Abstracto

Se purificó una cutinasa ácida (TtcutB) de Thielavia terrestris CAU709 hasta una
homogeneidad aparente con una actividad específica de 983 U mg -1 . La masa
molecular de la enzima se estimó en 27,3 y 27,9 kDa mediante SDS-PAGE y
filtración en gel, respectivamente. Una búsqueda de homología de secuencia
peptídica no reveló cutinasas homólogas de T. terrestris , excepto por un gen de
cutinasa putativo (XP003656017.1), lo que indica que TtcutB es una nueva
enzima. TtcutB exhibió un pH ácido óptimo de 4.0 y estabilidad a pH 2.5-10.5. La
actividad óptima fue a 55 ° C, fue estable hasta 65 ° C y retuvo más del 30% de
actividad a 0 ° C. K m valores hacia p-el nitrofenil ( p NP) acetato, el p NP-butirato
y el p NP-caproato fueron 8,3, 1,1 y 0,88 mM, respectivamente. La cutinasa
exhibió una actividad sintética fuerte sobre el butirato de butilo de éster aromático
en un entorno no acuoso, y se observó la eficacia de esterificación más alta del
95% en las condiciones de reacción optimizadas. Las propiedades bioquímicas
únicas de la enzima sugieren un gran potencial en las industrias productoras de
ésteres de sabor.
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Palabras clave
Thielavia terrestris
Cutinase
Adaptación al frío
Caracterización
Síntesis de ésteres de sabores

