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ÍNDICE
INTRODUÇÃO
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
SUGESTÃO BIBLIOGRÁFICA
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INTRODUÇÃO
Nos últimos anos a demanda por agentes de controle biológico vem crescendo
no Brasil e no mundo devido à preocupação com a segurança alimentar e
sustentabilidade da produção agrícola. Isto porque, a intensificação do uso de
bioprodutos para o controle de fitopatógenos contribui diretamente para a redução da
utilização de agrotóxicos nos sistemas agrícolas, diminuindo os impactos negativos
desses produtos no ambiente e na saúde humana.
Dentre os agentes de biocontrole, fungos do gênero Trichoderma encontram-se
entre os mais conhecidos e comercializados em todos os países devido ao grande
potencial que possuem para melhorar a sanidade das plantas e a produção vegetal
(Harman, 2004a; Bettiol et al. 2012).
Embora sejam conhecidos há mais de 80 anos, o incremento das pesquisas
visando entender melhor o potencial biotecnológico desses fungos ocorreu apenas nas
últimas três décadas. Revisões recentes descrevem a evolução dos estudos realizados
sobre o gênero Trichoderma, justificando a importância desses fungos na produção
agrícola mundial (Brotman et al., 2012; Carreras-Villasen et al., 2012; Gruber e Seidl-
Seiboth, 2012; Harman et al., 2012; Hermosa et al., 2012, Lorito et al., 2010; Ryder et
al., 2012; Rubio et al., 2012).
Os bioprodutos a base de Trichoderma têm sido empregados com sucesso no
controle de fitopatógenos, principalmente os de solo, pertencentes aos gêneros
Fusarium, Pythium, Rhizoctonia e Sclerotinia, em culturas importantes como soja,
feijão, algodão, milho e várias hortaliças e plantas ornamentais (Bettiol et al., 2012).
Dentre as características responsáveis pelo sucesso desses fungos podem ser
mencionadas a facilidade com que são isolados, multiplicados e manipulados em
condições de laboratório; a produção abundante de conídios em vários tipos de meios e
substratos; a capacidade que possuem de colonizar o solo e o sistema radicular das
plantas e os diversos mecanismos que podem utilizar no controle de fitopatógenos e na
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promoção de crescimento de plantas (Melo, 1991; Howell, 2003; Harman et al., 2004a;
Harman et al., 2012).
1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios
por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de
suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxílio
de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Tampas para tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000± 0,04g;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121°C e 1 atm por 20
minutos.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
6.2 Pesar 10g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser
realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratação.
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6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em
cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
6.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 6.6 e 6.7 (diluição seriada), utilizando o
tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Campo 1
Campo 2
E1 E2 E5
E3 E4
Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por 103 e, quando utilizada a
diluição 10-4, por 104.
Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está
disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br (Produtos e serviços – softwares).
Esse software realiza cálculos e armazenadas as informações para a emissão de laudos.
A sugestão é que o software seja sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão
nas análises.
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8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma série de diluição seriada (Figura 3). A diluição selecionada, deve-se
colocar na câmara de Neubauer para contagem.
10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
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1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios
viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de
conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos
conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Tampa para tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensaio – tipo vortex;
- Banho de ultrassom e frequência de 40 kHz;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1.000mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20g;
- Ácido lático: 20g;
- Água destilada: 20g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magnético dentro de capela de exaustão de gases.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
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Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
7.2 Pesar 10g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma série de diluição para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve
ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratação.
7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
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7.8 Para obter a diluição 10-3repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluição seriada), utilizando o
tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 20µL da suspensão
para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.
Conídio ativo
não
Conídio germinado germinado
Conídio inativo
8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.2), sendo que de cada pesagem deve
ser realizada uma diluição seriada (itens 7.6 e 7.8). Da diluição selecionada, deve-se
colocar cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.10 e Figura 1 e 3).
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10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
11. GLOSSÁRIO
Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.
Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho
em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo.
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Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do conídio.
Conídios inativos: conídios não viáveis.
Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
conídio.
Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados.
Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios.
Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se
desfazem na presença de água.
Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande
estabilidade.
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1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de
colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o
diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado
diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias
formadas pelo Trichoderma.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Tampa para tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000 ± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensaio – tipo vortex;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121°C e 1 atm por
20 minutos.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
21
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e
para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:
7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do início da análise.
7.1.2 Pesar 10g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar com 90
g do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para
cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem
deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar
maior tempo de hidratação.
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
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Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição
apropriada.
Informação do fabricante Diluir até
105 10-6
106 10-7
107 10-8
108 10-9
109 10-10
1010 10-11
1011 10-12
1012 10-13
7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
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Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com três alíquotas de 20L da diluição seriada referente a marcação da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por
no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;
7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e
selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três
gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de
colônia.
7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça
de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma alça de Drigalski.
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da
solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton com alça de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2ºC, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
número de colônias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2ºC, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para
verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da
visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.
7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e
conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada duas séries de diluição (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas,
deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (item 7.2.3 e Figura 2).
