1.

Hipótesis y componentes de investigación:

Dado que la alternativa para manejar los RSU son los rellenos sanitarios por normativa,
estos generan gran cantidad de lixiviados generando un problema ambiental. Para tratar
los lixiviados generados en rellenos sanitarios existen diferentes alternativas para
reducción de sus cargas contaminantes, sin embargo, la gran mayoría son de alto costo,
complejidad operativa y muchas veces difíciles de implementar.
Sin embargo, es posible generar una alternativa de tratamiento efectivo y de bajo costo
mediante el uso de mecanismos naturales para remediación.
La idea principal de la propuesta es la utilización de un biopolímero con capacidad de
biosorción para coagular los contaminantes. Luego se generará un tratamiento por etapas
de biorremediación del lixiviado mediante la metabolización de compuestos orgánicos y
nitrogenados a través de comunidades de bacterias presentes a nivel radicular y
movilización de compuestos orgánicos y metales hacia las plantas y/o hongos. De esta
forma se generará biomasa vegetal y fúngica donde los contaminantes quedarán
secuestrados en las plantas, con el objetivo final de obtener un efluente tratado con
valores que cumplan la normativa ambiental.

Caso en estudio
Como caso de estudio se considerará el Relleno Sanitario Loma Los Colorados (RSLLC),
diseñado y operado por KDM Tratamiento, de KDM Empresas. Este relleno está ubicado
en el kilómetro 65 de la Ruta 5 norte, 3 kilómetros al norte de la localidad de Montenegro,
comuna de Til Til. Cada día llegan al relleno sanitario alrededor de 7.000 toneladas
diarias. Ahí cada silo es traspasado a un camión de transferencia que lo lleva al frente de
trabajo, lugar donde finalmente se descargan los residuos para su posterior acomodación
y compactación.

2. Metodologías de investigación y desarrollo:

1. Desarrollo de un biopolímero vegetal extraído de plantas del género Opuntia:

Extracción de biopolímero
  Los pads (paletas) de Opuntia son homogenizados en blender de cuchillas
Rotativas (ej. Moulinex) en agua con una proporción de 1:5
 Filtrar en tela fina
 Para la precipitación se utiliza alcohol isopropílico al 95% en proporción 1:3
 Centrifugar a 3560g por 10 minutos.
 Separación del mucílago y lavado con alcohol isopropilico al 95%
 Filtración al vacío con filtro Whatman 5
 Secado en olla a 70 °C por 4 horas

Análisis químico de biopolímero

 Humedad: es medido por secado a 73°C en olla de vacío (AOAC, 1984)

 Proteínas: es medido mediante el método micro-Kjeldalh (AOAC,1984)
 Cenizas: se determina por incineración en mufla Heraeus a 500°C por 8 horas
(AOAC, 1984)
 Componentes Inorgánicos: se usa un método fotométrico para determinar potasio
y absorción atómica para el análisis de calcio (AOAC, 1984)
 Rendimiento: es determinado en peso de biomasa fresca y seca, es expresada
como porcentaje de mucílago (%)

2. Pruebas de coagulación-floculación de lixiviado:

 Test de jarras.
 Formulación del polímero: sólido, viscoso o líquido.
 Balance de masas del coagulado y del sobrenadante.

Formulación del polímero

Se evaluará el empleo del polímero sobre el porcentaje de remoción.

Se evaluará el proceso de floculación y adsorción empleando los lixiviados del relleno
sanitario de Lomas los colorados.

Test de jarras medición de la capacidad de floculación y biosorciòn, % de remoción de

SST desde el lixiviado con el polímero de una cactácea.
Se evaluaran distintas dosificaciones del polímero formulado de acuerdoa un diseño
factorial.

Prueba de Jarras y determinación de propiedades fisicoquímicas.

Para evaluar la clarificación de agua mediante prueba de jarras se aplicó un diseño

experimental completamente al azar con arreglo factorial de 2 x 3 x 2 x 2 donde el primer
factor es la concentración de coagulantes aplicados con dos niveles (35 y 40 mg/L), el
tercer factor el pH con 2 niveles (6 y 7), y el cuarto factor la velocidad de agitación con dos
niveles (100 y 200 rpm); resultando 24 tratamientos por triplicado, y el control corresponde
a la muestra de agua sin tratamiento. Las propiedades fisicoquímicas evaluadas en el
agua tratada fueron la Turbidez (NTU), la eficiencia de actividad coagulante (opuntia-
alumbre) (%), el color (UPC), pH, sólidos totales disueltos (SST) (mg/L) y conductividad
eléctrica (μS/cm).

