuarán las pruebas bioquímicas pertinentes para su
identificación.
3. En la piña se buscarán hongos del género Aspergillus, productoras de
ácido acético, así como bacterias ácido-acéticas para la producción
de vinagre. La identificación del hongo se hará con base en sus
características macroscópicas y microscópicas, y para las bacterias
se harán pruebas bioquímicas.
4. Con la tierra se seguirá el procedimiento dependiendo lo que crezca
en la caja de cultivo, ya sea hongos, levaduras o bacterias. Para el
caso de los hongos, se identificarán con base en sus características
macroscópicas y microscópicas; para las bacterias, se harán pruebas
bioquímicas. En el caso de las levaduras, se observarán las
características morfológicas de las colonias y un frotis en fresco al
microscopio.
IV. CUESTIONARIO
1. Mencione cinco industrias en donde se utilizan microorganismos

durante los procesos de fabricación.
2. Mencione cinco bacterias que son utilizadas en la industria alimentaria,
así como el producto o proceso en el que participan.
3. Mencione cinco levaduras que son utilizadas en escala industrial, así
como el producto o proceso en el que participan.
4. Mencione los lugares donde se pueden encontrar las bacterias del
género Lactobacillus.
5. Mencione los lugares donde se pueden encontrar hongos del genero
Aspergillus.
101
V. RESULTADOS
Resultados de las pruebas que se efectuaron a cada una de las

colonias.
Bacterias Levaduras Hongos

Tierra
Queso
Piña
VI. OBSERVACIONES
Fotografías de las cajas de cultivo
VII. CONCLUSIONES
13
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I. OBJETIVO
- Obtener nódulos de Rhizobium de raíces de alfalfa.

- Observación microscópica de bacterias de Rhizobium
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
La producción agrícola basada en leguminosas es fundamental para la

alimentación humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente.
Por ello la interacción natural de estas plantas con una bacteria del
suelo a nivel de la raíz, es ecológicamente importante, como medida
para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran
el suelo y contaminan el ambiente.
La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce

a su hospedero, lo infecta a través de los pelos radicales para que en la
matriz de las células corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada
que da lugar a un tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de
la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se
ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada
nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al
ribosoma vegetal para la síntesis de proteínas vegetales;
simultáneamente por la fotosíntesis la leguminosa reduce el C02 en
carbohidratos que servirán como fuente de carbono y energía para
Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la

aplicación de fertilizantes químicos al suelo; incrementan el contenido
de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en
las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de producción
y la contaminación de mantos acuíferos y suelos, es vital para una
agricultura sustentable.
GRUPOS DE INOCULACIÓN CRUZADA Y ASOCIACIONES

DE Rhizobium – LEGUMINOSA
Grupo de Especies de Género Leguminosa
Inoculación Rhizobium hospedero incluida
cruzada
103
Grupo de alfalfa R. meliloti Medicago Alfalfa
Melilotus Trebol dulce
Trigonella Alholva
Grupo del trébol R. Trifolium Trébol
leguminosarum
biovar trifolii
Material Biológico
- Raíces de alfalfa con nódulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bisturí
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estéril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGÍA
1. Preparación del Medio PSA

Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta
que las papas estén cocidas.
Filtrar la solución de cocción y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de
sacarosa y 1.2 g agar – agar autoclave 120ºC 15? Y proceder a
plaquear
2. Observación Microscopia de Bacterias de Rhizobium
- Obtener los nódulos de Rhizobium de las raíces de alfalfa.
- Caracterizar los nódulos según posición en las raíces, color, forma,
tamaño.
- Lavar con agua destilada los nódulos y realizar disección del nódulo
sobre un porta objeto y dejar caer el líquido interno para realizar
un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
- Realizar coloración Gram
- Observación en el microscopio a 100X
3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA

Esterilización de nódulos
- Disponer los nódulos en un matraz de 100 ml
- Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
- Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 – 8 minutos, decantar
- Lavar con agua destilada estéril 3 veces
- Realizar la disección del nódulo con la ayuda de pinzas y bisturí sobre
papel estéril.
- Dejar caer el líquido interno del nódulo seccionado apretando con la
pinza o pasar sobre la superficie del medio.
- Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 – 27ºC en estufa, 5 días.
105
V. CUESTIONARIO
- Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium.
- Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium.
- Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de
Rhizobium.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
14
PRÁCTICA
OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces
cerevisiae
I. OBJETIVO
Estudiar el efecto de la temperatura de incubación en la cinética de la
fermentación alcohólica de un mosto azucarado, con Saccharomyces
cerevisiae.
II. FUNDAMENTO TEORICO
La fermentación alcohólica en mostos azucarados se origina por el

metabolismo anaerobio de Saccharomyces cerevisiae, que forma etanol y
CO2 como productos principales, a través de la ruta de Embden-
Meyerhof-Parnas. Esta fermentación puede representarse por la ecuación
estequiométrica de Gay -Lussac (Phaff y Amerine, 1979, Reyes et al.,
1992, Westermann y Huige, 1979):
C6H12O6 --------> 2 C2H5OH + 2 CO2
glucosa etanol
Los rendimientos de etanol y CO 2 en la práctica son siempre menores a

los valores teóricos. Estos dependen del inóculo (tipo, actividad y
concentración de la cepa de levadura), de la composición del medio de
cultivo (concentraciones de fuentes de macronutrientes, micronutrientes,
factores de crecimiento, e inhibidores), de las condiciones ambientales
(temperatura, presencia o ausencia de O2, pH y aW), del crecimiento
microbiano, y de la formación de más de 800 metabolitos en pequeñas
cantidades (Quintero, 1981, Phaff y Amerine, 1979, Reyes et al., 1993).
El cultivo inicia al inocular la levadura. Inicialmente predomina el

metabolismo aerobio a expensas del O 2 disuelto en el mosto; cuando éste
se termina, se establece el metabolismo anaerobio, que se ve favorecido
por la saturación del medio con el CO 2 desprendido (Westermann y
Huige, 1979). A partir de ese momento inicia la FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA PRIMARIA O FERMENTACIÓN TUMULTUOSA. En esta
etapa, la cinética de producción de etanol se presenta relacionada
directamente con las cinéticas de crecimiento microbiano y de consumo
de sustrato (Quintero, 1981). Durante este período, se observa un
burbujeo muy enérgico, mientras que las velocidades de consumo de
sustrato y de formación de productos son máximas.
107
La actividad de la fermentación disminuye cuando la disponibilidad del
sustrato principal (azúcares) llega a una concentración limitante,
observándose entonces un desprendimiento mínimo de burbujas.
La temperatura de cultivo es uno de los principales factores que afectan

a la cinética de la fermentación alcohólica. Influye en el rendimiento y en
la velocidad de producción del etanol y en la formación de diversos
compuestos aromatizantes, como los alcoholes superiores y los ésteres
(Phaff y Amerine, 1979).
Materiales:
1 asa bacteriológica
1 baño de temperatura controlada
2 barras de agitación magnéticas
1 charola profunda
2 embudos de 7 cm de diámetro
5 espátulas pequeñas de acero inoxidable
7 frascos de 120 ml de capacidad nominal con tapa de rosca
1 frasco de vidrio de 1000 ml esterilizable (de suero), con tapón de

