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Título
Objetivo: Demostrar mediante un estudio de laboratorio que las características funcionales del ensayo de hierro total en agua tratada por el método de la
ortofenantrolina son adecuada para la aplicación analítia de rutina. Registrar la información y los datos necesarios para establecer las especificaciones de operatividad
la valoración. Confirmar y documentar que el desarrollo del procedimiento analítico, para cuantificar hierro en aguas tratadas son confiables para los análisis rutinarios.
Alcance: Aplica a las aguas tratatadas que llegan al laboratorio producto de los porcesos para potabilizarla.
Responsabilidad: Los analistas químicos y/o técnicos de laboratorio son los directamente responsables de efectuar los estudios de validación, adicionalmente
registrar, analisar y documentar la información correspondiente. El supervisor planificará el estudio, redactará el protocolo, supervisará la operatividad y comprobará la
integridad de los registros. Garantia de Calidad examinará y aprobará el protocolo de validación; examinará y aprobará los datos del informe de validación.
ratada por el método de la
as especificaciones de operatividad de
onfiables para los análisis rutinarios.
Otros materiales
Material Uso especifico Observación
po que se describan en el
Marca
Tolerancia
INTRODUCCION
Validación de métodos analíticos
Hojas de los procedimientos y del cálculo
Este programa contiene instrucciones y las hojas del cálculo para la validación interna de métodos analíticos cuantitativos. En caso de una validación interna señale las
pruebas a realizar dependiendo del método. En los casos de métodos nuevos, desarrollados en el laboratotio y/o normalizados donde se ampli el alcance ó han sido
modificados, es recomemdable realizar una validación completa con todos los parámetros descritos. Existe otros métodos normalizados donde no es posible realizar u
validación total (ejemplo pH), en estos casos se fijan los siguientes par´metros para validar: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad (si hay laboratorios par
comparar).
Presione click en los botones para ir a la hoja de cálculo especifica
SE
5.2 SELECTIVIDAD (CONDICIONES EXTREMAS)
6. LINEALIDAD (PATRON) LP
8. REPETIBILIDAD
RP
9. PRECISION INTERMEDIA PI
10.1 EXACTITUD EX
EN
EX
10.2 EXACTITUD ADICIÓN DE PATRÓN
LD LC
11. LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION
RB
LD LC
RB
12. ROBUSTEZ
CR
13. CONFIRMACIÓN DE RUTINA
IN
14. INCERTIDUMBRE
IN
15. CONCLUSION Y CERTIFICADO
El esquema abajo puede ayudarte a decidir que estudios son necesarios para la validación. Las 6 cajas azules contienen todos los diversos estudios de la validación
posibles cuando una validación completa es necesaria. (validación de un nuevo método desarrollado).
Estudio de exactitud
Parámetros mínimos para
Estudio de repetibilidad todos los métodos analíticos
en el laboratorio
Selectividad / especificidad
%HR mínima :
%HR máxima:
0.0600
2.6352 %
0.0600
1.0690
SELECTIVIDAD
Definición:
Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de forma inequivoca en
presencia de otras sustancias químicas que pueden estar presentes en la muestra. Frecuentemente el término especificidad se utiliza como
sinónimo del anterior, aunque debería reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta obtenida solo se puede producir con una única
entidad química, algo que no es posible cuando se refiere a procedimientos analíticos que emplean instrumentación no específica. Como
existen muy pocos métodos que den respuesta a un único analito, el término selectividad es normalmente más apropiado.
La presencia de interferencia puede tener distintos efectos en la determinación del analito como: imposibilitar su inequivoca identificación
(aparición de falsos positivos), distorsionar la respuesta del analito (afectan normalmente la pendiente y la ordenada).
La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetro, debe conocerse el grado
de respuesta del método proporcionada únicamente por el analito.
Procedimiento:
a) Para efectuar estudios de selectividad debemos realizar estudio bibliográfico de las interferencias posibles; en este punto es de vital
importancia la información que nos propociona métodos validados que aparezcan en libros oficiales (ASTM).
b) Realizar estudio experimental ó retrospectivo de las muestra a evaluar para verificar la existencia de interferencias de acuerdo a la literatura;
la exisencia de concentraciones altas de las interferncias de acuerdo al estudio experimental ó retrospectivo; conlleva a realizar un diseño
experimental para evaluar la incidencia de estas interferencias en la selectividad del método y verificar si es adecuado ó no para la matriz de
interes.
c) Si con el estudio del punto anterior definimos la adecuación del método para la matriz de interes; realizamos replicas sextuplicadas con las
posibles calidades de agua para usar en el laboratorio.
d) Los coeficientes de variación de los sextuplicados debe de estar por debajo del 2.0%
e) Si alguna interferencia se evalua; se realizá el analisis seis veces adicionado la interferencia y sin adicionarla. Se observa el porcentaje de
discrepancia de a cuerdo a la formula: xxxxx y se concluye la incidencia de está sobre le resultado.