Se realizó la Prueba de Jarras de acuerdo con la norma ASTM No. D2035-80, en un

floculador portátil VELP® modelo FP4, agregando el coagulante orgánico y el sulfato de
aluminio a los recipientes con muestras de agua, que se sometieron a una agitación
rápida (velocidad para cada tratamiento) por 1 minuto y posteriormente a una agitación
lenta de 30 rpm por 20 minutos, y por último se dejó sedimentar el flóculo por 30 minutos
(ASTM International, 2008).

3. Prueba piloto con humedales artificiales:

 Obtención de plantas del género Typha y Sarcocornia.

 Volumen escala piloto.
 Determinación del Tiempo de residencia hidráulica.
 Cantidad y proporción relación plantas/área.
 Cantidad y proporción de grava y arena.
 Aclimatación de especies vegetales.

4. Prueba piloto mediante micorremediación:

 Obtención de inóculo de Pleurotus ostreatus.

  Cultivo líquido puro de Pleurotus ostreatus en medio PDA.
 Diseño de sustrato y medio de soporte.
 Colonización y nutrición del micelio.

5. Diseño de procesos:

Diseño de un proceso de floculación y biosorción de lixiviado en un relleno

sanitario

 Evaluación de pretratamiento y/o post-tratamiento con bio-polímero.

 Evaluación de etapas de humedal artificial y micorremediación.
o Tratamiento A: Filtros → Especie halófila (Typha) → Especies
fúngicas (Pleurotus).
o Tratamiento B: Filtros → Especie halófila (Sarcocornia) →
Especies fúngicas (Pleurotus).
o Tratamiento C: Filtros → Combinación de especies halófilas
(Typha + Sarcocornia) → Especies fúngicas (Pleurotus).
o Tratamiento D: Filtros → Especies fúngicas (Pleurotus) →
Especies halófilas (Typha y Sarcocornia).

6. Análisis de contaminantes afluente y efluente:

 DQO,
 Nitrógeno,
 Sólidos suspendidos,
 Conductividad,
 pH,
 Perfil de metales,
 NTU.
Determinación de DQO, SST, pH, CE, nitrógeno y fósforo

Parámetro Método analítico Materia Monitoreo diario

prima reactor

pH pHmetro x al final

Materia orgánica sólidos volátiles x al final

Biomasa sólidos suspendidos x al final

volátiles

DQO titulación x x

Nitrógeno total Kjeldahl x al final

Amonio (y razón electrodo de ión amonio x al final

C/N)

Nitratos absorbancia UV x al final

COT titulación x x (si el sustrato es

lodo)

Glucosa DNS x (si el sustrato es

glucosa)

AGVs cromatografía de gases x x

Etanol cromatografía de gases x

Alcalinidad (CaCO3) titulación x al final

Flujo de gas salida Desplazamiento volumen x

Composición gas cromatografía de gases x

salida
7. Ensayos de ecotoxicología:

2.5.7.1 Bioensayo de toxicidad aguda mediante bioluminiscencia bacteriana de

Vibrio fisheri

Materiales y Equipos

Equipo incubador y fotómetro SDIX Microtox 500

Programa MicrotoxOmni Software for Windows 95/98/NT

Micropipetas 10uL, 500uL, 1000uL.

Viales liofilizados Vibrio fischeri NRRL-B-11177 (-20 °C), SDIX (USA).

Solución de reconstitución del reactivo (agua desionizada ultra pura)

NaCl diluyente a 2%NaCl en agua desionizada (6,0 a 8,5pH).

OAS (solución de ajuste osmótico) NaCl al 22%.

Solución estándar IC 50 de fenol, 100mg/L.

Solución estándar IC 50 de sulfato de zinc x7H2O, 100mg/L.

HCL 0,1M

NaOH 0,1M

Metodología

El ensayo de toxicidad aguda por bioluminiscencia bacteriana mediante Vibrio fischeri

está basado en el protocolo según Jhonson, 2005 y la norma ISO 11348-3 (2007) “Water
quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of
Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria”.
Para este análisis se utiliza como reactivo la bacteria marina Vibrio fisheri NRRL B-11177
suministrada por SDIX (USA) en viales de 2ml con 0,5 ml de cultivo puro liofilizado la cual
debe ser refrigerada a -20°C. Este vial se reconstituye con 1,5 ml de diluyente Microtox
(solución de 2% de NaCl estándar), luego se deja incubar a 5°C por 15 min con el objetivo
que la bacteria alcance un luminiscencia óptima para su posterior análisis. Ya
reconstituida la bacteria, se utiliza el protocolo 45% Basic Tox en el programa
MicrotoxOmni Software for Windows 95/98/NT, y para la lectura se utiliza un equipo SDIX
Microtox500, el cual se utiliza como incubador y fotómetro.

Los lixiviados se centrifugan a 5000g durante 20 minutos en tubos Falcon de 50ml.

Debido a que las muestras de lixiviados presentan coloración se someten a una medición
de absorbancia con espectrofotómetro calibrado a 490nm, Posteriormente se utiliza un
factor de corrección al final de la experiencia.

Se utilizan 10 cubetas de ensayo de 5 ml de vidrio, numeradas de la siguiente manera:

A1,A2,A3,A4,A5,B1,B2,B3,B4 y B5.

En el vial A5 se mezclan 2500uL de muestra con 250uL de solución OAS, se mezcla 3

veces haciendo vórtice luego se descartan 750uL. este es la muestra al 100%.

Se realizan diluciones seriadas en razón 1:2 de la muestra haciendo transferencias de

1000uL desde A5 a A4, luego se agrega 1000uL de diluyente, posteriormente se mezcla y
de esta mezcla se agregan 1000uL a A3, luego se agregan 1000uL de diluyente y se
mezcla, de esta mezcla se transfieren 1000uL a A2, luego de la cubeta A2 se transfieren
1000uL a A1 y se agregan 1000uL de diluyente, se mezclan y se descartan 1000uL. Las
diluciones seriadas serían las siguientes:

A1 = 5,63% de muestra

A2 = 11,25% de muestra

A3 = 22,5% de muestra

A4 = 45% de muestra

A5 = 90% de muestra (sin dilución)

Luego se depositan 500 ml de diluyente en B1,B2,B3,B4 y B5.

Se agregan 10uL de la bacteria reconstituida a las cubetas B1 a B5 apoyando el puntero

de la pipeta sobre la pared interna de la cubeta sin tocar la solución.

Se deben esperar 15 minutos para el desarrollo de la bioluminiscencia.

Realizar lecturas a tiempo 0:

Cubeta B1 en el pocillo de lectura, presionar el boton SET del fotómetro para setear el
instrumento, y presionar la barra espaciadora en el teclado del pc.

Colocar las cubetas desde B1 a B5 en el pocillo de lectura a medida que el pc lo indique y

accionar el botón read en el M500 así se obtienen las medidas de bioluminiscencia a T0
(I0). anotar los datos.

Inmediatamente se transfieren 500ml de A5 a B5, de A4 a B4, de A3 a B3, de A2 a B2 y

finalmente de A1 a B1, sumado a los controles de fenol y ZnSO4x7H2O,

Las nuevas diluciones en los pocillos B1 a B5 serán los siguientes:

B1 = 2,81% de muestra

B2 = 5,68% de muestra

B3 = 11,38% de muestra

B4 = 22,75% de muestra

B5 = 45,50% de muestra

Presionar la tecla espaciadora, cuando el monitor lo indique realizar las lecturas para el
tiempo 5min (I5) y 15min (I15). el programa OmniTox debería entregar la curva de
toxicidad correspondiente. anotar los resultados.

Análisis de los datos

El software utiliza los datos de luminiscencia para calcular el punto final del bioensayo, los
resultados se entregan en EC50(mg/L), esto significa que la concentración de la muestra
que causa el 50% de inhibición de la luz emitida por la bacteria Vibrio fischeri. se mide el
EC50 para 5 y 15 minutos, también indica el rango de confianza al 95%. para dicho valor
mientras más estrecho sea el rango de confianza mayor fiabilidad de los resultados.

Para clasificar los datos se adopta el criterio de Bulich (1982), el cual establece rangos de
porcentajes de acuerdo a una escala de toxicidad:

EC50% Clasificación
<25 Muy tóxico

25 - 50 Tóxico

51 - 75 Moderadamente tóxico

76 - 90 Levemente tóxico

> 90 No tóxico

Los valores de los controles deberían ser los siguientes:

 Solución estándar para compuestos orgánicos IC 50 de fenol a 5 min (13 y

26mg/L)
 Solución estándar para metales IC 50 de ZnSO4x7H2O a 15 min (5 y 12mg/L)

2.5.7.2 Bioensayo de toxicidad de la germinacion y elongación radicular de Lactuca

sativa

Materiales y equipos

Material biológico: Semillas de Lactuca sativa L. var. BSS (Black Seed Simpson, variedad
de invierno), Lactuca sativa L var. mantecosa o similar.

