UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE

TECÁMAC

DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

Práctica No 1: “AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE

MUESTRAS BIOLOGICAS”

OBJETIVO: Aplicar las técnicas de dilución para el procesamiento de muestras

biológicas. Aplicar las técnicas de aislamiento en placa a partir de las
muestras biológicas. Realizar el aislamiento de microorganismos a
partir de muestras biológicas en diferentes medios de cultivo.

INTRODUCCIÓN.
Para la identificación y cuantificación microbiana en una muestra, existen
métodos microbiológicos tanto en placa como en tubo. Las principales etapas
para la identificación y cuantificación microbiana son:
a. Preenriquecimiento. Etapa en la cual se aumenta la viabilidad de la
flora microbiana presente de la muestra, generalmente se utiliza cuando
esta ha sufrido un proceso técnico o de estrés microbiano, como
cambios de pH, baja actividad acuosa, etc.
b. Enriquecimiento. Se lleva a cabo en medios de cultivo selectivos donde
se propicia el crecimiento de microorganismos de interés y se evita el
crecimiento de la flora contaminante.
c. Aislamiento. Fase en la que se utilizan medios de cultivo como
selectivos y diferenciales, con la finalidad de obtener el cultivo axénico
o puro. Es de suma importancia la morfología colonial desarrollada.
d. Pruebas bioquímicas. En esta etapa se evalúa la presencia de
metabolitos o el uso de diferentes sustratos en medios de cultivo
diferenciales.
 e. Pruebas serológicas. A partir de un cultivo axénico se evidencia los
antígenos somáticos o flagelares del microorganismo mediante la
reacción específica antígeno-anticuerpo.
f. Identificación fágica. Se realiza mediante la evaluación a la infección
del microorganismo por un bacteriófago altamente específico.
g. Pruebas moleculares. Mediante las técnicas de Reacción en Cadena
de la Polimeriza (PCR) a partir de iniciadores o “primers” específicos se
identifican a partir de su patrimonio genético al microorganismo.
Cabe señalar que la técnica más empleada para el aislamiento microbiano
es la siembra en placa, sin embargo, dependiendo del inóculo inicial es necesario
usar una serie de diluciones de tal forma que después del periodo de incubación
correspondiente se obtenga entre 30 - 300 unidades formadoras de colonia (UFC)
por placa.
En función de los datos esperados que se tengan de la muestra, los
factores de dilución más empleados son binarios o diluciones base 2 y decimales
o diluciones base 10, donde al número de UFC encontradas se multiplica por el
inverso de la dilución. En una muestra desconocida se recomienda por tanto, usar
diluciones binarias para no perder el inóculo y hacer más sensible el conteo
microbiano.
Las técnicas más usadas para el aislamiento en placa son:
 Estría cruzada. Se realiza a partir de la inoculación de la placa con una
asada y se esparce con movimiento en zig-zag en un cuarto de la placa.
Posteriormente se esteriliza el asa bacteriológica por incineración, se
enfría en al agar en condiciones estériles y se toca la mitad de las veces
el estriado anterior y la otra mitad sin tocarlo, aproximadamente 8 a 10
estrías, repitiéndose dicha operación dos veces más, donde en la última
estría se gira hacía el centro de la placa.
 Estría simple. A partir de una asada de inóculo se esparce en medio de
la placa, se incinera el asa, se enfría en el agar y se disemina el inóculo
en toda la placa con estrías en zig-zag.
  Espatulado, varilla acodada o técnica de Drigalsky. Consiste en
depositar un volumen de 0.1 mL de inóculo en una placa y con una
varilla acodada de vidrio previamente flameada con alcohol, se esparce
el inóculo con movimientos rotatorios por toda la placa.
 Vaciado en placa. En esta técnica se deposita 1 mL del inóculo en una
caja de Petri vacía y estéril. Posteriormente se vierten de 12 a 15 mL de
agar fundido a una temperatura soportable en el dorso de la mano (48ºC
aproximadamente).

MATERIAL BIOLÓGICO. Una muestra de heces, orina, saliva y sangre.