Fecha :
Selectividad °T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
V (mL) ó W (mg) 20.34 Blanco (H2OS / Al - Reac) V (mL) ó W (mg) 20.34 Blanco (H2OS / Al - Reac)
1 0.071 0.067 0.068 0.068 1 0.071 0.067 0.068 0.068
2 0.069 0.067 0.070 0.070 2 0.069 0.067 0.070 0.070
3 0.072 0.069 0.071 0.071 3 0.072 0.069 0.071 0.071
4 0.068 0.068 0.069 0.075 4 0.068 0.068 0.069 0.072
5 0.068 0.068 0.069 0.074 5 0.068 0.067 0.069 0.070
6 0.073 0.068 0.069 0.073 6 0.073 0.068 0.069 0.070
Promedio respuesta 0.070 0.068 0.069 0.072 Promedio respuesta 0.070 0.068 0.069 0.070
Desviación estándar 0.002 0.001 0.001 0.002 Desviación estándar 0.002 0.001 0.001 0.001
Coef. de variación 3.046 1.079 1.490 0.070 Coef. de variación 3.046 1.207 1.490 0.070
V (mL) ó W (mg) 20.34 Matriz sola (H2OS / Al + Reac) Promedio absorbancias 0.060
1 0.060 0.060 0.060 0.060 Desviación estándar 0.0019
2 0.060 0.060 0.062 0.063 Coef. de Variación 3.12 %
3 0.062 0.062 0.058 0.056
4 0.062 0.062 0.062 0.062
5 0.062 0.062 0.058 0.056
6 0.060 0.060 0.060 0.060
V (mL) ó W (mg) 20.34 Matriz + Fe + Al (0.3ppm y 0.2 ppm) Promedio absorbancia 0.062
1 0.061 0.061 0.063 0.061 Desviación estándar 0.0011
2 0.061 0.061 0.062 0.061 Coef. de Variación 1.71 %
3 0.061 0.061 0.062 0.062
4 0.061 0.061 0.063 0.062
5 0.063 0.061 0.064 0.063
6 0.063 0.063 0.064 0.063
% de discrepancia 2.69 %
Diferencia entre las medias 0.0016
Error estándar combinado 0.0009
T studen (estadistico) 2.2281
Intervalo de confianza -0.0003 A 0.0036
SELECTIVIDAD (CONDICIONES EXTREMAS)
Definición: Se verifica el comportamiento del analito ante circunstancias no normales del laboratorio (Tempeatura, Luz; humedad relativa).
Procedimiento: a) Para efectuar estudios de selectividad debemos realizar estudio bibliográfico de la estabilida del analito de inters; en este punto es de vital importanc
la información que nos propociona métodos validados que aparezcan en libros oficiales (ASTM).
b) Realizar estudio experimental de las muestra a evaluar para verificar la incidencia en la estabilidad del analito a cuantificar. Se realizá un diseño experimental en
tiempos estipulados por el estudio bibliografico realizado.
c) la diferencia observada no debe influenciar en los resultados.
Fecha : 15/May/2007
Selectividad °T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
eño experimental en
0.061
0.0015
2.42 %
0.060
0.0017
2.79 %
0.062
0.0013
2.11 %
0.061
0.0014
2.32 %
RANGO LINEAL DE TRABAJO
Para cualquier método analítico es necesario establecer su rango lineal de trabajo donde puede ser aplicado; de una manera general se trabaja alrededor de los límite
especificación del analito que se quiere evaluar, no obstante se pueden definir rangos más amplios pero que incluya las especificacines del analito.
la gráfica siguiente ayuda a comprender la importancia de determinar este rango lineal; aunque existe otros métodos donde el comportamiento de la respuesta vs la
concentración del analito no es representación de una curva de primer orden (puede ser de primer , segundo ó tercer orden).
Rango de
linealidad
Result
ado
Concentración
En la practica es conveniente verificar la linealidad en el rango donde se espera la concentración de las muestras; tambien es muy util para diseñar una estrategia de
calibración de rutina al usar el método.
Procedimiento:
a) Se realiza curva de calibración de concentración vs respuesta del instrumento, usando cinco niveles de concentración del estándar de referencia certificado (cada ni
se prepara por triplicado).
b) La curva se raliza alrededor de la concentración de especificación o las concentraciones que se trabajan de rutina (en la décima parte de la concentración de
especificación y el doble de la concentración de especificación).
c) Se halla la ecuación de la recta Y=mX + b.
d) Se tabulan los resultados y se grafican, se determinan lo coeficientes de correlación (r>0.999) y coeficientes de determinación (r2>0.998), adicionalmente.