Agua dura reconstituida (APHA, 1992). para su preparación se recomienda utilizar

reactivos Grado ACS y agua destilada en vidrio o Millipore Supera Q.

Placas de Petri de 100mm de diametro

Papel de filtro Whatman número 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. el papel de filtro

que se selecciones como sustrato de germinación debe tener las siguientes
características:

 Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido.
  Resistencia de la fibra de papel para que las radículas crezcan por su superficie
sin atravesarlo, situación que dificulta la remoción de las plantas sin dañarlas
 Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores)
 Que no promueva el desarrollo de hongos no asociados a las semillas.

Matraces aforados de 50mL

Regla u otro elemento de medición

Pinzas

Toallas de papel

Bolsas plasticas

Cámara oscura termostatizada 22+-2°C

Programas de análisis estadístico

Metodologia

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática
de toxicidad agua (120 hrs de exposición en el que se pueden evaluar los efectos
fitotóxicos de compuesto puros o mezclas complejas en el proceso de germinación de las
semillas y en el desarrollo de las plantulas durante los primeros días de crecimiento. como
puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en
su germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo. la
evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen indicadores
representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.

a diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación en la

elongación de la radícula y del hipocolito de las plantulas permite ponderar el efecto tóxico
de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son
suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir
completamente procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello
del modo y sitio de acción del compuesto. desta manera, la inhibición en la elongación de
la radícula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la
evaluación de efectos biológicos en vegetales.
este ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros
solubles, de aguas superficiales (lagos y ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo
humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos,
sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al., 1997, Cheung et al., 1989,
Dutka, 1989).

Obtener las semillas de lechuga (L. sativa L var. mantecosa) se realiza en semilleros
locales, procurando que sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), con buen
poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo.

Las semillas seleccionadas se almacenan fraccionadas a 4°C, en oscuridad y ambiente

seco. conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al menos durante 2 años.

Seleccionar 25 semillas por placa de petri las cuales fueron colocadas en 5 filas de 5
semillas cada una.

Se ensayan 4 diluciones por muestra preparadas en alícuotas de 20mL de lixiviado

En cada experimento se prueba de 2 a 3 mL de la muestra pura, 4 diluciones y un control

negativo (agua destilada esterial), todo por duplicado

Las placas se incuban en al oscuridad a 20°C por 120 horas (5 dias)

Después de la incubación, se anota el número de semillas que germinaron y se mide la

longitud de la raíz en milímetros

Evaluación de los datos

La toxicidad se evalúa por la medición de los efectos subletales (inhibición de la

prolongación de la raíz). el porcentaje de inhibición de la prolongación de la raíz (IP) se
realiza de la siguiente forma:

% de Inhibición (IP) = (muestras - control / control) x 100

IP negativa: Tóxica (inhibición de la prolongación de la raíz)

IP positiva: Se considera estimulación del crecimiento

IP = 0: No tóxica
El procesamiento estadístico de toda la información se realiza en microsoft excell 2010, y
con el paquete de programas STATISTICA, versión 5 para windows (StaSoft, Inc. 1996).

Metodología Según Castillo, 2006

Para realizar una curva de dosis respuesta se recomienda preparar un mínimo de cinco o
seis diluciones de la muestra o compuesto a estudiar, de manera que se obtengan valores
de toxicidad intermedios entre 100 y 0%. para las muestras ambientales se recomienda el
uso de un factor de dilución de 0,3 o 0,5 para la preparación de la serie de diferentes
concentraciones. el uso de un factor de 0,3 permite evaluar la toxicidad considerando el
intervalo entre 100% y 1% de la muestra realizando cinco diluciones (100,30,10,3 y 1%).
al aplicar un factor de dilución de 0,5, es necesario utilizar el mayor número de diluciones
para abarcar el mismo intervalo de concentraciones (100,50,25,12,6,3 y 1,5%), pero se
obtiene mayor precisión en los resultados. para la preparación de cada dilución se utiliza
agua dura reconstituida (es posible el uso de agua mineral dura para consumo humano),
realizando el control negativo con el agua de dilución empleada.