MATERIALES Y EQUIPO.
2 placas de agar nutritivo
2 placas de agar papa dextrosa
2 placas de agar sal manitol
30 mL de agar rojo violeta y bilis fundido
1 asa bacteriológica
1 varilla acodada
2 cajas de Petri estéril
1 caja de Petri no estéril
10 mL de alcohol del 96%
1 gradilla
2 lámparas de alcohol o mecheros
5 tubos de ensaye con 9 mL de solución salina estéril
1 micropipeta de 1000 L
5 puntas de micropipeta en un frasco estéril
90 mL de solución salina estéril en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 vidrio de reloj
1 balanza granataria
1 espátula
MATERIAL QUE DEBERÁ TRAER CADA EQUIPO y que será utilizado en todas
las prácticas de laboratorio: Papel absorbente o klinex, Jabón para manos, Jabón
para lavar material, Maskintape, Franela, 6 Bolsas de polipapel, Alcohol en gel,
Fibra para lavar material y BATA.

METODOLOGÍA
1. A partir de una muestra biológica, pesar 10 g o 10 mL en condiciones
estériles según sea el caso y verter en el matraz Erlenmeyer
conteniendo la solución salina estéril.
2. Agitar perfectamente hasta que la muestra esté homogénea en el
diluyente.
3. Realizar el esquema de dilución hasta 1: 1 000 000 tomando una
alícuota de 1 mL del matraz y transferirla al tubo de ensaye con 9 mL de
solución salina estéril, repitiendo dicha operación hasta la última
dilución.
4. Estría cruzada.
a. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración, dejar enfriar y
tomar una asada de la dilución 1: 10 000.
b. Realizar un estriado en la placa de agar nutritivo haciendo de 8 a
10 estrías en forma de zig-zag.
c. Esterilizar el asa y enfriarla en un lugar de la placa sin inóculo.
d. Realizar un estriado tocando la mitad de las veces la estría
anterior y el resto sin tocar a ésta.
e. Repetir los dos pasos anteriores. En la cuarta y última estría
direccionar el inóculo hacia el centro de la placa.
f. Incubar la placa invertida a 37ºC por 24 horas en la estufa de
incubación.
5. Estría simple.
a. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración, dejar enfriar y
tomar una asada de la dilución 1 : 1000
 b. Realizar un estriado en medio de la placa de agar sal y manitol.
c. Incinerar el asa bacteriológica, enfriarla y realizar un estriado
descendente en toda la placa.
d. Incubar la placa invertida a 37 ºC por 24 horas en la estufa de
incubación.
6. Espatulado.
a. Depositar en condiciones estériles 0.1 mL de la dilución 1 : 100
en una placa de agar papa dextrosa.
b. Flamear la varilla acodada previamente sumergida en alcohol del
96%, dejar enfriarla sin sacarla del área estéril.
c. Esparcir el inóculo por toda la placa con la varilla acodada estéril
con movimientos rotatorios de ésta.
d. Incubar la placa invertida a temperatura ambiente por 3 días en la
estufa de incubación.
7. Vaciado en placa.
a. Tomar 1 mL de inóculo de la dilución 1 : 100 000 y colocarla en
una caja Petri estéril vacía.
b. Verter de 12 a 15 mL de agar rojo violeta y bilis fundido estéril
(48ºC aproximadamente al dorso de la mano) y homogenizar el
inóculo con movimientos rotatorios, 5 a la derecha y 5 a la
izquierda, sobre la mesa de trabajo.
c. Incubar la placa invertida a 37ºC por 24 horas en la estufa de
incubación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Reportar los crecimientos registrados en las placas y reportarlos en UFC / g
o mL de muestra, según sea el caso.
2. ¿Cuál es el motivo por el que se incuban las placas invertidas?
3. ¿Por qué es importante la temperatura de vertido del agar fundido en la
técnica de vaciado en placa?
 4. ¿En el caso de muestras que se desconoce la carga microbiana esperada,
explique porqué es mejor utilizar una dilución con menor factor que las de
mayor factor?
5. Defina un medio selectivo y un diferencial.

