Professional Documents
Culture Documents
al medicamentelor
Analiza
medicamentului
Generalităţi
Metodele controlului 2
- punct de solidificare
- titrare amperometrică
- titrare potenţiometrică
- fluorimetrie
- spectrometrie de emisie atomică (AES, ICP etc.)
- spectrometrie de absorbţie atomică (AAS)
- spectrofotometrie de absorbţie în infraroşu (IR)
- spectrofotometrie de absorbţie în ultraviolet şi vizibil (UV, VIS)
- cromatografie pe hârtie
- cromatografie pe strat subţire (TLC)
7
Metode fizice şi fizico-chimice de control
prezentate în Farmacopeea Europeană
Prelevarea probelor
în vederea efectuării
controlului analitic
15
Prelevarea probelor
« Probele prelevate pentru identificarea calitativă şi determinarea
cantitativă a componentelor produselor farmaceutice trebuie să constituie
o imagine semnificativă a lotului sau a seriei analizate » (FR-X)
Noţiuni definite şi utilizate în FR-X, referitoare la prelevare:
- lot (o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară, din
care se obţin una sau mai multe serii de produse)
- serie (totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii
identice, într-un singur ciclu de operaţii)
- recipient (conţine unităţile de produs care constituie o serie,
ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.)
- ambalaj (conţine recipientele grupate adecvat)
FR-X formulează reguli privind prelevarea din:
- depozit
- din farmacii
- din industrie
- din puncte farmaceutice
16
Prelevarea probelor
Cantitatea prelevată:
De 3 ori cea necesară pentru analiză
- 2 părti : proba propriu-zisă
- 1 parte : contraprobă
Cantitatea prelevată:
De 2 ori cea necesară pentru analiză
- 1 parte : proba propriu-zisă
- 1 parte : contraprobă
Metode de control al
proprietăţilor fizice
simple
23
Controlul culorii
Control vizual (Farmacopeea Română)
Etaloane de culoare
- soluţie etalon de cobalt (6,5 % CoCl2 în HCl 1 %);
- soluţie etalon de fier (5 % FeCl3 în HCl 1 %);
- soluţie etalon de cupru (6,5 % CuSO4 în HCl 1%);
- soluţie etalon cu dicromat de potasiu (0,55 % K2Cr2O7
în H2SO4 1 %).
24
Controlul culorii
Control optic (în special pentru probe solide)
- determinarea componentelor de culori de bază;
- determinarea spectrului de reflexie
Culoarea unei suprafeţe se poate exprima (cu aproximaţie
bună) ca un amestec, realizat în raport corespunzător, de trei
culori de bază. Prin amestecarea celor trei culori de bază se
poate obţine o mulţime de nuanţe diferite. Cele trei culori de
bază se pot stabili convenţional.
Unul din convenţii (sistemul R.G.B.) se bazează pe culorile:
roşu ("Red", 700,0 nm), verde ("Green", 546,1 nm) şi albastru
("Blue", 435,8 nm).
Există şi alte sisteme, bazate pe alte nuanţe de bază, de
exemplu sistemul C.I.E.
Determinarea raportului de amestecare a culorilor de bază
se realizează cu aparate optice speciale.
25
Solubilitatea
Densitatea relativă . . .
. . . raportul dintre masa unui volum de substanţă şi masa unui
volum egal de apă, la 20 oC ( d 2020 ) sau la 4 oC ( 20 ) (mărimi
d4
adimensionale) o
m (subst. 20 C)
20
d 20
m (apã 20 oC)
masã
20
volum (20 oC)
27
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru)
Proba lichida
m0 = masa picnometrului gol ;
mr = masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (r)
m = masa picnometrului umplut cu proba lichida () ; V = volumul picnometrului
dr = densitatea relativa a lichidului in raport cu lichidul de referinta
m r m0 m m0
V
r
m m0 m m0
r ; dr
m r m0 r m r m 0
28
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru)
Proba solida
m0 = masa picnometrului gol
mR = masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (R)
mS = masa picnometrului cu proba solida introdusa
mSR = masa picnometrului continand proba solida si umplut cu
lichidul de referinta
= densitatea absoluta a probei solide
dR = densitatea relativa a probei solide in raport cu lichidul de
referinta
29
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru) – Proba solida
VS mS m 0
VL R mSR m 0
m R m0
V VS + VL
R
mS m 0
R
m R + mS mSR m 0
mS m 0
dR
R m R + mS mSR m 0
30
Densitatea
Masurarea densitatii lichidelor (cu balanta Mohr-Westphal)
31
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)
. . . proprietatea substanţelor optic active de a roti planul de
polarizare al luminii plan-polarizate. Activitatea optică se datorează
asimetriei care se poate manifesta la nivelul:
- molecular (în stare solidă, în soluţie, în stare gazoasă);
- supramolecular (în stare cristalină sau în soluţii de
complecşi intermoleculari)
Asimetrie la nivel molecular:
- cu un (sau mai mulţi) atomi cu configuraţie spaţială "chirală"
("centru de chiralitate") ( în special în cazul atomului Csp3 )
- asimetrie moleculară globală (fără un centru bine definit de
chiralitate)
- asimetrie alenică
- asimetrie spiranică la compuşi organici
- asimetrie atropică
Putere de rotaţie 32
(a planului de polarizare al luminii plan-polarizate)
Plan de simetrie
(oglindire)
W W
Y C Z Z C Y
X X
Omeprazol
(amestec racemic) Esomeprazol
Pantoprazol Rabeprazol
Putere de rotaţie 34
(a planului de polarizare al luminii plan-polarizate)
Omeprazol
atomul de sulf
35
Planul de oscilatie al vectorilor intensitatii de camp
electric si magnetic la o radiatie plan-polarizata
Ansamblul de vectori intensitate
camp electric-intensitate camp
magnetic este chiral
Dextrogir Levogir
(D) (L)
a [a]D c d
20
Pentru soluţii :
a [a]D d
20
Pentru lichide :
38
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)
În unităţi SI
a(rad)
[a]SI ; [a ] rad m 2 kg 1
d(m) c(kg / m )
3 SI
α(rad)
[α]SI ; [α ] rad m 2 kg 1
d(m) ρ(kg/m )
3 SI
În unităţi tolerate
a(grade)
[a ] ; [a] grade cm3 dm 1 g 1
d(dm) c(g / cm )
3
a(grade)
[a ] ; [a] grade cm3 dm 1g 1
d(dm) (g / cm )
3
39
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)
+
.
2Cl H2O
q B1 + 1
g 2
M = 355,29 mol 2
46
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
2,5 mol
(C ) B1 0,07036
0,1 355,29 l
q NaCl + 1
Pentru clorura de sodiu : M NaCl 58,45 ; 1,5
2
Rezultă :
m NaCl 1,5
0,07036 2 + 0,2308
58,45 0,5
m NaCl 1,7550 g
47
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
q glucoza + 1
M glucoza 180,16 ; 1
2
m glucozã
0,07036 2 + 0,2308
180,16 0,5
m glucozã 8,1144 g
48
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
Exemplu
Să se determine masa de clorură de sodiu ( mNaCl ) aflată în 250 ml
soluţie izotonică cu următoarea compoziţie impusă :
clorhidrat de morfină . . . . . . . . . . 10 g
bromhidrat de scopolamină . . . . . 0,2 g
clorhidrat de efedrină . . . . . . . . . . 15,0 g
clorură de sodiu . . . . . . . . . . . . . . . 4.( mNaCl ) g
apă distilată ad . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml
Rezolvare
Mase moleculare : Concentraţiile molare impuse :
clorhidrat de morfină : 375,84 clorhidrat de morfină : 0,02661
bromhidrat de scopolamină : 438,32 bromhidrat de scopolamină : 0,00046
cloridrat de efedrină : 201,69 clorhidrat de efedrină : 0,07437
clorura de sodiu: 58,45
49
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
m NaCl 1,5
0,2308 ; m NaCl 0,89858 0,9
58,4 0,1
Metode de separare
aplicate în controlul
analitic al
medicamentelor
52
Metode de separare
Acidulare cu 10
5
H2SO4 dil. Faza H2O
7
Faza Et2O
Extr. 3x20 ml Et2O Faza H2O
Fractia B
6 (Reziduu)
56
Schema de separare dupa Stas - Otto
13
Faza Et2O
Faza H2O
Fractia D
Alcalinizare cu NaOH
11 Extr. 3x20 ml Et2O 12
3M (pH 11-14)
Faza H2O
16 15
Faza Et2O Extr. 3x20 ml cu amestec Neutralizare cu H2SO4 dil.