e) t obtenido se compara con el t teórico para ensayos bilaterales (2 colas) con una probabilidad del 95% (p=0.05) para correlación lineal
f) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp< Gtab, las varia
no inciden sobre los resultados
Si tobt > ttab existe correlación lineal significativa
Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Determinación de la linealidad (mínimo cuadrados). Analisis de varianzas
Dato X Y Xi-Xp (Xi-Xp)2 Yi-Yp (Yi-Yp)2 (Xi-Xp)(Yi-Yp) Factor (Y/X) Promedio
1 0.05000 0.01100 -0.26000 0.06760 -0.05060 0.00256 0.01316 0.22000
2 0.05000 0.01100 -0.26000 0.06760 -0.05060 0.00256 0.01316 0.22000 0.220
3 0.05000 0.01100 -0.26000 0.06760 -0.05060 0.00256 0.01316 0.22000
4 0.15000 0.03000 -0.16000 0.02560 -0.03160 0.00100 0.00506 0.20000
5 0.15000 0.02800 -0.16000 0.02560 -0.03360 0.00113 0.00538 0.18667 0.191
6 0.15000 0.02800 -0.16000 0.02560 -0.03360 0.00113 0.00538 0.18667
7 0.30000 0.05900 -0.01000 0.00010 -0.00260 0.00001 0.00003 0.19667
8 0.30000 0.06100 -0.01000 0.00010 -0.00060 0.00000 0.00001 0.20333 0.200
9 0.30000 0.06000 -0.01000 0.00010 -0.00160 0.00000 0.00002 0.20000
10 0.45000 0.08900 0.14000 0.01960 0.02740 0.00075 0.00384 0.19778
11 0.45000 0.09000 0.14000 0.01960 0.02840 0.00081 0.00398 0.20000 0.199
12 0.45000 0.08900 0.14000 0.01960 0.02740 0.00075 0.00384 0.19778
13 0.60000 0.11900 0.29000 0.08410 0.05740 0.00329 0.01665 0.19833
14 0.60000 0.11900 0.29000 0.08410 0.05740 0.00329 0.01665 0.19833 0.198
15 0.60000 0.11900 0.29000 0.08410 0.05740 0.00329 0.01665 0.19833
Suma 4.65000 0.92400 0.00000 0.59100 0.00000 0.02314 0.11691
Gexp
Promedio 0.31000 0.06160 0.00000 0.03940 0.00000 0.00154 0.00779
b 0.0003 m 0.1978
r 0.9997 r2 0.9994 Σ {(X – X) (Y – Y)}
i i
r=
tr 153.35
{[Σ(X – X) ] [Σ(Y – Y) ]}
2 2 1/2
i i
Linealidad
0.14000
0.12000
0.10000 R² = 0.9994475158 | r | n-2
r=
0.08000
1 - r2
ÁREA
0.06000
0.04000
0.02000
0.00000
0.00000 0.10000 0.20000 0.30000 0.40000 0.50000 0.60000 0.70000
0.12000
0.10000 R² = 0.9994475158
0.08000
1 - r2
ÁREA
0.06000
0.04000
0.02000 Σ {(X – X) (Y – Y)}
i i
0.00000
m=
0.00000 0.10000 0.20000 0.30000 0.40000 0.50000 0.60000 0.70000
Σ (X – X)
i
2
CONCENTRACION %
se trabaja alrededor de los límite de
s del analito.
tamiento de la respuesta vs la
te de la concentración de
.998), adicionalmente.
0.000 0.00000
0.008 0.00006
0.003 0.00001
0.001 0.00000
0.000 0.00000
0.82286
Volv
er
Intro
LINEALIDAD MATRIZ + PATRON
Procedimiento:
a) Se realiza curva de calibración de concentración vs respuesta del instrumento, adicionando estándar de referencia a una matriz para los cinco nivles de concentració
especificados en la prueba de linealidad (cada adición del nivel se prepara por triplicado)
b) Se halla la ecuación de la recta Y = mX + b
c) Se tabulan los resultados y se grafican , se determinan los coeficientes de correlación (r>0.999) y coeficiente de determinación (r2>0.998), adicionalmente se calcul
valor de t = | r | (n-2)1/2 / (1 - r2) 1/2
d) t obtenido se compara con el t teórico para ensayos bilaterales (2 colas) con una probabilidad del 95% (p=0.05) para correlación lineal.
Si tobt > ttab existe correlación lineal significativa
e) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp < Gtab, las
varianzas no inciden sobre los resultados.
Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Analisis de varianzas
Blanco
Dato X Y Xi-Xp (Xi-Xp)2 Yi-Yp (Yi-Yp)2 (Xi-Xp)(Yi-Yp) Factor (Y/X) Promedio
1 0.05000 0.02800 -0.26000 0.06760 -0.05147 0.00265 0.01338 0.56000 -0.090
2 0.05000 0.02700 -0.26000 0.06760 -0.05247 0.00275 0.01364 0.54000 Matriz 0.547
3 0.05000 0.02700 -0.26000 0.06760 -0.05247 0.00275 0.01364 0.54000 0.018
4 0.15000 0.04700 -0.16000 0.02560 -0.03247 0.00105 0.00519 0.31333
5 0.15000 0.04800 -0.16000 0.02560 -0.03147 0.00099 0.00503 0.32000 0.320
6 0.15000 0.04900 -0.16000 0.02560 -0.03047 0.00093 0.00487 0.32667
7 0.30000 0.07600 -0.01000 0.00010 -0.00347 0.00001 0.00003 0.25333
8 0.30000 0.07700 -0.01000 0.00010 -0.00247 0.00001 0.00002 0.25667 0.256
9 0.30000 0.07700 -0.01000 0.00010 -0.00247 0.00001 0.00002 0.25667
10 0.45000 0.10800 0.14000 0.01960 0.02853 0.00081 0.00399 0.24000
11 0.45000 0.10600 0.14000 0.01960 0.02653 0.00070 0.00371 0.23556 0.238
12 0.45000 0.10700 0.14000 0.01960 0.02753 0.00076 0.00385 0.23778
13 0.60000 0.13700 0.29000 0.08410 0.05753 0.00331 0.01668 0.22833
14 0.60000 0.13900 0.29000 0.08410 0.05953 0.00354 0.01726 0.23167 0.231
15 0.60000 0.13900 0.29000 0.08410 0.05953 0.00354 0.01726 0.23167
Suma 4.65000 1.19200 0.00000 0.59100 0.00000 0.02383 0.11863
Promedio 0.31000 0.07947 0.00000 0.03940 0.00000 0.00159 0.00791 Gexp
b 0.01724 m 0.2007
r 0.9997 r2 0.9994
tr 151.88 r=
Σ {(X – X) (Y – Y)}
i i
{[Σ(X – X) ] [Σ(Y – Y) ]}
i
2
i
2 1/2
Linealidad
0.16000
0.14000
R² = 0.9994367236 | r | n-2
0.12000 r=
0.10000 1- r2
0.08000
ÁREA
0.06000
0.04000
0.02000 Σ {(X – X) (Y – Y)}
i i
r=
0.00000
0.000000.100000.200000.300000.400000.500000.600000.70000
Σ (X – X) i
2
CONCENTRACION %
ara los cinco nivles de concentración
ineal.
Analisis de varianzas
S S2
0.012 0.00013
0.007 0.00004
0.002 0.00000
0.002 0.00000
0.002 0.00000
0.7012987
Volv
er
Intro
PRECISION / REPETIBILIDAD
Definiciones:
La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las
condiciones prescritas; la procedencia de las muestras destinadas al estudio de la precisión puede ser de muestras reales o preparadas en el laboratorio.
El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a tod
método de ensayo. Como consecuentia de la existencia de estos errores los análisis efectuados sobre muestras idénticas en las mismas circunstancias no conducen
generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo,
instrumentarl, reactivos, tiempo,etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión.
La precisión engloba diferentes tipos de estudios:
La precisión de un método analítico se expresa generalmente como el coeficiente de variación (CV) de una serie de medidas y se calcula matemáticamente de la
siguiente manera:
CV (%) = (s/ x)*100; donde "s" = desviación estándar y " x " media aritmética de los resultados
Procedimiento:
a) El ensayo de repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio
(preparación de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista.
b) Se realiza la prueba entre 7 a 10 veces
c) Esta muestra homogénea puede ser preparada en el laboratorio ó una muestra de planta.
d) Se halla los coeficientes de variación (CV); para la mayoría de ensayos instrumentales los CV <2.0%, para análisis de trazas ó límites se admiten CV < 5.0% ó más
altos.
RECOLECCIÓN DE DATOS PARA VALIDACIÓN
Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
Repetibilidad °T máxima: %HR máxima:
Analista No.1
V ó W (teórico) 10.00000 Agua dest. Cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias
Analista No.2
V ó W (teórico) 10.00000 Agua dest. Cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias
10.00000 1 0.03800 0.03800 Desviación estándar
10.00000 2 0.03900 0.03900 Coef. de Variación
10.00000 3 0.03900 0.03900
10.00000 4 0.03800 0.03800
10.00000 5 0.03800 0.03800
10.00000 6 0.03600 0.03600
10.00000 7 0.04000 0.04000
uestra homogénea en las
laboratorio.
aleatorios inherentes a todo
unstancias no conducen
s (analista, equipo,
emáticamente de la
Reproducibilidad
Diferente
Diferente
Diferente
Diferente
Diferente
0.0384
0.0011
2.9507 %
0.0383
0.0013
3.2742 %
PRECISION INTERMEDIA
Definiciones:
Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
aparatos, días, etc) y en un mismo laboratorio.
El objetivo del estudio de la precisión intermedia es determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en un mismo
laboratorio pero en condicones operativas diferentes.