CONCLUSIONES
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DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

PRACTICA No.2 “FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA”

OBJETIVO:
Realizar la fermentación alcohólica a partir de zumo de frutos en diferentes
condiciones de aireación, como ejemplo de un proceso bioenergético.
INTRODUCCIÓN.
Dentro del metabolismo celular existen dos grandes vertientes desde el punto de
vista energético y biosintético. Aquellos en los cuales a partir de moléculas
complejas generalmente reducidas se obriene energía en forma de compuestos
fosfatados y poder reductor en forma de NADPH+ H+ y FADH2 llamado
catabolismo, complementariamente ese poder reductor y energía (ATP
comúnmente), se utiliza con fines biosintéticos , donde partiendo de moléculas
generalmente oxidadas y simples se generan moléculas reducidas complejas.
Rutas importantes del catabolismo celular se conoce con el nombre de
bioenergética, donde el común denominador es la obtención de energía. Las
principales rutas que la integran son: vía Embden Meyer Parnas (glicolisis), ciclo
de los ácidos tricarboxilicos (de Krebs), fosforilación oxidativa y cadena
respiratoria.
Fermentaciones.
La glicolisis es la vía por excelencia degradadora de carbohidratos, principalmente
hexosas las cuales dan como producto final ácido pirúvico, ATP, y NADH+ H+,
que dependiendo de la carga enzimática con que cuente la célula procariote o
eucariote así como las condiciones de oxido-reducción del entorno de este ácido
se canaliza a ciclo de Krebs o a una fermentación.
En sentido general una fermentación se entiende como toda transformación de un
sustrato por un ser vivo, liberando un metabolito, entonces un producto resultado
de una fermentación puede ser tan variado como un antibiótico, un ácido orgánico,
un aminoácido, aunque en el ámbito de la bioenergética una fermentación se lleva
a cabo a partir del ácido pirúvico generalmente en condiciones restringidas de
oxígeno y que como productos finales se generan ácidos orgánicos, alcoholes,
hidrogeno molecular o bióxido de carbono.
Una de las fermentaciones más importantes tanto a nivel industrial como
alimentario es la alcohólica donde a partir de la descarboxilación del pirúvato se
reduce a etanol más bióxido de carbono, donde la enzima más importante es la
deshidrogenasa alcohólica.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

1 mortero con pistilo estéril.
1 embudo de vidrio.
1 soporte universal con arillo.
1 gasa estéril.
10 gr de levadura de pan.
1 matraces erlenmeyer de 250 ml estéril con 100 ml de medio para levaduras.
4 matraces erlenmeyer de 250 ml estériles
2 pipetas graduadas estériles
4 pipetas Pasteur estériles
1 perilla
1 tapón de hule para matraz Erlenmeyer de 250 ml.
1 agitador orbital con baño maría.
1 peseta
2 lámparas de alcohol.
10 ml alcohol de 96º en caja Petri.
1 espátula.
500gr de frutas carnosa.
100gr de piloncillo.
1 equipo de destilación con refrigerante y soporte correspondientes.
1 refractómetro.

METODOLOGIA
1.- lavar perfectamente el fruto de elección.
2.- macerar el fruto en el mortero en condiciones de esterilidad.
3.- filtrar el macerado en el embudo previamente flameado con gasa estéril.
4.- colectar el zumo en un vaso de precipitados de 100ml estéril.
5.- adicionar al matraz 50 ml de zumo obtenido en condiciones estériles.
6.- medir ºBrix iniciales.
7.- inocular en condiciones de esterilidad el medio de fermentación con 10 gr de
levadura de pan.
8.- un matraz testigo se inocula con 15gr de piloncillo finamente molido.
9.- incubar 48 hrs a 32ºc de acuerdo al siguiente esquema.
Parámetro/matraz 1 2 3 4
Con piloncillo xxx xxx
Con zumo frutal xxx xxx
En agitación xxx xxx
En reposo xxx xxx
ºbrix tiempo 0
ºbrix tiempo 12 h
ºbrix tiempo 24 h
ºbrix tiempo 48 h
V de etanol (ml)
Biomasa (mg)

10.- después del tiempo de fermentación, destilar el medio fermentado por 2hrs a
80ºc y colectar el etanol formado.
11.- registrar los resultados obtenidos en la tabla anterior.
RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál fue el objetivo de incubar en agitación y en reposo?
2.- Investigue 3 aplicaciones de productos obtenidos por fermentación alcohólica.
3.- Además de etanol como producto de fermentación ¿qué otros productos a
partir del ácido pirúvico se pueden obtener por dicha vía?
4.- Desde el punto de vista energético ¿cuál vía es más eficiente, la fermentación
o la respiración?
5.- ¿Cuál es la fermentación y enzima involucrada llevada a cabo en el ser
humano durante un stress físico, donde participa el musculo y el higao?