14
Fractia E CHCl3 si i-PrOH (3 + 1) + NH4OH 6M (pH 11-14)
Faza H2O
17
Fractia F
57
Rp. nitrofuranoza (0,23 %), glicerina, alcool cetilic,
1
polietilenglicol, Me-paraben, Pr-paraben
Et2O 11
10 Faza Et2O
8 Extractie Me-paraben
Pr-paraben
Faza H2O
nitrofuranoza
12
glicerina
(uree)
Suport cromatografic:
- hârtie poroasă (cromatografie pe hârtie)
- strat subţire depus pe un suport plan (TLC)
- coloană umplută cu faza staţionară
- tub capilar cu suprafaţa internă acoperită cu faza staţionară
61
Clasificarea metodelor cromatografice
Criterii de clasificare:
1) după starea de agregare a fazelor mobilă (FM) şi
staţionară (FS)
2) după polaritatea fazelor (FM şi FS)
3) după mecanismul de interacţiune a componentelor
probei cu FM şi FS
Exemple
xi
(R F )i 1 ; (hR F )i (R F )i 100
xF
Literatura de specialitate contine
(R M )i lg 1 1 numeroase valori RF , RM si hRF
(R ) pentru substante farmaceutice,
F i
masurate in conditii de executie
specificate.
71
- prin distanţa (xi) parcursă de componenta " i " într-un interval de timp dat
(comun pentru toate componente) - în special la cromatografia în strat subţire
- prin timpul necesar (ti - timp de retenţie al componentei " i ") pentru parcurgerea
lungimii L a coloanei cromatografice
73
Cromatografie în strat subţire cu zona de preconcentrare
74
Ibuprofen (1 %) ; Rf = 0,57
Hexobarbital (5 %) ; Rf = 0,41
Pentobarbital (1 %) ; Rf = 0,26
Fenobarbital (1 %) ; Rf = 0,18
START (0 mm)
77
Cromatografia cu coloana (umpluta sau capilara)
2
1 t t 0
2 σ i
C i (t) f(Q v , σ i , m i ) e
mi
La HPLC : f(Q v , σ i , m i )
2 π Qv σi
Forma şi caracteristicile unui “peak” cromatografic 79
Δt inf 2 σ
Δt inf 0,850 Δt 0,5
Δt b 4 σ
Δt b 1,700 Δt 0,5
Δt e 2 2 σ
Δt e 1,201 Δt 0,5
A C(t ) dt 2 Cmax 1,065 t 0,5 Cmax
80
Abaterea de la liniaritate a izotermei de retentie cromatografica
81
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic
Caracterizarea performanţei în raport cu componenta ” i ” :
numărul de talere teoretice, Ni , în raport cu componenta
respectivă.
2
ti
2 2
ti ti
N i 5,55 8
i (t i )0,5 (t i )e
2 2
ti ti
16 4
(t i ) b (t i )int
83
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic
“ N ” depinde de :
- natura FM şi FS
- temperatura de lucru
- viteza liniară de deplasare a FM
- lungimea ( L ) parcursă de componente
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic 84
A,B,C
L B
H A + + Cu constante caracteristice
N u sistemului cromatografic
B
u optim
C
H minim A + 2 B C
85
Indici de retenţie
Timpul de retenţie al unei componente depinde :
- identitatea chimică a componentei respective
- natura FS
- debitul de gaz purtător
- temperatura coloanei cromatografice
- caracteristicile geometrice ale coloanei şi umpluturii
Scop : a se defini mărimi alternative, care . . .
- să depindă semnificativ de identitatea chimică a componentei
respective, . . . dar . . .
- să depindă în măsură minimă de ceilalţi factori
indici de retenţie în locul timpilor de retenţie
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 93
Indici de retenţie
- indice Kováts ( I ) ( E. Kováts , 1958 )
- indice liniar de retenţie ( J )
- - - - etc - - -
Indice Kováts
Observaţie : în seria omoloagă a n-alcanilor, logaritmul timpilor de
retentie reduşi ai membrilor seriei variază liniar cu numărul atomilor
de carbon ( n ) din molecula alcanului, dacă măsurările sunt făcute în
condiţii identice de lucru
S-a impus (arbitrar) : indicele Kováts al unui n-alcan, cu " n "
atomi de carbon în moleculă, să aibă valoarea:
Iz = 100.n
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 94
Kováts Ervin
ervin.kovats@epfl.ch
95
Cromatografie în faza gazoasă ( indici de retentie )
AD ED
AB BC
98
AD ED
AB BC
Indice Kováts
Exerciţiu
Într-o coloană gazcromatografică se injectează un amestec care
conţine n-heptan (C7H16), n-octan (C8H18), n-nonan (C9H20),
n-decan (C10H22), fenacetină. În condiţiile separării indicele
Kováts al fenacetinei este 1250. Semnalul cromatografic al
fenacetinei este situat . . .
a) . . . înaintea "picului" heptanului
b) . . . între "picurile" heptanului şi octanului
c) . . . între "picurile" octanului şi nonanului
d) . . . între "picurile" nonanului şi decanului
e) . . . după "picul" decanului
Răspuns : e
100
Indice Kováts al stimulantilor SNC la diferite coloane
Faza staţionară
Stimulant al SNC Carbowax 20M/KOH Apiezon-L/KOH
150 oC 190 oC 150 oC 190 oC
Tranilcipromină 1852 1915 1248 1271
Nicotină 1876 1926 1353 1392
Clorfentermină 1916 1950 1380 1422
Modalină 1969 2015 1473 1499
Cipenamină 1976 2022 1419 1456
Fendimetrazină 2009 2057 1475 1505
N-metilefedrină 2022 2108 1405 1437
Efedrină 2072 2179 1358 1400
Pseudoefedrină 2191 2217 1362 1398
Fenilpropanolamină 2212 2295 1339 1369
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie ) 102
Indici de retenţie
Exerciţiu
Într-o coloană gazcromatografică se injectează un amestec care
conţine metan (CH4), n-nonan (C9H20), n-decan (C10H22), şi tri-n-
propilamină. Componentele se eluează la următorii timpi de retenţie :
nonan la 1,8 minute , decan la 6,6 minute , tri-n-propilamina la 3,4
minute , metan (componentă neretardată) la 0,2 minute. Identificaţi
domeniile de valori în care se incadrează indicele Kováts (I) şi
indicele de retenţie liniar (J) pentru tri-n-propilamină.
a) I < 800 şi J < 8,250
b) I : între 800 - 900 şi J = 8,533
c) I : între 900 - 1000 şi J = 9,333
d) I : între 1000 - 1100 şi J = 8,250
e) I > 1100 şi J = 8,533 Răspuns : c
104
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
B
IT A +
T+C
SI – substanta de interes
IN – ingredienti
SD – semnal detector
107
Analiza cantitativa cu etalon intern (II)
m EI k EI A*T k EI A*P
mSI k SI A T k SI A P
k SI A P
mSI m EI
k EI A*P
SI – substanta de interes
IN – ingredienti
EI – etalon intern
SD – semnal detector
108
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Modalităţi de analiză cantitativă (etalon intern)
Prin folosirea unui etalon intern, ales adecvat, se pot compensa unele erori
(pierderi) de analiză, efectuate la operaţiile de prelucrare prealabilă a probei
(operaţii de extracţii, purificări, diluări, derivatizări, concentrări etc.).
Cerinţe pentru un etalon intern bun:
- să prezinte proprietăţi asemănătoare cu componentele de interes
din probă (să fie afectate de aceleaşi tipuri de erori la operaţiile de
prelucrare premergătoare injectării în coloana gazcromatografică)
- să nu interacţioneze chimic cu nici una din componentele probei în
condiţiile de prelucrare şi separare gazcromatografică
- să genereze "peak" cromatografic separat clar de "peak"-urile tuturor
componentelor din probă.
Caz particular de utilizare a unui etalon intern: metoda adaosurilor
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 109
Modalităţi de analiză cantitativă
c) Metoda adaosurilor
Se recomandă în acele cazuri în care prezenţa unei componente (de interes
sau nu) modifică sensibilitatea de detectare a unei componente de interes
("efect de matrice") sau eficienţa operaţiilor de prelucrare prealabilă a
probei.
Esenţa metodei : Se adaugă probei cantităţi cunoscute din componenta de
interes, afectată de efectul de matrice şi se injectează amestecurile în
coloana GC. Se reprezintă grafic semnalul detectorului (aria), asociat cu
componenta de interes dependenţă liniară.