En el estudio de la precisión intermedia se deben considerar aquellas circunstancias en las que se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe
evaluar los efectos usados al variar una serie de factores. Típicos factores a estudiar incluyen el día, el analista, el instrumento, etc. (ver tabla 1) no es necesario
estudiar cada uno de estos factores individualmente sino que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto de factores está dentro de los
límites establecidos.
Procedimiento:
El ensayo de precisión intermedia del método se efectúa sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el
principio (preparación de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista.
Se realiza la prueba entre 3 veces cada analista participante por cada día de la prueba.
La muestra homogénea puede ser preparada en el laboratorio o una muesta de planta
Se halla los coeficientes de variación (CV); CVtotal < 2 CVrepetibilidad
50 4 0.040 0.040
3 50 5 0.039 0.039
50 6 0.039 0.039
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.039
50 1 0.038 0.038 Desviación estándar 0.0006
Dia 1 1 50 2 0.039 0.039 Coef. de Variación indi. 1.49
50 3 0.039 0.039
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.039
50 1 0.038 0.038 Desviación estándar 0.0006
Dia 1 2 50 2 0.039 0.039 Coef. de Variación indi. 1.49
50 3 0.039 0.039
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.038
50 1 0.039 0.039 Desviación estándar 0.0015
Dia 1 3 50 2 0.036 0.036 Coef. de Variación indi. 4.06
50 3 0.038 0.038
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.040
50 1 0.040 0.040 Desviación estándar 0.0006
Dia 2 1 50 2 0.040 0.040 Coef. de Variación indi. 1.43
50 3 0.041 0.041
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.040
50 1 0.039 0.039 Desviación estándar 0.0010
Dia 2 2 50 2 0.041 0.041 Coef. de Variación indi. 2.50
50 3 0.040 0.040
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.039
50 1 0.040 0.040 Desviación estándar 0.0006
Dia 2 3 50 2 0.039 0.039 Coef. de Variación indi. 1.47
50 3 0.039 0.039
Precisión intermedia (cambio de instrumento)
Datos analista 1:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.094
50 1 0.093 0.093 Desviación estándar 0.0023
1 50 2 0.093 0.093 Coef. de Variación indi. 2.45
1
50 3 0.097 0.097
Datos analista 2:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.093
50 1 0.094 0.094 Desviación estándar 0.0006
2 50 2 0.093 0.093 Coef. de Variación indi. 0.62
50 3 0.093 0.093
Datos analista 3:
V (mL) W (mg) 50 Agua des. cargada (0,2ppm) Resp. Correg. Promedio absorbancias 0.094
50 1 0.095 0.095 Desviación estándar 0.0010
3 50 2 0.094 0.094 Coef. de Variación indi. 1.06
50 3 0.093 0.093
entes analistas,
uestra en un mismo
o. El analista debe
a 1) no es necesario
s está dentro de los
entemente desde el
EXACTITUD
Definición y generalidades:
La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el
valor experimental encontrado.
No deben confundirse exactitud con precisión. La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de medicines, pero no da ninguna indicación de lo cerca qu
está del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de
precisión.
La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la
media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza
Método de placebo cargado: Se prepara un placebo del problema que contiene todos los ingredientes excepto el analito a determinar. Sobre dicho placebo se añade
cantidades conocidas de un analito patron a tres niveles de concentración dentro del rango a estudiar. El ensayo de recuperación se realiza como mínimo con 3
replicados para cada nivel. El analito se determina en cada muestra utilizando el mismo método analítico a evaluar y se calcula la recuperación (Greeb, 1996 Carr. 199
Mehta 1989). El problema del método de placebo cargado está en como se introduce el analito sobre el placebo. El proceso de adición, por mucho que simule lo más
exactamente posible la preparación del producto acabado, solo se trata de una aproximación ya que en el producto acabado real el analito o principio activo está
intimamente mezclado con los otros ingredientes. Po lo tanto, la eficacia de la recuperación obtenida con el método del placebo cargado puede llegar a ser más elevad
de lo que en realidad es. Aún teniendo en cuenta este inconveniente.
Procedimiento:
a.) Se prepara placebo o matriz sin el analito
b.) Añadir cantidades exactas del analito en tres niveles de concentración del rango lineal, realizar triplicado en cada nivel.
c.) Se prepara para cada nivel de adición estándares por duplicado.
d.) Se halla los porcentajes de recuperación de las muestras adicionadas de acuerdo a la fórmula:
Porcentaje de recuperación ® = Xm / μ * 100
Diferencia = Xm - μ
Donde:
Xm = valor medio hallado
μ = Valor aceptado como verdadero
e.) Los porcentajes de recuperación deben estar entre 98.0% y 102.0%, para análisis de trazas o límites se admiten recuperaciones entre el 95.0% y
105.0%.
f.) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp < Gtab, las
varianzas no inciden sobre los reultados.