REFERENCIAS
Brock (2000) Biología de los Microorganismos. Ed: Prentice Hill. México.
Gacesa, Hubbie (1990). Tecnología de las enzimas. Ed: Prentice Hall. México.
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ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

PRACTICA No.3 “FERMENTACIÓN LÁCTICA”

OBJETIVO:
Realizar la fermentación láctica a partir de diferentes fuentes de inóculo y en
diferentes sustratos, como ejemplo de una fermentación.
INTRODUCCIÓN.
La fermentación láctica es llevada a cabo a partir del producto final de la vía
Embden-Meyerhoff Parnas que es el ácido pirúvico. Este por la acción de la
enzima Lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de la coenzima NADH + H+
(reducida) se realiza la oxidación del grupo carbonilo del carbono 2 del piruvato a
la función alcohol liberando así ácido láctico. En general esta fermentación es
llevada a cabo por un grupo microbiano llamado bacterias lácticas, que son
organismos gram-positivos, catalasa y oxidasa negativos, no esporulados,
microaerofilicos que producen al menos un 50% de ácido láctico.
De esta última característica, las bacterias lácticas se dividen en dos grandes
grupo; las homofermentativas que producen al menos un 90% de lactato, y las
heterofermentativas con una generación de al menos un 50% de dicho ácido. Este
grupo microbiano cumple una función importante dentro del ámbito alimenticio,
principalmente de los alimentos nutracéuticos, ya que son flora normal del tracto
intestinal de mamíferos, incluyendo al ser humano, evitando así la implantación de
microorganismos patógenos. Cabe señalar que su hábitat natural no solo se limita
al intestino sino a la cavidad oral y vaginal,
Por ultimo esta enzima que es inductiva también es suma importancia en la
homeostasis del cuerpo humano, ya que se encuentra presente en varios órganos
y tejidos y por lo tanto es una herramienta diagnostica en el caso de lisis celular,
principalmente de infartos tanto cardiacos, renales, musculares o hepáticos. Pr
tanto se presentan 5 isoenzimas en función del número de cadenas polipeptidicas
H o M presentes en su estructura cuaternaria.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

1 mechero de Bunsen
2 lámparas de alcohol.
1 jarra de anaerobiosis con gas pack o vela.
1 probeta de 100 ml estéril
1 matraz Erlenmeyer con 300 ml de caldo BHI estéril preparado al 50% con leche
descremada 50% agua.
1 yogurt para beber.
1 leche fermentada tipo yakult.
20g de búlgaros.
1 refractómetro.
1 potenciómetro con electrodo de vidrio.
1 bureta con solución valorada de NaOH 0.1N.
1ml de solución indicadora de rojo fenol al 0.01%
1 soporte universal con pinzas para bureta.
6 pipetas estériles de 10 ml
2 matraces Erlenmeyer de 125 ml.
8 tubos con rosca estériles
1 vidrio de reloj
1 espátula
1 balanza analítica
1 pipeta pasteur

METODOLOGIA
1.- En condiciones de esterilidad tomar un inóculo de 5.7 ml o 5.7 g según sea el
caso y adicionarlo al matraz con 50 ml del medio de cultivo BHI.
2.- En condiciones de esterilidad tomar una alícuota de 5 ml y medir ºbrix inicial,
pH inicial y acidez inicial. Incubar el matraz 48 hrs a 32ºC siguiendo el siguiente
esquema:
Parámetro/matraz 1 2 3 4 5 6
Con búlgaros 16 g xxx xxx
Con leche fermentada xxx xxx
Con yogurt p/beber xxx xxx
En aerobiosis xxx xxx xxx
En anaerobiosis xxx xxx xxx
ºbrix tiempo 0
ºbrix tiempo 12 h
ºbrix tiempo 24 h
 ºbrix tiempo 48 h
pH tiempo 0 h
pH tiempo 12 h
pH tiempo 24 h
pH tiempo 48 h
Acidez tiempo 0 h
Acidez tiempo 12 h
Acidez tiempo 24 h
Acidez tiempo 48 h

RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1.- construir una gráfica ºBrix vs tiempo, pH vs tiempo y acidez vs tiempo, tanto
puntual como acumulado.
2.- ¿A qué tipo de reacción fundamental pertenece este tipo de enzima?
3.- ¿Qué interpretación le da la determinación de ºBrix, pH y acidez en el protocolo
experimental?
4.- ¿Cuál es la función del yakult, yogurt y búlgaros.
5.- ¿Cómo se llama el ciclo bioquímico de metabolización del ácido láctico en el
ser humano, y en que tejidos se lleva a cabo?
6. Explique la importancia y de el nombre de los mecanismos regulatorios en la
biosíntesis de las enzimas inductivas.

