UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

Integrantes: Benalcázar Cristian Fecha: 29/ 11/ 2017

NRC: 3083
Geovanna Puchaicela
Materia: Cultivo de Tejidos Vegetales

1. Tema
Diseño experimental de la fase de desinfección del cultivo in vitro.

2. Objetivos

2.1. Objetivo General

Diseño experimental de la fase de desinfección del cultivo in vitro de Raiz de la

especie Cinchona Officinalis.

2.2. Objetivos Específicos

 Realizar una búsqueda bibliográfica de diferentes métodos de desinfección para

las Raíces de Cinchona Officinalis.
 Establecer un protocolo de desinfección eficaz para semillas de Cinchona
Officinalis.
 Desarrollar un diseño experimental y aplicar pruebas estadísticas empleando el
programa InfoStast para analizar los datos obtenidos del % de contaminación y
oxidación que presentan las yemas apicales de Cinchona Officinalis.
 Identificar el tratamiento más eficiente en la disminución de la oxidación y
contaminación.

3. Marco teórico

3.1. Cinchona Officinalis

Cinchona Officinalis en la corteza de quina se emplea en una serie de preparados
medicinales bajo la forma de extractos líquidos, tintura y en polvo. La quinina bajo la
forma de sulfato y clorhidrato se emplea para combatir la malaria y para darle sabor a
bebidas gaseosas respectivamente. Como sulfato de quinidina se usa como sedativo
cardíaco.
La Cinchona calisaya es un árbol que alcanza una altura de 24 mts. y un diámetro de 0.60
mts. sus hojas son pecioladas, opuestas, lanceoladas u ovaladas. Sus flores son
pedunculadas de cáliz tubular.
Su fruto es capsular y ovoide, el cual encierra unas semillas denticuladas.
Partes de la planta se usa la Corteza, los principales componentes : Alcaloides (quinina,
quinidina, cinchonina, cinchonidina).
Formas de uso : Extracto, tintura, alcaloides, sales de alcaloides (sulfato de quinina).

Tabla 1: Clasificación científica de Cinchona Officinalis

CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Gentianales

Familia: Rubiaceae

Subfamilia: Cinchonoideae

Tribu: Cinchoneae
Nombre científico Cinchona Officinalis
Nombre común  Cinchona
(Soria & Viteri, 1999).
Características Morfológicas:

Arbol de la quina puede ser reconocida dentro de su género por sus hojas que son
generalmente más agudas en el ápice y tienen la domatia predominantemente en la
porción basal (proximal), la extremidad del cáliz muy profundamente lobulado, y sus
frutos con paredes de textura bastante gruesa; mientras en C. calisaya las hojas en su
mayoría son obtusas a redondeadas en el ápice y con las domatias en su mayoría que se
encuentran en la parte superior, la extremidad del cáliz superficialmente lobulada, y sus
frutos con paredes parecidas al papel. Cinchona Officinalis es una de las pocas especies
de este género que Andersson ha diagnosticado como que tienen siempre hoyo de
domatias en las hojas.

3.2. Parámetros a considerar en el desarrollo de un diseño experimental

Es fundamental conocer los factores que influyen realmente y estimar esta influencia.
Para conseguir esto es necesario variar las condiciones que afectan a las unidades
experimentales y observar la variable respuesta.
Las etapas a seguir en el desarrollo de un problema de diseño de experimentos son las
siguientes:
 Definir los objetivos del experimento.
 Identificar todas las posibles fuentes de variación, incluyendo:
 Factores tratamiento y sus niveles,
 Unidades experimentales,
 Factores bloque, factores ruido y covariables.
 Elegir una regla de asignación de las unidades experimentales a las condiciones de
estudio (tratamientos).
 Especificar las medidas con que se trabajará (la respuesta), el procedimiento
experimental y anticiparse a las posibles dificultades.
 Ejecutar un experimento piloto.
 Especificar el modelo.
 Esquematizar los pasos del análisis.
 Determinar el tamaño muestral.
 Revisar las decisiones anteriores. Modificarlas si se considera necesario (Dìaz, 2009).

