UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO – UFOP

ESCOLA DE FARMÁCIA
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE FARMÁCIA

GÉSSICA COUTO SCHAUN

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI IN VITRO E IN VIVO

DE SISTEMAS AUTOEMULSIONÁVEIS CONTENDO NIFURTIMOX E
BENZNIDAZOL

OURO PRETO - MG
2017
 Géssica Couto Schaun

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI IN VITRO E IN VIVO

DE SISTEMAS AUTOEMULSIONÁVEIS CONTENDO NIFURTIMOX E
BENZNIDAZOL

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Curso de Graduação em Farmácia da Universidade
Federal de Ouro Preto como requisito para a
obtenção do título de Farmacêutico.

Professor orientador: MSc. Ana Lia Mazzet

Professor co-orientador: Profa Maria Terezinha Bahia

OURO PRETO - MG
2017
 GÉSSICA COUTO SCHAUN

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI IN VITRO E IN VIVO

DE SISTEMAS AUTOEMULSIONÁVEIS CONTENDO NIFURTIMOX E
BENZNIDAZOL

Monografia defendida em 30 de março de 2017 como requisito parcial para obtenção

de grau em Farmácia pela Universidade Federal de Ouro Preto.

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________

Orientador: MSc. Ana Lia Mazzeti

Universidade Federal de Ouro Preto

______________________________________
Prof. Arlete R. Penitente Barcelos
Universidade Federal de Ouro Preto

______________________________________
MSc. Giani Martins Garcia
Universidade Federal de Ouro Preto
 DEDICATÓRIA

Dedico primeiramente aos meus pais Raimundo e Ilza,

por toda dedicação e esforço para a realização desse
sonho. A minha irmã Renata e a minha prima Thialle, por
todo cuidado. A todos os meus familiares pelo imenso
apoio e carinho. A Ana Lia por toda paciência e
dedicação. E a todos os meus amigos que participaram
dessa minha caminhada.
 AGRADECIMENTO

Agradeço a Deus por sempre me proteger e guiar meu caminho pelos melhores
lugares, colocando sempre em minha vida pessoas e experiências maravilhosas.

Aos meus pais Raimundo e Ilza por serem minha fortaleza, meus exemplos de
fé e garra. A minha irmã Renata, que apesar da distância, sempre me apoiou e me
ajudou. A minha prima Thialle, irmã que eu escolhi, por toda a dedicação, todo carinho.
A todos os meus tios por todo apoio, carinho e ensinamentos, vocês têm imensa
participação nessa minha conquista, em especial, meu dindo Ildes e minha dinda
Urânia, não podia ter escolhido melhores padrinhos! A todos os meus primos, pela
amizade, irmandade e cumplicidade. Amo vocês!

A Zé Antônio e toda família Cotta, em especial Beth, Thati e Marcelo, pelo apoio
e suporte quando eu cheguei em Minas. Se hoje eu estou terminando meu curso em
Ouro Preto, vocês tiveram uma grande participação nessa conquista.

A minha república Patotinha, que me ensinou valores imensuráveis que só

acrescentaram à minha vida. Essa casa foi o meu alicerce durante o meu período em
Ouro Preto e será meu alicerce para toda a vida. Agradeço imensamente pelos
melhores momentos. A nossa irmandade bota o pé na eternidade!

A minha orientadora Ana Lia e a minha co-orientadora Maria Terezinha por

nunca terem desistido de mim. Por todo ensinamento, não só acadêmico, mas
também de vida. Admiro vocês imensamente! Na vida, em cada etapa escolhemos
pessoas para serem nosso exemplo e na minha jornada acadêmica, longe do meus
pais e familiares, vocês se tornaram minha referência de mulher, de amiga e de
profissional. Obrigada por tudo!

A Karol, Alvaro, Suiane, por nunca medirem esforços para me ajudar. Pela
amizade e companheirismo. Por fazerem meus dias no laboratório sempre melhores!

Aos meus amigos/companheiros de iniciação científica Ruan, Lidiane, Lais,

Priscila e Breno. Obrigada por dividirem essa experiência comigo.
 A Ludmila e a Irisa, por terem feito parte da minha caminhada acadêmica.

A todos amigos que fiz nesses últimos anos. Em especial Laryssa, Pryscila e
Jessika, que fizeram minha caminhada no curso de farmácia mais feliz, por toda as
curriolas, por aturarem meus dramas e pela cumplicidade. Amo vocês!

E um agradecimento mais que especial à Gloriosa Escola de Farmácia! Pelo

ensino de qualidade, por me tornar uma farmacêutica diferencia!

Por fim, gratidão a todos que contribuíram direta ou indiretamente para essa
minha conquista!

Gratidão!
“A única revolução possível é dentro de nós.”
Mahatma Gandhi
 RESUMO

Palavras-chave: T. cruzi, doença de Chagas, nova formulação, SEDDS

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta cerca

de 6 milhões de pessoas no mundo, sendo classificada pela Organização Mundial de
Saúde como “doença tropical negligenciada”. A terapia específica para essa doença
está restrita aos fármacos nifurtimox e benznidazol, que apresentam limitações em
relação a eficácia e a indução de reações adversas. Dessa forma, novas estratégia
estão sendo estudas, dentre elas a reformulação de medicamentos já disponíveis. Um
tipo de formulação lipídica consiste nos sistemas autoemulsionantes (SEDDS) de
administração de fármacos, que visa melhorar a biodistribuição dos fármacos, reduzir
sua toxicidade e melhorar o acesso aos órgãos alvos. Dessa forma, o estudo tem
como objetivos (i) avaliar citotoxicidade dos SEDDS contendo nifurtimox e benznidazol
quando comparados ao fármaco livres utilizando células H9c2; (ii) avaliar a atividade
anti-T.cruzi in vitro dos SEDDS contendo nifurtimox e benznidazol quando
comparados aos fármacos livres utilizando células H9c2 infectadas pela cepa Y de T.
cruzi; e (iii) avaliar a eficácia in vivo dos SEDDS quando comparada aos fármacos
livres em camundongos infectados por T. cruzi. A avaliação da citotoxicidade in vitro
mostrou que a formulação, em concentrações superiores ao IC90 dos fármacos livres
apresentaram viabilidade celular ≥ a 75%, demonstrando a ausência de toxicidade da
formulação em concentrações efetivas dos fármacos. Os estudos de atividade anti-T.
cruzi in vitro resultaram em valores de IC-50 e IC-90 semelhantes da formulação
quando comparado aos fármacos livres ( SEDDS benznidazol o valor de IC-50
1,29±0,014 µM e o IC-90 foi 7,245±1,99 µM; para o SEDDS nifurtimox o IC-50 e o IC-
90 foram respectivamente 0,71±0,12 µM e 4,37±1,44 µM). A avaliação da eficácia in Comentado [LFm1]: Confirmar

vivo mostrou que a formulação não induziu aumento dos índices de cura quando
comparado aos fármacos na forma livre. Apesar dos resultados obtidos terem
mostrado que a formulação de SEDDS não aumentou a eficácia dos fármacos, a
formulação apresenta vantagens como melhoria da biodisponibilidade oral, possuir
baixo custo e ser de fácil produção em larga escala e a facilidade de ser administrados
diretamente por via oral.
 ABSTRACT

Key-words: T. cruzi, Chagas' disease, new formulation, SEEDS

Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, affects about 6

million people worldwide, and is classified by the World Health Organization as a "neglected
tropical disease." Specific therapy for this disease is restricted to nifurtimox and benznidazole,
which present limitations on efficacy and the induction of adverse reactions. Thus, new
strategies are essential, including the reformulation of medicines available. The lipid
formulation, as self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS), aims to improve the tissue
biodistribution of drugs, reduce their toxicity and improve access to target places. Therefore,
this study aims to (i) evaluate the cytotoxicity of SEDDS containing nifurtimox and
benznidazole and drugs using H9c2 cells; (ii) evaluate the in vitro anti-T.cruzi activity of
SEDDS containing nifurtimox and benznidazole using H9c2 cells infected by Y strain of T.
cruzi; (iii) evaluate the efficacy in vivo SEDDS in infected mice. The evaluation of in vitro
cytotoxicity showed that the formulation presented cell viability ≥ 75%, demonstrating the
absence of toxicity of the formulation at effective concentrations of the drugs in concentrations
higher than IC90 of drugs. The anti-T. cruzi activity studies in vitro resulted in similar IC-50
and IC-90 values of the formulation when compared to free drugs (SEDDS benznidazole the
IC 50 value was 1.29 ± 0.014 μM and IC-90 was 7.245 ± 1.99 μM; SEDDS nifurtimox IC-50
and IC-90 were 71 ± 0.12 μM and 4.37 ± 1.44 μM, respectively). Evaluation of in vivo efficacy
showed that the formulation do not induce increase cure when compared to free drugs. Although
the results obtained showed that the SEDDS formulation did not increase the efficacy, but the
formulation has advantages such as improved oral bioavailability, low cost and easy to large
scale production and facility for oral administration.
LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo do Trypanosoma cruzi em triatomíneos e mamíferos. .................. 5

Figura 2: Fórmula estrutural do nifurtimox (3-metil-4 {(5-nitrofurfurilidene)

amino} tiomorfoline-1-,1-dioxide) .................................................................................. 7

Figura 3: Fórmula estrutural do benznidazol (N-benzil-2-nitroimidazole-1-

acetamida). ......................................................................................................................... 7

Figura 4 - Representação esquemática da metodologia utilizada para a avaliação

dos diferentes tratamentos. Os camundongos foram inoculados com 5000
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi e tratados com 25, 50, 75 e 100 mg/kg de
benznidazol por via intraperitoneal durante 20, 10, 7 e 3 dias; com 100 mg/kg de
benznidazol via oral por 20 ou 40 dias ou com 50mg/kg de nifurtimox por 20 ou 40
dias. Foi realizado exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com
Ciclofosfamida e coletas de sangue para PCR 30 e 180 dias após o fim do tratamento.
(dpt: dias pós-tratamento). ............................................................................................... 16

Figura 5 - Teste de viabilidade celular com utilizando H9c2. Teste de viabilidade

celular de células H9c2 tratadas com benznidazol, nifurtimox livres e incorporados às
formulações de SEDDS e a formulação sem fármaco. Concentração inicial de 1000
µM com 8 séries de diluição 1:2, em um ensaio de 72h. Os resultados representam a
média de dois experimentos independentes. ................................................................. 20

Figura 6 - Curvas de dose-resposta representativas da atividade in vitro de

nitrocompostos livres e incorporados a formulações SEDDS e da formulação
sem o fármaco (SEDDS Branco) sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y
do Trypanosoma cruzi. Células H9c2 infectadas pela cepa Y do T. cruzi foram
incubadas com nifurtimox, benznidazol, as formulações contendo fármaco e a
formulação sem fármaco na concentração inicial de 20μM, seguida de 8 séries de
diluição 1:2, em um ensaio de 72h. Cada ponto das curvas de dose-resposta
corresponde à média de três experimentos independentes. O cálculo de IC-50 e IC-
90 foi realizado utilizando-se o software CalcuSyn. ...................................................... 23
LISTA DE ABREVIATURA

Bz Benznidazol

CNT Controle não tratado

CO2 Dióxido de carbono

CV Coeficiente de variação

DMEM Dulbecos Medium

DNA Ácido desoxirribonucleico

DNDi Drugs for Neglected Disease Initiative

DP Desvio padrão

Dpt Dias pós-tratamento

ESF Exame de sangue a fresco

FIC Concentração inibitória fracional

IC-50 Concentração do fármaco que inibe 50% da infecção

IC-90 Concentração do fármaco que inibe 90% da infecção

Log Logarítimo

Nfx Nifurtimox

NMP N-metilpirrolidona

Pb Pares de base
PBS phosphate buffered saline

PCR Reação em Cadeia Polimerase

Rpm Rotações por minuto

SFB Soro fetal bovino

SEDDS Self-emulsifying drug delivery systems

TGI Trato gastrointestinal

WHO World Health Organization

SFB Soro Fetal Bovino

T. cruzi Trypanosoma cruzi

 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Concentrações dos fármacos livres e incorporados a formulação que

proporcionam valores da viabilidade da célula H9c2 acima de 75% sobre cepa Y do
Trypanosoma cruzi. .......................................................................................................... 22

Tabela 2 - Valores de IC-50 e IC-90 dos fármacos nifurtimox e benznidazol na forma

livre e incorpora na formulação de SEDDS sobre da cepa Y do Trypanosoma cruzi.
............................................................................................................................................ 24
Tabela 3 - Efeito do tratamento com benznidasol e nifurtimox na forma livre e
incorporado a formulação de SEDDS no curso da infecção de animais infectados pela
cepa Y de Trypanosoma cruzi. ........................................................................................ 26
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
2 OBJETIVO ................................................................................................................... 3
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 3
2.2 Objetivo Especifico .............................................................................................. 3
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA DA LITERATURA ..................................................... 4
3.1 Doença de Chagas .............................................................................................. 4
3.2 Quimioterapia ....................................................................................................... 6
3.3 Novas estratégias para o tratamento da doença de Chagas .......................... 8
3.4 Sistemas autoemulsionantes ............................................................................ 10
4 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 12
4.1 População de Trypanosoma cruzi .................................................................... 12
4.2 Fármacos ............................................................................................................ 12
4.3 Formulação SEDDS .......................................................................................... 12
4.4 Avaliação da citotoxicidade............................................................................... 13
4.5 Avaliação da atividade anti-T. cruzi in vitro ..................................................... 14
4.6 Avaliação da eficácia da formulação em induzir cura em camundongos
infectados pelas cepas Y e colombiana do T. cruzi. .................................................. 14
4.6.1 Procedimentos éticos .................................................................................. 14
4.6.2 Infecção e esquema de tratamneto ............................................................ 15
4.6.3 Exames parasitológicos para o controle de cura ...................................... 15
5 RESULTADO E DISCUSSÕES ............................................................................... 19
6 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 28
7 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 29
 1

1 INTRODUÇÃO

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é

causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi, e foi descoberta pelo
pesquisador Carlos Chagas em 1909. Sua transmissão ocorre tanto de forma vetorial,
pelo inseto da subfamília Triatominae, como pela via oral, transfusão sanguínea e
vertical de mãe para filho (RASSI JR.; RASSI; MARIN-NETO, 2010; WHO, 2016a). De
acordo com o WHO cerca de 6 milhões de pessoas encontram-se infectadas no
mundo (WHO, 2016a).

A doença de Chagas apresenta duas fases sucessivas: uma fase aguda e uma
fase crônica. A fase aguda geralmente é assintomática, mas em alguns casos há o
aparecimento de sintomas inespecíficos. Durante a fase crônica, os indivíduos
também podem encontrar-se assintomáticos, mas alguns podem progredir para
formas clínicas da doença - cardíaca, digestiva ou cardiodgestiva (WHO, 2016a).

A quimioterapia especifica para a doença de chagas é composta pelos

fármacos nifurtimox e benznidazol (WHO, 2016a). Ambos apresentam eficácia na fase
aguda da doença, porém, quando são administrados na fase crônica sua eficácia é
diminuída (URBINA; DOCAMPO, 2003). Nas últimas duas décadas estudos de novas
alternativas terapêuticas foram realizados para a superação desses limites, dentre
elas encontram-se o desenvolvimento de novos fármaco, reposicionamento de
fármacos, novas formulações para os fármacos disponíveis e terapia de combinação
(BAHIA; DINIZ; MOSQUEIRA, 2014).

Diante do exposto o presente trabalho se propôs a avaliar a atividade e eficácia

de sistemas autoemulsionantes (SEDDS) de administração de fármacos na tentativa
de compensar a baixa solubilidade em água e a baixa permeabilidade dos fármacos,
o que leva a efeitos colaterais graves, freqüentemente observados nos tratamentos
benznidazol e nifurtimox (BAHIA; DINIZ; MOSQUEIRA, 2014).

O SEDDS é um sistema lipídico de liberação constituído de uma mistura

homogênea de óleos, agentes tensoativos e de fármacos, que se dispersa
espontaneamente para produzir emulsão fina de óleo-em-água após diluição aquosa
com pouca agitação (AGRAWAL; KUMAR; GIDE, 2015). Nessa perspectiva, esse
sistema aumenta a solubilidade e a biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em
 2

meio aquoso devido à sua capacidade de manter o fármaco em estado solubilizado

no trato gastrointestinal (KOLLIPARA; GANDHI, 2014), proporcionando a diminuição
da dose e da frequência de administração e potencial redução dos efeitos tóxicos
(KALE; PATRAVALE, 2008; POUTON, 1997; SHAJI; JADHAV, 2010).

Ainda que a formulação não seja capaz de induzir melhoria na eficácia do

benznidazol nem do nifurtimox na infecção experimental in vitro e in vivo por cepa Y
de T. cruzi, a disponibilização de uma nova formulação é um aspecto importante na
busca por novas alternativas terapêuticas para uma enfermidade cujo tratamento
ainda é tão falho.
 3

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a atividade e a eficácia dos sistemas autoemulsionantes (SEDDS, do

inglês self-emulsifying drug delivery systems) contendo nifurtimox e benznidazol in
vitro e in vivo na infecção experimental por T. cruzi.

2.2 Objetivo Especifico

• Avaliar citotoxicidade de SEDDS contendo nifurtimox e benznidazol quando

comparados ao fármaco livres utilizando células H9c2.
• Avaliar a atividade anti-T.cruzi in vitro de SEDDS contendo nifurtimox e
benznidazol quando comparados aos fármacos livres utilizando células H9c2
infectadas pela cepa Y de T. cruzi.
• Avaliar a eficácia in vivo de SEDDS contendo nifurtimox e benznidazol
comparada ao fármaco livre em camundongos infectados por T. cruzi.
 4

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA DA LITERATURA

3.1 Doença de Chagas

A doença de Chagas é classificada pela Organização Mundial de Saúde como

“doença tropical negligenciada”. Atuamente há 6 milhões de pessoas infectadas no
mundo, principalmente na América Latina e, nas últimas décadas, casos da doença
tem sido relatados em países como Estados Unidos da América, Canadá, em países
da Europa e em alguns países orientais do pacífico. Este novo panorama da doença
de Chagas pode estar associado à migração de pessoas infectadas dos países da
América Latina para outras regiões do mundo (WHO, 2016a).

A doença de Chagas foi descoberta em 1909, sendo registrada pelo

pesquisador Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas como originária da interação do
homem com o agente etiológico, o protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi
(CHAGAS, 1909).

O T. cruzi tem um ciclo de vida complexo com vários estágios de

desenvolvimento, envolvendo hospedeitro invertebrado, insetos da subfamília
Triatominae, e hospedeiro vertebrado, mamíferos (CHAGAS, 1909). Espécies de
triatomíneos dos gêneros Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma tem destaque como
vetor da doença de Chagas humana (WHO, 2016)

O ciclo de vida desse protozoário (figura 1), no inseto vetor, tem início no
repasto sanguíneo do triatomíneo, durante o qual ingere formas tripomastigotas
sanguíneas de um hospedeiro vertebrado infectado. No tubo digestivo do inseto, esta
forma se diferencia em epimastigota que, ao chegar no intestino médio, se multiplica
por divisão binária. Em seguida, essas formas migram para a porção final tubo
digestivo, onde sofrem o processo de metaciclogênese e transformam-se em
tripomastigotas metacíclicos (NEVES et al., 2011, p.89).

Os tripomastigotas metacíclicos são as formas infectantes para o hospedeiro

vertebrado, pois diferente dos epimastigotas que são digeridos por células
fagocitárias, eles têm a capacidade de penetrar e se multiplicar em qualquer célula
nucleada, exceto neutrófilos e eosinófilos (BRENER, Z., ANDRADE, Z. A., 2000).
 5

A infecção no hospedeiro vertebrado ocorre quando formas infectantes,

depositadas sobre a pele lesada, penetram no local da picada ou em mucosa íntegra.
Essas formas caem na corrente sanguínea e infectam células nucleadas do
hospedeiro vertebrado. No interior das células, as formas tripomastigotas se
diferenciam em amastigotas, as quais após se multiplicarem, diferenciam-se
novamente em tripomastigotas. Com o rompimento das células, essas formas caem
novamente na corrente sanguínea, podendo ser ingeridas por um inseto vetor durante
um novo repasto sanguíneo ou infectar outras células do hospedeiro (NEVES et al.,
2011, p. 89).

Outras formas de infecção são as não vetoriais, como a oral, transfusão

sanguínea e vertical de mãe para filho. Atualmente a transmissão oral tem adquirido
importância epidemiológica, sendo responsável por surtos regionais de infecção
aguda (RASSI JR.; RASSI; MARIN-NETO, 2010).

Figura 1: Ciclo do Trypanosoma cruzi em triatomíneos e mamíferos.

Fonte: http://www.who.int/tdr/diseases-topics/chagas/chagas_f1.jpg?ua=1.

Após a infecção o indivíduo apresenta a fase aguda da doença, caracterizada

por uma grande carga parasitária em diversos tecidos. Nesta fase, a maioria dos
indivíduos infectados são assintomáticos ou oligossintomáticos (RASSI JR.; RASSI;
MARIN-NETO, 2010). Com o desenvolvimento da respota imune, o indivíduo evolui
para a fase crônica da doença. Nesta fase, o parasita permanece no hospedeiro,
 6

muitas vezes, como infecção assintomática po/dendo permanecer assim por décadas
ou até mesmo por toda vida (NAGAJYOTHI et al., 2012).

Alguns indivíduos, em períodos variáveis de tempo, evoluem para as formas

sintomáticas da doença: a forma cardíaca, digestiva ou mista (LAMAS et al., 2006;
URBINA, 2009). A forma cardíaca é a mais grave e a mais frequente manifestação da
fase crônica da doença de Chagas, podendo levar a insuficiência, arritmias,
tromboembolismo e morte súbita (RASSI JR.; RASSI; MARIN-NETO, 2010).

3.2 Quimioterapia

A tentativa de encontrar um fármaco para a doença de Chagas teve início logo

após sua descoberta, mas os primeiros compostos testados não tiveram sucesso. No
final da década de 1960 ocorreu a descoberta da atividade curativa dos
nitrocompostos na infecção murina e, posteriormente, para o tratamento em humanos,
isso marcou a era do benznidazol e do nifurtimox revisado por BAHIA; DINIZ;
MOSQUEIRA, 2014. Esses medicamentos são utilizados atualmente no tratamento
da doença e são eficazes quando utilizados na fase aguda, porém sua eficácia diminui
quanto mais tardia for a infecção (WHO, 2016a). Dessa forma, os nitrocompotos
quando administrados na fase crônica da doença levam a baixos níveis de cura, sendo
em muitos casos, ineficazes (URBINA; DOCAMPO, 2003).

Na fase crônica o parasito encontra-se, em sua maioria, confinado em tecidos

profundos (principalmente cardíaco e digestivo) e em replicação lenta. Os fármacos
disponíveis para o tratamento da doença de Chagas possuem meia vida relativamente
curta e pequena penetração no tecidual, o que poderia explicar sua baixa efetividade
nessa fase da doença (URBINA, 2010).

O mecanismo de ação do nifurtimox (3-metil-4 {(5-nitrofurfurilidene) amino}

tiomorfoline-1-,1-dioxide – figura 2), está associado a redução do grupamento nitro
que reage produzindo radicais livres, o superóxido e o peróxido de hidrogênio, que
são altamente tóxicos, inviabilizando a sobrevivência do parasito que tem um
mecanismo de detoxicação deficiente (URBINA; DOCAMPO, 2003). Na presença do
íon férrico (Fe³+), esses metabólitos formam o radical livre hidroxila que se liga a
lipídios, proteínas e DNA, lesando as células. Como consequência, os tecidos do
hospedeiro também podem ser lesados e ocorrer reações adversas como
 7

hipersensibilidade, anorexia, vômitos, polineurite e depressão da produção de células

da medula óssea (OLIVEIRA et al., 2008).

Figura 2: Fórmula estrutural do nifurtimox (3-metil-4 {(5-

nitrofurfurilidene) amino} tiomorfoline-1-,1-dioxide)

O mecanismo antiparasitário do benznidazol (N-benzil-2-nitroimidazole-1-

acetamida – figura 3) é pouco elucidado. Acredita-se que seu mecanismo de ação se
dá por meio de estresse oxidativo, que envolve a modificação covalente de
macromoléculas por intermediários nitroreduzidos ou por outras interações de
nitrorredução com os componentes do parasito, o mais comum é a inibição da síntese
de proteína (BRENER, Z., ANDRADE, Z. A., 2000; OLIVEIRA et al., 2008; URBINA;
DOCAMPO, 2003).

Figura 3: Fórmula estrutural do benznidazol (N-benzil-2-

nitroimidazole-1-acetamida).

O benznidazol apesar de ser mais tolerado que o nifurtimox, também causa

reações colaterais indesejadas no hospedeiro, sendo as principais a dermatite por
hipersensibilidade, depressão da medula óssea e polineuropatia priférica (BRENER,
Z., ANDRADE, Z. A., 2000).
 8

De acordo com o Consenso Brasileiro em Doença de Chagas de 2015 a

administração da dose do benznidazol em adultos é de 5,0 mg/Kg/dia e em criança é
de 10mg/Kg/dia. Em ambos os casos, a administração é por via oral, sendo a dose
dividida em duas ou três vezes ao dia, durante 60 dias, com dose máxima
recomendada de 300mg/dia. Já o nifurtimox é administrado, em adultos, na dose de
10mg/Kg/dia e em criança na dose de 15mg/Kg/dia sendo administrado por via oral,
dividida em três vezes ao dia, durante 60 dias (CARLOS PINTO DIAS et al., 2016). O
tempo de tratamento somado aos efeitos adversos, são fatores que levam o paciente
a abandonar o tratamento.

Nesse contexto observa-se a necessidade de novos medicamentos ou

estratégias terapêuticas para a doença de Chagas que sejam melhor tolerados e que
melhorem a eficácia do tratamento.

3.3 Novas estratégias para o tratamento da doença de Chagas

Espuelas em 2012 revisou os avanços na quimioterapia de protozooses e

mostrou que novos medicamentos e/ou estratégias terapêuticas podem ser
alcançadas em curto, médio e longo prazo. Segundo esta classificação temos: (i) curto
prazo, os medicamentos disponíveis para a patologia usados em diferentes
estratégias terapêuticas, como a terapia de combinação, (ii) médio prazo, utilização
de medicamentos disponíveis ou em testes clínicos para outras patologias que
possam se adequar a doença de Chagas ou melhoria de compostos através de novas
estratégias de formulação, e (iii) longo prazo, a descoberta de novos alvos
terapêuticos específicos do parasita e a síntese ou descoberta de novos compostos
ativos (ESPUELAS et al., 2012).

Estudos realizados nas últimas duas décadas tem demonstrado que o T. cruzi,
como a maioria dos fungos e leveduras, requer esteróis específicos para a viabilidade
e proliferação celular em todas as fases do seu ciclo de vida sendo, a via de
biossíntese do ergosterol quimicamente validada in vitro (URBINA, 2002; URBINA;
DOCAMPO, 2003). Esta descoberta tornou a via de biossíntese do ergosterol alvo de
estudos na busca de novos tratamanentos para a doença de Chagas. Dentre os
inibidores da biossíntese do ergosterol, destacam-se os derivados azólicos
posaconozol e o ravoconazol (URBINA, 2010).
 9

O posaconazol (POS), um análogo de itraconazol, teve atividade anti-T. cruzi

comprovada por diversos estudos in vitro (MOLINA et al., 2000; URBINA et al., 1998)
e in vivo (MOLINA et al., 2000). Já o ravoconazol, nos ensaios in vitro demonstrou ser
ativo contra o T. cruzi, porém nos experimentos in vivo, com modelos murinos, sua
atividade foi limitada, devido às suas propriedades farmacocinéticas (URBINA et al.,
2003). Contudo, esses resultados não descartaram o potencial desse fármaco no
tratamanto de infecções humanas por T. cruzi, principalmente após o desenvolvimento
do E1224, um pró fármaco do ravuconazol que possui propriedades farmacocinéticas
mais favoráveis (BAHIA; DINIZ; MOSQUEIRA, 2014).

Os promissores resultados em ensaios pré-clínicos dos derivados azólicos na

infecção experimental por T. cruzi levou a ensaios clínicos com o posaconazol e o
E1224. No entanto, os resultados obtidos até o momento em ensaios clínicos foram
decepcionantes, evidenciando a necessidade da busca por novas alternativas
(DRUGS FOR NEGLECTED DISEASES INITIATIVE, 2013; MOLINA et al., 2014).

Outro composto promissor para o tratamento da doença de Chagas é o

nitrocomposto fexinidazol (BAHIA et al., 2012). Sua atividade anti T.cruzi foi
descoberta nos anos 80, mas recentemente foi “redescoberta” pela Iniciativa de
Medicamentos para a Doenças Negligenciadas (DNDi) na exploração
nitroimidazólicos novos e antigos para o tratamento da tripanossomíase Africana,
conhecida como doença do sono, e da doença de Chagas (BAHIA; DINIZ;
MOSQUEIRA, 2014). O fexinidazol se mostrou eficaz na infecção experimental por T.
cruzi nas fases agudas e crônicas induzidas por cepas parcialmente resitentes e
resistentes ao benznidazol (BAHIA et al., 2012). O fexinidazol também foi testado em
ensaio clínico, porém os resultados obtidos ainda não foram divulgados.

A partir dos resultados obtidos experimentalmente e em ensaios clínicos com

diferentes compostos, o interesse pelos fármacos convencionais, o benznidazol e o
nifurtimox, foi renovado no sentido de utilizar estratégias de reformulação a fim de
alcançar melhores resultados (BAHIA; DINIZ; MOSQUEIRA, 2014). O principal
desafio da farmacoterapia da doença de Chagas é atingir os parasitas intracelulares,
pois há o desafio da barreira física que, dificulta o acesso de concentrações do
fármaco que vão efetivamente eliminar os parasitas nos tecidos (ROMERO;
MORILLA, 2010).
 10

A doença de Chagas é uma parasitose de ampla distribuição tecidual, os

parasitas são distribuídos nas membranas das mucosas, músculo cardíaco,
esquelético e liso e células da glia. Devido a essa característica, o fármaco anti-T.
cruzi ideal para atuar nas duas fases da doença, deve ter um elevado volume de
distribuição e alta capacidade de penetração nos tecidos (ROMERO; MORILLA,
2010).

O benznidazol e o nifurtimox possuem um elevado volume de distribuição,

porém com acesso intracelular limitado o que resulta em uma alta concentração
plasmática e o surgimento dos efeitos adversos (ROMERO; MORILLA, 2010). Isso
pode estar relacionado à solubilidade desses compostos. A solubilidade aquosa de
uma substância é uma das suas mais importantes propriedades físico-químicas. A
baixa solubilidade aquosa e dissolução lenta pode potencialmente limitar a absorção
de um fármaco a partir do trato gastrointestinal. Assim, o desenvolvimento de novas
formulações, muitas vezes, é necessário para promover a melhor distribuição e
penetração dos fármacos nos tecidos. Porém, a fraca solubilidade na água limita não
só a aplicação farmacológica de um fármaco, mas também desafia seu
desenvolvimento farmacêutico (AGRAWAL; KUMAR; GIDE, 2015). Como um
resultado, a investigação em novos agentes solubilizantes e técnicas para aumento
da solubilidade é importante, assim como a introdução em sistemas lipídicos de
liberação.

3.4 Sistemas autoemulsionantes

Os sistemas autoemulsionantes (SEDDS) de administração de fármacos é um

exemplo de sistema lipídico de liberação sendo constituído de uma mistura
homogênea de óleos, agentes tensoativos e de fármacos, que se dispersa
espontaneamente para produzir emulsão fina de óleo-em-água após diluição aquosa
com pouca agitação (AGRAWAL; KUMAR; GIDE, 2015). Nessa perspectiva, esse
sistema aumenta a solubilidade e a biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em
meio aquoso devido à sua capacidade de manter o fármaco em estado solubilizado
no trato gastrointestinal (KOLLIPARA; GANDHI, 2014), isso proporciona a diminuição
da dose e da frequência de administração além do potencial redução dos efeitos
tóxicos (KALE; PATRAVALE, 2008; POUTON, 1997; SHAJI; JADHAV, 2010).
 11

Outras vantagens dos SEDDs são capacidade de contornar metabolização

hepática e promover o transporte linfático de fármacos mais lipofílicos, além de
possuir baixo custo e ser de fácil produção em larga escala (DATE et al., 2010;
PORTER; CHARMAN, 2001).

De acordo com Nazzal et al., 2002 e Porter et al., 2008 esse sistema pode ser
administrado diretamente por via oral, o que facilitaria a administração do fármaco em
crianças, ou interiorizados em cápsulas duras ou moles. Exemplos de fármacos
disponíveis no mercado que possuem formulação auto-emulsionantes de
administração oral são: Sandimmune®, Sandimmune Neoral®, Norvir® (ritonavir) e
Fortovase® (saquinavir) (NAZZAL et al., 2002; PORTER et al., 2008; WADHWA;
NAIR; KUMRIA, 2012).

Considerando a alta incidência de efeitos adversos, a pouca eficácia na fase

crônica da doença, o longo período de tratamento e a baixa solubilidade em meio
aquoso do benznidazol e nifurtimox, usados na terapia convencional da doença de
Chagas, o sistema auto-emulsionante de administração de fármaco (SEDDS) parece
uma alternativa viável para a melhoria da eficácia do tratamento com estes fármacos.
 12

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 População de Trypanosoma cruzi

Foi utilizada a cepa Y de T. cruzi, classificada como DTU II (ZINGALES et al.,

2009). Essa cepa foi isolada de um paciente na fase aguda da doença de Chagas por
Pereira de Freitas, em 1950, em Marília (SP) e posteriormente estudada e descrita
por Silva & Nussenzweig, 1953. A cepa Y (ZINGALES et al., 2009) foi escolhida por
apresentar, nos estudos in vivo, características biológicas como a indução de alta
parasitemia e 100% de mortalidade na infecção murina, facilitando, neste caso, a
avaliação da atividade tripanocida da formulação. Além disso, é considerada
parcialmente resistente ao tratamento com benznidazol (FILARDI; BRENER, 1987).

4.2 Fármacos

-Benznidazol (Bz): N-benzyl-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl) acetamide (LAFEPE -

comprimido; doação - pó).

-Nifurtimox (Nfx): (RS)-3-methyl-N-[(1E)-(5-nitro-2-furyl) methylene]

thiomorpholin-4-amine 1,1-dioxide (Bayer).

4.3 Formulação SEDDS

Foi utilizada, para este estudo, a formulação desenvolvida e caracterizada por

Mazzeti 2016. Sendo composta por Miglyol® 810N : Capryol® 90 : Lipoid® S75 :
Labrasol® : N-metil pirrolidona (NMP) (30 : 15 : 20 : 15 : 20) (% v/v). Para sua
preparação, inicialmente misturou o Lipoid® S75, Miglyol® 810N e o Capryol® 90 sob
agitação e aquecimento (não ultrapassando 40°C), até completa dissolução do Lipoid®
S75. Posteriormente e em outro recipiente, misturou-se o fármaco (exceto na
formulação branca), o NMP e o Labrasol® sob agitação até a completa solubilização
do fármaco quando foram então adicionados a solução de Miglyol® 810N. A esta
mistura de excipiente foram preparadas formulações de SEDDS contendo
benznidazol na concentração de 25 mg/mL e outra contendo nifurtimox na
concentração de 12,5 mg/mL (MAZZETI, 2016).
 13

4.4 Avaliação da citotoxicidade

Para excluir os efeitos tóxicos do fármaco e da formulação sobre as células

hospedeiras, culturas de cardiomiblastos H9c2 não infectadas pelo T. cruzi foram
tratadas com concentrações cerca de 100 vezes maior que o valor do IC-90 dos
fármacos, além de concentrações correspondentes da formulação. O experimento foi
realizado conforme previamente padronizado (DINIZ et al., 2013), utilizando a
resazurina, um indicador colorimétrico de proliferação que se baseia na redução
química do reagente devido à atividade metabólica das células. Através de reações
de oxi-redução, o corante passa da cor azul (forma oxidada e não fluorescente) para
rosa (forma reduzida, fluorescente), e esta mudança de cor pode ser medida pela
leitura colorimétrica ou fluorimétrica (AHMED; GOGAL; WALSH, 1994; FIELDS;
LANCASTER, 1993). Assim, duzentos microlitros de suspensão das células H9c2 em
meio de cultura DMEM, na concentração de 5x103 /mL, foram pipetados em placas de
96 poços e incubados a 37ºC, 5% CO2 por 24 horas. O meio de cultura foi removido
e substituído por 200 µL de meio contendo os fármacos de nifurtimox e benznidazol,
das formulações contendo nifurtimox e benznidazol, além da formulação branca. A
placa foi, então, incubada por 72 horas, a 37ºC. As concentrações utilizadas
corresponderam a no mínimo 100 vezes superior ao valor de IC-90 de cada fármaco
e foram diluídos na proporção 1:2. Foram utilizados controles em cada placa: controles
negativos (meio + resazurina), controles negativos (meio), controles positivos (meio +
células), controles para avaliar o potencial das substâncias (meio + substância) em
reduzir o corante. Após as 72 horas de incubação, foi adicionados 20 µL de resazurina
1mM a cada poço. A placa foi submetida a leitura espectrofotômetro de microplacas
(570 nm e 600 nm). A porcentagem de inibição da proliferação induzida pelos
compostos foi calculada considerando o percentual de redução das células incubadas
na ausência de fármaco, como na fórmula abaixo:

(𝑚𝑒𝑖𝑜 + 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑟𝑖𝑛𝑎570 )𝑚é𝑑𝑖𝑎 − (𝑚𝑒𝑖𝑜570 )𝑚é𝑑𝑖𝑎

𝑅0 =
(𝑚𝑒𝑖𝑜 + 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑟𝑖𝑛𝑎600 )𝑚é𝑑𝑖𝑎 − (𝑚𝑒𝑖𝑜600 )𝑚é𝑑𝑖𝑎

𝐴570 − (𝐴600 × 𝑅0 )𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜

%𝑟𝑒𝑑𝑢çã𝑜 =
𝐴570 − (𝐴600 × 𝑅0 )𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒
 14

4.5 Avaliação da atividade anti-T. cruzi in vitro

A avaliação do efeito do tratamento com nifurtimox e benznidazol, SEDDS

contendo nifurtimox e benzidazol e SEDDS branco (sem fármaco) foi realizada
utilizando células H9c2 como hospedeiras, infectadas pela cepa Y de T. cruzi. Para
isso, foram plaqueadas 1x104 células por poço, sobre lamínulas de 13 mm de
diâmetro, em placas de 24 poços e incubadas por 24 horas a 37ºC, 5% CO2. Formas
tripomastigotas originadas de cultura de células Vero, foram utilizadas para a infecção
em uma razão de 20:1 (parasitos/células). Após 24 horas de interação, o
sobrenadante foi removido e cada poço foi lavado com PBS estéril, a fim de remover
os parasitos não internalizados. Meio de cultura contendo os fármacos e as
formulações em diferentes concentrações foram adicionados a cada poço, em um
volume total de 1 mL. A maior concentração utilizada foi 20 µM de cada fármaco, bem
como concentrações correspondentes das formulações, diluídas na proporção de 1:2,
num total de 8 diluições. As células foram incubadas por 72h, a 37ºC. Em todos os
experimentos foram utilizados controles, que correspondem a células infectadas e não
tratadas. As lamínulas contendo as células foram lavadas com PBS, fixadas com
metanol por dez minutos e em seguida, coradas pela solução de Giemsa (10% em
água destilada) por 10 minutos. A quantificação do número de células infectadas foi
feita por microscopia óptica (URBINA et al., 1998). O efeito de cada substância foi
calculado em relação a inibição da infecção comparada ao controle infectado não
tratado. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, com no mínimo duas
repetições.

4.6 Avaliação da eficácia da formulação em induzir cura em camundongos

infectados pelas cepas Y de T. cruzi.

4.6.1 Procedimentos éticos

Os experimentos com animais foram realizados sob licença do Comitê de Ética

em Pesquisa da Universidade Federal de Ouro Preto (CEUA: 2014/56). As
metodologias e os modelos estabelecidos foram usados com um número mínimo de
animais que permitiram a avaliação estatística e científica dos dados.
 15

4.6.2 Infecção e esquema de tratamneto

Para esta avaliação foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas, 18-20g, 7

animais/grupo, infectados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Y
(parcialmente resistente ao benznidazol). Os animais foram tratados com 50mg/kg de
nifurtimox, SEDDS contendo nifurtimox na quantidade correspondente 50mg/kg do
fármaco; 100mg/kg de benznidazol, SEDDS contendo benznidazol na quantidade
correspondente a 100mg/kg do fármaco; SEDDS branco (mesmo volume que as
formulações contendo os fármacos) por 20 dias consecutivos. Os parâmetros usados
para avaliar o impacto dos tratamentos na evolução da infecção foram: (i) supressão
da parasitemia - avaliada antes e após a imunossupressão, (ii) mortalidade - avaliada
diariamente até 30 dias após o término do tratamento e (iii) reação em cadeia da
polimerase (PCR) - realizada em amostras de sangue coletadas 30 e 180 dias após o
término do tratamento. Os animais que apresentaram parasitemia persistentemente
negativa até 30 dias após o término do tratamento, foram imunossuprimidos com
ciclofosfamida e a parasitemia avaliada diariamente durante o período de
imunossupressão. A utilização da imunossupressão com ciclofosfamida aumenta a
sensibilidade dos testes parasitológicos devido à indução da reativação da
parasitemia nos animais não curados (CALDAS et al., 2008).

4.6.3 Exames parasitológicos para o controle de cura

Exame de sangue a fresco - O exame de sangue a fresco foi realizado a partir

do quarto dia de infecção e até o trigésimo dia após o término do tratamento, para a
observação da reativação natural da parasitemia nos animais tratados e não curados.
Após este período, os animais que apresentaram a parasitemia negativa foram
submetidos a imunossupressão com ciclofosfamida. Foram administradas doses de
0,05mL de ciclofosfamida (Genuxal®), correspondentes à concentração de 50mg/kg
de peso corporal, durante quatro dias consecutivos, com espaços de três dias,
intercalando-se três ciclos de administração. Foram realizados exames de sangue a
fresco durante e até 10 dias após o término da imunossupressão, cessando-se o
esquema de administração da ciclofosfamida nos animais que apresentaram a
reativação da parasitemia.
 16

Figura 4 - Representação esquemática da metodologia utilizada para a avaliação

dos diferentes tratamentos. Os camundongos foram inoculados com 5000 tripomastigotas
da cepa Y de T. cruzi e tratados com 25, 50, 75 e 100 mg/kg de benznidazol por via
intraperitoneal durante 20, 10, 7 e 3 dias; com 100 mg/kg de benznidazol via oral por 20 ou
40 dias ou com 50mg/kg de nifurtimox por 20 ou 40 dias. Foi realizado exame de sangue a
fresco antes e após a imunossupressão com Ciclofosfamida e coletas de sangue para PCR
30 e 180 dias após o fim do tratamento. (dpt: dias pós-tratamento).

Fonte: MAZZETI, 2016

PCR em amostras de sangue periférico - A PCR em tempo real foi realizada

no sangue dos animais coletado 30 e 180 dias após o tratamento específico, com o
objetivo de confirmar falha terapêutica. Para isso, foram coletados 200µL de sangue
de cada animal, pelo plexo venoso retro-orbital, misturados a 35µL de anticoagulante
citrato e armazenados a 4ºC por no máximo 48 horas.

A extração do DNA genômico do sangue total dos animais foi realizada

utilizando-se o kit comercial “Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega”. Foram
transferidos 200μL do sangue coletado de cada animal para microtubos de 1,5 mL
contendo 600μL “Cell Lysis Solution”. O conteúdo dos tubos foram homogeneizado
por inversão (5-6 vezes) e mantidos a temperatura ambiente por 10 minutos, sendo
homogeneizados por inversão 3 vezes durante esse período. Em seguida os
microtubos foram centrifugados por 20 segundos a 13.000 rpm e o sobrenadante
removido, restando apenas 10-20μL de líquido residual nos microtubos, os quais
foram levados ao vórtex por 15 segundos, para a ressuspensão das células brancas
do sangue. Posteriormente foi adicionado 200 μL de “Nucleic Lysis Solution” a cada
 17

microtubo, o qual foi incubado por 45 minutos em banho-maria a 37ºC. Decorrido esse
tempo, foi acrescentado 1 μL de “Rnase solution” a cada microtubo e estes foram
incubados novamente a 37ºC por 15 minutos em banho-maria. Ao atingir a
temperatura ambiente, foi adicionado 67 μL de “Protein Precipitation Solution” aos
microtubos que foram homogeneizados em vórtex por 15 segundos e centrifugados
por 3 minutos a 13.000 rpm. O sobrenadante de cada amostra, contendo o DNA, foi
transferido para um microtubo de 0,6 mL, contendo 200 μL de isopropanol a
temperatura ambiente. Os microtubos foram invertidos várias vezes para a
precipitação do DNA e centrifugados por 1 minuto a 13.000 rpm. O sobrenadante foi
descartado por inversão e 300 μL de etanol 70%, a temperatura ambiente foi
adicionado, sendo o microtubo invertido várias vezes para lavar o DNA, e centrifugado
por 1 minuto a 13.000 rpm. O sobrenadante foi descartado por inversão e o microtubo
invertido sobre papel absorvente para secagem por 20 minutos. Após a secagem,
foram adicionados 67 μL de “DNA Rehydration Solution” e os microtubos incubados a
4ºC por 48 horas para a reidratação do DNA.

Para a reação de PCR em tempo real, cada amostra foi analisada em duplicata,
utilizando-se 2 μL de DNA genômico na concentração de 25ng/µL, 0,35 μM de
oligonucleotídeos iniciadores específicos para a repetição de 195 pares de bases (pb)
do DNA do T. cruzi, TCZ-F∗ 5’-GCTCTTGCCCACAMGGGTGC-3’, onde M = A ou C
(Invitrogen) (CUMMINGS e TARLETON, 2003), e TCZ-R 5’-
CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3’, o qual amplifica um produto de 182 pb, 5 μL de
“Sybr Green® PCR Mastermix”, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10
μL. Separadamente, para cada amostra analisada, também foi relizada, em duplicata,
a quantificação de parasitos no sangue para dosar o fator alfa de necrose tumoral
murino-específico (TNF-alfa), eleito como o controle endógeno da reação e utilizado
para normalizar a mesma. Para cada reação foram utilizados 2 μL de DNA genômico
(50 ng), 0,50 μM de oligonucleotídeos iniciadores TNF-5241 5’-
TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA-3’ e TNF-5411 5’-CAGCA
AGCATCTATGCACTTAGACCCC-3’ (CUMMINGS; TARLETON, 2003), 5 μL de “Sybr
Green® PCR Mastermix”, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. As
reações foram distribuídas em placas de 96 poços (Fast 96-Well Reaction Plate, 0,1
mL, MicroAmp™), centrifugadas por 2 minutos a 200 rpm e levadas ao termociclador
StepOnePlus (Apllied Biosystems). O programa de termociclagem consistiu em
 18

aquecimento a 95ºC por 10 minutos, 40 ciclos de 94ºC por 15 segundos e 62ºC por 1
minuto, sendo os dados coletados nesta última temperatura e a curva “Melt” ou de
dissociação (para checagem da especificidade do produto de DNA amplificado) foi
realizada com temperaturas variando de 95ºC a 60ºC. Em cada placa foram incluídos
um controle negativo da extração (proveniente de camundongo normal), em duplicata,
para sangue, e um controle negativo da PCR, em duplicata, com água no lugar de
DNA, para a reação com oligonucleotídeos iniciadores do T. cruzi e do TNF-alfa
(CUMMINGS; TARLETON, 2003).
 19

5 RESULTADO E DISCUSSÕES

Esse trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a atividade e a eficácia dos
sistemas autoemulsionantes (SEDDS, do inglês self-emulsifying drug delivery
systems) contendo nifurtimox e benznidazol in vitro e in vivo. Para isso, inicialmente,
foi avaliada a indução de citotoxicidade in vitro do nifurtimox e do benznidazol na forma
livre e incorporados à formulação de SEDDS além, da formulação na ausência de
fármaco (SEDDS branco).

O experimento foi feito em triplicata, duas vezes, com concentrações iniciais

(1000µM) cerca de 100 vezes maiores que o IC-90. Para a análise dos dados,
consideramos que as concentrações das formulações são julgadas seguras quando
a viabilidade celular, em média, é superior a de 75% (ISO/EN10993-5, 2009)

Em altas concentrações dos fármacos livres e das formulações, observa-se que

a viabilidade de células H9c2 é comprometida, porém, em concentrações superiores
às efetivas, todos os tratamentos podem ser considerados seguros.
 20

Figura 5 - Teste de viabilidade celular com utilizando H9c2. Teste de viabilidade celular
de células H9c2 tratadas com benznidazol, nifurtimox livres e incorporados às formulações de
SEDDS e a formulação sem fármaco. Concentração inicial de 1000 µM com 8 séries de
diluição 1:2, em um ensaio de 72h. Os resultados representam a média de dois experimentos
independentes.

5A
5B
100 100

75
V i a b i li d a d e ( % )

75
V i a b i li d a d e ( % )

50 50

25 25

0 0
5
2

,5
1

00
0
5

0
2

,5

5
,2
1

00
0

,6
0
5

7 ,8

50
,2

25
,6

62

12
7 ,8

50
25
62

12

31

10
15
31

10
15

C o n c e n tra ç ã o (u M ) C o n c e n tra ç ã o (u M )
B e n z n id a z o l S E D D S B e n z n id a z o l N ifu r tim o x S E D D S N ifu r tim o x

100

5C
75
V i a b i li d a d e ( % )

50

25

0
5

0
,5

0
2

,2

0
2
1

,6

0
1

6
,8

1
5

3
7

C o n c e n t r a ç ã o t e ó r ic a d e f á r m a c o ( u M )

S E D D S b ra n c o

Fonte: Resultado da pesquisa

Quando se utiliza 1000 µM de benznidazol a viabilidade de células H9c2 é da

ordem de 55,35 ± 8,39%, porém na concentração de 500µM a viabilidade celular
passa a 77,88 ± 10,60%, demonstrando que, a utilização de 500µM, ou menos, de
benznidazol é considerada segura (Figura 5A), uma vez que a viabilidade celular é ≥
75%. É importante ressaltar que esta concentração é 57,54 vezes maior que o IC-90
do fármaco livre.

Além disso, os resultados obtidos com os experimentos de citotoxicidade

mostram que o nifurtimox induz maior toxicidade para células H9c2 quando
comparado ao benznidazol. A utilização de 31,25 µM de nifurtimox é considerada
 21

segura, uma vez que induz 76,87 ± 8,64% de viabilidade celular, esta concentração é
4,54 vezes maior que o IC-90 do fármaco (Figura 5B).

Os experimentos de citotoxicidade também revelaram se os constituintes da

formulação de SEDDS interferem na viabilidade celular. Para isso, utilizou-se o
SEDDS branco, ou seja, a formulação na ausência dos fármacos (Figura 5C). Os
resultados mostram que a formulação é segura para a célula H9c2, uma vez que
quando se utiliza um volume de formulação que corresponde à utilização de 31,25 µM
do fármaco, a viabilidade celular permanece acima de 75% em células H9c2.

Posteriormente, verificou-se se a incorporação dos fármacos à formulação

altera o perfil de viabilidade celular, utilizando células H9c2. De acordo com os
resultados, apesar da formulação induzir um aumento de citotoxicidade em relação ao
fármaco livre, quando se observa altas concentrações de benznidazol, a utilização da
formulação ainda é segura, uma vez que não induz toxicidade (viabilidade celular
acima de 75%) nas concentrações efetivas do fármaco.

O SEDDS contendo benznidazol na concentração de 31,25 µM apresentou

uma viabilidade celular acima de 75% (82,31 ± 4,84%) apresentando uma relação de
3,60 vezes maior que o IC-90 do fármaco na forma livre. De forma semelhante, a
utilização de SEDDS contendo nifurtimox é considerada segura em concentrações
inferiores a 15,625 µM (2,27 vezes maior que o IC-90), no qual observa-se viabilidade
celular na ordem de 87,46 ± 9,97% (Figura 7), esta concentração é 2,27 vezes superior
ao IC-90 do fármaco.

Estes resultados indicam que as formulações, nas concentrações superiores

aos IC-90 dos fármacos livres, ou seja, concentrações consideradas efetivas, não
interferem na viabilidade das células H9c2. Os resultados obtidos nos testes de
citotoxicidade estão resumidos na tabela 1. Dessa forma, o próximo passo do estudo
foi avaliar a atividade dos SEDDS contendo fármacos em relação aos fármacos livres.
 22

Tabela 1 – Concentrações dos fármacos livres e incorporados a formulação que

proporcionam valores da viabilidade da célula H9c2 acima de 75% sobre cepa Y do
Trypanosoma cruzi.

Fármaco Viabilidade celular acima de 75%

(concentração)
Benznidazol

Livre 500µM

SEDDS 31,25 µM

Livre 31,25 µM
Nifurtimox

SEDDS 15,625 µM

Fonte: Resultado da pesquisa.

Assim, estabeleceu-se a concentração de 20µM dos fármacos livres e de

SEDDS como a maior concentração para os experimentos da avaliação da atividade
anti-T. cruzi. Foram realizadas 8 diluições em série, na proporção de 1:2. Após 72
horas de incubação com os fármacos e com as formulações, as lamínulas foram
coradas e a contagem do número de células infectadas foi realizada no microscópio
óptico. O percentual de infecção observada nas células após os diferentes
tratamentos foi dividido pelo percentual de infecção observado nas células não
tratadas, esse valor obtido foi subtraído de 100 (valor que representa 100% de
infecção) e posteriormente multiplicado por 100, fornecendo o percentual de inibição
da infecção.

O experimento foi realizado em duplicata, duas vezes e a partir da contagem

do controle de células infectadas e não tratadas, observou-se que o percentual de
infecção nessas células, nos diferentes experimentos, variou de 36,6% a 52,4%
(dados não mostrados). Esse nível de infecção permitiu observar de forma adequada
o efeito dos diferentes tratamentos quando as células foram incubadas com os
mesmos.
 23

Como pode ser observado nas curvas de dose-resposta (figuras 6), a

formulação que não continha fármaco (SEDDS branca) não foi capaz de inibir a
infecção em células H9c2 pela cepa Y de T. cruzi. De forma diferente, as formulações
e os fármacos livres diminuíram de forma dose dependente a infecção por T. cruzi.

Figura 6 - Curvas de dose-resposta representativas da atividade in vitro de

nitrocompostos livres e incorporados a formulações SEDDS e da formulação sem o
fármaco (SEDDS Branco) sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y do Trypanosoma
cruzi. Células H9c2 infectadas pela cepa Y do T. cruzi foram incubadas com nifurtimox,
benznidazol, as formulações contendo fármaco e a formulação sem fármaco na concentração
inicial de 20μM, seguida de 8 séries de diluição 1:2, em um ensaio de 72h. Cada ponto das
curvas de dose-resposta corresponde à média de três experimentos independentes. O cálculo
de IC-50 e IC-90 foi realizado utilizando-se o software CalcuSyn.

100
100

90
80
80

70
% d e in ib iç ã o
% d e in ib iç ã o

60
60

50

40
40

30

20 20

10

0 0
- 1 .0 - 0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 - 1 .0 - 0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
lo g d a c o n c e n tr a ç ã o d a d r o g a ( m ic r o m o la r) lo g d a c o n c e n tr a ç ã o d a d r o g a ( m ic r o m o la r)

N ifu rtim o x S e d d s N ifu rtim o x S E D D S B ra n c o B e n z n id a z o l S e d d s B e n z n id a z o l S E D D S B ra n c o

Fonte: Resultado da pesquisa.

O valor médio de IC-50 para o benznidazol foi de 2,10±0,41 µM, enquanto

8,69±1,46 µM foram necessários para induzir 90% de redução no número de infecção.
Para o SEDDS de benznidazol o valor de IC-50 foi 1,29±0,014 µM e para o IC-90
7,245±1,99 µM. Com relação ao nifurtimox, o valor de IC-50 e IC90 foram
respectivamente 0,72±0,15 µM e 6,88±4,77 µM e para o SEDDS nifurtimox o resultado
de IC50 foi 0,71±0,12 µM e IC-90 4,37±1,44 µM.

Os dados obtidos na investigação da atividade entre diferentes nitrocompostos

na forma livre e incorporado a formulação de SEDDS podem ser resumidos na tabela
abaixo:
 24

Tabela 2 - Valores de IC-50 e IC-90 dos fármacos nifurtimox e benznidazol na forma livre
e incorpora na formulação de SEDDS sobre da cepa Y do Trypanosoma cruzi.

Fármaco IC 50 IC-90
Benznidazol

Livre 2,10±0,41 µM 8,69±1,46 µM

SEDDS 1,29±0,014 µM 7,245±1,99 µM

Livre 0,72±0,15 µM 6,88±4,77 µM

Nifurtimox

SEDDS 71±0,12 µM 4,37±1,44 µM

Fonte: Resultado da Pesquisa.

Os resultados do IC-50 e IC-90 para os fármacos livres e para as formulações

contendo os fármacos encontram-se de acordo com resultados encontrados na
literatura, que mostram que nitrocompostos são geralmente ativos na escala de
micromolar (BAHIA et al., 2014; MORAES et al., 2014). Os resultados obtidos com
esse trabalho corroboram com os valores de IC-50 encontrados por diferentes autores
na literatura para o nifurtimox, onde há uma variação de 1,2 a 2,7 μM contra
amastigotas da cepa Y (MORAES et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2008) e para o
benznidazol o IC-50 é de 2,4 μM (MORAES et al., 2014). Então, pode-se afirmar que
as formulações de SEDDS contendo os fármacos apresentaram atividade contra as
formas amastigotas da cepa Y de T. cruzi em células H9c2 semelhante ao fármaco
livre.

A formulação SEDDS é um sistema lipídico de liberação que se dispersa

espontaneamente formando emulsão fina de óleo-em-água após diluição aquosa com
pouca agitação (AGRAWAL; KUMAR; GIDE, 2015). Nessa perspectiva, esse sistema
aumenta a solubilidade e a biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em meio
aquoso devido à sua capacidade de manter o fármaco em estado solubilizado no trato
gastrointestinal (KOLLIPARA; GANDHI, 2014). Considerando a possibilidade de
melhora de absorção e penetração a partir de SEDDS, ainda que a atividade das
 25

formulações in vitro tenha sido semelhante aos fármacos livres, o próximo objetivo do
trabalho baseou-se em avaliar a atividade in vivo das formulações.

Dessa forma, utilizou-se camundongos Swiss fêmeas, divididos em grupos de

5 ou 7 animais infectados pela cepa Y de T. cruzi e tratados na fase aguda. Os
controles do experimento foram: grupo não infectados e não tratados, infectados não
tratados, infectados trados com SEDDS branco.

Os grupos tratados corresponderam: grupo tratado com benznidazol 100

mg/kg, nifurtimox 50 mg/kg, SEDDS de benznidazol 100mg/kg e SEDDS de nifurtimox
50 mg/kg e SEDDS branco administrado por via oral, durante 20 dias.

Para a avaliação do efeito do tratamento, foram utilizados os parâmetros de

percentagem de cura (negativação de exame de sangue a fresco antes e após a
imunossupressão, além de PCR 30 e 180 dias após o tratamento) e de mortalidade
(até 30 dias após o fim do tratamento) em modelo agudo de infecção murina por T.
cruzi. De acordo com a tabela 2 é possível observar que a dose necessária para a
supressão da parasitemia não apresenta diferença significativa quando compara o
fármaco na forma livre e incorporado na formulação de SEDDS.
 26

Tabela 3 - Efeito do tratamento com benznidasol e nifurtimox na forma livre e

incorporado a formulação de SEDDS no curso da infecção de animais infectados pela
cepa Y de Trypanosoma cruzi.

TRATAMENTO/ DOSE NEGATIVAÇÃO RESULTADO MORTALIDADE

DA NEGATIVO NO ESF
PARASITEMIA E/OU PCR
(N° DE DOSE)

NINT ND ND 0/5 (0%)

INT 0/7 0/7 (0%) 7/7 (100%)

SEDDS BRANCO 0/7 0/7 (0%) 7/7 (100%)

NIFURTIMOX 50 BENZNIDAZO 100

Livre 7/7 (1±0) 4/7 (57,4%) 0/7 (0%)

mg/kg

SEDDS 7/7 (1,14±0,38) 4/7 (57,4%) 0/7(0%)

Livre 7/7 (1,43±0,79) 1/7 (14,3%) 0/7 (0%)

mg/kg

SEDDS 7/7 (1,71±0,75) 2/7 (28,57%) 0/7 (0%)

Fonte: Resultado do Experimento.

A análise do exame de sangue a fresco, do teste de PCR e da mortalidade

mostram que a incorporação dos fármacos na formulação de SEDDS não induziu
aumento dos índices de cura quando comparado aos fármacos na forma livre. Além
 27

disso, os constituintes da formulação (formulação branca) não interferem no curso da

infecção de camundongos pela cepa Y de T. cruzi,

Desse modo, os resultados mostram que a formulação de SEDDS não foi capaz
de induzir melhoria na eficácia do benznidazol, nem do nifurtimox na infecção
experimental in vitro e in vivo pela cepa Y de T. cruzi.

Nessa perspectiva, apesar dos resultados obtidos terem mostrado que a

formulação de SEDDS não aumenta a eficácia dos fármacos, a formulação apresenta
vantagens como melhoria da biodisponibilidade oral, possuir baixo custo de produção
e ser de fácil produção em larga escala, além da capacidade de ser administradas
diretamente por via oral em qualquer concentração proporcionando a adequação da
dose administrada pelo peso do indivíduo, fatores que aumentariam a adesão ao
tratamento por parte desses pacientes. Logo, disponibilizar uma nova formulação para
a administração de fármacos parece uma alternativa viável para a melhoria no
tratamento.
 28

6 CONCLUSÕES

A análise de citotoxicidade da formulação de SEDDS branco e SEDDS contendo

os fármacos benznidazol e nifurtimox, nas concentrações superiores aos IC-90 dos
fármacos livres (concentrações efetivas), não interferem na viabilidade das células
H9c2.

A avaliação da atividade in vitro mostrou que as formulações de SEDDS contendo

os fármacos apresentaram atividade contra as formas amastigotas da cepa Y de T.
cruzi em células H9c2 semelhante ao fármaco livre.

A avaliação da atividade in vivo do benznidazol e do nifurtimox incorporados a

formulação SEDDS não induziu aumento dos índices de cura quando comparado aos
fármacos na forma livre.

A formulação de SEDDS não foi capaz de melhoria na eficácia do benznidazol,

nem do nifurtimox na infecção experimental in vitro e in vivo por cepa Y de T. cruzi.

Contudo, a formulação apresenta vantagens como melhoria da biodisponibilidade

oral, possuir baixo custo e ser de fácil produção em larga escala, além da capacidade
de ser administradas diretamente por via oral, sendo uma alternativa à formulação já
comercializada.
 29

7 REFERÊNCIAS

AGRAWAL, A. G.; KUMAR, A.; GIDE, P. S. Toxicity Study of a Self-

nanoemulsifying Drug Delivery System Containing N-methyl pyrrolidone. Drug
Research, v. 65, n. 8, p. 446–448, 2015.

AHMED, A. S.; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-
radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an
alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological
Methods, v. 170, n. 2, p. 211–224, 15 abr. 1994.

BAHIA, M. T. et al. Fexinidazole: A Potential New Drug Candidate for Chagas

Disease. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 6, n. 11, p. e1870, 1 nov. 2012.

BAHIA, M. T. et al. Antitrypanosomal activity of fexinidazole metabolites,

potential new drug candidates for Chagas disease. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 58, n. 8, p. 4362–4370, ago. 2014.

BAHIA, M. T.; DINIZ, L. D. F.; MOSQUEIRA, V. C. F. Therapeutical approaches

under investigation for treatment of Chagas disease. Expert opinion on
investigational drugs, v. 23, n. 9, p. 1225–37, 2014.

BRENER, Z., ANDRADE, Z. A., B.-N. Trypanosoma Cruzi e Doença de

Chagas, Zilton A. Andrade - Livro - WOOK. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan S.A., 2000.

CALDAS, I. S. et al. Benznidazole therapy during acute phase of Chagas

disease reduces parasite load but does not prevent chronic cardiac lesions.
Parasitology Research, v. 103, n. 2, p. 413–421, 4 jul. 2008.

CARLOS PINTO DIAS, J. et al. II Consenso Brasileiro em Doença de

Chagas, 2015. Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2015. Anais...Brasília:
Epidemiol. Serv. Saúde, jun. 2016Disponível em:
<http://www.iec.pa.gov.br/template_doi_ess.php?doi=10.5123/S1679-
49742016000500007&scielo=S2237-96222016000500007>. Acesso em: 25 jun. 2016

CHAGAS, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfologia e o

 30

ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., agente etiológico de nova

entidade mórbida do homem. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 1, n. 2, p.
159–218, ago. 1909.

CUMMINGS, K. L.; TARLETON, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi

in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 129, n.
1, p. 53–59, 2003.

DATE, A. A. et al. Self-nanoemulsifying drug delivery systems: formulation

insights, applications and advances. Nanomedicine (London, England), v. 5, n. 10,
p. 1595–1616, 2010.

DINIZ, L. DE F. et al. Benznidazole and Posaconazole in Experimental Chagas

Disease: Positive Interaction in Concomitant and Sequential Treatments. PLoS
Neglected Tropical Diseases, v. 7, n. 8, p. e2367, 15 ago. 2013.

DRUGS FOR NEGLECTED DISEASES INITIATIVE. Pesquisa sobre novo

medicamento contra a doença parasitária que mais mata nas Américas
apresenta série de resultados e revela indícios que podem levar à melhoria de
tratamentos – DNDi. Disponível em: <http://www.dndi.org/2013/media-
centre/langues-press-releases/e1224-po/>. Acesso em: 20 jun. 2016.

ESPUELAS, S. et al. Innovative Lead Compounds and Formulation Strategies

As Newer Kinetoplastid Therapies. Current Medicinal Chemistry, v. 19, n. 25, p.
4259–4288, 1 set. 2012.

FIELDS, R. D.; LANCASTER, M. V. Dual-attribute continuous monitoring of cell

proliferation/cytotoxicity. American biotechnology laboratory, v. 11, n. 4, p. 48–50,
mar. 1993.

FILARDI, L. S.; BRENER, Z. Susceptibility and natural resistance of

Trypanosoma cruzi strains to drugs used clinically in Chagas disease. Transactions
of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 81, n. 5, p. 755–759,
1987.

ISO/EN10993-5. International Standard ISO 10993-5 Biological evaluation of

medical devices - Part 5: Tests for cytotoxicity: in vitro methods. . 2009, p. 42.
 31

KALE, A. A.; PATRAVALE, V. B. Design and evaluation of self-emulsifying drug

delivery systems (SEDDS) of nimodipine. AAPS PharmSciTech, v. 9, n. 1, p. 191–6,
2008.

KOLLIPARA, S.; GANDHI, R. K. Pharmacokinetic aspects and in vitro–in vivo

correlation potential for lipid-based formulations. Acta Pharmaceutica Sinica B, v. 4,
n. 5, p. 333–349, 2014.

LAMAS, M. C. et al. Development of parenteral formulations and evaluation of

the biological activity of the trypanocide drug benznidazole. International Journal of
Pharmaceutics, v. 307, n. 2, p. 239–243, 2006.

MAZZETI, A. L. Avaliação da eficácia de nitrocompostos em diferentes

formulações e regimes de tratamento na infecção experimental por
Trypanosoma cruzi. Ouro Preto: 2016, 2016.

MOLINA, I. et al. Randomized Trial of Posaconazole and Benznidazole for

Chronic Chagas’ Disease. New England Journal of Medicine, v. 370, n. 20, p. 1899–
1908, 15 maio 2014.

MOLINA, J. et al. Activities of the triazole derivative SCH 56592 (Posaconazole)

against drug-resistant strains of the protozoan parasite Trypanosoma
(Schizotrypanum) cruzi in immunocompetent and immunosuppressed murine hosts.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 44, n. 1, p. 150–155, 2000.

MORAES, C. B. et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than

CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug
discovery and development. Scientific reports, v. 4, p. 4703, 2014.

NAGAJYOTHI, F. et al. Mechanisms of Trypanosoma cruzi persistence in

Chagas disease. Cellular Microbiology, v. 14, n. 5, p. 634–643, maio 2012.

NAZZAL, S. et al. Preparation and in vitro characterization of a eutectic based

semisolid self-nanoemulsified drug delivery system (SNEDDS) of ubiquinone:
Mechanism and progress of emulsion formation. International Journal of
Pharmaceutics, v. 235, n. 1–2, p. 247–265, 2002.
 32

NEVES, D. P. et al. Parasitologia Humana. In: DE LANA, M.; TAFURI, W. L.

(Eds.). Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. 12° ed. São Paulo: Atheneu, 2011.
p. 89–114.

OLIVEIRA, M. DE F. et al. Tratamento Etiológico Da Doença De Chagas No

Brasil. Revpatoltrop, v. 37, n. 3, p. 209–228, 2008.

PEREIRA DA SILVA, L. H.;NUSSENZWEIG, V. Sobre uma cepa de

Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o camundongo branco. Folia Clin. Biol.,
v.20, n.3, p. 191-208, 1953.

PORTER, C. J. H. et al. Enhancing intestinal drug solubilisation using lipid-

based delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 60, n. 6, p. 673–691,
2008.

PORTER, C. J. H.; CHARMAN, W. N. Intestinal lymphatic drug transport: An

update. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 50, n. 1–2, p. 61–80, 2001.

POUTON, C. W. Formulation of self-emulsifying drug delivery systems.

Advanced Drug Delivery Reviews, v. 25, n. 1, p. 47–58, abr. 1997.

RASSI JR., A.; RASSI, A.; MARIN-NETO, J. A. Chagas disease. The Lancet,
v. 375, n. 9723, p. 1388–1402, 17 abr. 2010.

ROMERO, E. L.; MORILLA, M. J. Nanotechnological approaches against

Chagas disease. Advanced Drug Delivery Reviews, 2010.

SHAJI, J.; JADHAV, D. Newer approches to self emulsifying drug delivery

systemInternational. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2010.

URBINA, J. A. et al. Antiproliferative effects and mechanism of action of SCH

56592 against Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi: in vitro and in vivo studies.
Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 42, n. 7, p. 1771–7, jul. 1998.

URBINA, J. A. Chemotherapy of Chagas disease. Current pharmaceutical

design, v. 8, n. 4, p. 287–95, 2002.

URBINA, J. A. et al. In vitro and in vivo activities of ravuconazole on

 33

Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Int J Antimicrob Agents,
v. 21, n. 1, p. 27–38, 2003.

URBINA, J. A. Ergosterol biosynthesis and drug development for Chagas

disease. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 104, n. SUPPL. 1, p. 311–318,
2009.

URBINA, J. A. Specific chemotherapy of Chagas disease: Relevance, current

limitations and new approaches. Acta Tropica, v. 115, n. 1–2, p. 55–68, 2010.

URBINA, J. A.; DOCAMPO, R. Specific chemotherapy of Chagas disease:

Controversies and advances. Trends in Parasitology, 2003.

WADHWA, J.; NAIR, A.; KUMRIA, R. Emulsion forming drug delivery system for
lipophilic drugs. Acta Poloniae Pharmaceutica - Drug Research, v. 69, n. 2, p. 179–
191, 2012.

WHO. WHO | Chagas disease (American trypanosomiasis). Disponível em:

<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/>. Acesso em: 10 jun. 2016a.

WHO. WHO | More information on Chagas diseases transmission.

Disponível em: <http://www.who.int/chagas/home_transmission_more/en/>. Acesso
em: 10 jun. 2016b.

ZINGALES, B. et al. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific

nomenclature: Second revision meeting recommends TcI to TcVI. Memorias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 104, n. 7, p. 1051–1054, nov. 2009.