hule.
1 gradilla
1 matraz erlenmeyer de 500 ml
1 mechero
1 piceta
2 pipetas graduadas de 1 ml,2 ml,10 ml.
1 probeta de 250 ml
1 recipiente metálico de 15-20 cm de altitud y 18-22 cm de diámetro.
1 termómetro de -10 a 50 oC
4 tubos de ensayo medianos con rosca
2 vasos de precipitados de 50 ml,600 ml y 1000 ml
Reactivos:
Extracto de levadura
H2O destilada o desionizada
K2HPO4
K2SO3
MgSO47 H2O
MnSO4H2O
(NH4)2SO4
Sacarosa (Glucosa o maltosa)
Soluciones amortiguadoras de referencia, pH 4.0 y 7.0
Solución de azul de metileno al 0.5 %*
Solución de fenol al 1 % *
Solución de fenol al 5 % *
Solución de H2SO4 al 10 % *
Solución de NaOH al 10 % *
Solución de Na2SO3 (50 mg L-1)
Solución de vitaminas y minerales *
Un tubo con cultivo axénico de 48 h de una cepa de Saccharomyces

cerevisiae, en medio complejo sólido.
(*) Preparados previamente
Equipo (para el grupo):
Autoclave, balanza granataria digital, congelador, incubadora o baño de

temperatura controlada, parrillas de calentamiento y agitación
electrorregulables, potenciómetro, refrigerador.
III. PROCEDIMIENTO
Se evaluaran dos niveles de temperatura en la fermentación alcohólica
dentro del rango normal que se utiliza en la industria, para la elaboración
de las bebidas alcohólicas, propuestos de acuerdo al Cuadro No. 1.1.
Cada equipo de alumnos preparará su medio de cultivo y el inóculo;
llevará a cabo la fermentación de 3 – 5 días a una temperatura asignada.
Se realizaran muestreos de acuerdo al cronograma propuesto, y se
realizará la evaluación de los cambios en las concentraciones de
levaduras, de etanol y de azúcares reductores. Después de efectuar los
cálculos se realizará una comparación de los resultados de dos equipos,
109
cada uno con un nivel diferente de temperatura. Cada equipo presentará
un informe con los resultados de ambos equipos y escribirá su discusión.
Los resultados se discutirán en una sesión global.
Cuadro 1.1 Niveles de temperatura para la
Fermentación Alcohólica
_________________________________________________________________________
Fermentación Temperatura
No. (oC )
______________________________________________________________________
1 24
2 30
_________________________________________________________________________
S. cerevisiae en caldo dextrosa

Cultivo del inóculo
Saboraud, cultivo a 28°C, 48 h,
200 rpm.
Preparación de
Pipetas, tubos, frascos de
muestreo y fermentador.
Materiales de muestreo
Preparación del medio

Con base al cuadro 1.2.
de fermentación
Esterilización a 121°C, 15
Fermentación Inocular el medio de cultivo
principal con 5% (v/v) del
inóculo de 48 h. Incubar a 24
o 28°C por 3-5 días.
MuestreoSe muestrea de acuerdo al

cronograma, tomando 15
ml.
Conteo diferencial de levaduras

Análisis de la
viables y no viables, azúcares
reductores y grado alcohólico.
fermentación
Informe de resultados
Cálculos, gráficas, tablas y
dibujos; discusión y
conclusión.
Figura 1.1 Diagrama de actividades para el desarrollo de la práctica de

fermentación alcohólica
1a Actividad: Cultivo del inóculo
Estructura
Se preparan 2 matraces erlenmeyer con caldo dextrosa–Sabouraud
estéril.
Se verifica la pureza de la cepa de Saccharomyces cerevisiae que se ha

desarrollado previamente en medio sólido inclinado, realizando un frotis
teñido con la técnica simple de azul de metileno al 0.5 %
El caldo dextrosa–Sabouraud se inocula con una asada de la levadura en

condiciones asépticas y se incuba durante 48 h, a 28oC, con agitación.
2a Actividad: Preparación de materiales para muestreo
Estructura
Esta actividad se realiza antes de la fermentación principal.
111
Los frascos de muestreo (120 ml) se hierven en baño maría, durante 30
min. Después se retiran del agua con precaución, se escurren, se cierran
y se dejan enfriar lentamente.
Se esterilizan 4 pipetas graduadas de 10 ml, 3 tubos de ensayo con tapón

