Manual de Prácticas

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA
“José María Morelos y Pavón”
Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Elaborado por:
Q.F.B. Miriam Rosa María López Nieto
Modificado por:
D.C. Mariana Álvarez Navarrete
M.C. Ivone Huerta Aguilar

Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica
Director del Instituto

Ing. Paulino Alberto Rivas Martínez
Subdirector Académico
M.C. Alejandro Domínguez
Jefe del Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica

D.C. Eliel Rafael Romero García
Titular de la Asignatura de Microbiología

D.C. Mariana Alvarez Navarrete
Primera Edición: 2015

Instituto Tecnológico de Morelia
Av. Tecnológico # 1500, Col. Lomas de Santiaguito
C.P. 58140, Morelia, Michoacán
Impreso y hecho en México
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Contenido
Presentación ..................................................................................................................................... 4
Reglamento general de los laboratorios de la carrera de Ingeniería Bioquímica .................. 5
Recomendaciones para el estudiante ........................................................................................... 7
Práctica No. 1. Esterilización de material utilizado en el laboratorio de microbiología y
preparación de medios de cultivo .................................................................................................. 8
Práctica No. 2. Preparación y esterilización de medios de cultivo ......................................... 12
Práctica No. 3. Técnicas de siembra y aislamiento de cultivos puros ................................... 18
Práctica No. 4. Morfología de las colonias bacterianas ........................................................... 24
Práctica No. 5. Tinción simple ...................................................................................................... 28
Práctica No. 6. Tinción de bacterias con el colorante azul de metileno ................................ 32
Práctica No. 7. Tinción de Gram .................................................................................................. 36
Práctica No. 8. Técnicas especiales para tinción de orgánulos (tinciones estructurales) .. 42
Práctica No. 9. Cultivo anaeróbico .............................................................................................. 48
Práctica No. 10. Pruebas bioquímicas ........................................................................................ 53
Práctica No. 11. Aislamiento de hongos de diferentes fuentes............................................... 60
Práctica No. 12. Microcultivo de hongos filamentosos ............................................................. 72
Práctica No. 13. Estudio de un virus ........................................................................................... 76
Anexo 1. Preparación de disoluciones y colorantes ................................................................. 82
Anexo 2. Estructura y manejo del microscopio óptico .............................................................. 84
Anexo 3. Interpretación de pruebas bioquímicas para bacterias Gram negativas .............. 87
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 93
3
Presentación
La Microbiología es una ciencia que trata acerca del estudio de los organismos vivos que no se
pueden ver a simple vista. Estos microorganismos pueden ser vistos con la ayuda de microscopios,
que magnifican objetos.
La Microbiología trata preferentemente de los grandes grupos de hongos, bacterias y virus que
presentan una variabilidad y fenómenos fisiológicos tan grandes como los objetos de disciplinas
tradicionales como la Botánica o la Zoología.
El estudio de los microorganismos ha brindado en los últimos años grandes aportaciones para la
solución de problemas biológicos básicos. Su fácil manejo, el crecimiento rápido, la gran capacidad
adaptativa y otras características han hecho de los microorganismos el objeto de estudio preferido
de la Bioquímica y la Genética.
Aunque durante mucho tiempo los microorganismos causaron graves problemas de enfermedades
en plantas, animales y humanos, cabe destacar que desde la antigüedad algunas especies
microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como
quesos, vino, pan y cerveza, y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de
investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología es que el alumno se inicie en el

conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas,
nutricionales, su control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el
laboratorio.
Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los
microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio una serie de
recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales
procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule de forma adecuada a los
microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Este manual contiene 13 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente
con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden de presentación
corresponde al programa del curso teórico semestral de Microbiología, que forma parte del Plan de
estudios de la carrera de Ingeniería Bioquímica en el Instituto Tecnológico de Morelia.
En cada práctica se presentan una breve introducción y los objetivos para facilitarla comprensión
de la base teórica y lo que se realizará en la misma, después se indican los materiales necesarios
y los procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con
figuras y esquemas. Posteriormente, en cada práctica se exponen preguntas para que el alumno,
además de reportar de manera ordenada y sistemática sus resultados, realice una investigación
bibliográfica para responder dichas preguntas.
También se presentan dos Anexos que contienen las indicaciones para la preparación de
disoluciones y colorantes necesarios para la realización de cada una de las prácticas.
Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para profesores y estudiantes del curso
de Microbiología de la carrera de Ingeniería Bioquímica. Este manual está elaborado de acuerdo a
la infraestructura de los laboratorios y a la programación semestral del curso.
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Reglamento general de los laboratorios de la carrera de Ingeniería

Bioquímica
Objetivo
Que toda persona que desarrolle alguna actividad dentro del laboratorio cumpla con las normas de
seguridad y organización establecidas en este manual y optimice los recursos con los que cuentan
los laboratorios.
Organización
1. Los equipos de trabajo serán de dos personas.