REFERENCIAS
Leningher (2000), Bioquímica. Ed: Omega. Barcelona, Esp.
Boshinsky (2000), Bioquímica. Ed: Mc Graw Hill. México.
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DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

PRACTICA No.4 “FOTOSÍNTESIS MICROBIANA”

OBJETIVO:
Evaluar la fotosíntesis microbiana en condiciones anoxigénicas y oxigénicas.
INTRODUCCIÓN.
La diversidad microbiana se clasifica desde dos puntos importantes; la fuente de
carbono y la fuente de energía. Desde la primera los microorganismos se
clasifican en:
 Heterótrofos; organismos que utilizan compuestos orgánicos como
sustrato carbonado.
 Autótrofos; utilizan compuestos inorgánicos carbonados como bióxido de
carbono o sales como los carbonatos o bicarbonatos.

Desde el punto de vista de la fuente de energía los organismos vivos se clasifican

en:
 Quimiolitotrofos; que son aquellos que obtienen energía a partir de
compuestos reducidos inorgánicos como donadores de electrones.
 Quimiorganotrofos; pertenecen a este grupo los organismos que obtienen
su energía a partir de compuestos orgánicos generalmente reducidos.
 Fototrofos; utilizan la energía luminosa que es captada por la clorofila en la
fae luminosa de la fotosíntesis.

Dentro de este contexto los organismos fotosintéticos se consideran entonces

fotoautotrofos, es decir utilizan la energía luminosa fijando el CO 2 como fuente
carbonada única. Cabe señalar que la fotosíntesis microbiana difiere de la
fotosíntesis de organismos eucariotes en el tipo de pigmento fotorreactivo, las
condiciones de oxido-reducción y el organelo o sitio celular donde se lleva a cabo,
de tal manera que mientras que los organismos eucariotes fotosintéticos tienen al
cloroplasto como organelo que alberga la clorofila, en los organismos procariotas,
en específico las cianobacterias y las bacterias purpuras del azufre al carecer de
cloroplasto realizan la fotosíntesis en unidades de membrana llamadas
clorosomas, donde el pigmento fotorreactivo se llama bacterioclorofila.
Dependiendo de las condiciones redox del entorno, los microorganismos
fotosintéticos se clasifican en oxigénicos como las cianobacterias (algas
verdeazules) y los anoxigénicos, principalmente las bacterias purpuras del azufre,
donde los pigmentos fotorreactivos son para los oxigénicos la P680 y P700
(fotosistema II no cíclico y fotosistema I cíclico respectivamente) y la P870 para los
anoxigénicos. Correspondientes todos ellos a la fase luminosa de la fotosíntesis
cuya principal meta es la captación de energía en forma de ATP y poder reductor
como NADH+ H+.
Complementariamente dicho poder reductor y energía en forma de ATP es
utilizada para la fijación de bióxido de carbono en la fase obscura de la fotosíntesis
(ciclo de Calvin), donde la ribulosa bifosfato carboxilasa y la fosfo ribulo quinasa
son las enzimas relevantes involucradas en la incorporación del bióxido de
carbono liberando una molécula de una hexosa fosfato.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

1 matraz con 125 ml de medio de KNOP con tapón de algodón.
100 ml de verde de lago o de río.
10 ml de azul de metileno 1:10
1 pipeta de 10 ml estéril.
1 jarra de anaerobiosis con gas pack o vela.
1 estufa de incubación a temperatura ambiente.
1 papel filtro whatman del no. 10.
1 soporte universal con arillo para embudo
1 horno de esterilización.
1 balanza analítica.
1 desecador.
1 pinzas de punta roma.
1 embudo de vidrio.
2 lámparas de alcohol.