Se extrapolează dreapta până ce intersectează axa pe
care sunt reprezentate cantităţile adăugate. Acest punct de intersecţie se
găseşte pe semiaxa negativă a axei cantităţilor adăugate. Cantitatea
corespunzătoare segmentului definit de punctul de intersecţie şi originea
axelor este egală cu cantitatea de componentă de interes prezentă în proba
originală.
110
Modalităţi de analiză cantitativă (metoda adaosurilor)
Condiţie necesară : posibilitatea măsurării unui semnal de detector care se
datorează exclusiv componentei de interes ("peak"-ul componentei de
interes să fie separat satisfăcător de "peak"-urile altor componente din
probă) (EM=efect de matrice).
111
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare : transformarea chimică, în condiţii controlate, a
componentelor probei înainte de injectarea probei
în gazcromatograf
Motivaţia:
- prin derivatizarea grupelor funcţionale polare molecule cu
polaritatea diminuată interacţiune mai intensă cu faza staţionară
(frecvent) nepolară accentuarea eficienţei de separare
- prin derivatizare creşte volatilitatea componentelor volatilizare la
temperaturi mai mici scade pericolul descompunerii termice
şi creşte eficienţa de separare a coloanei GC
- prin derivatizarea selectivă a unor grupe funcţionale se obţin deseori
informaţii suplimentare despre structura moleculară a componentelor
112
(CTMS) (HMDS)
114
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
b) cu t-butil-dimetil-clorsilan
Grupe funcţionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH
[imidazol]
R-OH +
DMFA ; - HCl
Temperatura camerei
Exemplu :
+ R-OH R-O-Si(CH3)3 +
( TMSA )
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 118
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
e) cu (izopropeniloxi)-trimetil-silan (IPOTMS)
- IPOTMS este un reactiv asimilat mai recent în GC
- IPOTMS este folosit cu succes mai ales pentru silanizarea
acizilor carboxilici, alcoolilor alifatici şi fenolilor
- atât agentul (IPOTMS) cât şi produsul secundar de
reacţie sunt volatili se recomandă pentru
silanizarea compuşilor hidroxilici volatili (excesul de
IPOTMS şi acetona formată se îndepărtează uşor)
119
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
f) cu N-(trimetil-silil)-dimetilamină (TMSDMA)
- TMSDMA este utilizat mai ales pentru silanizarea aminelor
şi aminoacizilor
- în prezenţa (CTMS) (catalizator) se poate folosi şi pentru
silanizarea grupelor hidroxilice
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 120
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
g) cu N-(trimetilsilil)-imidazol (TMSIM)
c) cu dialchilacetalii N,N-dimetilformamidei
În gazcromatografie a fost utililzat prima dată de Horning
(derivatizarea acizilor graşi şi a amino-acizilor)
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 126
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
d) cu acizi alchilboronici
Domeniu de utilizare : compuşi care conţin în moleculă două sau mai multe
grupe funcţionale (aminoacizi, glucide, catecolamine), dar şi în cazurile
probelor cu acizi graşi, prostaglandine, sfingozine, steroizi etc.
127
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 128
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
1) Benzocaine
2) Lidocaine
3) Procaine
4) Oxyprocaine
5) Tetracaine
6) Oxybuprocaine
7) Cinchocaine
Separation of TMS-derivatives of steroids (capillary GC) 132
1) androsterone ; 2) etiocolanolone ; 3) dehydro-epiandrosterone ; 4) dS-androstene-3b, 17b-
diol ; 5) 11-keto-etiocolanolone; 6) oestradiol ; 7) 11-hydroxy androsterone ; 8) 11-hydroxy-
etiocolanolone ; 9) epiprednonalone ; 10) 16-a-OH-dehydro-epiandrosterone ; 11) allopregna-
nediol ; 12) pregnanediol ; 13) pregnanetriol ; 14) 16-keto-androstenediol ; 15) dS-androste-
ne-3b,16a, 17b-triol ; 16) & 17) by-products ; 18) 17-keto-pregnanetriol ; 19) 16a-OH-preg-
nenolone ; 20) pregnene-3b, 17a, 20a-triol ; 21) tetrahydrocortisone ; 22) tetrahydrodioctyl-
phtalate ; 23) tetrahydrocorticosterone ; 24) tetrahydrocortisol ; 25) allotetrahydrocortisol ;
26) a-cortolone ; 27) b-cortolone ; 28) choloesterol ;
29) a-cortol ; 30) methyldesoxycholate (I.S.)
Column: 25 m x 0.22 mm
SF: CP-Sil 5 (0.12 mm)
T: 100 oC to 210 oC in 25 min
then 1.5 oC/min to 265 oC
Carrier gas: He
Detector: FID
133
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografia lichidă de
performanţă, la presiune
înaltă (HPLC)
( Horváth Csaba - părintele
metodei analitice HPLC )
1966 – realizarea tehnicii
HPLC
1970 – recunosterea
potentialului analitic deosebit
al fazei stationare inverse
(nepolare)
Horváth Csaba
(1930 - 2004)
141
Cromatografie cu faza mobilă lichidă - HPLC
Reprezentarea
schematică a unui
sistem HPLC
142
Cromatografie cu faza mobilă lichidă - HPLC
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 143
HPLC
Mărimi derivate caracteristice în HPLC
t t t0 – timpul de retenţie al
Factor de capacitate k 'i i 0
componentei neretardate
t0
k 'j
Factor de separare αi, j 1 ; ( k 'j k i' )
k i'
1,18 (t j t i )
Rezoluţie R i, j 0
Δt 0,5; j Δt 0,5;i
t 0,5;i reprezintă lăţimea "peak"-lui nr. " i " la semi-înălţime
(exprimata ca interval de timp)
144
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
HPLC
HPLC
150 - 250 oC
3 - 8 ore
+ HO-R
- H2O
+ H2N-R
+ SOCl2
- SO2 - HCl
- HCl
147
Conditii
anhidre
+
- HCl
Conditii
anhidre
+
- HCl
+ H2O
- HCl
+n
+ H2O
n
- (n+1) HCl
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 148
Gruparea Si-NH-R este stabilă la hidroliză însă cea mai stabilă grupare este
Si-O-Si-R . Faza staţionară modificată în această manieră, utilizată cel mai
frecvent, este aceea în care R este un rest octadecilic:
Si-O-Si(CH3)2-(CH2)17-CH3
Această fază staţionară este foarte nepolară.
Alte grupări legate de support :
Solvenţii utilizaţi cel mai des în HPLC cu fază inversă (hidrofobă) : tetrahidrofuran,
acetonitril, metanol, apă, soluţii tampon cu pH potrivit
În cazul FS polare (fază directă) nu se utilizează solvenţi polari (apa nici chiar în urme!)
deoarece poate dezactiva ireversibil FS (în special silicagelul nederivatizat)
152
Separarea HPLC a unor antibiotice
1) Amoxicilină
2) Benzilpenicilină
3) Feneticilină (sarea de sodiu)
4) Flucloxacilină (sarea de potasiu)
C
O COOH Faza staţionară : C18 (5 m, pori de 10 nm)
O
NH Faza mobilă : (A) tampon fosfat cu pH 7,0
Cl Cl (B) acetonitril : apă (9 : 1 ; v/v)
Detectare : 275 nm ; Debit : 1 ml/minut
Aceclofenac
timp A B
(min) (% v/v) (% v/v)
0-25 70 50 30 50
25-30 50 20 50 80
30-50 20 80
50-52 20 70 80 30
52-65 70 30
Analiza HPLC a purităţii Aceclofenacului ( Ph. E. ed. V ) 155
O
O COOH O O O C
C C R C O C O
O O O R N
NH NH NH Cl
Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl
(I) ( II ) ( III )
Aceclofenac (1) – (I) R : H
(2) – Aceclofenac
(3) – (II) R : -CH2-COOH
(4) – (II) R : -CH2-COO-
-CH2-COOH
(5) – (III)
(6) – (II) R : -CH3
(7) – (I) R : -CH3
(8) – (II) R : -C2H5
(9) – (I) R : -C2H5
(10) – (II) R : -CH2-C6H5
156
Determinarea selectiva a impuritatilor de acridona in
Carbamazepina prin suprimarea semnalului Carbamazepinei
(Carter)
157
Determinarea selectiva a impuritatilor de acridona (A)
in Carbamazepina (C) prin suprimarea semnalului
Carbamazepinei (Carter)
Coloana: 25x0,46 cm
FS: polara si chirala “Whelk-01”
FM: C6H14 + i-PrOH + Ac. acetic
(98:2:0,5)
Debit: 0,9 ml/min.
