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NUTRIÇÃO
a) os vegetais são fotossintéticos, isto é, obtêm energia da luz solar, e autotróficos, nutrindo-se
exclusivamente de substâncias inorgânicas;
A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos
microrganismos. Seu papel é múltiplo. Com exceção dos protozoários, capazes de englobar
partículas sólidas, os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias em solução
através da membrana citoplásmica. A água é o solvente universal. Além disso, a água exerce
função primordial na regulação da pressão osmótica e, pelo seu elevado calor específico, na
regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não
ser quando esta é precedida de um congelamento brusco a, no mínimo, 30°C negativos.
Como a água, o oxigênio atmosférico não é um nutriente, e funciona apenas como receptor
final de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam
diferentemente em presença de O2 livre:
microrganismos aeróbios exigem a presença de oxigênio livre; alguns, todavia, o exigem em
pequena quantidade, não tolerando as pressões normais de O2 atmosférico: são os
microaerófilos;
microrganismos -anaeróbios não toleram a presença de oxigênio livre, morrendo rapidamente
nessas condições; microrganismos facultativos tanto podem crescer na presença como na
ausência de oxigênio livre.
Entre as bactérias, encontramos os três tipos de comportamento. As algas são aeróbias, bem
como os protozoários. Os fungos são aeróbios ou facultativos, nunca anaeróbios.
Meios seletivos são aqueles cujas características impedem o crescimento de certos germes,
permitindo apenas o crescimento de outros. O meio descrito em 1.4.2, por exemplo, é seletivo
para germes fotolitotróficos. Muitas vezes a seletividade do meio depende da adição de algum
composto inibidor dos germes indesejáveis. Assim, por exemplo, corantes básicos inibem o
crescimento de germes Gram-positivos, enquanto que a azida sódica inibe os Gram-negativos.
Meios diferenciais são aqueles que conferem características especiais às colônias de germes que,
em condições normais, seriam idênticas. Assim, germes fermentadores de lactose, semeados em
meio contendo lactose e um indicador, dão colônias de cor diferente das dos não-fermentadores,
pois, crescendo, fermentam a lactose, dando ácido Tático, que faz "virar" o indicador.
A massa total de uma, população microbiana, crescendo em meio líquido, pode ser determinada
de várias formas, conforme segue.
a) Determinação do peso seco ou úmido. A medida do peso úmido é bastante falha, dando
apenas uma idéia grosseira da massa microbiana presente. Prefere-se, por isso, a determinação
do peso seco, que, sendo corretamente executada, constitui o processo básico de medida de
massa, servindo como referência na padronização de outros métodos. Uma amostra de 50 ml ou
mais da suspensão microbiana é centrifugada, o sobrenadante desprezado e o sedimento celular
lavado algumas vezes com água destilada. Apôs a última centrifugação, o sedimento é colocado
em um vidro de relógio previamente tarado e, em seguida, secado em estufa até peso constante.
Há, contudo, certas limitações inerentes a essa técnica. São necessárias amostras relativamente
grandes para que as medidas tenham significado. Isso significa que não é possível acompanhar o
crescimento de uma população microbiana desde as suas fases iniciais, sendo necessário esperar
que a massa atinja um nível crítico. A lavagem das células antes da secagem pode levar a perdas
de material e, além disso, componentes celulares solúveis podem ser retirados. O processo não
pode geralmente ser aplicado quando o meio de cultura contém partículas sólidas em suspensão.
1. Contagem do número total de indivíduos, sem levar em conta se estão vivos ou mortos. A
técnica mais comum está em colocar diluições conhecidas da suspensão em câmaras de
contagem e, sob o microscópio, enumerar diretamente o número de partículas presentes num
determinado volume. Outra técnica consiste em espalhar-se uma quantidade conhecida da
suspensão numa área determinada de uma lâmina, corá-la e, em seguida, contar o número de
germes presentes em vários campos do microscópio. Sabendo-se a área do campo, calcula-se
o número de germes da suspensão. Existem atualmente aparelhos eletrônicos que contam
automaticamente o número de partículas de uma suspensão.
a) Fase de "lag". Inicialmente há um período em que contagens de germes não revelam aumento
de número. Determinações de massa, todavia, geralmente demonstram que há um aumento,
reflexo de um aumento no tamanho dos indivíduos. Essa fase só ocorre quando os
microrganismos semeados provêm de uma cultura velha, não mais em crescimento exponencial.