METODOLOGIA
1.- en condiciones estériles inocular al medio de cultivo 20 ml de agua verde de
río.
2.- adicionar 5 gotas de azul de metileno 1:10
3.- incubar durante 7 días de acuerdo al siguiente esquema:
Parámetro 1 2 3 4 5 6
Aerobiosis con iluminación natural xxx
Aerobiosis con iluminación intensiva xxx
Aerobiosis en obscuridad total xxx
Anaerobiosis con iluminación natural xxx
Anaerobiosis con iluminación intensiva xxx
Anaerobiosis en obscuridad total xxx
Decoloración del a. de metileno (en +) inicio
Decoloración del a. de metileno (en +) día 1
Decoloración del a. de metileno (en +) día 2
Decoloración del a. de metileno (en +) día 3
Decoloración del a. de metileno (en +) día 4
Decoloración del a. de metileno (en +) día 5
Decoloración del a. de metileno (en +) día 6
Decoloración del a. de metileno (en +) día 7
Biomasa final (mg de peso seco)

4.- observar el medio de reacción diario anotando el grado de decoloración

registrado para cada matraz.
5.- eliminar la humedad del papel filtro el último día de la incubación, colocando
en una charola de aluminio dentro del horno de esterilización a 60ºc por 4hrs.
Registrar el peso del papel filtro vacío en la balanza analítica. (utiliza pinzas de
punta roma).
6.- colocar el papel filtro dentro del embudo de vidrio fijado al soporte universal y
verter el medio de cultivo. Desechar el sobrenadante.
7.- colocar el papel filtro húmedo en una charola de aluminio dentro del horno de
esterilización a 60ºc por 4hrs. Registrar el peso del papel filtro con el crecimiento
retenido en la balanza analítica.
8.- cálculos: biomasa =peso del filtro seco con crecimiento – peso del filtro seco vacío.

RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1.- Escriba los resultados de decoloración en la tabla anterior.
2.- Interprete el objetivo de cada vial o matraz y el global del esquema.
3.- Diga cuál es la función del azul de metileno en el medio de cultivo.
4.- Diga cuál es la composición del medio KNOP.
5.- ¿En qué organelo se lleva a cabo la fotosíntesis microbiana en procariotes?

REFERENCIAS
Brock (2000) Biología de los Microorganismos. Ed: Prentice Hill. México.
Curtis (2000) Biología. Ed: Interamericana. México.
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ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

PRACTICA No.5 “PRODUCCIÓN DE BIOGAS”

OBJETIVO:
Evaluar la producción de biogás a partir de diferentes fuentes de materia fecal
como sustratos.
INTRODUCCIÓN.
A partir de la crisis energética del petróleo que se viene en este siglo, existen una
serie de alternativas biotecnológicas que si bien ha existido desde tiempos
remotos, no se han explotado y aplicado hasta ahora por la conveniencia de la
quema de combustibles fósiles. Las opciones brindadas por la biotecnología son la
producción de etanol a partir de la fermentación de azucares presentes en
gramíneas como el maíz, la producción de biodiesel a partir de aceites quemados
y la producción de gas metano o biogás por medio de la fermentación anaeróbica
de la materia orgánica.
Esta última opción es realizada por un grupo de microbiano llamado bacterias
metanogénicas, que actúan en las últimas etapas de un consorcio microbiano
degradador de materia orgánica, donde a partir de ácido acético, o de bióxido de
carbono e hidrógeno molecular, sufren una reducción para liberar métano. A esta
relación donde el producto liberado por un grupo microbiano sirve como sustrato
para otro se conoce como; Sintrofia (nutrición mutua).
Como se usan como fuente de carbono un compuesto inorgánico como lo es el
CO2, este grupo microbiano se considera autótrofo. Las enzimas transportadoras
del carbono que se van a incorporar a biomasa o reducir a metano son; el metano
furano, tetrahidro metanopterina, coenzima M, F420 y su coenzima, F430 y su
coenzima y el 7-mercaptoheptanoil-treonina fosfato, donde la proteína corrinoide y
la monóxido de carbono deshidrogenasa juega un papel importante en la vía
asimiladora y por lo tanto la ausencia generación del biogás.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

1 recipiente de plástico de 3 a 5 litros con taparrosca.
1 equipo de venoclisis.
1 preservativo sin lubricante (condón).
1 balanza granataria.
1 abatelenguas
3 litros de agua residual doméstica
1 pistola con silicón.