g) Finalmente se aplica test t. (p = 0.05; gl =_ 3 - 1 = 2) = 4.303
|100 - x | * n Al ser t exp < t tab no existe diferencia significativa entre la recuperación medida y el
t exp= 100% por lo que la exactitud es correcta
CV
X = promedio de recuperaciones
n = número de niveles
CV= coeficiente de variación de recuperaciones
Fecha : 15/May/2007
°T mínima:
°T máxima:
Cuadro 4. Determinación de la exactitud. 1.600
Dato X Y XY X2 Y2 %R 1.400 R² = 0.9737923528
1 1.200
Absorbancia encontrada
1.117 1.019 1.138 1.248 1.039 91.25
1.000
2 1.117 1.075 1.201 1.248 1.156 96.26
0.800
3 1.117 1.052 1.175 1.248 1.107 94.18
0.600
4 1.299 1.273 1.653 1.688 1.620 97.96
0.400
5 1.299 1.308 1.699 1.688 1.711 100.69
0.200
6 1.299 1.280 1.663 1.688 1.638 98.51 0.000
7 1.559 1.495 2.331 2.430 2.235 95.90 1.000 1.100 1.200 1.300 1.400 1.500 1.600
8 1.559 1.512 2.356 2.430 2.285 96.95 Absorbancia aceptada como verdadera%
Datos corregidos para exactitud por debajo de la concentración nóminal Analisis de varianzas (test de cochra
V (mL) ó W Resp.
(mg) 20.00 Respuestas
Correg.
Prom. Abs. std 1.117 %R Promedio
20.80 1 1.060 1.019 Desviación estánd. 0.0000 91.25 93.896
Muestra 21.00 2 1.129 1.075 Coef. de Variación 0.00 96.26
20.80 3 1.094 1.052 94.18
20.09 1 1.122 1.117 97.96 99.055
Estándar 20.09 2 1.122 1.117 100.69
20.09 3 1.122 1.117 98.51
95.90 96.133
96.95
95.55
Gexp
Datos corregidos para exactitud en la concentración nóminal
V (mL) ó W Resp.
(mg)
25.00 Respuestas Prom. Abs. std 1.299
Correg.
25.40 1 1.293 1.273 Desviación estánd. 0.0000
Muestra 25.40 2 1.329 1.308 Coef. de Variación 0.00
25.57 3 1.309 1.280
24.94 1 1.296 1.299
Estándar 24.94 2 1.296 1.299
24.94 3 1.296 1.299
medida y el
%HR mínima :
%HR máxima:
923528
) = 0.8709
n" el número de
) = 0.8709
n" el número de
1.442 2.079
0.732 0.536
0.708
Volver
Intro
Volver
Intro
EXACTITUD ADICION PATRON
Definición y generalidades:
Método de adición de patrón: Se utiliza esta aproximación cuando no es posible preparar un placebo de la matriz de la muestra que no contenga el analito. Este podría
ser el caso de las muestras liofilizadas en los que la presencia o ausencia del analito es significativamente distinta. Se añaden sobre una o varias muestras cantidades
conocidas de un analito patrón a tres niveles de concentración dentro del rango a estudiar. Se realizan como mínimo 3 replicados para cada nivel y se analizan las
muestras adicionadas y no adicionadas según el método analitico calculando finalmente la recuperación. Este método tiene la ventaja de utilizar muestras reales y no
requiere la preparación especial de un placebo cargado. ya que la adición de un patrón sobre una muestra no es exactamente lo mismo que el producto acabado real.
Procedimiento:
a) Se trabaja con la ecuación de la curva del rango lineal.
b) A una cantidad de matriz del proceso se añade cantidades conocidas exactas del analito en tres niveles de concentración del rango lineal, realizar triplicado en cada
nivel.
c) Se hallan las respuestas experimentales netas para las concentraciones adicionadas y se compara con los resultados obtenidos por interpolación con la recta de
calibración para las mismas concentraciones del analito.
d) Los porcentajes de recuperación deben estar entre 98.0% y 102.0%, para análisis de trazas ó límites se admiten recuperaciones entre 95.0% y 105.0%.
e) Se verifica las varianzas en cada nivel de concentración para ver la incidencia de estos en los resultados, realizando un test de cochran (G), si Gexp < Gtab, las
varianzas no inciden sobre los resultados.
f) Finalmente se aplica test t. (p = 0.05; gl =_ 3 - 1 = 2) = 4.303
|100 - x | * n Al ser t exp < t tab no existe diferencia significativa entre la recuperación medida y el
t exp= 100% por lo que la exactitud es correcta
CV
X = promedio de recuperaciones
n = número de niveles
CV= coeficiente de variación de recuperaciones
medida y el
%HR mínima :
%HR máxima:
4284357
) = 0.8709
n" el número de
1.788 3.196
1.192 1.421
0.7346429037
Volver
Intro
LIMITE DE DETECCCION Y CUANTIFICACION
Definición y generalidades:
Dado un método analítico determinado se entiende por límite de cuantificación (LC) de dicho método, la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se pue
las condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud; y por límite de detección (LD) la mínima cantidad de analito en la muestra que se pu
no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales (ICH, QZA)
El límite de cuantificación es por tanto un término cuantitativo mientras que el límite de detección es solo cuantitativo, encontrándose entre ambos términos un rango de
el que si bien o puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos.