É a conseqüência de uma necessidade de renovação dos microrganismos que, em culturas velhas,
já perderam certos sistemas enzimáticos por esgotamento do substrato, estão deficientes em
ácidos nucléicos e outros componentes importantes do protoplasma. Ao serem colocados em
novo meio de cultura, antes de iniciarem sua multiplicação, passam por essa fase de renovação,
aumentando de tamanho em conseqüência da síntese de material. É claro que germes crescendo
exponencialmente, semeados em meio idêntico, não apresentam fase de lag; apresentá-la-ão,
todavia, se o novo meio for mais pobre que o original. A semeadura de microrganismos, mesmo
velhos, em meio mais rico que o original leva, na maior parte das vezes, a uma supressão ou
redução da fase de lag.
d) Fase de declínio. Depois de um certo tempo, o número de germes que morre torna-se
progressivamente superior ao dos que surgem. Eventualmente a cultura se esteriliza. A
duração dessa fase é, também, extremamente variável.
d) Agitação. Uma das conseqüências da agitação é promover uma melhor aeração do meio,
favorecendo o crescimento de germes aeróbios e facultativos. Além disso, entretanto, a agitação
promove uma homogeneização dos nutrientes no meio de cultura e uma dispersão dos produtos
metabólicos, o que também favorece o crescimento, de maneira apreciável, inclusive de
microrganismos anaeróbios.
Denomina-se esterilização o processo pelo qual são mortos todos os germes de um matéria! ou
suspensão, inclusive as formas esporuladas. Geralmente os processos empregados para esse fim
são processos físicos, por serem mais eficientes e, com algumas exceções, menos dispendiosos
que os químicos.
1.6.2. TEMPERATURA
De todos os processos empregados para malar microrganismos, o calor é sem duvida alguma, o
mais eficiente e econômico. Pode ser empregado de duas maneiras: seco e úmido. O calor seco
age, presumivelmente, promovendo uma oxidação violenta de componentes do protoplasma. Sua
eficiência e relativamente baixa, pois não tem muita capacidade de penetração. Alem disso, não e
todo tipo de material que pode ser submetido as temperaturas necessárias para esterilização pelo
calor seco (160 a 180 °C" durante um tempo mínimo de uma ou duas horas). Empregam-se, para
vidraria, óleos ou pós; nem todo material metálico pode ser esterilizado a seco; certos
instrumentos delicados podem perder o corte ou a tempera. O processo da flambagem. utilizado
nos laboratórios de microbiologia para esterilizar alças e fios de platina, boca de tubos de
ensaio e outros instrumentos, consiste em passar-se o material diretamente na chama do bico de
Bunsen.
O calor úmido e muito mais eficiente. Age promovendo a desnaturação de proteínas e dissolução
de lipídeos, o que também contribui para intensificar o primeiro processo. Tem alta capacidade
de penetração e pode ser utilizado para uma grande variedade de materiais, inclusive biológicos.
A temperatura de 60 :C, durante uma hora e suficiente para matar as formas vegetativas de todos
os microrganismos. excetuando-se os termófilos, naturalmente. A 100 °C as formas vegetativas
morrem em poucos minutos; se mantida essa temperatura durante 15 min. morrem, também, a
maioria dos esporos. Assim sendo, a simples fervura e um processo que pode ser utilizado para
esterilizar certos tipos de material. Ha, contudo. esporos, principalmente de germes saprófitos.
que podem resistir ao aquecimento a 100 °C durante varias horas, suportando, mesmo,
temperaturas um pouco mais altas. Para matar qualquer tipo de microrganismo. inclusive todos
os tipos de esporos, emprega-se vapor d'agua aquecido a 120°C, sob uma pressão de uma
atmosfera acima da normal, durante 20 min. O aparelho utilizado para esse fim e a autoclave,
que consiste num recipiente de paredes resistentes onde se coloca o material. O vapor poderá ser
produzido pelo aquecimento da água contida na própria autoclave ou ser introduzido por
tubulação adequada. Para que o processo seja eficiente. e indispensável que se evite mistura de ar
ao vapor, e que o material esteja acondicionado e distribuído de forma conveniente. Certos tipos
de material não podem ser submetidos a temperaturas tão elevadas; meios de cultura contendo
hidratos de carbono como sacarose, por exemplo. não podem ser esterilizados dessa forma.
Nesses casos recorre-se ao processo da tindalização. Nesse processo, o material é aquecido a
temperaturas relativamente baixas (70 a 100 ºC) durante uma hora, em três dias consecutivos.
No primeiro aquecimento, morrem as formas vegetativas. Com o resfriamento do material,
germinam os esporos porventura existentes, passando a formas vegetativas que serão destruídas
pelo aquecimento subseqüente e. assim, até a esterilização total. É óbvio que tal processo só
funciona quando o meio de suspensão é nutriente, capaz de promover a germinação dos esporos.