METODOLOGIA
1.- colectar 2 litros de agua residual doméstica en el recipiente de plástico.
2.- pesar 50 g del estiércol correspondiente y verterlo al recipiente de plástico.
3.- perforar con cuidado con el vástago del equipo de venoclisis la taparrosca del
recipiente y sellarla con silicón.
4.- cerrar herméticamente (incluyendo las válvulas del equipo de venoclisis) el
recipiente del agua residual inoculada con el estiércol e incubar a temperatura de
invernadero o arriba de 30ºc por 7 días.
5.- fijar el condón con cinta adhesiva y abrir la válvula del equipo de venoclisis.
Registrar el diámetro y la altura de inflado del condón.
6.- cálculos biogás producido (ml) = π . 𝑟 2 . h donde r = ½ diámetro y diam = p . π
RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Graficar ml de biogás vs tiempo en días a partir de los datos experimentales de
todos los equipos que utilizaron diferentes sustratos.
¿En qué condiciones redox y temperatura se propicia la generación del biogás?
Menciona la composición química porcentual del biogás.
Investiga dos géneros microbianos de bacterias metanogenicas.
Menciona los sustratos a partir de los cuales los metanogénos sintetizan biogas.
Explica porque en la degradación de la materia orgánica los metanogenos son
organismos sintróficos.

REFERENCIAS
Brock (2000) Biología de los Microorganismos. Ed: Prentice Hill. México.
Stanier, Duudorof (1995) Microbiologia. Ed: Aguilar. Barcelona Esp.

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ASIGNATURA: BIOQUÍMICA II

PRACTICA No.6 “OBTENCIÓN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS

COFACTORES A PARTIR DE TEJIDOS ANIMALES”

OBJETIVO:
Obtener una enzima oxidorreductasa a partir de fuentes animales y observar su
actividad.
INTRODUCCIÓN.
De todas las propiedades que posee un organismo vivo, quizá la más
característica es su capacidad para utilizar y transformar la energía del medio
ambiente. Todos los procesos químicos y físicos que están relacionados con la
obtención de energía en un ser vivo se denomina respiración. Un término que se
utiliza como sinónimo bioquímico de respiración es bioenergética (quedan
incluidos los procesos fotosintéticos). Donde en la respiración conduce a la
oxidación de metabolitos hasta bióxido de carbono y agua, siendo generalmente
dichas reacciones exergónicas, es decir, liberan energía.
Al no ser un ser vivo una máquina térmica, debe poseer un mecanismo enzimático
que le permite capturar y almacenar la energía liberada en los procesos de
oxidación. La utilización o captura de energía involucra la participación de enzimas
específicas, capaces de catalizar conversión de ADP en ATP (reacción
endergónica).

ALIMENTOS ADP + P
[O2] ENERGIA ENERGIA
PROCESOS
ENDERGONICOS
CO2 + H2O ATP
Un compuesto químico se puede oxidar de diferentes maneras. La oxidación típica
es aquella en la cual el oxígeno se une a un compuesto. Otra forma de oxidación
es la pérdida de hidrógeno (deshidrogenación). También se oxida un compuesto
cuando pierde electrones o cuando gana valencias positivas, donde al efectuarse
la misma, siempre otro forzosamente se debe reducir y, al ser procesos que
ocurren simultáneamente se denominan fenómenos de óxido-reducción o
reacciones redox.
Su importancia en los organismos vivos radica en que la mayor parte de energía
que utilizan estos se deriva de procesos de oxidación. Considerando a la vida
como una combustión constante, es decir, desde el punto de vistq químico, la vida
es una cadena de oxidaciones y en cada oxidación se desprende una determinada
cantidad de energía que el organismo aprovecha para realizar funciones vitales y
para efectuar fenómenos sintéticos endergónicos.
Todas las oxidaciones biológicas se caracterizan por su rapidez y por la suavidad
con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH generalmente
neutro y a bajas temperaturas. Sin embargo, oxidaciones biológicas no son tan
sencillas, pues se ha comprobado que en la oxidación de cada metabolito
intervienen una gran cantidad de aceptores de hidrógeno.
La deshidrogenasa láctica (LDH) es una enzima de origen citoplásmico que
cataliza reversiblemente la siguiente reacción.