1 . Introducción
La cutinasa (EC 3.1.1.74) es una enzima lipolítica / esterolítica inducible, capaz de
catalizar la escisión no solo de los enlaces éster de la cutina, el principal polímero
alifático de la cutícula de la planta, sino también de otros ésteres solubles en agua
y triglicéridos insolubles ( Chen , Su, Chen y Wu, 2013; Sulaiman et al., 2012 ). Se
considera que las cutinasas son intermedias entre las esterasas y las lipasas, ya
que pueden hidrolizar eficazmente ésteres solubles y triacilgliceroles
emulsionados. Sin embargo, no muestran activación interfacial, que es una
característica típica de la lipasa ( Egmond y Van Bemmel, 1997 ). Recientemente,
las cutinasas han recibido mucha atención debido a su posible aplicación en
diversos campos industriales, como alimentos, productos químicos finos,
productos farmacéuticos y medioambientales (Chen et al., 2013 ). En la industria
alimentaria, se pueden usar para hidrolizar el exceso de grasa en alimentos ricos
en grasas como la leche, con el objetivo de reducir la energía de los alimentos, o
para sintetizar ésteres de sabor como biocatalizador en bioprocesos verdes
limpios, que se ha considerado como un ruta alternativa a la industria química
sintética tradicional ( De Barros, Azevedo, Cabral, y Fonseca, 2012 ). En la
industria química, se usan para producir detergentes para la eliminación de grasa
en la ropa doméstica ( Castro-Ochoa et al., 2012 ). En la industria farmacéutica, se
ha desarrollado una preparación enzimática que contiene cutinasa para aumentar
el efecto farmacológico de los agentes agrícolas ( Pio y Macedo, 2007).) En la
industria ambiental, las cutinasas pueden usarse para la degradación de plásticos
biodegradables ( Watanabe et al., 2014; Yang, Xu et al., 2013 ).
La disponibilidad de cutinasas que poseen características funcionales deseables
para fines específicos es un factor limitante en su aplicación. Por lo tanto, el
aislamiento de nuevas cutinasas que poseen propiedades especiales es de gran
valor e importancia económica potencial. Las cutinasas se encuentran
principalmente en diferentes especies de hongos ( Castro-Ochoa et al., 2012;
Fraga, Carvalho y Macedo, 2012; Nyyssölä et al., 2014; Pio y Macedo, 2007;
Roussel et al., 2014; Speranza & Macedo, 2013 ), aunque también se han
notificado varias enzimas cutinolíticas bacterianas ( Dutta, Krishnamoorthy, y
Dasu, 2013; Hegde y Veeranki, 2013; Kitadokoro et al., 2012). Varias cutinasas se
han purificado y caracterizado a partir de diversos hongos, incluyendo Alternaria
brassicicola (Koschorreck, Liu, Kazenwadel, Schmid y Hauer, 2010 ), Coprinopsis
cinerea ( Merz, Schembecker, Riemer, Nimtz y Zorn, 2009 ), Fusarium
oxysporum ( Fraga et al., 2012; Speranza y Macedo, 2013 ), Fusarium
solani ( Kwon, Kim, Yang, Song y Song, 2009 ), Monilinia fructicola ( Wang,
Michailides, Hammock, Lee y Bostock, 2002 ), Sirococcus conigenus ( Nyyssölä et
al., 2014 ), Trichoderma harzianum ( Rubio, Cardoza, Hermosa, Gutierrez y Monte,
2008 ) y Trichoderma reesei ( Roussel et al., 2014) La mayoría de estos son
hongos mesofílicos; no hay informes sobre cutinasas de hongos termófilos, a
excepción de Humicola insolens ( Nielsen, Borch y Westh, 2007 ). Thielavia
terrestris es un tipo de ascomiceto termófilo transmitido por el suelo que puede
crecer normalmente a un pH relativamente bajo (por ejemplo, 4,5) y temperatura
elevada (40-45 ° C) ( Yang, Xu et al., 2013 ). No hay informes sobre la producción
o caracterización de cutinasas de ninguna de las especies de Thielavia , excepto
una cutinasa debaja masa molecular (TtcutA), que se informó recientemente en
nuestro laboratorio ( Yang, Xu et al., 2013 ). Aquí, describimos la purificación y la
caracterización bioquímica de otra cutinasa ácida deT. terrestris CAU709. Luego
investigamos la aplicación de esta cutinasa en la síntesis de ésteres de sabor.
2 . materiales y métodos
2.1 . Materiales, microorganismos y producción de enzimas
p -Nitrofenol ( p NP) y ésteres p NP que incluyen p -nitrofenil acetato ( p NPA), p -
nitrofenil butirato ( p NPB), p -nitrofenil caproato ( p NPC), p -nitrofenil
dodecanoato ( p NPD), p - nitrofenil miristato ( p NPM) y p -nitrofenil palmitato
( p NPP) fueron los productos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). p-
nitrofenil hexacaprato ( pNPH) se adquirió de HEOWNS Company (Tianjing,
China). Triacetina, tributirin, tricaproin, tricaprylin y tricaprin se compraron de TCI
Co. (Tokio, Japón). También se obtuvieron Fast Red TR Salt y 4-