Existe gran variedad de métodos estadísticos para hallar el límite de detección y cuantificación; en el presente protocolo de validación aplicaremos el método de extra
de calibrado a concentración cero ( 0 ).
Procedimiento:
a.) Se trabaja con la ecuación de la curva del rango lineal (Y = mX+b), y se hacen correcciones de los valores de Y.
b.) Se calcula los residuos al cuadrado (Yexp - Yc)2.
c.) Se calcula la desviación estándar del blanco S (x/y)
SX/Y = {[S ( Y - Y1)2]/ (n-2)}1/2
Y = Respuestas
Y1 = Respuesta corregida
n = # de datos
d.) Se calcula los límites de cuantificación y detección.
LD = YB + 3SX / Y
LC = YB + 10SX / Y
e.) Se preparan para calcular estos límites tres muestras a concentraciones que se suponen cercanas al LC y se analizan en las condiciones descritas en el método ob
tabla de resultados:
f.) De este pequeño estudio de linealidad a concentraciones bajas se deduce una nueva recta de calibrado que será la que se extrapole. ( Y= mX +b)
g.) Se calcula r, r2 y T estadísticos, adicionalmente el test de cochran
h.) Se prepara una nueva curva (Y = mx + b) de desviación estándar de las medidas (eje Y) vs las concentraciones (eje X).
i.) Esta ecuación nos proporciona un nuevo valor de la ordenada en el origen Sbl.
j.) Se calculan los nuevos límites de detección y cuantificación de acuerdo a la ecuaciones:
LD (K=3) CD = Ybl + (3*Sbl)
------------------------------
m* 3
Ybl + (10*Sbl)
LC (K=10) CD = ---------------------------
m* 3
Nota: Lo que se trata de probar es la linealidad en este rango y la probabilidad de tener límites de cuantificación y de detección más bajos; de igual forma la decisión fin
exigencias del método que se está validando.
Fecha : 15/May/2007
°T mínima:
°T máxima:
Linealidad LC y LD
0.140 0.025
0.120 0.020
0.100 R² = 0.9994475158 R² = 0.9476635514
0.015
0.080
ÁREA
0.010
Àrea
0.060
0.040 0.005
0.020
0.000
0.000 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090 0
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700
CONCENTRACION %
Concentración (%)
Dato X Y Ym S LC y LD
1 0.011 1.50E-03
2 0.05000 0.012 0.011 1.00E-03
1.00E-03
3 0.010 R² = 0.0669872981
4 0.015
S
5.00E-04
5 0.07500 0.014 0.015 5.77E-04
0.00E+00
6 0.015 0.00000 0.02000 0.04000 0.06000 0.08000 0.10000 0.12000
7 0.019 CONCENTRACION BAJA
8 0.10000 0.021 0.020 1.15E-03
9 0.019
Ybl =2.11E-03 LD = (Ybl + (3 x Sbl)) / (m x (3)1/2) 0.014043
Sbl = 0.0007 LC = (Ybl + (10 x Sbl)) / (m x (3)1/2) 0.030384
presente en la muestra que se puede cuantificar bajo
de analito en la muestra que se puede detectar aunque
pole. ( Y= mX +b)
bajos; de igual forma la decisión final depende de las
%HR mínima :
%HR máxima:
X2 Y2 (Y/X)*100
0.00250 0.00012 22.000
0.00250 0.00014 24.000
0.00250 0.00010 20.000
0.00563 0.00023 20.000
0.00563 0.00020 18.667
0.00563 0.00023 20.000
0.01000 0.00036 19.000
0.01000 0.00044 21.000
0.01000 0.00036 19.000
LC y LD
35514
669872981
Volve
r
Intro
Volve
r
Intro
Robustez
La guía ICH, Q2A define la robustez de un método analítico como la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones
proporcionando idea de su fiabilidad o "estabilidad" durante su empleo en rutina. es por tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para proporcion
pequeños cambios respecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante su utilización.
La robustez (Robustness) no debe confundirse con el término Ruggedness que es el grado de reproducibilidad de los resultados mediante el análisis de las mismas mu
condiciones tales como diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, lotes de reactivos, días, tiempos, diferentes, temperaturas, etc.; es decir s
los parámetros especializados en él, pero introduciendo las condiciones experimentales las variaciones habituales de laboratorio a laboratorio. Da una idea de la influe
ambientales y operacionales del método en los resultados, por lo que podría asimilarse al término reproducibilidad.
Para los estudios de robustez normalmente se utilizan métodos donde se plantea un factorial; el usado en el siguiente protocolo es el de youlder-steiner; donde plantea
producir 8 ensayos.