roscado vacíos y un embudo chico, en autoclave a 121oC, durante 15 min.
3a Actividad: Preparación del medio de fermentación
Estructura
Este medio de cultivo se prepara días antes del inicio de la fermentación
y adicionando sobre el vaso de precipitados primero el agua y poco a
poco cada uno de los componentes con base al siguiente cuadro:
Cuadro 1.2 Composición del caldo de glucosa para realizar la

fermentación alcohólica
__________________________________________________________________
Componentes g L-1 H2O
____________________________________________________________
Orgánicos
Extracto de levadura 2.0
Glucosa 120.0
Sol. de vitaminas y minerales (ml)** 2.0
Inorgánicos
K2HPO4 1.0
MgSO47H2O 0.4
MnSO4H2O 0.1
(NH4)2SO4 2.0
K2SO3* 0.05
_________________________________________________________________
*Se adiciona después de la esterilización.

**Preparada previamente según anexo A.
El volumen de trabajo de cada fermentador es de 700 ml, el cual incluye

al volumen del medio (95%) y al volumen del inóculo (5%). En la
preparación del medio se esterilizan por separado los componentes
orgánicos y los inorgánicos.
En un vaso de precipitados de 400 ml se mezclan los componentes

orgánicos indicados en el Cuadro 1.2, en 200 ml de agua, calculando las
cantidades de los componentes con base a un volumen de trabajo de 700
ml. Se mezcla el medio en una parrilla de agitación a temperatura
ambiente y se ajusta el pH a 4.0 con soluciones de H 2SO4 o NaOH al 10%,
con ayuda de un potenciómetro calibrado. Se esteriliza el medio en un
matraz erlenmeyer de 500 ml.
En un vaso de precipitados de 1 L se prepara por separado la solución de

componentes inorgánicos (con excepción del K 2SO3) en 465 ml de agua,
siguiendo el procedimiento descrito para el medio anterior hasta el ajuste
del pH. Esta solución se vierte en el fermentador junto con una barra de
agitación magnética. Se tapan todas las salidas del fermentador con
pequeños tapones de algodón largos y poco apretados, además se
colocará gasa por fuera de las salidas amarrándolas con hilo
Se esteriliza el matraz erlenmeyer y el fermentador con los medios en el

autoclave a 121oC, durante 15 min, y se enfría lentamente para evitar la
ruptura del frasco.
Por separado se esteriliza el tapón de rosca del fermentador, un tramo de

manguera esterilizable de 45 cm y 2 tramos de hilaza de 10 cm cada uno,
envueltas separadamente en papel de kraf
Los extremos de los tubos que estén expuestos, se tapan externamente

con algodón, amarrándolos con hilo.
Antes de iniciar el cultivo se lavan las manos con etanol 70%, se ponen
cubrebocas y se sanea la mesa con etanol 70%. Se coloca el fermentador
entre mecheros y sobre la mesa saneada, se vacía la solución de
componentes orgánicos estéril al fermentador, a través del orificio central
113
con rosca, con ayuda de un embudo estéril. Luego se retira el embudo y
se adiciona el K2SO3 y se coloca de nuevo el tapón de algodón.
Actividad: Fermentación y muestreo
Estructura
Antes de inocular el sistema de fermentación se debe verificar la pureza
del inóculo, por medio de la observación al microscopio de un frotis
teñido con tinción simple de azul de metileno al 0.5 %
Los tubos y el frasco se etiquetan previamente indicando los siguientes

datos: Número de la fermentación, número del equipo, fecha, hora del
muestreo y nombre de la persona que muestreó.
La fermentación inicia cuando se inocula asépticamente el mosto con 35