k1’ = 1,13 ; k2’ = 1,40 ; a12 = 1,24
162
Separarea enantiomerilor Colana ”Chiurobiotic T” (FS nepolara)
Clortalidonei F.M.: MeOH + H2O (20:80)
Debit: 1 ml/min
Temp.: 50 oC
Separarea enantiomerilor Naproxenului 163
dintr-un amestec neechimolar (R : S = 3 : 7)
Coloana (25x0,46 cm) cu FS polara (S,S)-ULMO
FM: C7H16 + PrOH (90:10) + 0,1 % acid trifluoracetic
kR’ = 1,54 ; kS’ = 2,065 ; aRS = 1,34
164
Rezoluţia enantiomerilor Colana ”Chiurobiotic T” (FS nepolara)
Bendrofluometazidei F.M.: MeOH + H2O (20:80)
Debit: 1 ml/min
Temp.: 50 oC
165
Separarea enantiomerilor şi
diastereoizomerilor Bemetizidei Coloana: “Chiracel OD-RH”
FM: acetonitril + apa (35:65)
Temperatura: 25 oC
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 166
VT > V > V0
VM > V > Vm
Vμ V Vμ V Vμ V
Kμ 0 ; (K d )μ 0 0
V V VT V
0 pori 0
Vpori reprezintă volumul fazei staţionare
Separarea gel-cromatografică
a unor enzime
1: glutamat dehidrogenaza
(290.000 Da);
2: lactat dehidrogenaza
(140.000 Da);
3: enolaz kinaza (67.000 Da);
4: adenilat kinaza (32.000);
5: citocrom C (12.400)
175
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
1: convulxină; 2: gyroxină;
3: crotoxină; 4: crotamină
176
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
Separarea proteinelor prin
cromatografie de gel-filtrare
1. IgM de şoarece
(M = 900 kDa);
2. Tiroglobulină bovină
(M = 670 kDa);
3. b-amilază din cartofi
(M = 200 kDa);
4. Seralbumină bovină
(M = 67 kDa);
5. Albumină aviară
(M = 45 kDa)
6. Ribonucleză bovină
(M = 13,7 kDa);
7. Azidă de sodiu
Gel: Dextran (coloana ZORBAX FG-250 (M = 0,067 kDa)
Eluent: NaCl (130 mM) + Na2HPO4 (50 mM) ; pH: 7,0 ; Debit: 1 ml/min.
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 177
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
Cromatogramele suprapuse
ale dextranilor având mase
moleculare diferite.
1. Dextran-50 (43,5 kDa)
2. Dextran-25 (21,4 kDa)
3. Dextran-12 (9,98 kDa)
4. Dextran-5 (44,4 kDa)
5. Dextran-1 (1,08 kDa)
179
Faza staţionară :
răşini (stare solidă) în formă de particule, care posedă pe suprafaţa lor
grupări chimice ionizabile, legate chimic ( –SO3H ; –PO3H2 ;
–NH2 ; –NR2 etc.). Grupările pot schimba starea lor de ionizare în funcţie
de pH-ul sau tăria ionică a fazei mobile.
Mecanism de interacţiune :
- interacţiuni electrostatice între speciile ionice din probă şi grupările
ionizate legate pe suprafaţa particulelor de răşină
- echilibre de schimb ionic
- efect salin primar şi interacţiuni de solvatare
181
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Răşinile schimbătoare de ioni se clasifică :
- după natura speciilor ionice schimbate
- cationiţi (schimbă cationi; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică negativă)
- anioniţi (schimbă anioni; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică pozitivă)
- după tăria acidă (bazică) a grupărilor ionice legate de răşină
- cationit / anionit tare
- cationit / anionit slab
• Un cationit este în " forma H " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin inter-
acţiuni electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este protonul, H+. Dacă
acest ion este dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de
exemplu cu Na+, atunci cationitul este în " forma Na ".
• Un anionit este în " forma OH " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin in-
-
teracţiuni electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este ionul OH . Dacă
acest ion este dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de
-
exemplu cu Cl , atunci anionitul este în " forma Cl ".
182
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Eluarea secvenţiala a
diferiţilor cationi sub
acţiunea progresiv
crescătoare a concentraţiei
eluentului (acidul HX)
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni 184
Exemplu :
Exemplu :
Un anionit este capabil să schimbe anionul reţinut în sfera de solva-tare
a grupei active (un cation cu sarcina electrică pozitivă) cu un alt anion,
aflat la concentraţie suficient de mare în mediul cu care răşina este în
contact.
Structura
Anionit Gruparea ionogenă
răşinii
Amberlit IRA-400 copolimer +
Amberlit IRA-410 stiren - DVB -N R3
-OH ; grupare amino pe
Amberlit IRA-4B fenolică
nucleu aromatic
copolimer
Amberlit IR-45
stiren - DVB -N(C3H7)2
Sephadex DEAE A-25 Dextran -O-CH2-CH2-N(C2H5)2
190
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Bazele organice sunt reţinute pe răşini cationice puternic acide. Eluarea lor
de pe răşină se realizează concomitent cu regenerarea răşinii folosind soluţii
diluate de acizi minerali.
195
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( II )
Bazele organice mai pot fi eluate cu soluţii diluate de hidroxid de sodiu
sau cu amoniac în solvenţi organici (ex. alcooli).
Separarea glucidelor ( I )
Proiectia Fischer
a moleculei de
Glucidele formeză cu acid glucoza
boric complecşi ionizabili
201
Separarea glucidelor ( II )
densitate de sarcina
1 2 3
AcO- OH- F-
1 2 3
- -
Cl- NO 3 NO2
1 2 3
2-
NO3- SO4 -
2
SO3
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni 200
densitate de sarcina
1 2 3
K+ Na+ Li+
1 2 3
2+ 3+
Ag+ Zn Al
205
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Metode de
spectrometrie optică
Spectrofotometrie
Generalităţi
208
VIS
NIR
IR Tranz. vibr.
FIR
- - - -
211
Spectrometrie optică
de absorbţie
Spectrofotometrie de
absorbţie în domeniul
ultraviolet şi vizibil
212
Esenţa metodelor :
Măsurarea variabilelor de energie ale unei radiaţii monocromatice
la trecerea acesteia printr-un strat de probă, în funcţie o variabilă
de undă a radiaţiei
Definirea mărimilor
(variabilelor) energetice
caracteristice absorbţiei
optice
F 0 (l )
k * (l ) c e (l ) ; A (l ) lg c d e (l )
F (l )
221
Relaţii cantitative între variabile de energie
şi datele de interes analitic
Conform relaţiei Bouguer - Lambert - Beer, absorbanţa este direct
proporţională cu concentraţia molară a speciei chimice răspunzătoare
de absorbţia optică.
Coeficientul e(l) se numeşte coeficient de absorbţie molară (sau
absorbtivitate molară) şi este o caracteristică a speciei chimice care
cauzează absorbţia optică ( depinde de l ).
ε (λ) n (λ)
A (λ) ~ c d 2 2
[n (λ) + 2]
În relaţia de mai sus n(l) este indicele de refracţie al probei la
lungimea de undă l.
în care:
A(l) este absorbanţa măsurată la lungimea de undă l ;
e(l) este absorbtivitatea molară a speciei absorbante la lungimea
de undă l ;
A11cm
%
(l ) este absorbţia specifică a speciei absorbante la
lungimea de undă l ;
d este grosimea de strat traversată de radiaţia electromagnetică ;
C este concentraţia molară în probă a speciei absorbante ;
C% este concentraţia procentuală (m/V) a speciei absorbante
Relaţii cantitative între variabile de energie 226
şi datele de interes analitic
Unităţi de măsură
(tolerate, utilizate în practica spectrofotometrică):
d tolerat
cm
mol mol Relaţie între absorbţia
C specifică şi absorbtivitatea
litru l
molară
gram g
C%
decilitru dl A11cm
%
M 10 e
litru l
e tolerat în care:
mol cm mol cm
M este masa moleculară a
decilitru dl
1%
A1cm speciei absorbante
tolerat gram cm g cm
227
Combinaţii de mărimi utilizate în controlul analitic al
medicamentelor
Raportul valorilor de absorbanţă, măsurate în spectrul unei specii chimice la
două lungimi de undă diferite l1 şi l2 , nu depinde (conform relaţiei BLB) de
concentraţia speciei chimice absorbante, deci se poate utiliza pentru stabilirea
identităţii chimice a componentei respective :
A(l1)
nu depinde de concentratie, (c), nici de grosimea de strat (d )
A (l 2 )
A (l1) A (l 2 ) c d [e (l1) e (l 2 )]
228
Analiza
spectrofotometrică
a amestecurilor
229
Analiza spectrofotometrică a amestecurilor
S S
A (l ) d e i (l ) Ci d [A1cm (l)] i [C%] i
1%
i 1 i 1
A12 e 2 (l1 ) A 21 e1 (l 2 )
r21 ; r12
A 22 e 2 (l 2 ) A11 e1 (l1 )
A(257 nm)
0,55
A(250 nm)
A(257 nm)
1,51 1,53
A(263,5 nm)
Teste de puritate 233
A(268 nm)
Ampicilină 1,10 1,30
A(266 nm)
A(361 nm)
Cianocobalamină 1,54 1,78
A(351 nm)
A(375 nm)
0,31 0,33
A(267 nm)
Riboflavină
A(444 nm)
0,36 0,39
A(267 nm)
Benzilpenicilină
sodică
A 0,18%
1cm 264 nm
A10cm
,18%
280 nm
0,72
234
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor
Trasarea spectrelor etalon : pentru tratare mai simpla a problemei se considera
cazul in care fiecare din cele N solutii etalon conţine câte o singura componenta a
amestecului, la concentraţii (Cet)n , ( n = 1, 2 , . . . , N ) cunoscute
L 2
F(A 0 , p n ) A(l) Â(l) ; (n 1,2,, N)
l 1
L 2
N
F(A 0 , p n ) A(l) A 0 p n A n (l) min
l 1 n 1
Condiţia de minim (necesară dar nu şi suficientă) :
F(A 0 , p n ) F(A 0 , p n )
0 ; 0 ; (n 1,2,.N)
A 0 p n
238
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor
N L L
A 0 L + p n A n (l ) A (l )
n 1 l 1 l 1
L N L L
A 0 A n* ( l ) + p n A n ( l ) A n* ( l ) A ( l ) A k* ( l )
l 1 n 1 l 1 l 1
(n* 1,2,, N)
Exemplu componentelor
Exemplu L = 17 ; N = 3 ; absorbanţe măsurate la 17 lungimi de undă 241
ε I (λ 2 )
R I (λ1, λ 2 ) ε I (λ 2 ) - R I (λ1, λ 2 ) ε I (λ1 ) 0
ε I (λ1 )
εS (λ 2 ) εS (λ 2 ) - R I (λ1, λ 2 ) εS (λ1 ) 0
R I (λ1, λ 2 )
εS (λ1 )
A(λ1 ) d ε I (λ1 ) CI + εS (λ1 ) CS
A(λ 2 ) d ε I (λ 2 ) CI + εS (λ 2 ) CS
HO O
C
O
O
C
H3C O
H
CH3
H3C
246
Supresarea contributiei ingredientilor
Rezultă că :
AI(246,8 nm) – 0,9467.AI(243,8 nm) = 0
indiferent de concentraţia ansamblului de ingredienţi, în timp ce . . .
AS(246,8 nm) – 0,9467.AS(243,8 nm) ≠ 0
247
Supresarea contributiei ingredientilor
0.1400
0.1200
0.1000
0.0800
0.0600
0.0400
0.0200
0.0000
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070
x = concentratie ( mg/ml )
248
Supresarea contributiei ingredientilor
Rezultatele analizei produsului “MEDOSTATIN”
Blister 1 Blister 2 Blister 3
Semnal Cantitate Semnal Cantitate Semnal Cantitate
optic (mg/comprimat) optic (mg/comprimat) optic (mg/comprimat)
0,1181 21,02 0,1184 21,08 0,1142 20,33
0,1132 20,15 0,1075 19,13 0,1187 21,13
0,1134 20,19 0,1126 20,05 0,1117 19,88
0,1127 20,07 0,1148 20,43 0,1094 19,48
0,1112 19,79 0,1160 20,66 0,1135 20,21
0,1114 19,83 0,1131 20,14 0,1134 20,19
0,1131 20,13 0,1152 20,51 0,1186 21,11
0,1180 21,00 0,1110 19,77 0,1142 20,33
0,1126 20,05 0,1130 20,12 0,1149 20,45
0,1131 20,13 0,1182 21,05 0,1125 20,02
Medie: 20,236 Medie: 20,294 Medie: 20,313
STD: 0,429 STD: 0,590 STD: 0,507
249
Metoda adaosurilor
A0(l1) = A0(l2)
251
Spectrofotometrie cu derivare in raport cu lungimea de unda
Exemplu: determinarea prin spectrofotometrie a Diazepamului
si a Bromurii de Otiloniu in amestec
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179
C2H5 O
O H 3C
O N+ C
C C O
CH3 C2H5
N N
Br
-
NH
C
O
H3C O
Cl
Diazepam Bromura de Otiloniu
(anxiolitic, sedativ, (relaxant al musculaturii netede
anticonvulsant, relaxant intestinale)
al muschilor scheletici)
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179 252
A.Y.E. Sayed, N.A.E. Salem : Analytical Sciences 2005:21, 595
Determinarea
Diazepamului si
Bromurii de Otiloniu
O O
C C CH3
N N
Cl
C2H5 O
H 3C N+ C
O
C2H5
Br
-
NH
C
O
H3C O
253
Determinarea Paracetamolului si acidului ascorbic din Eferalgan
V. David, Iulia Gabriela David, V. Dumitrescu
Spectre de absorbtie
(1) Paracetamol
(2) Acid ascorbic
(3) Eferalgan
Absorbantele Aet
X , A et
Y , A et
Z etc. ale unor solutii etalon care
A et
X ( l ) d e X ( l ) C et
X
A et
X ( l ) d e X ( l ) C et
X
A et ( l ) d e ( l ) C et Termenii incadrati in
Y Y Y (*) acest semn nu depind
A et
Z ( l ) d e Z ( l ) C et
Z de lungimea de unda
A (l ) C X C Y e Y (l ) C Z e Z (l )
d et + et + et +
A X (l ) C X C X e X (l ) C X e X (l )
et
A (l ) C X e X (l ) C Y C Z e Z (l )
d et + et + et +
A Y (l ) C Y e Y (l) C Y C Y e Y (l )
et
A (l ) C X e X (l ) C Y e Y (l ) C Z
d et + et + et +
A Z (l ) C Z e Z (l ) C Z e Z (l ) C Z
et
C X C Y e Y (l ) C Z e Z (l ) 257
A (l )
d et + et + et +
A X (l ) C X C X e X (l ) C X e X (l )
et
Dupa derivare
C X e X (l ) C Y C Z e Z (l ) termenii marcati
A (l )
d et + et + et + (*)
A Y (l ) C Y e Y (l) C Y C Y e Y (l )
et
cu dispar
A (l ) C X e X (l ) C Y e Y (l ) C Z
d et + et + et +
A Z (l ) C Z e Z (l ) C Z e Z (l ) C Z
et
d A (l ) C Y d e Y (l ) C Z d e Z (l )
D1X et d et + et +
dl A X (l) C X dl e X (l) C X dl e X (l)
d A (l ) C X d e X (l ) C Z d e Z (l )
D1Y et d et + et +
dl A Y (l) C Y dl e Y (l) C Y dl e Y (l)
d A (l ) C X d e X (l ) C Y d e Y (l )
D1Z et d et + et +
dl A Z (l) C Z dl e Z (l) C Z dl e Z (l)
258
d A (l ) C Y d e Y (l ) C Z d e Z (l )
D1X et d et + et +
dl A X (l) C X dl e X (l) C X dl e X (l)
d A (l ) C X d e X (l ) C Z d e Z (l )
D1Y et d et + et +
(*)
dl A Y (l) C Y dl e Y (l) C Y dl e Y (l)
d A (l ) C X d e X (l ) C Y d e Y (l )
D1Z et d et + et +
dl A Z (l) C Z dl e Z (l) C Z dl e Z (l)
Se observa :
D1X nu depinde de concentratia molara CX a componentei X in amestec
D1Y nu depinde de concentratia molara CY a componentei Y in amestec
D1Z nu depinde de concentratia molara CZ a componentei Z in amestec
---------------------------------------------------------
259
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
N.K. Vipul, M. Rajshree : Anal. Sci., 2007:23, 445
O
OH
C OH
N O
N
H
Atorvastatin :
C
OH
reduce in special
colesterolemia serica
Cl F
Fenofibrat :
reduce in special
C O C O concentratia trigliceridelor
O O serice
260
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
(1) 12 g/ml sare calciu a Atorvastatiei
(2) 12 g/ml Fenofibrat
(3) Amestecul celor doua solutii
261
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
4 , 8 , 12 , 16 , 20 si 22 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH
Divizor : 16 g/ml Fenofibrat in MeOH
262
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
2 , 4 , 8 , 10 , 12 , 16 , 18 , si 20 g/ml Fenofibrat in MeOH
Divizor : 12 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului 263
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
Analiza
spectrofotometrică
a sistemelor cu
echilibre chimice
266
Determinarea numărului de echilibre chimice independente
Într-o soluţie componentele chimice X şi Y, prezente în momentul preparării
soluţiei, interacţionează chimic în diferite rapoarte stoechiometrice şi prin
procese de echilibru formează M compuşi chimici noi :
a b a b
Importanţa în controlul
medicamentului:
a b a b numeroase substanţe active for-
mează complecşi de transfer de
a b a b sarcină (complecşi moleculari)
fie cu substanţele active ale altor
medicamente, fie cu unii
a b a b ingredienţi este afectată
biodisponibilitatea medicamen-
tului
a b a b
amestecare
V (CX)s V (CY)s
solvent
[X]s
A* Xs(l) A* Ys(l) [Y]s V
[XaYb]s
însumare
Scadere
Amestecare
Punct izosbestic 273
a b a b CX = [X] + a.[XaYb]
= d .{e(l*).[X] + a.e(l*).[XaYb]}=
= d . e(l*) .{ [X] + a.[XaYb]} = d . e(l*).CX
Punct izosbestic 274
1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil)- 1,4-dihidro-2,6-dimetil-
-3,5-piridin-carboxilat de dimetil -4-(2-nitrozofenil)-3,5-
(Nifedipin) piridin-carboxilat de dimetil
276
1.00
289 nm
0.80
Abszorbanta (d = 1 cm)
0.60
0.40
0.20
0.00
264 274 284 294 304 314 324 334 344 354
lungime de unda (nm)
278
Determinarea raportului stoechiometric. Metoda Job.
( metoda variaţiei continue )
În cazul în care într-un sistem componentele iniţiale (X şi Y) se implică
într-un singur echilibru chimic de tipul celui de mai jos, se poate determina
raportul coeficienţilor stoechiometrici asociaţi cu speciile iniţiale X şi Y
prin prelucrarea convenabilă a datelor de absorbţie optică.
a b a b
Metoda variaţiei continue 279
VX VY
CX C ; CY C
VX + VY VX + VY
Fracţiile molare ale substanţelor dizolvate în amestecul obţinut
sunt:
nX C VX VX
xX x
n X + n Y C VX + C VY VX + VY
nY C VY VY
xY 1 x
n X + n Y C VX + C VY VX + VY
[X]a.[Y]b = K.[XaYb]
d[X a Yb ]
0
dx x
0
a x0
Se poate demonstra faptul că :
b 1 x0
În caz concret, valoarea x0 se poate determina din date spectrofo-
tometrice.
Metoda variaţiei continue 282
Se poate demonstra că :
d A ( l )
0
dx x 0
modalitatea de
determinare experi-
mentală a valorii x0.
284
Reprezentarea simplificată
a unei tranziţii *
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 289
Reprezentarea simplificată a
unei tranziţii p - *
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 290
n = 1 l ≈ 30 nm
(efect batocrom)
n = 1 ef ≈ (1,5-2)xei
(efect hipercrom)
Spectrometrie de
fluorescenţă
Spectrometrie de fluorescenţă 296
Schema constructivă a
unui spectrofluorimetru
Randamentul F F (l 2 ) F F (l 2 )
cuantic al fluorescenţei : (l1, l 2 )
F ab (l1) F 0 (l1) F (l1)
Spectrometrie de fluorescenţă 298
Condiţii necesare pentru apariţia fluorescenţei utilizabile în scopuri analitice:
- proba să prezinte absorbţie puternică la lungimea de undă de excitare l1
( prezenţa unor cromofori adecvaţi ) ;
- molecula să se întoarcă în starea fundamentală printr-un proces radiativ ;
- deplasarea Stokes ( vezi mai jos ) să fie suficient de mare
299
O O
F C C
OH
N N
HN O
Gatifloxacin: antibiotic
de generatia a patra a
fluorochinolonelor
y = 36.084615x + 7.730769
5000 R2 = 0.999991
4000
3000
2000
1000
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
302
H H
+
N
O O -
Cl
O
Clorhidrat de Paroxetin
Absorbţie / Emisie 400 l1 300
1 H H
+
350 l2 N
2 O O -
300
l3 Cl
O
3
250 l4
200 l5 4 F
Clorhidrat de Paroxetin
l6 5
150 Abs Fluo
6
100
50
0
250 300 350 400 450 500
Lungime de undă (nm)
Spectrometrie de fluorescenţă 304
Exemplu :
a a
306
Spectrometrie de fluorescenţă
Dacă concentraţia substanţei fluorescente în probă este mare, atunci lumina
incidentă este absorbită în cea mai mare parte de primul strat de substanţă,
la straturile următoare ajungând flux de radiaţie mai mic.
Fluorescenţa probei este neuniformă şi fluxul de radiaţie emis de
probă ( FF(l2) ) nu este proporţional cu concentraţia speciei chimice
fluorescente. Din acest motiv măsurătorile de fluorescenţă se execută cu
concentraţii mici ale speciei fluorescente.
e ( l 1 ) d C
F ab (l1 ) F 0 (l1 ) F (l1 ) F 0 (l1 ) (1 10 )
e ( l 1 ) d C
F F (l ) (l1 , l 2 ) F ab (l1 ) (l1 , l 2 ) F 0 (l1 ) (1 10 )
e ( l 1 ) d C Dacă e(l1).d.C < 0,05 ,
10 1 ln(10 )d e ( l1 )C
eroarea relativă < 0,12 %
Aflatoxina B1 Aflatoxina B2
Aflatoxina G1 Aflatoxina B2
Spectrometrie de fluorescenţă 310
Excitare : 410 nm
Emisie : 510 nm
H3C
O
+
Exemple de aplicaţii analitice : 312
H3C NH Cl
-
O e) Determinarea fluorimetrică a Papaverinei
* (reacţia coralin)
O
CH3 W. Schneider ; K. Schroeter ; O. Boger (1920 – 1921)
(CH3-CO)2O O
CH3
- CH3-COOH Reacţia are loc la încălzire ;
- H2O Clorhidrat de Papaverină după răcire se adaugă 2-3
picături de H2SO4 conc.
O Cl
-
H3C
+
H3C N CH3
O
Coralin (produs de reacţie)
CH3
culoare galbenă
2[H] O fluorscenţă verde
O
CH3
O Cl
-
H3C Pentru ca reacţia sa fie pozitivă, gruparea
+ H
H3C
O
N CH3 metilenică ( * ) trebuie să fie nesubstituită
Reacţia este specifică papaverinei si se pretează
produs făra CH3 chiar la determinare cantitativă. Morfina dă un
O
fluorescenţă produs colorat dar fără fluorscenţă.
O
CH3
Spectrometrie de fluorescenţă 313
-
-
45 - 60 oC
Carnitina
HCl
produs fluorescent
l ex = 260 nm
l em = 310 nm
reactiv de derivatizare
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox 314
lex = 295 nm
(1,09/0,39 = 2,79 ≈ 3)
317
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox
HO O
N C OH M.I. Walash; M.S. Rizk; M.I. Eid;
H2N
M. El-Sayed Fathy
CH3 Acta Pharm., 2006:56, 431-440
(6-ciclohexil-1-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridon +
+ 2-aminoetanol (amestec in raport molar 1:1)
HOOCH2 CH2COO
-
HO O
3+ O CH3
N C Tb N C
3 Tb N
2- O
H2EDTA N
CH3 +
HOOCH2 CH2COO
-
-3H
3
Spectrometrie de
absorbţie în domeniul
infraroşu mijlociu (IR)
319
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR
Localizare spectrală : 2500 – 50000 nm (4000 – 200 cm-1)
Mecanismul de producere a absorbţiei : tranziţii între stările de vibraţie
ale moleculelor probei
Spectrofotometria IR oferă informaţii despre vibraţiile interne ale
moleculelor sau despre vibraţiile reţelei cristaline (dacă proba este
solidă)
Spectrofotometria IR oferă informaţii despre structura moleculelor
probei
Spectrofotometria IR se utilizează frecvent pentru identificarea unei substanţe
(spectrele IR sunt bogate în informaţii) dar se utilizează mai rar pentru
determinarea cantitativă a componentelor unei probe (radiaţia difuză este
însemnată în IR)
Obs. Spectrometria Raman este o altă tehnică (complementară tehnicii IR)
care permite identificarea unei substanţe datorită vibraţiilor moleculare.
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 320
La o moleculă biatomică,
numarul de undă al vibraţiei
de alungire a legăturii
covalente este:
~ 1 k a ,b
n
2 c a ,b
1 1 1
+
a ,b ma mb
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 321
- o legătură covalentă leagă doi atomi dintre care unul are masa mult diferită de masa
majorităţii atomilor din moleculă
(de exemplu legăturile între H şi un atom mai greu) ;
- o pereche de atomi posedă o legătură multiplă (dublă, triplă), cu o constantă de
forţă mult diferită de constanta de forţă a celorlalte legături din moleculă ;
- atomii dintr-o grupare funcţională formează un ansamblu care are stări de
vibraţie oarecum independente de stările de vibraţie ale restului moleculei (de
exemplu, gruparea amidică, nucleele aromatice, grupările alchilice etc.).
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 322
- -
c) gruparea XY (de exemplu C H , C Cl etc.)
326
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare
d) gruparea C-H
327
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare
e) gruparea C-H
vibraţia de valenţă: 3300 - 3380 cm-1 (fază gazoasă) Banda intensă
caracteristică
3310 - 3320 cm-1 (soluţie de CCl4)
vibraţie de deformaţie: 610 - 680 cm-1 (una sau două benzi intense)
f) gruparea Car H -
vibraţie de valenţă: 3000 - 3100 cm-1 (interpretare dificilă)
Tehnica ATR
Includerea probei (Attenuated Total Reflexion)
microcristaline în
comprimat de KBr probă păstoasă
sau de polietilenă
P a)
presiune Prisma ATR
probă păstoasă
3 IR P IR
7 7
spre pompa de vid Prisma ATR n
2 2
5 8 b)
6
4
7 7 IR P IR
1
probă lichidă
333
Domeniu de transparenţă (cm-1)
Solubilitate în apă
Material (pentru transmisie de 10 % la
(g/100 g)
grosimea de 2 mm)
Cuarţ (Infrasil) 50000 – 2220 insolubil
MgF2 (Irtran 1) 10000 – 1087 0,008 (la 18 oC)
ZnS (Irtran 2) 10.000 – 680 insolubil
CaF2 (Irtran 3) 25000 – 870 0,0015 (la 20 oC)
ZnSe (Irtran 4) 10000 – 454 insolubil
MgO (Irtran 5) 40000 – 1175 0,009 (la 30 oC)
Safir (Al2O3) 58820 – 1540 insolubil
As2S3 16660 – 870 insolubil
KRS-5 (TlBr/TlI) 20000 – 250 0,05 (la 20 oC)
KRS-6
47600 – 295 0,32 (la 20 oC)
(TlBr – TlCl)
35,7 (la 0 oC)
NaCl 47600 – 385
39,1 (la 100 oC)
Diamant 40000 – 125 insolubil
Polietilenă 625 – sub 50 insolubil
334
335
336
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
337
338
339
340
341
342
343
Spectrometrie Raman
344
Detector CCD
Laser si Retea de
filtru optic difractie
Oglinda
Div.
Oglinzi
Filtru
Proba Lentila Noch Fanta de intrare ajustabila
Mecanismul de generare a semnalului Raman 348
349
Spectrometrie
Raman
( IE ) – împrăştiere Rayleigh
( S ) – semale (benzi) Stokes
( aS ) – semnale (benzi) anti-Stokes
350
Intensitate în
Grupare chimică Domeniu ( cm-1 ) Asignare
comparaţie cu IR
Mai intens în Raman
R–C C–R 2300 – 2190 ( i ) n(C C)
decât în IR
Mai intens în Raman
R–C C–R 2140 – 2100 ( i ) n(C C)
decât în IR
Mai intens în Raman
>C=C< 1675 – 1600 ( m-i ) n(C=C)
decât în IR
“respiraţie” Mult mai intens în
Aromatic 1010 – 990 ( fi )
de nucleu Raman decât în IR
Mai intens în Raman
Aromatic 1620 – 1580 ( m-i ) n(C=C)
decât în IR
Mai intens în Raman
Nitril 2260 – 2220 ( i ) n(CN)
decât în IR
Mai intens în IR decât
Aldehide 1730 – 1700 ( m ) n(C=O)
în Raman
Mai intens în IR decât
Cetone 1750 – 1650 ( m ) n(C=O)
în Raman
Mai intens în Raman
C–Cl 850 – 650 ( i ) n(C–Cl)
decât în IR
351
Metode termice de
analiză
Metode termice de control analitic al medicamentelor 354
1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5 – sursă de lumină
6 – ocular
7 – mâner pentru
poziţionarea probei
356
357
Metode termice de control analitic al medicamentelor
TA – temperatura de topire a
componentei pure A
TB – temperatura de topire a
componentei pure B
PE – punct eutectic
TE – temperatura eutectică
xe(Fenacetina) = 0,6359
xe(ac. p-am. benz.) = 0,3641
Te = 116 oC
360
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Amestec eutectic
binar şi compus
stoechiometric
TA – temperatura de topire a
componentei pure A
TB – temperatura de topire a
componentei pure B
PE1 , PE2 – puncte eutectice
TE1 , TE2 – temperaturi
eutectice
361
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Amestec eutectic ternar
TA , TB , TC – temperaturile de
topire ale componentelor
pure A , B respectiv C
EAC , EBC , EAB – puncte
eutectice binare
EABC – punct eutectic ternar
Ex.
ac. acetilsalicilic (60 %)
paracetamol (20 %)
uree (20 %)
Te = 72 oC
362
Exemple de aplicare a termomicroscopiei în controlul
medicamentelor
Atât compusul (I) cât şi compusul (II) formează amestec eutectic cu acetanilidă
(în raport molar 1 : 1) ; cele două amestecuri eutectice au temperaturi de topire
mai diferite:
amestecul (I - acetanilidă) are p. t. 61 oC
Diferenţa de 2 oC
amestecul (II - acetanilidă) are p. t. 63 oC
363
Exemple de aplicare a termomicroscopiei în controlul
medicamentelor
Forma I Forma II
(sistem monoclinic) (sistem ortorombic)
(din solutie) (din topitura)
366
Forma I : monoclinica
Termodinamic forma stabila ; se obtine prin cristalizare din solutii
Nu se poate presa in comprimate decat in prezenta liantilor
Birefringenta: ne – no = 0,124
Forma II : ortorombica
Se poate pastila usor, dar se obtine foarte greu (prin cristalizare din topitura)
Birefringenta: ne – no = 0,349
De regula: din solutie cristalizeaza mai repede forma care este mai putin
stabila din punct de vedere termodinamic.
367
5 b-estradiol cristalizat din acetat de etil (lumina polarizata)
b-estradiol
20 m
368
b-estradiol cristalizat din alcool izopropilic (lumina polarizata)
20 m
369
6 Transformarea solid-solid (recristalizarea in timpul incalzirii
fara topire). Cristalele transparente cresc pe seama celor
netransparente (microscopie cu polarizoare incrucisate)
20 m
370
7
Observarea microscopica a sublimarii. Cristalele se
formeaza pe lamela superioara a probei. Se observa
formarea a cel putin doua feluri de cristale.
(observare cu polarizoare partial incrucisate)
50 m
371
8 Desolvarea hemihidratului de b-estradiol
(observare la 90 oC cu polarizoare partial incrucisate)
100 m
372
Desolvarea hemihidratului de b-estradiol
(observare la 105 oC cu polarizoare partial incrucisate)
Se observa modificarea imaginii suprafetei cristalului
datorita pierderii solventului de cristalizare.
100 m
Depistarea prin microscopie optica a impuritatii cristaline (prezenta 373
in urme) intr-o proba cristalina. Se observa microcristalul de NaCl
lipit de cristalul compusului majoritar. Prin difractie de raze X nu s-a
sesizat prezenta urmelor de NaCl.
9
374
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termogravimetrică (ATG - TGA)
C – cuptor
TC – termocuplu
B – solenoid
M – miez magnetic
P – probă
S – sursă de lumina
O – oglindă
FD – fotodiodă
F1 , F2 – fante
376
Metode termice de control analitic al medicamentelor 377
Descompunerea termică
a monohidratului
oxalatului de calciu
Termograma
ATD tipica
Pentru etalonare:
Indiu
Ttop = 156,4 oC
Ttop(I) = 131 oC
Ttop(II) = 128 oC
Ttop(III) = 126 oC
389
endo
391
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Traseul de topire a Carbamazepinei (forma de cristalizare III)
endo
392
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Traseul de topire a monohidratului de lactoza
endo
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC) 393
Procedeul de determinare a temperaturii de topire
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC) 394
Decelarea impuritatilor – determinarea puritatii
Determinarea puritatii din curba DSC de topire 395
AF
F
A PQ
F – Fractia transformata in
topitura pana in momentul cand
temperatura este Tm
396
Determinarea puritatii din curba DSC de topire
T0 Tm substanţei pure;
F (3) R este constanta universală a gazului
T0 TF
ideal.