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9. CONTAGEM DE COLÔNIAS
Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:
UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.
Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias.
Outra sugestão é a utilização da “Planilha Bacillus” para o cálculo da unidade
formadora de colônia, desenvolvida no âmbito do projeto Qualibio. A planilha permite
uma maior facilidade e precisão nas análises (Figura 3). Ela pode ser obtida no site:
http://www.cnpma.embrapa.br/, no link: “Eventos”, na parte de “Fórum” – “Bacillus
subtilis - 2012”.
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11. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
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1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios
por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de
suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio
de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
-Tampa para tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000 ± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensaio – tipo vortex;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121°C e 1 atm por 20
minutos.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
6.2 Pesar 0,1g do produto em erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com
solução salina com Tween a 0,1 % (corresponde às diluição 10-3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda
pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra
para evitar maior tempo de hidratação.
6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
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Campo 1
Campo 2
E1 E2 E5
E3 E4
Para obter a concentração do produto original, o resultado obtido deve ser multiplicado
pela diluição utilizada. Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por
103e, quando utilizada a diluição 10-4, por 104.
O resultado final será a média das 4 repetições.
Observação: O software, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está disponível
para cópia no site www.cnpma.embrapa.br (Produtos e serviços – softwares). Esse
software realiza cálculos e armazena as informações para a emissão de laudos. A
sugestão é que o software seja sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão
nas análises.
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8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na
câmara de Neubauer para contagem.
10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
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1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios
viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de
conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos
conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
-Tampa para tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000 ± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensaio – tipo vortex;
- Banho de ultrassom e frequência de 40 kHz;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1.000mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20g;
- Ácido lático: 20g;
- Água destilada: 20g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magnético dentro de capela de exaustão de gases.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
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Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDApodem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
7.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9
g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem (item 8). A
segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira
amostra para evitar maior tempo de hidratação.
7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida. Escolher a diluição apropriada segundo
a Tabela 1.
7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
37
Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 20µL da suspensão
para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.
7.10 Transferir as placas em BOD a25 ± 2º C, no escuro.
7.11 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em
função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8µL)
em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco
pontos por placa) (Figura 1).
7.12 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x.
38
Conídio ativo
não
Conídio germinado germinado
Conídio inativo
8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma diluição seriada (7.6). Da diluição selecionada, deve-se colocar cinco
gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.9 e Figura 1 e 3).
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10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
11. GLOSSÁRIO
Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.
40
1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de
colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o
diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado
diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias
formadas pelo Trichoderma.
2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Tampa de tubo de ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica calibrada com faixa de trabalho de 1 a 2000 ± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensaio – tipo vortex;
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5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121°C e 1 atm por
20 minutos.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
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esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e
para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:
7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do início da análise.
7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para
99,9 g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3). Devem ser
realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada
pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação
de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação.
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
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Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição
apropriada.
Informação do fabricante Diluir até
105 10-6
106 10-7
107 10-8
108 10-9
109 10-10
1010 10-11
1011 10-12
1012 10-13
7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
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Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com três alíquotas de 20L da diluição seriada referente a marcação da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por
no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;
7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e
selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três
gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de
colônia.
7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça
de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma alça de Drigalski.
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da
solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton com alça de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2ºC, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
número de colônias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2ºC, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para
verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da
visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.
7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e
conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada duas séries de diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições
selecionadas, deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (item 7.2.3 e
Figura 2).
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9. CONTAGEM DE COLÔNIAS
Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:
UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
BETTIOL, W.; GHINI, R.; MORANDI, M.A.B.; STADNIK, M.J.; KRAUS, U.;
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América Latina. In: ALVES, S.B.; LOPES, R.B. (eds.). Controle Microbiano de Pragas
na América Latina – Avanços e Desafios. Piracicaba, Fealq, 2008, p. 303-331.
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139–146, 2012.
GRUBER, S.; SEIDL-SEIBOTH, V.Self versus non-self: fungal cell wall degradation
in Trichoderma. Microbiology., vol. 158, p. 9–26,2012.
HARMAN, G.E.; HOWEL, C.R.; VITERBO, A.; CHET, I.; LORITO, M.Trichoderma
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RYDER, L. S.; HARRIS, B. D.; SOANES, D. M.; KERSHAW, M. J.; TALBOT, N. J.;
THORNTON, C. R. Saprotrophic competitiveness and biocontrol fitness of a
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SUGESTÃO BIBLIOGRÁFICA
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G.; KUBICEK, C.P. An oligonucleotide barcode for species identication in
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BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B.; PINTO, Z.V.; PAULA JÚNIOR, T.J.; CORREA,
E.B.; MOURA, A.B.; LUCON, C.M.M.; COSTA, J.C.B.; BEZERRA, J.L. Produtos
Comerciais à Base de Agentes de Biocontrole de Doenças de Plantas. Jaguariúna, SP,
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88). Acesso: http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/66628/1/Doc-88-1.pdf