III Curso de Férias em Imunologia e Biologia Molecular 02/02/2010

Clonagem

Elisa Beatriz Prestes

Clonagem molecular

• Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas

• Origem do termo: cada colônia bacteriana é um clone
• Tecnologia do DNA recombinante

Produção de proteínas em larga escala

Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA
Clonagem molecular
Clonagem molecular
Duas etapas principais
INSERTO VETOR
1. Ligação do fragmento de DNA em um plasmídeo
DNA
recombinante
2. Introdução do DNA recombinante numa célula hospedeira
compatível: transformação
 Ligação do inserto no vetor
Enzimas de restrição

• Capacidade de clivar DNA em regiões

específicas
• Palindrômicas

• 1973
enzimas com extremidades

coesivas
 Ligação do inserto no vetor
Digestão e ligação

Fragmento de DNA a
Vetor de ser clonado
clonagem
DNA recombinante

Clivagem com Ligação

endonuclease pela ligase
de restrição
 Ligação do inserto no vetor
Vetor de clonagem – Plasmídeo

Todo plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve ter:

• Origem de replicação (Ori)
• Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)
• Resistência a antibiótico (Amp, Kan, etc.)

*Extra: gene da β-galactosidase (lacZ)

 Transformação
Transformação em células competentes

DNA
recombinante

Bactéria

Células competentes
• Células bacterianas quimicamente modificadas para receberem o
DNA recombinante
++++++++ ++++++++

++++++++ ++++++++
Ca2+ competentes Eletrocompetentes
 Transformação
Seleção de colônias
Resistência a antibiótico

Ampicilina
X
Expressão de β-galactosidase
• Fragmento de DNA é inserido no meio do gene lacZ

β-gal: degrada polissacarídeos

Amp + X-gal + IPTG X-gal: substrato cromogênico
forma
precipitado azul quando há atividade de β-gal
IPTG: indutor da atividade de β-gal
 Transformação
Toothpick e “PCR de colônia”

Técnicas de screening
Toothpick
tamanho do inserto
PCR de colônia
“identidade” do inserto

b
00p kb
5 1
z io DNA D NA zio
a + a
e o v eo + e o e ov
íd íd
m íd íd
s m s m s s m
Pla Pla Pla Pla
 Transformação
Toothpick e “PCR de colônia”

Primer F
Inserto

Primer R

b
00p kb
5 1
t ivo NA NA io
g a D + D a z
n e o + o o v
le de íd e de
ro í í
nt lasm l asm l asm
C o P P P

~1kb

~500pb
Células

• Transformação X Transfecção
Vetores de clonagem

• Por que não transformar DNA linear?

TIPOS DE VETORES MAIS POPULARES

• Plasmídeos (mais comuns) – até 20kb
• Fago lambda – até 25kb
• Cosmídeos – 35 a 45kb
Plasmídeos

• Plasmídeos presentes em
grande número de cópias

• Regiões:
- Origem (ColE1, f1)
- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)
- Gene de resistência a antibiótico
Fago λ
Genes da lisogenia
• Empacotamento in vitro

eficiência 10%
sítio cos

DNA de interesse

• Infecção E. coli
eficiência 100%

Vetores de substituição
Vetores de inserção
Cosmídeos

• Plasmídeos com um fragmento de DNA do fago λ
sítio cos

• Utilizam sistema de empacotamento in vitro do fago λ

• Tornam-se circulares na célula hospedeira
• Permitem clonagem de genes maiores – 35 a 45kb
Vetores de expressão

• Plasmídeo cujo inserto deverá ser expresso numa proteína

• Amplamente utilizados na pesquisa e em terapias atuais
http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o
Obrigada!