methylumbelliferyl butyrate (MUF-butirato) de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
EE. UU.). Las resinas Sephacryl ™ S-100 de alta resolución, Q Sepharose ™ Fast
Flow y CM Sepharose ™ Fast Flow se obtuvieron de GE Healthcare (Piscataway,
NJ, EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de calidad analítica a
menos que se especifique lo contrario.
La cepa fúngica utilizada en el presente estudio se depositó en el Centro de
Colección de Cultivos Microbiológicos Generales de China (CGMSS, n.º de
acceso 6233). La cepa se mantuvo en agar dextrosa de patata (PDA) a 4 ° C y se
transfirió cada 6-7 semanas. Para la producción de cutinasa, T. terrestrisCAU709
se incubó en una placa PDA a 45 ° C durante 2 días, y luego una pieza de medio
(1 cm 2 ) cubierto con micelio fue transferido al medio de cultivo. El medio de
cultivo (1 L) consistió en 10 g de aceite de oliva, 25 g de salvado de trigo, 10 g
de triptona, 1 g de K 2 HPO 4 , 0.5 g de MgSO 4y agua destilada. Después de la
incubación a 50 ° C en un agitador rotatorio (200 rpm) durante 3 días, el caldo de
cultivo se recogió y se centrifugó (10.000 g ), y el sobrenadante se usó como la
enzima bruta.
2.2 . Ensayo enzimático
La actividad de la cutinasa se determinó mediante el método de Sumby, Matthess,
Grbin y Jiranek (2009) con ligeras modificaciones: se añadieron 50 μl de enzima
adecuadamente diluida a 400 μl de tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) y
se precalentaron durante 2 min. y luego se añadieron 50 μl
de p NPB 20 mM preparado en isopropanol puro. La mezcla de reacción se
incubó a 50ºC durante 10 minutos, y luego se añadieron 500 μl de tampón de
fosfato de sodio 300 mM enfriado (pH 7,0) que contenía 5% de SDS (p / v) para
finalizar la reacción. Después de enfriar la mezcla en hielo durante 2 minutos, se
cuantificó la p NP liberada midiendo la absorbancia a 410ºC. Nuevo
Méjico. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima
que libera 1 μmol p NP por minuto bajo las condiciones anteriores. La
concentración de proteína se estimó de acuerdo con el método de Lowry,
Rosebrough, Farr y Randall (1951) . La actividad específica se expresó en
términos de unidades de enzima por miligramo de proteína.
2.3 . SDS-PAGE, análisis de zimograma y determinación molecular nativa
La SDS-PAGE se realizó según el método de Laemmli (1970) usando un gel de
apilamiento al 4,5% y un gel separador al 12,5%. Las bandas de proteína se
tiñeron con azul brillante Coomassie R-250. Se utilizó un kit de calibración de bajo
peso molecular (GE Healthcare). La tinción de la actividad de la cutinasa se realizó
según lo descrito por Karpushova, Brümmer, Barth, Lange y Schmid (2005) .
La masa molecular nativa de la cutinasa purificada se estimó mediante filtración en
gel: se cargaron 0,5 ml de muestra concentrada (2 mg) en una columna
Sephacryl S-100 (100 x 1,0 cm) preequilibrada con Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 (
que contiene NaCl 100 mM), y luego se eluye con el tampón de equilibrado a un
caudal de 0,3 ml min -1 . Las proteínas estándar utilizadas para la calibración
fueron citocromo c (12,4 kDa), α-quimiotripsinógeno A (tipo II, de páncreas
bovino, 25,6 kDa), albúmina de huevo (45,0 kDa), albúmina sérica bovina
fracción V (66,2 kDa) y fosforilasa b ( de músculo de conejo, 97.2 kDa).
2.4 . Purificación de una cutinasa de T. terrestris CAU709 y su análisis interno de
secuencias de péptidos
TtcutB se purificó de acuerdo con el protocolo de purificación para TtcutA
informado por Yang, Xu et al. (2013) . Hay una pequeña diferencia en la
purificación de columna Q Sepharose Fast Flow. Las fracciones activas para
TtcutA se eluyeron con NaCl 0-50 mM gradiente en el estudio previo ( Yang, Xu et
al., 2013 ). Después de eso, las fracciones activas para TtcutB en el presente
estudio se eluyeron mediante una elución constante de 50 mM de NaCl. Las
fracciones recogidas se controlaron por ensayo de actividad y la pureza de la
enzima se verificó por SDS-PAGE. La cutinasa purificada (TtcutB) se usó para
estudios posteriores.
Para determinar su secuencia de aminoácidos parcial, la cutinasa purificada se
envió al Centro Nacional de Análisis Biomédico (China) para la secuenciación
mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en
tándem por ionización por electrospray (HPLC-ESI-MS / MS). La secuenciación
espectral de masas se realizó como los protocolos descritos en el estudio previo
( Yang, Tang et al., 2013 ).
2.5 . Caracterización bioquímica de la cutinasa purificada
La actividad enzimática se midió en diferentes tampones (50 mM) con valores de
pH que variaban de 2.5 a 10.5 usando el ensayo enzimático estándar
(Sección 2.3 ). Los tampones usados fueron glicina-HCl (pH 2.5-3.5), tampón de
citrato (pH 3.0-6.0), tampón MES (pH 5.5-6.5), tampón fosfato (pH 6.0-8.0),
tampón Tris-HCl (pH 7.5-9.0 ) y glicina-NaOH (8.5-10.5). Para la determinación de
la estabilidad del pH, la enzima se incubó en los mismos tampones a 50 ° C
durante 30 min, y la actividad residual se midió a 50 ° C en tampón de
citrato 50 mM (pH 4,0).
La temperatura óptima de la cutinasa purificada se determinó midiendo su
actividad en el intervalo de temperatura de 0-100 ° C en tampón de citrato 50 mM
(pH 4,0). Para determinar la termoestabilidad de la cutinasa purificada, la enzima
se trató a diferentes temperaturas (0-100 ° C) durante 30 min, y las actividades
residuales se midieron a 50 ° C en tampón de citrato 50 mM (pH 4,0).
2.6 . Especificidad del sustrato y parámetros cinéticos
La especificidad del sustrato de la cutinasa purificada se determinó a
50ºC durante 10 minutos en tampón de citrato 50 mM (pH 4,0) de acuerdo con el
método de Liu et al. (2013) . Los sustratos ensayados contienen ésteres p NP que
incluyen p NPA, p NPB, p NPC, p NP caprilato, p NPD, p NPH, p NPM ypNPP, y
sustratos sintéticos de triacilglicerol que incluyen triacetina, tributirin, tricaproin,
tricaprilina y tricaprin. Una unidad de actividad enzimática se definió como la
cantidad de enzima requerida para liberar 1 μmol de ácido graso por minuto bajo
las condiciones de ensayo anteriores.
Se investigó la propiedad de hidrólisis de la enzima purificada en cutinas. Las
cutinas se prepararon a partir de cáscaras de manzana según el método
de Walton y Kolattukudy (1972) . Se añadieron 40 μg de cutinasa purificada en
1 ml de solución de cutina al 1% (p / v) en tampón de citrato 25 mM (pH 4,0), y se
incubaron a 50ºC durante 18 h. La cantidad de ácidos grasos liberados se
cuantificó por titulación con NaOH 10 mM como se menciona anteriormente. La
actividad de cutinasa se expresó como la cantidad de cutina (μmol) por hora por
miligramo de proteína.
Los parámetros cinéticos constantes de la cutinasa purificada hacia p NPA, pNPB
y p NPC se determinaron midiendo las actividades de la enzima con diferentes
concentraciones de sustrato en tampón de citrato 50 mM pH 4,0 a 50 ° C durante
5 min. Los valores de K m y V max se calcularon mediante el software "GraFit".
2.7 . Síntesis del butirato de butilo por la cutinasa purificada de T. terrestris
La reacción sintética se realizó en 10 ml de disolvente de mezcla que contenía
ácido butírico igual y 1-butanol (100 mM) y 5 U ml- 1 de cutinasa liofilizada. La
mezcla se incubó a 50 ° C con agitación constante a 150 rpm durante 14 h, y se
analizaron 50 \ mu l de la mezcla de reacción cada 2 h mediante cromatografía
de gases según el método de De Barros, Fonseca, Fernandes, Cabral y Mojovic.
(2009) .
Se estudió la optimización de las condiciones de reacción para la síntesis de
butirato de butilo. El efecto del disolvente sobre la eficacia de esterificación se
examinó cambiando diversos disolventes orgánicos que incluyen n-hexano,
ciclohexano, n-heptano, isoheptano y acetona. Luego, la temperatura de reacción
se optimizó variando las temperaturas de 35 ° C a 55 ° C bajo el disolvente
optimizado. Por último, las concentraciones de los dos sustratos en la síntesis de
butil butirato se optimizaron. Los experimentos se llevaron a cabo de la siguiente
manera: primero, la concentración de 1-butanol se mantuvo constante a 0,1 M,
mientras que la concentración de ácido butírico se varió de 0,04 a 0,14 M, luego
se obtuvo una concentración de ácido butírico óptima constante, mientras que el
1-butanol 0.04 a 0.14 M.
3 . Resultados
3.1 . Purificación e identificación de una cutinasa de T. terrestris
Se purificó una cutinasa extracelular a homogeneidad a partir del sobrenadante de
cultivo de T. terrestris CAU709 con un pliegue de purificación de 16 y un
rendimiento de recuperación del 10% ( Tabla 1 ). La actividad específica de la
enzima se incrementó de 62 U mg -1 a 983 U mg -1 . La cutinasa purificada fue
electroforéticamente homogénea como se observó mediante SDS-PAGE con una
masa molecular de aprox. 27,3 kDa ( figura 1 ), mientras que se encontró que la
masa molecular nativa de la cutinasa era de aproximadamente 27,9 kDa mediante
filtración en gel, lo que indica que es una proteína monomérica.
Tabla 1 . Purificación de una cutinasa (TtcutB) de T. terrestris .

Paso de purificación Actividad Proteína Actividad Factor de Rendimiento

total (U) a total (mg) específica purificación (- (%)
(U mg -1 ) fold)
Extracto sin células 23,900 385 62 1 100
(NH 4 ) 2 SO 4fraccionamiento 18,900 160 118 1.9 79
Paso de purificación Actividad Proteína Actividad Factor de Rendimiento
total (U) a total (mg) específica purificación (- (%)
(U mg -1 ) fold)
Flujo rápido de CM- 15,400 108 143 2.3 64
sepharose
Flujo rápido de Q-Sepharose 7660 9 851 14 32
Sephadex G-75 2460 2.5 983 dieciséis 10

un
La actividad de la enzima se determinó a 50 ° C en tampón de citrato 50 mM pH 4.0.

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Fig. 1 . SDS-PAGE y análisis de zimograma de la cutinasa purificada de T.
terrestris . Lane M, patrones de proteínas de bajo peso molecular; carril 1, cutinasa
purificada; carriles 2 y 3, análisis de zimograma de cutinasa en SDS-PAGE
utilizando MUF-butirato y α-naftil acetato, respectivamente.

TtcutB se digirió con tripsina y los fragmentos peptídicos se analizaron por

espectrometría de masas. Las secuencias de aminoácidos de los cinco
fragmentos peptídicos principales fueron SGTETGNLGNGVYPEVADLGK (Péptido
1), PQFSDTATDELDNATGLCPK (Péptido 2), GPAWLHEK (Péptido 3), VLFLRCK
(Péptido 4) y VNDQDANWAVR (Péptido 5). Las secuencias peptídicas se
enviaron a NCBI BLAST para la búsqueda de homología. Los péptidos 1 y 3
mostraron 75% y 100% de identidad, respectivamente, a una cutinasa putativa
de T. terrestris NRRL 8126 (XP003656017.1), mientras que los péptidos 2, 4 y 5
no mostraron similitud de secuencia significativa con otras enzimas lipolíticas o
estrolíticas conocidas.
3.2 . Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de la
cutinasa purificada
El TtcutB purificado exhibió actividad óptima a pH 4,0 ( figura 2 a). La actividad
enzimática disminuyó en menos del 40% cuando el pH aumentó a 9,0 o disminuyó
a 3,0, lo que indica un amplio rango de pH para una actividad enzimática
relativamente alta ( Fig. 2 b). La cutinasa también mostró una excelente
estabilidad al pH, ya que más del 80% de su actividad se mantuvo cuando se
mantuvo a 50 ° C durante 30 minutos dentro del intervalo de pH de 2.5-10.5 ( Fig.
2 b). La enzima fue más activa a 55 ° C ( Fig. 2c), y mostró alta actividad a
temperaturas relativamente bajas, teniendo 55% y 31% de su actividad máxima a
20 ° C y 0 ° C, respectivamente ( Fig. 2 d ) La enzima era estable hasta 65 ° C,
reteniendo más del 90% de su actividad ( Fig. 2 d). Las semividas de
desnaturalización térmica de cutinasa purificada a 50, 55, 60, 65, 70 y
80ºC fueron 867, 637, 369, 245, 51 y 49 minutos, respectivamente ( figura 2 e).
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Fig. 2 . PH óptimo (a), estabilidad del pH (b), temperatura óptima (c),
termoestabilidad (d) y vida media de desnaturalización (e) de TtcutB de T.
terrestris . El efecto del pH sobre la actividad de la enzima se determinó a 50 ° C
utilizando p NPB como sustrato en diferentes tampones (50 mM) con pH en el
rango de 2.5 a 10.5. Para la estabilidad del pH, las actividades residuales se
midieron a 50 ° C en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) después de que
la enzima se había incubado a 50 ° C durante 30 min. Los tampones utilizados
fueron (♦) tampón de glicina-HCl (pH 2.5-3.5), (□) tampón de citrato de sodio (pH
3.0-6.0), (●) tampón de MES (pH 5.5-6.5), (■) tampón de fosfato de sodio ( pH 6,0-
8,0), (○) tampón Tris-HCl (pH 7,5-9,0) y (♢) tampón de glicina-NaOH (8,5-10,5). La
temperatura óptima se determinó midiendo la actividad de la enzima a diferentes
temperaturas (0-100 ° C) en tampón de citrato sódico 50 mM (pH 4,0). Para la
determinación de la termoestabilidad, las actividades residuales de la cutinasa se
midieron después de que la enzima se había incubado a diferentes temperaturas
(0-100 ° C) durante 30 minutos. Para la determinación de semividas de
desnaturalización térmica, la cutinasa purificada se incubó a diferentes
temperaturas (50-80 ° C) en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) durante
5 h, se tomaron alícuotas en diferentes momentos, y se midieron las actividades
enzimáticas residuales. Las temperaturas determinadas fueron ()) 50 ° C, (□) 55 °
C, (▴) 60 ° C, (♢) 65 ° C y (△) 70 ° C. Los experimentos se realizaron tres veces y
se indican los errores estándar.

3.3 . Especificidad del sustrato y parámetros cinéticos del TtcutB purificado

Las actividades específicas de la cutinasa de T. terrestris CAU709 hacia diferentes
sustratos se muestran en la Tabla 2 . La enzima hidrolizó los derivados de p NP
con cadenas de acilo de C 2 a C 16 , mostrando la actividad más alta con p NPB
(C 4 ) como sustrato. Cuando el número de átomos de carbono en los sustratos
aumentó a más de 4 o disminuyó por debajo de 4, las actividades específicas
disminuyeron drásticamente ( Tabla 2 ).
Tabla 2 . Especificidad del sustrato del TtcutB purificado de T. terrestris .

Sustrato Actividad específica (U mg -1 ) Actividad relativa (%)

pNP ésteres a
p NPA (C 2 ) 140 ± 3.1 14.2
p NPB (C 4 ) 983 ± 4.2 100.0
p NPC (C 6 ) 382 ± 4.2 38.9
p NP caprilato (C 8 ) 140 ± 3.2 14.2
p NPH (C 10 ) 89 ± 0.7 9.1
p NPD (C 12 ) 53 ± 0.4 5.4
p NPM (C 14 ) 27 ± 0.08 2.7
p NPP (C 16 ) 4.3 ± 0.01 0.4

Triglicéridos b
Triacetina (C 2 ) 132 ± 5.3 13.4
Tributirina (C 4 ) 1,938 ± 44 197.2
Tricaproin (C 6 ) 925 ± 21 94.1
Sustrato Actividad específica (U mg -1 ) Actividad relativa (%)
Tricaprylin (C 8 ) 616 ± 11 62.7
Tricaprin (C 10 ) 176 ± 8.9 17.9
Aceite de oliva 219 ± 9.5 22.3

un
Los ensayos con ésteres de p- NP se realizaron a 50 ° C en tampón de citrato de
sodio 50 mM (pH 4,0) que contenía Triton X-100 al 0,1% y goma arábiga al 0,1%.
segundo
Las actividades con aceite de oliva y triglicéridos sintéticos como sustratos se midieron
en tampón de citrato sódico 2,5 mM (pH 4,0) que contenía un 0,1% de sustrato y un 0,1%
de goma arábiga. Los resultados se presentan como medias ± desviación estándar
( n = 3).