Factores tratamiento: son aquellas fuentes cuyo efecto sobre la respuesta es de particular
interés para el experimentador. Tratamiento pueden ser cualitativos o cuantitativos.
Factores “nuisance”: son aquellas fuentes que no son de interés directo pero que se
contemplan en el diseño para reducir la variabilidad no planificada.
Los niveles de un factor tratamiento son los tipos o grados específicos del factor que se
tendrán en cuenta en la realización del experimento (Guitierrez, 2008).

4. Problema de caso
 Se necesita una producción masiva de la especie Cinchona Officinalis, utilizando la
raíz como explante, por lo que es necesario identificar un protocolo de desinfección
que me asegure la mayor cantidad de plantas viables.

MÉTODOS DE DESINFECCIÓN DE DESINFECCIÓN DE Cinchona Officinalis

El cultivo in vitro, como técnica, consiste en cultivar asépticamente una porción aislada
de la planta bajo condiciones de ambiente controlado, para que las células expresen su
potencial intrínseco e inducido.

El presente trabajo tiene como objetivo proponer un diseño experimental de la fase de

desinfección del cultivo in vitro de Cinchona Officinalis determinar el efecto de diferentes
desinfectantes del explante como tiempos de inmer-sión en el establecimiento in vitro de
explantes primarios de Cinchona Officinalis.

A los 7 días se evaluará el porcentaje de contaminación y de oxidación del explante. Se

aplica un diseño experimental completamente aleatorizado con análisis de varianza
bifactorial y clasificación simple.

4.1. Protocolos de desinfección de Cinchona Officinalis

Tabla 2: Protocolo de desinfección

Autor Titulo Parte Protocolo de desinfección

de la
planta

1.1.Variables
Tabla 3: Variables

Dependiente Independiente
% de contaminación Tiempo
% de Oxidación Concentración del H2O2

1.2. Diseño experimental

4.3.1 Porcentaje de contaminación

 Tabla 4: Diseño experimental - % contaminación

Hipoclorito de sodio (NaClO)

1% 3.5% 6%
20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min
94 68 68 64 57 44 47 31 55
80 50 60 94 87 53 56 46 61
46 48 0 88 66 46 49 49 35
47 55 72 61 50 66 65 45 22
53 61 58 66 64 45 57 30 35
49 60 67 78 61 41 53 34 39
67 76 81 65 58 61 46 35 38
68 58 45 76 55 0 41 28 69
64 77 55 0 56 41 65 31 51
70 73 60 80 57 45 65 22 46

Tabla 5: Tabla de contingencia del % de contaminación

Hipoclorito de sodio (NaClO)

1% 3.5% 6%
20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 0 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
Tabla 6: Diseño experimental – % oxidación
Hipoclorito de sodio (NaClO)
1% 5% 20%
20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min
68 53 32 32 58 46 34 54 67
71 45 26 26 55 42 43 0 65
53 48 61 61 56 0 46 61 72
0 44 62 62 75 51 51 0 44
47 48 45 45 48 57 54 57 0
43 38 53 53 47 79 63 69 56
61 64 0 0 49 79 33 36 56
61 49 26 26 67 0 54 31 69
44 52 63 63 0 69 0 64 42
71 45 37 37 51 62 61 71 48
Tabla 7: Tabla de contingencia del % de oxidación

Hipoclorito de sodio (NaClO)

1% 3.5% 6%
20 min 30 min 40 min 20 min 30 min 40 min 20 30 40 min
min min
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 0 1 1 1
0 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 1 1 1
1 0 1 1 0 1 0 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1

Tomando como referencia el estudio de () que empleó como desinfectantes: etanol a

(65%, 70% y 90%), Alcohol (70) % Hipoclorito de sodio (1, 6, 7) % y ácido sulfúrico
(4.5%, 5% y 5.5%) de acuerdo a la bibliografía se decidió emplear el Hipoclorito de sodio
como desinfectante más óptimo. Se estableció un modelo experimental empleando los
mismos porcentajes de 1%, 6% y 4.5% de Hipoclorito de sodio para analizar el % de
contaminación y oxidación que puedan influir en la viabilidad de las Raices de Cinchona
Officinalis.