Para el caso de las muestras cuya toxicidad es desconocida, previo a la realización de la

prueba definitiva, se sugiere una prueba presuntiva ( ensayo preliminar) utilizando
diluciones logarítmica (100; 10; 1; 0,1; 0,01) que permitan establecer el intervalo de
concentración conveniente para obtener valores de efecto entre 100 y 0%.

con el fin de controlar la sensibilidad de las semillas, simultáneamente a la evaluación de

la toxicidad de una muestra debe realizarse un control positivo, utilizando, por ejemplo,
una sal de Zn (II) como tóxico de referencia. la concentración de este control es la
correspondiente a la CI50 para el lote de semillas en uso.

Procedimiento

Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro

Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la fecha y hora
de inicio y término del bioensayo.

Saturar el papel filtro con 4 o 5 mL de la dilución evitando que se formen bolsas de aire.

Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente veinte semillas, dejando espacio
suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces.
Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad.
dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que
produzca germinación (semillas fotoblásticas negativas), las cajas de Petri deben cubrirse
de la luz inmediatamente después de colocarlas en las cápsulas y durante el periodo de
ensayo. incubar durante 120h (5dias) a una temperatura de 22+-2C°. realizar repeticiones
para cada dilución ensayada.

Efecto en la elongación de la radícula e hipocotilo

Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamente la longitud de la radícula

y del hipocotilo de cada una de las plántulas correspondientes a cada concentración de
tóxico o dilución de muestra y a los controles. la medida de elongación de la radícula se
considera desde el nudo (región más engrosada de transición entre radícula y el
hipocotilo) hasta el ápice radicular. la medida de elongación del hipocotilo se considera
desde el nudo hasta el sitio de inserción de los 2 cotiledones.

Esquema de pantula de L. sativa al finalizar el periodo de exposición

Expresión de los resultados

Se realizan los siguientes cálculos:

 Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de

las plántulas de cada repetición.
 Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo, con el
promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación
del control negativo
 Porcentaje de inhibición en la germinación
Luego elaborar la gráfica dosis-respuesta colocando en su ordenada el porcentaje de
inhibición y en la abscisa, la concentración. mediante un método gráfico o el uso de
programas estadísticos, calcular la concentración que produce el 50% de inhibición
(CI50/CE50) para cada punto final evaluado. para el caso de muestras en donde la
inhibición es inferior al 50%, o para determinar el valor correspondiente al NOEC o LOEC,
se realiza el análisis de comparación de medias (t de Student, Dunnett) para verificar la
significancia estadística en el porcentaje de efecto.

Interpretación de los resultados

Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula o del hipocotilo son efectos
subletales. La inhibición de la germinación podría considerarse como un efecto letal,
siempre y cuando se pueda corroborar que finalizada la exposición a una muestra las
semillas no germinaron por muerte del embrión, y que no existe simplemente un retraso
en el proceso de germinación, manteniendo la viabilidad de la semilla.
esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con semillas.

tipo de ensayo eslático

temperatura 22+-2°C

calidad de luz Oscuridad

volumen de solución de 4ml

prueba
agua de dilución agua dura reconstituida

numero de semillas por 20

replica

número de replicas 3

duración de la prueba 120h

efecto medido inhibición en elongación de la radícula e hipocotilo.

inhibición en la germinación

resultado final CE50 o CI50 (% inhibición)

aceptabilidad de los germinación >90%, control positivo y negativo de

resultados acuerdo con los valores

control positivo Zn (II)

2.5.7.3 Bioensayo de mortalidad de Eisenia foetida

Materiales y equipos

Cultivo de lombrices

Papel filtro: 80 a 85g/m2, aprox. 0,2mm de grosor, grado medio

Suelo artificial:

-10% de musgo Sphagnum sp. (pH 5.5 a 6.0, no residuos de plantas visibles, molido
finamente, secado para medir la cantidad de humedad)

-20% de arcilla kaolin o 30% de kaolinita (tamaño de la partícula menor a 40um)

-70% de arena de silica industrial (#70 grado de malla, arena fina debe ser dominante a
mas de 50% con partículas entre 50 y 200um)

CaCO3 - 99% de pureza para ajustar pH

Metodología
Los oligoquetos lumbrícidos como Eisenia foetida y Eisenia andrei han sido empleadas en
bioensayos ecotoxicológicos (Calow, 1993; Robidoux et al., 1999; Fisher et al., 2001),
debido a la facilidad de cultivar en laboratorio, presentan tiempos generacionales
relativamente más cortos que otros oligoquetos, utilizan menores volúmenes de suelo en
su cría y en el laboratorio y son ecológicamente representativos del ambiente terrestre
(Van Gestel et al., 1988; keddy et al., 1995, OECD, 2000: Robidoux et al., 2001).