Fecha : 15/May/2007
°T mínima: %HR mínima :
°T máxima: %HR máxima:
Factor Condición
Factor validado Condición validado Experimento Factor A/a Factor B/b Factor C/c
modific. modificada
1 A B C
pH 7,0 a pH 5,0
A 2 A B c
3 A b C
T 10 b T40
B 4 A b c
5 a B C
Tiempo lectura 0,5 H c Tiempo lectura 12 H
C 6 a B c
7 a b C
Balones tipo A d Balones tipo B
D 8 a b c
Cálculo del
Celda de vidrio normal e Celda de cuarzo efecto
E 0.002 0.000 0.002
Marca reactivo
Marca de reactivo Carlos Erba f AFECTA NO AFECTA AFECTA
F Merck
Factor Factor
Factor D/d Factor G/g Resultado
E/e F/f
D E F G 0.060
D e f g 0.061
d E f g 0.063
d e F G 0.059
d e F g 0.061
d E f G 0.057
D e f G 0.059
D E F g 0.059
Volver
Intro
Confirmación de rutina
Posterior a la validación se realiza una confirmación a lotes de rutina; confrontados frente a la recta de calibración de la validación; adicionalmente las muestras se carg
con cantidades conocidas de patrones para verificar su recuperación.
Blanco:
Ecuación de la recta de linealidad
BK1(X1) BK2
Lote1 0.041 0.040 0.19782 Pendiente (m)
Lote2 0.059 0.059 0.00028 Intercepto (b)
Lote3 0.040 0.040
Lote4 0.042 0.043
Lote5 0.041 0.041
Lote6 0.043 0.043
Suma 0.266000 0.266000
S 0.007 0.007
St 0.007
En la medida de lo posible, los laboratorios de ensayo acreditados tienen que indicar las Incertidumbres asociadas a los resultados cuantitativos según se establece en
Un requisito básico de la GUM es la utilización de un modelo matemático para evaluar la incertidumbre. Dicho modelo debe incluir todas las magnitudes que puedan re
contribución significativa a la incertidumbre asociada al resultado del ensayo. No obstante, pueden darse circunstancias en que no sea necesario el esfuerzo de crear u
detallado, en cuyo caso habrá que adoptar otras directrices y utilizar otros métodos basados, por ejemplo, en datos sobre la validación y las características del método
Campo de aplicación
Este protocolo tiene como finalidad proporcionar una directriz relativa a la evaluación1 de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos en los métodos usados en el lab
agua potable de EMCALI. Todo ensayo consistente en determinar el valor numérico de un mensurando o una característica se denomina ensayo cuantitativo
La determinación de las características de un método de ensayo es, con frecuencia, esencial para evaluar la incertidumbre asociada a los resultados. Esto es particula
cuando los resultados están sujetos a efectos importantes e imprevistos, que mejor se pueden considerar aleatorios, o cuando es imposible crear un modelo matemátic
Los datos sobre las características del método suelen considerar también el efecto simultáneo de distintas contribuciones a la incertidumbre y, por tanto, su utilización p
considerablemente el proceso de evaluación de la incertidumbre. La información sobre las características del método de ensayo suele derivarse de:
• Datos obtenidos durante la validación y verificación de un método de ensayo antes de su aplicación en las condiciones del ensayo.
• Estudios de ínter comparación conforme a ISO 5725.
Datos obtenidos de los controles de calidad (es decir, con muestras de control);
• Programas de ensayos de aptitud.
Procedimiento
En la práctica, la idoneidad de los métodos de ensayo utilizados para realizar ensayos rutinarios suele comprobarse por medio de estudios de validación y verificación
datos así obtenidos sirven para evaluar la incertidumbre global del método de ensayo evaluado.
Se utiliza el siguiente modelo matemático:
UCRM = Incertidumbre expandida del material de referencia ó tolerancia del patrón de referencia.
K = Factor de cobertura del material de referencia certificado ó (3)1/2.
S = Desviación estándar del ensayo de precisión intermedia en la validación
n = Número de veces de análisis en la precisión intermedia.
Tratamiento de muestra
1. Incertidumbre debida a la precisión
50ml muestra Incertidumbre estándar U
0.00299
Adición de 2 mL HCl + 1 mL NH2OH.HCl
m= 0.19782 b= 0.00028
Incertidumbre precisión intermedia: Incertidumbre verificación de la trazabilidad del método
ctor.
r su magnitud y la magnitud de la
icional.
Incertidumbre
estándar
5.8E-05
0.0E+00
2.9E-02
0.0E+00
0.0E+00
0.0E+00
0.0E+00
0.0E+00
Volver
Intro
CERTIFICADO DE LA VALIDACION PARA DETERMINAR HIERRO TOTAL EN AGUA
POTABLE
Conclusiones:
Fecha:
Analista 1: Analista 2: