FITOKIMIA

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT)

Kelompok III :
Apriani (1601003)
Evelyn Palullungan (1601006)
Heryanto (1601010)
Sutantri Abeng Intan Messila (1601019)
Yurika R. Paembonan (1601024)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan suatu metode pemisahan canggih
dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan
sebagai uji identitas, uji kemurnian dan
penetapan kadar.
 PRINSIP KINERJA ALAT
Dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solutsolut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan
keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat
berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar
kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas,
jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan
mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Beberapa keuntungan KCKT, antara lain :
1. Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam
prosedur analisis dan pengolahan data
2. Volume sampel kecil
3. Daya pisah tinggi
4. Merupakan metode analitis cepat,peka, akurat,
tepat, reproducible, preparative
5. Dapat digunakan untuk analisis sampel organik
dan anorganik, bersifat volatil dan nonvolatil,
stabil dan tidak stabil secara thermal.
6. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas.
KCKT juga memiliki beberapa kelemahan,
yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis
sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai
dokumen otentik
 Persiapan penggunaan alat KCKT
persiapan
 Hubungkan kabel power ke sumber listrik
 Siapkan larutan baku, sampel, fasa gerak, dan peralatan lainnya yang
akan digunakan
 Hubungkan suction filter ke dalam larutan fasa gerak yang akan
digunakan

Instrumentasi
1. Hidupkan SCL-10Avp, SPD-10 Avp, LC-10 ATvp
2. Hidupkan CPU, monitor, dan printer
3. Pada menu windows klik 2x icon Class vp
4. Klik icon intrument , akan terdengar bunyi yang menandakan sitem telah
terhubung
5. Klik file, method, New
 Lanjutan !!!
6. Lakukan pencucian kolom, sebagai berikut ;
– Klik method, instrument set up, klik task bar
Pumps, isi parameter A. Flow dengan 1 ml/menit
– Klik Down load, klik ok
– Buka katup DRAIN pada LC-10AT vp, klik icon
instrumen on/of, tunggu hingga ± 3 menit
– Klik icon turn pumps on/of
– Tutup katup DRAIN pada LC-10AT vp
7. Klik Taskbar SPD-10Avp (Det. A) isi parameter A.
Flow dengan laju alir yang diinginkan (misalnya 1
ml/menit)
8. Klik Taskbar SPD-10Avp (Det..A), isi parameter
panjang gelombang, beri checklist pada kolom,
Acquisition channel on, isi parameter RunTime
sesuai waktu analisis.
 Lanjutan!!!
9. Klik Download, klik OK
10. Klik icon Turn Pumps on/off
11. Tunggu hingga kira-kira 15 menit
12. Klik file, method, save as, isi nama file method, klik save
13. lihat posisi baseline dengan cara mengklik control, preview run
14. Untuk mengganti skala tampilan monitor, klik tombol kanan
mouse, pilih properties, sis Taskbar Scale To dengan user difined, isi
parameter y min dengan –0,01 y max dengan 0,04, klik ok.
15. Klik icon zero SPD, dan perhatikan kelurusan baseline, jika sudah
lurus lakukan test slope dengan cara mengklik icon threshold, klik
waktu awal dan waktu akhir test. Nilai slope akan muncul, jika nilai
slope lebih kecil dari 500 berarti analisis bisa dilakukan, jika tidak
tunggu hingga baseline lurus, lakukan test slope lagi.
16. Jika sudah lurus, klik Control, klik Stop Run
17. Untuk memulai analisa, klik Control, klik Single Run, isi file data,
pastikan data Path sebagai C:\Class VP\Data, untuk
menspesifikasikan folder data.
 Lanjutan!!!
18. Klik start, tunggu hingga tampilan waiting for trigger pada
monitor
19. Putar posisi tuas Rheodyne pada posisi LOAD, injeksikan
baku atau sampel dengan menggunakan microsyringe, lalu
putar posisi tuas pada posisi INJECT, Analisis akan mulai
berlangsung dan akan berhenti secara otomatis sesuai
dengan waktu yang telah diatur atau dapat distop secara
manual dengan cara mengklik Control, klik Stop Run.
20. Untuk mengganti skala tampilan monitor, klik tombol
kanan mouse, pilih properties, isi Taskbar Scale To dengan
Normalized, klik ok
21. Lanjutkan injeksi larutan baku atau sampel selanjutnya
dengan mengikuti langkah 17-20.
Perhatian :
1. Pastikan selalu fasa gerak yang digunakan telah
disaring dengan saring yang sesuai dan telah
didegessing,
2. Fasa gerak yang digunakan harus baru
3. Sebelum melakukan suatu analisa, metoda analisa
tersebut harus divalidasi terlebih dahulu (metoda
analisa yang baru)
4. Jika menggunakan dapar, setelah penyuntikan kolom
harus dicuci dengan Aqua bidest ± 2 jam setelah itu
baru dengan metanol (menghindari pembentukan
garam di kolom).
Peringatan :
1. Suhu ruangan harus tetap
2. Jangan mengoperasikan alat diatas kapasitas
tekanan maksimumnya (250kgt)
Cara kerja alat dan bagiannya
Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom.
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant
pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan
konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa
syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut
teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor
yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya
ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran
yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi
Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau
gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan
kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang
kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.
Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan
adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm
atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
Detektor (Detector)
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi
adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan
memberi respons untuk semua tipe senyawa.
Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi
tidak selalu dapat diperoleh.
Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai
penambahan kekuatan fasa gerak selama
analisis kromatografi berlangsung. Efek dari
Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan
kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien
dijelaskan oleh Snyder.
Insprestasi Hasil Pemisahan
Lanjutan !!
waktu retensi dan volume retensi dapat
diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk
mengidentifikasi secara kualitatif suatu
komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol.
Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding
atau proporsional dengan konsentrasi dan
dapat digunakan untuk memperoleh hasil
secara kuantitatif.
감사합니다. 