Dentro de las pruebas de toxicidad, la ejecución de bioensayos con lombrices

específicamente, Eisenia foetida constituye una de las principales especies para al
evaluación de suelos debido a que estos organismos tienen una alta sensibilidad a
contaminación por metales pesados como Zn, Cd y Pb (Conder et al., 201).

Preparar el suelo artificial combinando los ingredientes en los porcentajes en peso seco,
una vez combinados los materiales, mezclar bien, y añadir una cantidad de carbonato de
calcio (CaCO3) igual al 0,40% del peso combinado total. se deberá ajustar el pH de la
mezcla a 7+-0,5.

Después del ajuste de pH hidratar el suelo artificial a 45% contenido de humedad, se

utilizan aproximadamente 297ml de agua de hidratación para 600gr de suelo (600*0,45 =
270gr = 270mL)

Test del tóxico de referencia (2-Cloroacetamida)

El tóxico de referencia debería ser evaluado mensualmente cuando se tiene un cultivo

propio de lombrices, si las lombrices son obtenidas de un proveedor externo se deberá
hacer un testeo con el tóxico de referencia por cada lote nuevo de lombrices.

se requieren a lo menos 3 concentraciones diferentes de solución stock de 2-

cloroacetamida que son añadidas a los 600gr de suelo artificial(minimo 3 réplicas). se usa
una concentración de aproximadamente 38,5mg/kg. el cálculo de los otros 2
concentraciones de los controles positivos se hacen de manera similar.

Cálculo de la cantidad de 2-cloroacetamida en polvo para 600g de suelo artificial

R = W*C*T

donde:
R = cantidad de tóxico de referencia a añadir (mg)

W = peso de tierra artificial a utilizar (gr)

C = factor de conversión (1kg/1000g)

T = concentración objetivo del toxico de referencia (mg/kg)

Ejemplo de cálculo:

W = 600g

T = 38,5mg/kg

R = (600g) * (1kg/1000g) * (38,5mg/kg) = 23,1mg

Se realizan mínimo 4 controles y 4 réplicas con 10 lombrices adultas cada una, al suelo
artificial se le deben agregar 2gr de alimento cada 2 días (guano de vaca seco), todo en
frascos de 750ml tapados con film perforado para intercambio de gases.

La duración del test son 14 dias (medición de mortalidad a los 7 y 14 días), la temperatura
debe ser de 20°C+-2. el test debe ser a luz continua, esto es para asegurarse que las
lombrices estén en el medio durante todo el test.

debe reportarse cualquier comportamiento o síntomas patológicos.

Al final del test debe medirse el contenido de humedad del test

Tratamiento de los resultados

Los datos de mortalidad/concentración deben ser en un gráfico logarítmico de

probabilidad se deben estimar la dosis letal media (DL50) y los límites de confidencia.

También se acepta el análisis probit.

Cuando 2 concentraciones en una serie geométrica (en un rango de a lo más 2.0) resulta
en 0 y 100% de mortalidad, esos 2 valores son suficientes para indicar el rango donde cae
la DL50.

Reporte del test

El reporte del test debe tener la siguiente información:

 Sustancia a testear: datos de identificacion quimica, metodo de aplicacion

 Animales testeados: edad, mantenimiento y condiciones de cría, lugar de
procedencia.
 Condiciones del test: descripción y detalles de cualquier variación de los
materiales del test y condiciones recomendadas
 Información de preparación de los medios

Resultados

Media de peso y número de lombrices vivas de cada tratamiento al inicio y al final del test

Descripción de síntomas obvios de enfermedad o cambios distintivos en los organismos

observados

Método usado para determinar el LD50 detallando todos los datos usados y los resultados
del test

Gráfico mostrando la curva concentración/efecto

Mortalidad en animales de control

Mortalidad con la sustancia de referencia

LD50 y todo los datos usados para calcularlo

Humedad del suelo artificial al comienzo y al final del test, pH al principio del test

La concentración más alta que no causa mortalidad

La concentración más baja que causa el 100% de mortalidad

3. Bibliografía:

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