ACIDO LACTICO + NAD+ ACIDO PIRUVICO +

Es un tetrámero
NADH+ constituido
H+ por cuatro polipéptidos con un peso molecular total
alrededor de 135kda. El tetrámero puede estar constituido por dos tipos de
monómeros H (abundante en el corazón) y M (abundante en hígado), los cuales
según se organicen, constituyen LDH1 8HHH), LDH2(HHMM), LDH4(HMMM) y
LDH%(MMMM).
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO
-Tubos de ensaye de 18 x 150mm. -NaCl al 0.9%.
-pipetas de 1.5 y 10 ml. -bureta de 25ml.
-cianuro de potasio al 0.4 y 0.01%. -mortero.
-lactato de sodio al 1%. -tijeras.
Azul de metileno 0.002M -eter.
-fosfato dibásico de sodio 0.06M. -baño maría.
-vaso de precipitados. -matraz Erlenmeyer.
-p-feniléndiamina al 1% (recién preparada). -arena, navaja y nujol.
-alfa-naftol al 0.15% (en alcohol).
-N-N-dimetil-p-feniléndiamina al 0.5% (recién preparada).

METODOLOGIA
Preparación del sistema deshidrogenasa láctica-NAD+
b) Preparación de la coenzima NAD+
i. Matar una rata con éter, abrirla y obtener 4 g de fragmentos de músculo de
las patas traseras.
ii. Cortar el musculo en fragmentos más pequeños y ponerlos en agua a
ebullición por 5min. En un matraz Erlenmeyer de 125ml (en proporción de
6ml por gramo de musculo).
iii. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena (+ - 1gr) y triturar
bien el músculo.
iv. Centrifugar a 3000 rpm durante 15min. Recuperar el sobrenadante y
etiquetarlo como “coenzima NAD+”, el precipitado se desecha.

c) Preparación de la enzima LDH

i. Colocar 4 g de músculo de las patas de la rata en un mortero previamente
sumergido en hielo y adicionar NaCl al 0.9% (en proporción de 8ml/g de
músculo) agregar un poco de arena (+ - 1 g) y triturar perfectamente.
ii. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 min.
iii. Centrifugar a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetado
como deshidrogenasa láctica LDH. El precipitado se desecha.

d) Determinación de actividad enzimática.

Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos, preparar las 3 series siguientes en
tubos de ensaye etiquetados como se indica a continuación.
NOTA: trabajar las soluciones de cianuro de potasio con mucha precaución, ya
que es una sustancia altamente peligrosa, no se debe utilizar pipeta, manipular
dicha sustancia con bureta y lavarse perfectamente las manos.
Tubo no 1 2 3 4
KCN al 0.5% 1.0 1.0 1.0 1.0
Lactato al 1% 1.0 1.0 1.0 1.0
Azul de metileno 0.002M 0.3 0.3 0.3 0.3
Agua (ml) 0.0 1.0 1.0 1.0
Sobrenadante “coenzima” (ml) 1.0 0.0 1.0 1.0
Sobrenadante “LDH” (ml) 1.0 1.0 1.0 0.0
Lectura inicial
Lectura 15 min
Lectura 30 min
Lectura 60 min

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0ml de nujol. Incubar
en baño maría a 37ºc y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en
el cuadro los grados de decoloración con signos + y con 0 la falta de la misma.
NOTA: después de haber agregado el nujol, no agitar el tubo.

RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1.- Escriba los resultados de decoloración en la tabla anterior.
2.- Interprete el objetivo de cada tubo y el global del esquema.
3.- Diga cuales son las funciones de cada ingrediente adicionado.
4.- Mencione otros tipos de oxidorreductasas importantes.
5.- ¿Qué otro aplicación industrial podría dársele a las oxidorreductasas?
6.- ¿Por qué se debe de manejar con cuidado el cianuro de potasio?
7.- ¿Por qué es importante las condiciones de reacción del experimento?

REFERENCIAS
Yánez Avila, R. Manual de prácticas de Bioquímica. Ed: IPN.
Sánchez Cerezero, J. Manual de procedimientos de Bioquímica Clínica. Ed:
ECNB/IPN.
Arciniega C. Curso Experimental de Bioquímica General. Ed: ECNB/IPN.
López Munguia, A. Tecnología Enzimatica. Ed: UNAM.