De um modo geral, os microrganismos são mais resistentes ao frio do que ao calor. Com
algumas exceções, a temperatura de geladeira (5 ºC) pode ser empregada para a conservação de
culturas. Temperaturas inferiores a 0"'C podem ser letais para microrganismos. O congelamento
lento promove a formação de cristais de gelo que perfuram a membrana e a parede celulares. A
alternância de congelamento e descongelamento é um processo bastante eficiente pata destruir
microrganismos. O congelamento brusco a temperaturas inferiores a -30 C não leva à formação
de cristais, e os microrganismos geralmente sobrevivem durante muno tempo nessas condições,
principalmente se o processo é seguido de um dessecamento a vácuo. Essa é a técnica da
liofilização, empregada para a conservação de microrganismos e de material biológico em geral.
1.6.3. RADIAÇÕES
De interesse prático pela sua atividade letal sobre microrganismos são as radiações ultravioleta
(UV) e as radiações chamadas ionizantes.
As radiações ionizantes exercem atividade de forma diferente, pois atingem átomos e não-
moléculas; são incomparavelmente mais eficientes. Enquanto que, para se matar uma célula de
Esclierichia coli, são necessários IO6 quanta, no caso dos raios UV, apenas 1 quantum é
suficiente quando se trata de radiações ionizantes. Atualmente o seu emprego é muito limitado
em virtude do alto custo do equipamento e dos riscos inerentes ao processo. As pesquisas em
curso visam sua aplicação à esterilização de produtos alimentícios e medicamentos.
Sons audíveis têm uma freqüência que não ultrapassa 24 000 Hz. Entre 9 000 e 200 000 Hz,
freqüências supersônicas e acima de 200 000 Hz ultra-sônicas. Muitos microrganismos são
sensíveis a vibrações ultra-sônicas, sendo destruídos por lise e extravasamento do conteúdo
celular. Uma das explicações para o fato baseia-se no fenômeno da cavitação: os gases
dissolvidos em líquidos submetidos a tais vibrações saem de solução sob a forma de micro
bolhas. Estas, violentamente agitadas, chocam-se contra as paredes microbianas, rompendo-as. O
emprego da sonicação para a ruptura de microrganismos tem sido útil, por permitir a obtenção
de frações independentemente de um tratamento químico ou térmico e isentas de partículas
inertes como alumina.
Desinfetantes. São substâncias que agem diretamente sobre estruturas microbianas, causando a
morte do microrganismo. As principais estruturas envolvidas no processo são a membrana
citoplasmática, sensível aos agentes capazes de dissolver os lipídeos que a compõem, e as
proteínas enzimáticas ou estruturais, sensíveis a uma variedade de substâncias com mecanismos
diversos de ação: oxidantes. desnaturantes, alquilantes, ativos contra grupos sulfidrílicos, etc.
Pelo fato de agirem sobre estruturas comuns a todas as células, quer de microrganismos, quer de
seres superiores, os desinfetantes são tóxicos gerais, não possuindo especificidade para este ou
aquele microrganismo e não podendo ser introduzidos nos organismos superiores. É claro que
nem todos os germes são igualmente sensíveis, mas o que sucede, em geral, ê que. quando um
microrganismo é mais resistente, ele o é a iodos os desinfetantes indiscriminadamente. É o que
acontece, por exemplo, com Pseudomonas aeruginosa. Certos desinfetantes, tendo uma ação
mais branda, podem ser usados na superfície de tecidos vivos. Nesse caso particular, tomam • o
nome de antissépticos.
Agentes quimioterápicos. São substâncias que interferem, na grande maioria dos casos, em
determinadas vias metabólicas, isto é. a ação dos agentes quimioterápicos se restringe às células
de microrganismos que possuem a via metabólica sensível. Assim, por exemplo, a sulfanilamida
age competindo com o ácido p-aminobenzóico, que é um metabólito essencial para a síntese do
ácido fólico. Células ou microrganismos incapazes de sintetizar ácido fólico são resistentes
àquele agente. Os agentes quimioterápicos podem ser sintéticos, como é o caso das sulfas e
cloranfenicol ou naturais, como os antibióticos, sendo, então, produzidos por microrganismos: é
o caso da penicilina, estreptomicina, tetraciclinas etc.
Deve-se ressaltar que. em tecnologia industrial, o termo desinfetante é utilizado para designar
qualquer agente químico empregado num processo microbiológico para inibir ou matar
microrganismos contaminantes indesejáveis. Tanto podem ser utilizados agentes do primeiro
grupo (desinfetantes) como do segundo (quimioterápicos).
que mata o mesmo germe, nas mesmas condições e no mesmo tempo, constitui o coeficiente
fenólico. Apesar de tal determinação ser obrigatória por lei, o coeficiente fenólico é um índice
extremamente precário da atividade de um desinfetante, a não ser que ele seja, também, de
natureza fenólica. Isso porque desinfetantes diferentes, tendo mecanismos de ação diferentes,
serão afetados de forma diversa pelas condições de uso. Assim, tem grande influência na
atividade dos desinfetantes o fator de diluição. Verificou-se ser válida a equação:
Cnt = K.