Análisis de resultados
 Comprobación de la normalidad de los datos del % de contaminación:

Análisis gráfico

Ilustración 1: Histograma con polígono de frecuencia representando los datos del % de contaminación
El histograma y el polígono de frecuencia nos indican que los datos de % de
contaminación poseen una distribución normal ya que tienen la forma característica de
la campaña de Gauss.
 Análisis Estadístico

 Test Shapiro-Wilk

Se empleó la prueba de Shapiro-Wilk ya que esta nos permite contrastar la normalidad de

un conjunto de datos, nuestros datos corresponden al % de contaminación que existe en
las semillas de Vasconcella stipulata después de aplicar cada uno de los tratamientos que
corresponden a la Tabla 2.

Ilustración 2: Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk

Se empleó el nivel confianza del 95% con un 𝛼 = 0,05, se tomó estos valores en base….

El teste de Shapiro-Wilk tiene las siguientes hipótesis:

𝐻0 = 𝐿𝑜𝑠 𝑑𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙

𝐻1 = 𝐿𝑜𝑠 𝑑𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑛𝑜 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙

Como el p-valor (<0,0001) en el test de Shapiro-Wilk es menor al valor de 𝛼 = 0,05 se

rechaza la 𝐻0 , es decir que los datos del % de contaminación no presentan una
distribución normal.

 Prueba de Tukey

Ilustración 3: Prueba de Tukey

Se aplicó la prueba de Tukey que es una prueba no paramétrica ya que nuestros datos no
resultaron tener una distribución normal. Como podemos observar la letra A corresponde
a las mejores opciones siendo el tratamiento 2 el mejor, el cual posee 1% de Hipoclorito
de sodio y es administrado durante un periodo de 30 minutos, esto se determina gracias a
que posee la menor media que corresponde al % de contaminación es la menor.

 Comprobación de la normalidad de los datos del % de oxidación:

Análisis gráfico
Se aplicó la prueba de Tukey que es una prueba no paramétrica ya que nuestros datos no
resultaron tener una distribución normal. Como podemos observar la letra A corresponde
a las mejores opciones siendo el tratamiento 2 el mejor, el cual posee 1% de Hipoclorito
de sodio y es administrado durante un periodo de 30 minutos, esto se determina gracias a
que posee la menor media que corresponde al % de contaminación es la menor.

 Comprobación de la normalidad de los datos del % de oxidación:

Análisis gráfico

% de oxidacion de las Raices

Ilustración 4: Histograma con polígono de frecuencia representando los datos del % de oxidación
El histograma y el polígono de frecuencia nos indican que los datos del % de oxidación
no poseen una distribución normal ya que no tienen la forma característica de la campaña
de Gauss.

Análisis estadístico

 Test Shapiro-Wilk
 Ilustración 5: Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk

Los datos de la Tabla 6 que contienen el % de oxidación fueron analizados con el test de
Shapiro-Wilk, dándonos un p-valor <0,0001 igual que en él % de contaminación, con lo
que podemos establecer que los datos no presentaban una distribución normal.
 Prueba de Tukey
 Ilustración 6: Prueba de Tukey

La prueba de Tukey se realizó para determinar cuál de los métodos empleados es el mejor
para la desinfección de Cinchona Officinalis, siendo la letra A las mejores opciones, el
tratamiento 2 que corresponde al 1% de Hipoclorito de sodio por 30 minutos es mejor ya
que posee la menor media que corresponde al % de oxidación.

5. Conclusiones y Recomendaciones

 Se estableció un protocolo de desinfección in vitro para las semillas de

Vasconcella stipulata, empleando concentraciones de 1%, 4.5% y 6% de
hipoclorito de sodio en periodos de tiempo de 20, 30 y 40 minutos.
 Se empleó un diseño experimental que estaba constituido por 3 tratamientos con
3 bloques y como variables dependientes el porcentaje de contaminación y de
oxidación. Los datos obtenidos se analizaron con pruebas estadísticas en el
programa InfoStat.
 Gracias al test de normalidad de Shapiro-Wilks se determinó que los datos no
presentaban una distribución normal y con la ayuda de la prueba de Tukey se
confirmó que la concentración del 1% a un tiempo de 30 min de hipoclorito de
sodio es la mejor opción al momento de desinfectar semillas de Vasconcella
stipulata.
 Para el diseño experimental de la fase de desinfección de explantes de Rubus
glaucus Bent se toma la presencia/ausencia de contaminación y oxidación
como variables independientes y varios desinfectantes (Isodine 0.2%,
Fungicida Mertec 0.04% y Etanol 70%) con dos tiempos de exposición como
variables dependientes.
  De acuerdo con el análisis estadístico de los resultados obtenidos sobre la
presencia o ausencia de contaminación, el mejor tratamiento para la
desinfección de Rubus glaucus Bent es aquel que incluye la exposición de
Isodine 0.2% por 15 minutos, Fungicida Mertec 0.04% por 30 minutos y
Etanol 70% por 1 minuto. Por otro lado, el mejor tratamiento para conseguir
una menor frecuencia de oxidación es Isodine 0.2% por 15 minutos, Fungicida
Mertec 0.04% por 60 minutos y Etanol 70% por 1 minuto.