La especificidad del sustrato de TtcutB hacia triglicéridos sintéticos mostró la

misma tendencia y, por lo tanto, las actividades específicas disminuyeron
marcadamente a medida que el número de átomos de carbono en el sustrato
aumentó por encima de 4 o disminuyó por debajo de 4 ( Tabla 2 ); la actividad
específica más alta se observó con tributirina (C 4 ) como sustrato ( Tabla
2 ). Tenga en cuenta que la cutinasa también hidrolizó de manera eficiente el
aceite de oliva ( Tabla 2 ). TtcutB hidrolizó eficazmente las cutinas con una tasa de
degradación de 4,7 μmol / h / mg de proteína, lo que sugiere que debería ser una
cutinasa. Valores de la constante de Michaelis-
Menten K m y V max hacia pNPA, pNPB y p NPC se presentan en la Tabla 3 .
Tabla 3 . Parámetros cinéticos del TtcutB purificado de T. terrestris . un

Sustrato V max (μmol min -1 mg -1 ) K m (mM) k gato (s -1 ) k cat / K m (mM -1 s -1 )

p NPA 1281,4 ± 2,2 8.3 ± 0.1 0.58 0.07
p NPB 1857.9 ± 10.8 1.1 ± 0.05 0.85 0.77
p NBC 1339,6 ± 5,9 0.88 ± 0.03 0.61 0.68

un
La actividad de la enzima se determinó a 50 ° C en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH
4,0). Los resultados se presentan como medias ± desviación estándar ( n = 3).

3.4 . Síntesis del butirato de butilo por la cutinasa purificada

El efecto del disolvente de reacción sobre la eficacia de esterificación se presentó
en la figura 3 a, está claro que el n-heptano fue el medio de reacción óptimo para
la síntesis de butirato de butilo, ya que la eficacia de esterificación más alta del
70% se obtuvo a las 10 h ( Fig. 3 b). Por lo tanto, se eligió como disolvente de
reacción en el experimento posterior. La temperatura de reacción también mostró
un efecto significativo sobre la síntesis de butirato de butilo. La eficacia de la
esterificación aumentó con el aumento de la temperatura de reacción de 40 a 45 °
C, el aumento adicional de la temperatura a 60 ° C produjo una disminución
gradual de la síntesis y la mayor eficiencia de esterificación del 71% a 45 ° C
después de 8 h de incubación ( Fig. 3 b).
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Fig. 3 . Efecto del solvente de reacción orgánico (a), la temperatura (b) y la
concentración de sustrato (c) en la producción de butilbutirato por TtcutB de T.
terrestris . En la figura a, los disolventes utilizados fueron ciclohexano (♢), n-
hexano (□), n-heptano (△), isoheptano (■) y acetona (▴). En la figura b, las
temperaturas utilizadas fueron 40 ° C (♢), 45 ° C (△), 50 ° C (■), 55 ° C (□) y
60 ° C (▴). En la figura c, (□) significa que la concentración de 1-butanol se
mantuvo constante a 0.1 M, mientras que la concentración de ácido butírico varió
de 0.04 a 0.14 M, (■) significa que la concentración de ácido butírico se mantuvo
constante a 0.12 M, mientras que la concentración de 1-butanol fue variado de
0.04 a 0.14 M.