T0 = 428,14 K
H top (T0 Tm ) J
x2 ; R 8,314 Tm = 427,91 K
R T02 mol K Htop = 27,845 kJ/mol
x2 = 0,0042
399
Metode titrimetrice de
control al
medicamentelor
400
X+R Y+P
I1 + R Q + I 2
V
f
Ve
404
Metode titrimetrice de control al medicamentelor
Titrare indirecta
Alura generala a curbelor de titrare (I) 405
Alura generala a curbelor de titrare (II) 406
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 407
Permanganometrie
-
MnO4 + 8H+ + 5e
- Mn2+ + 4H2O
Iodometrie
-
I3 + 2e
- 3I
-
Bromatometrie
-
BrO3 + 6H+ + 6e
- -
Br + 3H2O
-
BrO3 + 6H+ + 5Br
- 3Br2 + 3H2O
Cerimetrie Ce4+ + e
- Ce3+
Cromatometrie
-
Cr2O72 + 14H+ + 6e
- 2Cr3+ + 7H2O
(2)
12
(3)
(4)
10
(5)
8
pH
PE (pH 7,00)
(5)
4
(4)
(3)
2
(2)
(1)
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
410
Acidimetrie
Titrare ale acizilor slabi monobazici cu o bază tare (NaOH 0,1 M)
Constantele de aciditate: (1) 10-3 M; (2) 10-4 M; (3) 10-5 M; (4) 10-6 M;
(5) 10-7 M; (6) 10-8 M; (7) 10-9 M; (8) 10-10 M
14
12
10 (8)
(7)
8 (6)
pH
(5)
6 (4)
(3)
4 (2)
(1)
2
HCl
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
411
Titrare bazelor tari monoacide cu un acid tare (NaOH 0,1 M)
Concentratia initiala a bazei: (1) 1 M; M (2) 10-1 M; (3) 10-2 M; (4) 10-3 M; (5) 10-4 M
14
(1)
(2)
12
(3)
(4)
10
(5)
8
pH
PE (pH 7,00)
(5)
4
(4)
(3)
2
(2)
(1)
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
Titrare bazelor slabe monoacide cu un acid tare (HCl 0,1 M) 412
Constantele de bazicitate: (1) 10-3 M; M (2) 10-4 M; (3) 10-5 M; (4) 10-6 M;
(5) 10-7 M; (6) 10-8 M; (7) 10-9 M; (8) 10-10 M
14
NaOH 0,1
12 (1) M
(2)
10 (3)
(4)
8 (5)
pH
(6)
6 (7)
(8)
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 413
R-COOH + KOH
-
R-COO K + H2O
R-COOR' + KOH
-
R-COO K + R'OH
m1 (g) m2 (mg)
probã KOH m2 (mg)
IS =
m1 (g)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 414
Indice de saponificare
2 g probă (m)
25 ml soluţie KOH în etanol (0,5 M)
(V0 – V).28,05
IS = 28,05 reprezintă jumătatea masei moleculare a KOH
m
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 415
- +
R-COOH + KOH R-COO K + H2O
m1 (g) m2 (mg)
probă KOH m2 (mg)
IA =
m1 (g)
5. Indice de peroxid , IP . . .
. . . este numărul de militri de soluţie 0,01 M tiosulfat de sodiu oxidat de
iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea peroxizilor din 1 gram
probă analizată (FR-X, pag. 994).
. . . este cantitatea de peroxid, exprimată ca număr de miliechivalenţi de
oxigen activ, care se găseşte în 1000 grame probă (DA-IX, pag. 86).
R-O-O-R’ + 2I + 2H+
-
R-OH + R’-OH + 2I2
m (g) probă
+ - 2-
2Na2S2O3 + I2 4Na + 2I + S4O6
V (ml) soluţie V(ml) – V0(ml)
0,01 M IP = 10 .
(V0 la martor) m(g)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 419
Exemple (FR-X)
Probă IS IA IH II IP
Lanolină anhidră 94 - 106 <1 - 18 - 32 <6
Alcool cetilstearilic <2 <1 200 - 220 <3 –
Alcool cetilstearilic
– <1 180 - 220 <3 –
emulgator
Balsam de Tolu 160 - 220 112 - 168 – – –
Unt de cacao 188 - 195 < 2,25 – 32 - 38 –
Cetaceu 115 - 135 <2 – <8 <8
Ulei volatil de lămâie – < 1,5 – – –
Ulei de floarea soarelui 185 - 196 <2 – 119 - 136 < 10
Ulei de floarea soarelui
– < 0,2 – – <5
neutralizat
Polisorbat 80 45 - 60 <2 65 - 85 19 - 24 –
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 420
+ -
AH + B BH + A
422
Metode titrimetrice de control al medicamentelor
+ -
B + AH BH + A
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 423
În consecinţă :
- un acid slab se titrează într-un solvent protofil (bazic) cu o bază puternică
(KOH, CH3ONa, (C4H9)4NOH etc.)
- o bază slabă se titrează într-un solvent protogenic cu un acid tare (HClO4)
- pentru titrarea diferenţiată a doi acizi slabi se utilizează un solvent protogenic
(cu caracterul acid intermediar celor doi acizi)
- pentru titrarea diferenţiată a două baze slabe se utilizează un solvent protofil
(cu caracterul bazic intermediar celor doua baze)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 424
. 2 CH3COOH -
2 ClO4
. -
2 CH3COO
2 HClO4
DMFA
CH3OH
-
-
CH3O
DMFAH
CH3OH + SO2 + B
+
[BH ][CH3SO3 ]
-
+
H2O + I2 + [BH ][CH3SO3 ] + 2B
- + -
[BH ][CH3SO4 ] + 2BHI
( B = bază: piridină, dietanolamină, imidazol)
Reactivul propriu-zis: anionul metilsulfit care se oxidează cu iod la anion
metilsulfat, iar reacţia necesită apă. Conform cercetărilor recente, baza ideală
este imidazolul.
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 427
Indicarea punctului
de echivalenţă:
- vizual (indicare nesigură);
- la folosirea piridinei drept bază (pH 4 - 5) – galben maro (SO2 cu I2
formează un complex galben în piridină);
la folosirea imidazolului drept bază (pH 6 - 7) - nu se formează complexul
galben alte metode de indicare.
- electrometrice: biamperometrice, bipotenţiometrice, conductometrice etc.
- fotometrice (525 - 600 nm).
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 428
Vizualizarea
spectrofotometrică
a punctului de
echivalenţă
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 429
A = anod
C = catod
SA = spaţiu anodic
SC = spaţiu catodic
F = placă poroasă
EI = electrozi indicator
+ 2 CH3OH + H2O
Cetonã Acetal
Remediu:
tehnici speciale de titrare :"flying start“ ( se reprezintă grafic
viteza de consumare a reactivului adaugat în funcţie de timp
curba de titrare ; prin extrapolarea părţii finale a curbei de
titrare se elimină sursa de eroare – vezi în continuare)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 434
R-SH +
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 436
+ 2HI 2R-COOH + I 2
6. Determinarea titrimetrică
a fenobarbitalului (titrare
acido-bazică)
Indicator : albastru de timol
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 440
8. Determinarea titrimetrică a
clorhidratului de papaverină
(titrare acido-bazică)
M = 150,2 (g/mol)
V = 13,31 (ml) = 0,01331 (l)
C = 0,01667 (mol/l)
2
1 mol Timol . . . . . . . 2 moli Br2 . . . . . . . . . . . . . . 3 mol KBrO3
m
150,2 mol Timol . . . . . . . . . . . . . . . 0,01667.0,01331 mol KBrO3
3HBr
Amlodipin
3Br2 Br2
(necesar + exces) (exces)
produsi de degradare
(incolori)
galben de metanil
(roşu în mediu acid) N2
N-metil uree
Cofeină Alloxan
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 450
Adidul p-amino-salicilic
reactioneaza cu bromul în
raport molar 1:4.
-
Ca
2+ Acamprosat
de calciu
2
2
2 NaOH (0,1 M)
indicarea
- 2+ potenţiome-
Răşină - Ca
trică a p. e.
2H2O
-
2 + 2Na
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 455
+ NaOH
( 0,1 M în etanol )
- H2O
indicare
potenţiometrică
a punctului de
echivalenţă
dizolvare în dimetilformamidă
18. Deterinarea Irbesartanului prin titrare spectrofotometrica 456
N. Rahman ; M.R. Siddiqui ; S.N. Hejaz Azumi (India)
Chem. Pharm. Bull. 2006:54(5), 626-631