ml del cultivo de 48 h de Saccharomyces cerevisiae, con una pipeta
estéril de 10 ml, a través del orificio central con rosca con ayuda de un
embudo estéril. Se flamea la abertura con un mechero bunsen y se coloca
asépticamente el tapón de acero inoxidable con rosca. Se anota la fecha y
la hora exactas del inicio de la fermentación. En este momento se conecta
asépticamente el tubo flexible estéril de 45 cm en la salida para toma de
muestra, y se cierra a 5 cm del borde de la manguera con una pinza Mohr
con rosca. Se mezcla el mosto inoculado sobre una parrilla de agitación y
se toma una alícuota de 15 ml con una jeringa estéril en condiciones
asépticas, absorbiendo por debajo del nivel del fermentador. De esta
muestra, 3 ml se vierten en un tubo de ensayo con tapón roscado estéril,
y 12 ml se vierten en un frasco de muestreo.
Después del muestreo se cierra el tubo con la pinza Mohr, se sacude el

tubo y se sumerge en una solución de Na 2SO4 (50 mg L-1) contenida en un
tubo de cultivo mediano sin rosca, durante 10 minutos.
El fermentador se coloca en un baño maría con temperatura controlada,

muestreando posteriormente en condiciones asépticas. Se anota primero
la apariencia del mosto: color, turbidez, intensidad de burbujeo,
formación de natas y/o sedimentos. Posteriormente el mosto se agita
sobre una parrilla eléctrica a temperatura ambiente, se toman 15 ml que
se vierten en el frasco de muestreo y en el tubo, como se indicó
previamente, anotando la hora exacta. Las muestras se congelan.
5a Actividad: Análisis de la fermentación
Estructura
Se determinarán los siguientes parámetros en cada muestra:
Conteo diferencial de levaduras viables y no viables *

Azúcares reductores *
Grado alcohólico *
IV. RESULTADOS
Estructura
El informe debe constar de una carátula con los datos de la práctica y del
equipo. En la segunda página se escribe el objetivo de la práctica y la
sección de Métodos, en donde se indican las temperaturas de
fermentación asignadas a cada equipo que se reporta. También debe
incluirse en esta sección cualquier actividad que haya sido realizada de
manera diferente a lo indicado en el protocolo.
Cuadros de resultados
Cuadros de resultados No. 1 y 2. Se presentan los resultados directos de

los análisis de azúcares reductores, de grado alcohólico y de conteo de
levaduras viables y no viables de todas las muestra y de cada condición
de cultivo (T°C), indicando además las alícuotas y diluciones manejadas
en cada análisis.
Cuadro de resultados No. 3. Anotar los datos de la curva estándar que se

realizó en el análisis de los azúcares reductores, junto con la ecuación de
la curva ajustada y el coeficiente de regresión.
Cuadros de resultados No. 4 y 5. Se anotan los datos calculados de cada

condición de cultivo (T°C): resultados de los conteos de levaduras viables
y totales (viables + no-viables) en unidades de log (# levaduras/ml) y ln
(# levaduras/ml); concentración de azúcares reductores en % (p/v), y
contenido alcohólico, en grados Gay-Lussac (°G.L.) o en %, v/v.
115
Gráficas
Utilizando los datos calculados de los Cuadros de resultados No. 4 y 5 se

realizarán las gráficas indicadas en los siguientes incisos, con ayuda del
programa de computación Excel, para graficar los datos.
En cada figura se escribirá el titulo con el número correspondiente, los

parámetros que se presentan, el factor que se estudia (T°C), el
microorganismo y el tipo de medio. Cada curva y coordenada quedará
bien identificado y con unidades.
Gráficas por cultivo. Se presentará una gráfica por cada cultivo

realizado a diferente temperatura (Figs. 1 y 2), indicando en abcisas el
tiempo en h; y en las ordenadas, el contenido alcohólico en °GL, la
concentración de azúcares reductores en % (p/v), y el conteo de
levaduras totales en log (# m.o./ml), o ln (# m.o./ml).
Gráfica de crecimiento microbiano. Se presentarán en una sola figura