Las concentraciones de los dos sustratos se optimizaron, cuando la concentración

de 1-butanol se mantuvo constante a 0.1 M, la concentración óptima de ácido
butírico para la producción de butirato de butilo se determinó en 0.12 M, donde la
mayor eficiencia de esterificación del 82% se obtuvo a 5 d ( Fig. 3 c). Luego,
cuando el ácido butírico se mantuvo constante a 0,12 M, el 1-butanol óptimo se
determinó a 0,08 M, ya que se obtuvo la mayor eficacia de esterificación (95%)
( Fig. 3c). Por lo tanto, la relación molar óptima final de ácido butírico a 1-butanol
fue 3: 2.
4 . Discusión
Las cutinasas se han purificado y caracterizado a partir de diversos hongos
( Fraga et al., 2012; Koschorreck et al., 2010; Kwon et al., 2009; Roussel et al.,
2014; Speranza & Macedo, 2013; Wang et al., 2002). ), especialmente hongos
fitopatógenos como Fusarium solani pisi , cuya cutinasa ha sido ampliamente
estudiada con respecto a su estructura y función. Sin embargo, no hay informes
sobre cutinasa de Thielavia spp, excepto una cutinasa de baja masa molecular
informada recientemente (TtcutA) en nuestro laboratorio ( Yang, Xu et al.,
2013). Aquí, describimos la purificación y caracterización de otra cutinasa ácida
(designada como TtcutB) de T. terrestris CAU709. La masa molecular de TtcutB
(27,3 kDa) ( Fig. 1) en el presente estudio estuvo de acuerdo con los informados
para otras cutinasas microbianas (rango de 25-30 kDa) ( Castro-Ochoa et al.,
2012; Fett, Wijey, Moreau y Osman, 1999; Rubio et al., 2008). ), siendo
ligeramente superior al de la cutinasa de M. fructicola (20,2 kDa) ( Wang et al.,
2002 ) y T. terrestris CAU709 (25,3 kDa) ( Yang, Xu et al., 2013 ), y mucho menor
que el de la cutinasa de Colletotrichum kahawae (40 kDa) ( Chen, Franco,
Baptista, Cabral y Coelho, 2007 ). Una búsqueda de homología de secuencia
peptídica no reveló cutinasas homólogas de T. terrestris, a excepción de un gen
de cutinasa putativo (XP003656017.1). Por lo tanto, TtcutB en el presente estudio
es una nueva enzima.
TtcutB mostró actividad óptima a pH 4.0 y estabilidad en un amplio rango de pH
(2.5-10.5) ( Fig. 2 ). El pH óptimo es similar al de la cutinasa (TtcutA) de T.
terrestris CAU709 ( Yang, Xu et al., 2013 ), pero fue inferior al de todas las
cutinasas informadas de otros microbios, como Thermomonospora fusca (pH 11.0)
( Fett et al., 1999 ), A. brassicicola (pH 8,0) ( Koschorreck et al.,
2010 ), Thermobifida fusca (pH 8,0) ( Chen et al., 2008 ), Aspergillus niger CBS
513,88 (pH 6,0) ( Nyyssölä) et al., 2013 ) y S. conigenus(pH 4.1-5.2) ( Nyyssölä et
al., 2014 ). La mayoría de las cutinasas informadas muestran estabilidad en
condiciones casi neutras o alcalinas ( Fett et al., 1999; Koschorreck et al., 2010;
Kwon et al., 2009 ), mientras que la cutinasa en el presente estudio mostró una
excelente estabilidad en todos los pH probados (pH 2.5-10.5). El rango de
estabilidad del pH en el presente estudio es mucho más amplio que el de otras
dos cutinasas ácidas ( Nyyssölä et al., 2013, 2014 ). Esta estabilidad de amplio
rango puede hacer que la cutinasa sea útil para procesos industriales llevados a
cabo tanto en ambientes ácidos como alcalinos.
Las temperaturas óptimas de la mayoría de las cutinasas microbianas varían de
40 a 60 ° C. La temperatura óptima de TtcutB (55 ° C, Fig. 2c ) es comparable a
la de la enzima de T. fusca sp. ( Hegde y Veeranki, 2013 ), pero más altos que los
de las cutinasas de A. brassicicola (40 ° C) ( Koschorreck et al., 2010 ), F.
solani (40 ° C) ( Kwon et al., 2009 ) y T . terrestris CAU709 (50 ° C) ( Yang, Xu et
al., 2013 ), y un poco menor que la cutinasa de T. fusca (60 ° C) ( Chen et al.,
2008) TtcutB en el presente estudio mostró termoestabilidad hasta 65 ° C,
reteniendo más del 95% de su actividad después del tratamiento a 65 ° C durante
0,5 h ( Fig. 2 d). Las enzimas termoestables son necesarias para muchas
reacciones catalíticas industriales que deben llevarse a cabo a altas
temperaturas. Curiosamente, TtcutB mostró una actividad relativamente alta a
bajas temperaturas, reteniendo más del 31% de su actividad a 0 ° C ( Fig.
2 d). Solo unas pocas enzimas microbianas adaptadas al frío han mostrado
actividad catalítica a temperaturas tan bajas ( Sumby et al., 2009; Yadav et al.,
2011 ), lo que sugiere que la cutinasa de T. terrestrispodría ser valioso como
aditivo para la maduración de queso y vino, dado que estos productos se
almacenan generalmente a temperaturas inferiores a 20 ° C ( Sumby et al.,
2009 ).
TtcutB exhibió una amplia gama de especificidad de sustrato ( Tabla 2 ). No solo