6. Cuestionario

Diferencias entre estadística y bioestadística

La estadística es una ciencia que forma parte de la matemática aplicada, provee métodos
y procedimientos para colectar, clasificar, resumir y analizar información proveniente de
una población, mientras que la bioestadística se encarga de generar y aplicar métodos
estadísticos a datos provenientes específicamente de las áreas biológicas (Botella &
Alacreu, 2013).

Aplicaciones de la bioestadística
 Obtiene datos y estadísticos para el Registro y Control de Enfermedades
 Evalúa la evolución de una enfermedad en el tiempo
 Compara poblaciones (caso-control / sanos-enfermos)
 Evalúa tecnología tecnología que sirven de diagnóstico clínico
 Evalúa la efectividad de tratamientos médicos
 Estima riesgos (Ruggiero, 2012)

Que parámetros se toma en cuenta al momento de realizar un diseño experimental

Es fundamental conocer los factores que influyen realmente y estimar esta influencia.
Para conseguir esto es necesario variar las condiciones que afectan a las unidades
experimentales y observar la variable respuesta.
Las etapas a seguir en el desarrollo de un problema de diseño de experimentos son las
siguientes:
 Definir los objetivos del experimento.
 Identificar todas las posibles fuentes de variación, incluyendo:
 Factores tratamiento y sus niveles,
 Unidades experimentales,
 Factores bloque, factores ruido y covariables.
 Elegir una regla de asignación de las unidades experimentales a las condiciones de
estudio (tratamientos).
 Especificar las medidas con que se trabajará (la respuesta), el procedimiento
experimental y anticiparse a las posibles dificultades.
 Ejecutar un experimento piloto.
 Especificar el modelo.
 Esquematizar los pasos del análisis.
 Determinar el tamaño muestral.
 Revisar las decisiones anteriores. Modificarlas si se considera necesario (Dìaz, 2009).
Factores tratamiento: son aquellas fuentes cuyo efecto sobre la respuesta es de particular
interés para el experimentador. Tratamiento pueden ser cualitativos o cuantitativos.
Factores “nuisance”: son aquellas fuentes que no son de interés directo pero que se
contemplan en el diseño para reducir la variabilidad no planificada.
Los niveles de un factor tratamiento son los tipos o grados específicos del factor que se
tendrán en cuenta en la realización del experimento (Guitierrez, 2008).

¿Qué medidas se deben tomar en cuenta cuando una especie tiene problemas de
bacterias y hongos endógenos?
Se debe emplear bacterioestaticos y fungiestaticos, los más empleados son: cefotaxima,
rifampicina, gentaminicina, anfotericin, benomil, carbendazim,etc.
En todas las ocasiones que se utilicen antibióticos para eliminar los microorganismos
contaminantes deben realizarse pruebas de sensibilidad antes de aplicarlos en el medio de
cultivo o directamente e a los explantes (Alvarado, 1998).