(Fig. 3), las curvas de crecimiento microbiano contra tiempo, de los
cultivos provenientes de dos niveles de temperatura. En esta gráfica se
evaluará el efecto de la temperatura en cada fase de las curvas de
crecimiento microbiano.
Gráficas de consumo de azúcares reductores. De manera similar a las

anteriores, se presentará en una sola figura (Fig. 4) las curvas de
contenido de azúcares reductores (%) contra el tiempo de las dos
fermentaciones.
Gráficas de producción de alcohol. En una sola figura (Fig. 5) se

presentarán las curvas de formación de alcohol de las dos
fermentaciones, indicando en las abcisas el tiempo en h, y en las
ordenadas el contenido alcohólico en °G.L.
Cálculo de los parámetros cinéticos
Estos se llevarán a cabo después de calcular las ecuaciones ajustadas de

línea recta en cada cultivo, utilizando solo los datos que corresponden a
la fase exponencial de los Cuadros de resultados No. 4 y 5. Las
ecuaciones ajustadas y los parámetros cinéticos que se indican a
continuación se escribirán en el Cuadro No. 6.
Tasas de rendimiento. Tomando los datos máximos y mínimos de los

parámetros de cada cultivo, se calcularán las tasas de rendimiento de
producto con respecto a sustrato, de biomasa con respecto a sustrato y
de producto con respecto a biomasa.
Parámetros de velocidad del proceso. Con los datos ajustados de la

fase exponencial de las curvas de levaduras viables se calculará la
velocidad específica de crecimiento microbiano. Con datos obtenidos en
el mismo intervalo de tiempo, se calcularán las velocidades específicas de
consumo de sustrato y de formación de producto (valores ajustados). En
base a un análisis de la gráfica de producción de alcohol se calcularán los
valores de productividad máxima y productividad total de etanol. Cada
equipo calculará los parámetros de su cultivo, y se intercambiarán los
resultados con el equipo que trabajo a diferente temperatura.
V. DISCUSION
Analizando los resultados de los Cuadros No. 4 y 5 y de las Figs. 1 y 2 se

pueden diferenciar las fases de las curvas de crecimiento microbiano y
las fases de producción, con especial énfasis en la fase exponencial de
crecimiento y la tropofase para etanol. En base a estas observaciones se
decidirá a qué modelo de formación de producto pertenece cada cultivo.
Las curvas de las Figs. 3 y 4 y los parámetros cinéticos calculados se

analizarán para determinar el efecto de la temperatura en las velocidades
de consumo del substrato y formación de etanol, y sus rendimientos. Se
compararán los resultados experimentales con los de la bibliografía.
VI. CONCLUSIONES
Declare brevemente si se cumplieron los objetivos planteados al inicio de

este protocolo y los aspectos más importantes aprendidos en esta
práctica
117
15
PRÁCTICA
DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION
FORMATIVA)
119
FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS
USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS
1.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 10%

PREPARACIÓN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua
destilada
2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%

PREPARACIÓN
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100 ml
3.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE GRAM

A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FÓRMULA:
Cristal violeta 2.0 gr
Etanol al 95% 20 ml
Oxalato de amonio 0.8 gr
Agua destilada 80 ml
PREPARACIÓN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio 10.0 gr
Agua destilada 20.0 ml
Yodo metálico 5.0 gr
Etanol, aforar a 100.0ml
PREPARACIÓN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metálico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ACETONA
FORMULA
Acetona 1 volumen
Etanol al 95% 2 volúmenes
D) COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina
0.5 gr
Agua destilada
100.0 ml
PREPARACIÓN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, después
aforara a 100 ml con más
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE ZIEHL- NEELSEN

A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
FORMULA:
Fucsina básica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIÓN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en baño a
ebullición
2.- Añadir la fucsina básica y disolver
3.- Añadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solución a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO
FORMULA
Ácido clorhídrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIÓN
Adicionar el ácido clorhídrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml
5.- MEZCLA CRÓMICA

Dicromatode potasio 20.0 gr
Ácido sulfúrico concentrado 20.0 ml.
Aguadestilada 250.0 ml.
121
BIBLIOGRAFÍA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Práctico de Microbiología General.

