I.

INTRODUCCIÓN

La colorimetría es una de las técnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de
Bioquímica. Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en
disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela
monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso
emergente.
La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está
relacionada con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos
relaciones están combinadas en la ley de Lambert-Beer:
Log Io / I = ∈ c l
En donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l el paso
óptico de la muestra absorbente (cm), c la concentración de la especie absorbente (moles/litro)
y ∈ el coeficiente de absorción molar ( M 1 cm1 ). La expresión log Io / I se denomina
absorbancia y se designa por A (siendo adimensional). Fijando el paso óptico (habitualmente
1 cm), resulta que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentración del soluto
absorbente. El coeficiente de absorción molar varía con la naturaleza del compuesto
absorbente, el disolvente, la longitud de onda y también con el pH.
La aplicación obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la
concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (p. ej. Carotenos, clorofila,
hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o
aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados
coloreados.
Los espectros de absorción, gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda, son
frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e identificación de
biomoléculas.
La fotocolorimetria es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato
que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador
que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda.
 II. OBJETIVOS

 Obtener el espectro de absorción de una sustancia.

 Preparar una curva de calibración para una sustancia coloreada.
 Determinar la concentración de una muestra problema mediante factor de calibración
y curva de calibración.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES

Espectrofotómetro
Azul de metileno 0,1 %
Sulfato de cobre 10 %
Dicromato de potasio
Agua destilada
Pipetas de 5 – 10 ml
Matraz

3.2 METODOS (PROCEDIMIENTO)

3.2.1 OBTENCION DEL ESPECTRO DE ABSORCION

3.2.1.1 Encender el espectrofotómetro.

3.2.1.2 Preparar 20 ml de: CuSO4 , azul de metileno y K 2CrO2 .
3.2.1.3 Colocar agua destilada (solvente) en una cubeta del espectrofotómetro
para que sirva de blanco.
3.2.1.4 Medir el balance a la longitud de onda seleccionada como inicial: 400
nm.
3.2.1.5 Reemplazar el blanco con una cubeta que tenga la muestra a medir.
3.2.1.6 Realizar lecturas de intervalo de 25 nm.
3.2.1.7 Construir los espectros de absorción para cada solución representando
el valor de absorbancia en el eje vertical y la longitud de onda en el eje
horizontal.
 3.2.2 CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN
 Preparar soluciones de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS (ml) I II III IV V VI
CuSO4 --- 1 2 3 4 5

Agua Destilada 5 4 3 2 1 ---

 Leer las D. Q. de las soluciones preparadas a longitud de onda

adecuada ( resultados de 4.1)
 Construir en una curva de calibración con las D. Q. y sus
concentraciones respectivas.
 Hallar el F. C. para cada solución y sacar un promedio.
 Determinar la concentración de la muestra problema.

IV. RESULTADOS
V. DISCUSIONES

Se ven en los resultados de la absorbancia a partir de las soluciones de concentración

conocida como aumentan de manera proporcional al aumento de concentración, demostrando
la relación directamente proporcional entre la concentración y la absorbancia. Por lo que a
mayor concentración mayor absorbancia.

VI. CONCLUSIONES

 La fotocolorimetría consiste en medir la absorción de luz que produce una

determinada sustancia al paso de un color determinado. Para ello, se utiliza un aparato
llamado fotocolorímetro que utilizamos en el laboratorio y nos permitió medir la
absorción de la luz concretamente.
 Se obtuvo el espectro de luz de la CuSO4 y K 2CrO2 .
 Se pudo preparar su curva de calibración para dichas sustancias.
 Se pudo determinar la concentración mediante factores de calibración y curva de
calibración.
VII. CUESTIONARIO

¿Cuál crees que es el método más exacto para obtener la concentración de una muestra
problema, el grafico o analítico? ¿Por qué?

El analítico, ya que es un instrumento especializado para el análisis químico que sirve

para medir la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud
fotométrica relativos a radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se
miden en una muestra.

¿Qué factores alteran la ley de Lamber y Beer?

Esta ley solo se cumple para concentraciones bajas, a partir de una concentración
0,01M empieza a haber desviaciones de la linealidad.
Además si la radiación utilizada no es monocromática, también puede haber errores.

¿El color que exhibe una sustancia está determinada por la luz que transmite o que
absorbe?

El color que exhibe se debe a lo absorbe, ya que El color que absorbe es el

complementario del color que transmite

A fin de probar la validez de la ley de BEER en la determinación de la vitamina A, se

prepararon soluciones de concentración conocida y se trataron por un procedimiento
normalizado con tricloruro de antimonio en cloroformo para producir una coloración
azul. El porcentaje de trasmisión de la luz icidente filtrada para cada concentración,
1
expresada en ug ml , fue el siguiente:
1
Concentración ug ml 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

Transmisión, % 66,8 44,7 29,2 19,9 13,3

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS

 http://documents.mx/documents/practica-no1-fotocolorimetria.html

 http://www.academia.edu/4264776/FOTOCOLORIMETRIA_carlos_lavarez
Carlos Alvarez Betin