hidrolizó eficientemente los ésteres de p NP, sino también los triglicéridos y el
aceite de oliva. La actividad enzimática más alta para diversos p sustratos NP se
obtuvo con p NPB (C 4 ), y los niveles de actividad disminuyó con el aumento de
longitud de cadena de carbono en el sustrato ( Tabla 2 ); esto es consistente con
el comportamiento de las cutinasas de T. harzianum ( Rubio et al., 2008 ), A.
brassicicola ( Koschorreck et al., 2010 ) y una biblioteca de ADN de compost de
rama foliar ( Sulaiman et al., 2012)) La enzima fue activa en varios triglicéridos con
la misma variación cuando se usaron ésteres de p NP como sustrato ( Tabla
2 ). Esta propiedad es similar a la de la cutinasa de A. brassicicola ( Koschorreck
et al., 2010 ). TtcutB de T. terrestris mostró una fuerte preferencia por sustratos
con una longitud de cadena de acilo corta, que es una característica típica de las
cutinasas ( Chen et al., 2010; Rubio et al., 2008 ). Aunque la especificidad del
sustrato de TtcutB hacia los ésteres p NP es similar a la de TtcutA de T.
terrestris CAU709 ( Yang, Xu et al., 2013)), las actividades específicas de TtcutB
para los triglicéridos son aproximadamente 2-3 veces más altas que las de TtcutA
( Tabla 2 ). Vale la pena señalar que la cutinasa en el presente estudio podría
hidrolizar el aceite de oliva con una actividad específica de 219 U mg -1 de proteína
( Tabla 2 ), que es claramente diferente de otras cutinasas informadas ( Chen et
al., 2010; Rubio et al. ., 2008; Sulaiman et al., 2012 ). El parámetro cinético,
los valores de K m de TtcutB para p NPA, p NPB y p NPC son todos poco más
altos que los de TtcutA para los sustratos correspondientes ( Tabla 3).), aunque
comparten la misma tendencia de variación de afinidad hacia diferentes sustratos
con varias longitudes de cadena de carbono ( Yang, Xu et al., 2013 ).
El butirato de butilo es importante para la industria de alimentos y fragancias, ya
que contribuye significativamente al aroma de manzana, piña, plátano, albaricoque
y mantequilla ( Chen et al., 2013; De Barros et al., 2012; Torres, Baigorí, Swathy,
Pandey, y Castro, 2009 ). Las cutinasas han mostrado propiedades únicas que
pueden explotarse para la síntesis de diferentes ésteres de sabor ( De Barros et
al., 2012 ). TtcutB en el presente estudio exhibió una eficacia de esterificación
significativa para la síntesis de butirato de butilo ( Fig. 3 ). La temperatura de
reacción óptima para el butirato de butilo por TtcutB es de 45 ° C ( Fig. 3 b), la
temperatura más alta o más baja condujo a la disminución de la eficiencia de la
esterificación. Los resultados similares también se observaron a partir de las
cutinasas deAcinetobacter sp. EH28 ( Ahmed, Raghvendra, y Madamwar, 2010 )
y Candida rugosa ( Raghavendra, Sayania, y Madamwar, 2010 ). Las
concentraciones óptimas de sustrato (0,08 M para 1-butanol y 0,12 M para ácido
butírico) para la síntesis de éster fueron relativamente bajas, lo que está de
acuerdo con la cutinasa de F. solani pisi , que tiene una concentración óptima de
sustratos inferior a 0,2 M ( Ahmed et al., 2010; De Barros et al., 2012 ). La eficacia
de esterificación de la cutinasa alcanzó valores altos hasta el 95%, que es
comparable a los rendimientos de las enzimas de F. solani pisi ( De Barros et al.,
2012 ), Acinetobactyersp. EH28 ( Ahmed et al., 2010 ) y C. rugosa ( Raghavendra
et al., 2010 ). Sin embargo, cabe destacar que el tiempo (8 h) para la síntesis de
butilbutirato en el presente estudio es mucho más corto que los tiempos
informados en otros artículos (8 días, Ahmed et al., 2010 ; 8 días, Raghavendra
et al., 2010 ; 3 días, Dheeman , Henehan y Frías, 2011 ).
5 . Conclusiones
Se purificó y caracterizó una nueva cutinasa ácida y adaptada en frío (TtcutB)
de T. terrestri . El pH y la temperatura óptimos de la enzima son pH 4.0 y 55 ° C,
respectivamente. La enzima es estable en un amplio rango de valores de pH y
temperaturas, y también muestra una actividad relativamente alta a bajas
temperaturas. La enzima exhibe una amplia especificidad de sustrato. Además, la
enzima sintetiza el butirato butílico de éster aromático usando 1-butanol y ácido
butírico con alta eficacia de esterificación. Estas excelentes propiedades hacen
que esta enzima sea un candidato atractivo para aplicaciones biotecnológicas.
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. Priti Katrolia por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo
fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos
Distinguidos (No. 31325021 ) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de
China (No. 31371718 ).
Referencias