Canoabo
CARPENTER, Philip. 1969. Microbiología. 2da Edición. Editorial

Interamericana, S.H. México.
PELCZAR. 1990. Microbiología. 2da Edición. Editorial. Mc Graw-Hill. México.
WALTER, W.G. 1980. Introducción a la Microbiología. Editorial

Continental. México.
GRASSINI, Luis. 1967. Microbiología Agraria. UCV-Facultad de Agronomía.

Caracas-Venezuela.
BLAIR, J. 1970. Manual Clínico de Microbiología. Bethesda. AMER-
Atlas, Ronald M. “Ecología Microbiana y Microbiología ambiental”.

Pearson, España, 2006.
FARRAS, Ramón Parés J. “Bioquímica de los Microorganismos”. Ed.

Reverté, S.A., España, 1997.
INGRAHAM, John L. “Introducción a la Microbiología”. Ed. Reverté, S.A.,

España, 2000.
JAY, James M. “Microbiología Moderna de los Alimentos”, Ed. Acribia, S.A.

España, 1992.
LEVEAU, J.Y. “Microbiología Industrial: Los microorganismos de interés

industrial”. Ed. Acribia, S.A. España, 2000.
OKAFOR, Nduka. “Modern Industrial Microbiology and Biotechnology”

Science Publishers, United States of America, 2007.
PRESCOTT, Lansing M. “Microbiología”. McGraw – Hill. Interamericana,

España 1999.
TORTORA Gerard J. “Introducción a la Microbiología”. Ed. Acribia, S.A.

España, 2002.
WAITES, Michael J. “Industrial Microbiology: An Introduction”, Blackwell

Science Ltd, Oxford, 2001.
WARD, Owen P. “Biotecnología de la Fermentación”, Ed. Acribia, S.A. España,

1991.
CAMACHO, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009.

Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de
Química, UNAM. México.
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos
troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados.
Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la
estimación de la densidad microbiana por la técnica de número más
probable.
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la

técnica del número mas probable, detección de coliformes totales,
coliformes fecales y Escherichia coli por el número mas probable”
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. ed.

Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.

2006, pp 935-936
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica
de Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and

Escherichia coli as Quality and Safety Indicators”. In: Compendium
of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs
F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

“Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
123

Practicasmicro Indust.2018

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Practicasmicro Indust.2018

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

DATOS DEL ALUMNO

Grupo………………………………………………………. Turno Calificación………………….

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es

Los microorganismos han demostrado ser un enorme

Los microorganismos son objetos de manipulaciones

El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para

FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia,

Cada sesión de laboratorio o práctica deberá tomarse como si se tratara de una

La prueba versará sobre los siguientes temas:

- Resumen del marco teórico del tema.

- Métodos a emplear y su relación con los objetivos planteados.

II. Resultados. Como producto de la observación posiblemente tendrá esquemas o

Consideraciones y ejemplos de cómo citar en un texto:

Al escribir la referencia completa de una obra citada en el texto, se debe escribir el

 Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio

II. MARCO TEORICO

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD

2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR

2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

2. Parte óptica del Microscopio:

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO

Diámetro del campo microscópico

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.

1) ¿Señale las partes de un microscopio óptico

1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.

II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS

Grafique la Observación y Resultados

Hay 2 tipos de técnicas:

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar,

Grafique la Observación y Resultados

OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio

1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.

Grafique la Observación y Resultados

- ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?

- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes

II. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas,

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos

b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las

d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.

CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para

c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIÓN DE UN FROTIS

3.1.PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparación del Frotis