7. Bibliografía

 Alvarado, Y. (1998). Control y prevencion de la contaminacion microbiana en la

micropropagacion de plantas. CENIC.
 Borja.M.et.al. (2017). Systems of pruning on Jigacho (Vasconcellea stipula Badillo)
under Greenhouse conditions. Hortscience vol 52, 1060-1064.
 Botella, P., & Alacreu, M. (2013). Estadisticas en ciencias de la salud. Valencia: CEU.
 Criollo, D. (2008). Evaluación de dos técnicas para la microinjertacion de babaco
(Vasconcella heilbornii cv. Pentagona) y chihualcán (Vasconcella heilbornii cv.
Chysopetala) en patrones de papaya (Carica papaya) bajo condiciones de
laboratorio, Santa Catalina-INIAP. Quito: ESPE.
 Dìaz, A. (2009). Diseño estadistico de experimentos . Universidad de Antoquìa.
 Duarte, O., & Paull, R. (2015). Exotic Fruits and Nuts of the New World. New york:
CABI.
 Espinosa, I. (2016). Germinación, microinjertación y cultivo de callos in vItro de
Vasconcellea stipulata V.M Badillo y Vasconcellea pubscenes A.DC. UNLP.
 Guitierrez, H. (2008). Anàlisis y diseño de experimentos. Mexixo: McGrawHill.
 Proaño, E. (2007). "FItoquimica y Agroindustrialización de dos genotipos de
Vasconcellea, chamburo (Vasconcellea cundinamarcensis V. Badillo) y toronche
(Vasconcellea stipulata V. Badillo". Quito: ESPE.
 Rodriguez, T. (2013). Rescate de las memorias culinarias de las zonas rurales de la
provinca de Tungurahua . Tungurahua: Universidad regional autonóma de los Andes.
 Ruggiero, M. (2012). Bioestadistica en la investigacion en epilepsia. Quito.
 Soria, N., & Viteri, P. (1999). Guía para el cultivo de babaco en el Ecuador. Quito:
INIAP (Estación Snata Catalina).
 Valencia, J. (2014). "Propagación por esquejes herbáceos de jigacho (Vasconcellea
stipulata V.Badillo). Ambato: Universidad Técnica de Ambato.
 Vélez, D., Armijos, R., & Zimmermann, M. (2015). Mejoramiento de la germinacion,
control de la hiperhibricidad y formación de brotes en Vasconcellea stipulata Badillo.
Revista colombiana de biotecnologia Vol. 17, 16-21.

sumergido en 0 · 1% Nonidet, superficie esterilizada en sodio

solución de hipoclorito (0 · 15% de cloro disponible)

Las sales se solubilizaron en etanol al 70% (20 mg en 2 ml), lo que aseguró la

esterilidad y nos permitió evitar la filtración en membranas
Las semillas se esterilizaron superficialmente en agua jabonosa durante 5 min,
luego se sumergieron en alcohol al 70% durante 30 s, luego en solución de
hipoclorito de sodio al 1% (v / v) durante 10 min.
La corteza de Cinchona en polvo (50 g) se mezcló con óxido de calcio (30 g), agua
(40 ml) e hidróxido sódico al 5% para formar una pasta y se mantuvo durante la
noche. Luego se envasó la pasta en un aparato Soxhlet y se extrajo con metanol
durante 8 horas a 60ºC. Se agitó el extracto metanólico con tres porciones
sucesivas de 25 ml de ácido sulfúrico al 5%. El extracto acidificado se alcalinizó
con solución de amoniaco (pH 10) y los alcaloides liberados se extrajeron con tres
porciones sucesivas de 20 ml de cloroformo. Los extractos de cloroformo se
combinaron. El cloroformo se separó por destilación para producir alcaloides
totales. Se secó hasta peso constante a 80 ° C y se mantuvo en un desecador
(Kokate, 2009). Luego se almacenó a 4 ° C hasta su uso en botella sellada, protege
contra la luz y la humedad.
Cultivos de suspensión de órganos de raíz de C. ledgeriana Moens
(Variedad Zapote) se han mantenido por 3 años
(Anderson et al 1982h) en medio basal MS (Flow Laboratories) que contiene ácido
2,4-diclorofenoxiacético (img / l), kinetina (O.img / l) y sacarosa (5%) bajo
iluminación continua a 25 ° C.
Semillas de C. ledgeriana procedentes de
Vietnam ~ uan Tho) y de C. succirubra
de Indiaa se sumergieron ~ n 70 '%' acuoso
solución de etanol y luego superficie
esterilizado por tratamiento con una solución saturada
solución acuosa de cloramina (sodio-ptolueno-
sulfocloramida) durante 20 minutos y
a continuación, con una solución acuosa al 6% de
hipoclorito de sodio durante 12 min.