2. El material que se solicite lo facilitarán los alumnos de servicio social al iniciar la práctica.
3. Los reportes de las prácticas deberán cumplir con los siguientes puntos:
 Indicar el número y nombre de la práctica.

 Elaborar una breve introducción.
 Redactar el objetivo general de la práctica.
 Elaborar una lista de materiales utilizados en la práctica.
 Elaborar un diagrama de flujo de la metodología.
 Redactar las conclusiones personales en relación al objetivo general de la práctica.
 Contestar el cuestionario que se encuentra al final de cada práctica.
 Anotar la bibliografía consultada.
Manejo del material y equipo
1. Se prohíbe realizar manipulaciones con equipo o materia del cual se desconozca su

funcionamiento.
2. No usar material o equipo que se encuentre en malas condiciones, reportarlo al profesor.
3. Los materiales, equipos y mesas de trabajo siempre deberán mantenerse limpios.
4. Sobre las mesas de trabajo sólo deberán colocarse los materiales y equipos.
5. El material que se utiliza para extraer reactivos de los frascos, como pipetas, espátulas y
cucharas, deberá estar perfectamente limpio y seco.
6. No calentar probetas, matraces aforados o frascos.
Disciplina
1. El servicio del laboratorio debe ser coherente con los horarios programados por la autoridad
correspondiente.
2. La asistencia a las prácticas deberá ser con puntualidad, con una tolerancia máxima de 10
minutos.
3. Los alumnos deben presentarse al laboratorio con el instructivo de prácticas correspondiente.
4. Los alumnos deberán leer con anticipación cada una de las prácticas que va a realizar en el
laboratorio.
5. Los equipos de trabajo se distribuirán de acuerdo al número de mesas y recursos con los que
cuenta el laboratorio.
6. La realización de la práctica deberá ajustarse al número de horas programadas.
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Actividades que no deben realizarse dentro del laboratorio
1. Alterar el orden, gritar y distraerse durante las horas de práctica.

2. Fumar, comer, beber, maquillarse o escuchar música.
3. Evitar el uso del celular durante toda la práctica.
4. Realizar experimentos no indicados en los instructivos de la práctica.
5. No usar los termómetros como agitadores.
6. Los alumnos no tendrán acceso a las áreas de material y reactivos, excepto cuando el
profesor titular de la práctica lo indique y se haga responsable.
7. No regresar reactivos a los frascos, ya que pueden contaminarse.
8. No tirar a los vertederos los líquidos y disoluciones sobrantes considerados como peligrosos,
deben depositarse en los recipientes designados para ello, ya que se procesarán para reducir
su peligrosidad.
9. Los sólidos generados en la práctica (papel, plástico, vidrio, orgánicos) deberán depositarse
en los recipientes destinados para tal efecto.
Reposición del material por extravío o destrucción
Cuando ocurra extravío o destrucción de material o equipo, se deberá reponer en un plazo no

mayor de 15 días.
Continuación de prácticas no concluidas
1. Para continuar una práctica fuera del horario establecido, se deberá solicitar autorización de
ingreso al jefe del laboratorio.
2. En caso de que el laboratorio esté ocupado con otros grupos durante el horario que se solicita,
se deberá pedir permiso de ingreso a profesor titular.
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Recomendaciones para el estudiante
Reglas de laboratorio
1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que
deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio.
2. Las mujeres deberán tener el cabello recogido.
3. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.
4. Deberá evitar la acumulación de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio sobre
la mesa de trabajo. Colocar todos los objetos personales (libros y mochilas) en el área
especificada por el profesor.
5. Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
6. Se prohíbe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto.
Se deberá lavar las manos meticulosamente con jabón y agua antes de salir del laboratorio,
incluso cuando salga por breves periodos.
7. Por seguridad no deberá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta
actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando
de evitar la formación de aerosoles.
8. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad
en el trabajo que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
1. Antes y después de cada sesión de práctica, los alumnos deberán limpiar las mesas de
trabajo con el desinfectante que se le proporcionará para este fin.
2. Cuando se utilice el mechero, deberá colocarse alejado de cuadernos y prendas de vestir, así
como del microscopio y otros equipos.
3. Al concluir cada sesión, el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u
objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en
lugares apropiados, que les indicará el profesor.
4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios,
balanzas analíticas, autoclaves y potenciómetros) y reportar al profesor cualquier irregularidad
en su funcionamiento.
5. En caso de producirse un accidente como un incendio o una lesión personal, el alumno
deberá notificarlo inmediatamente al profesor. En caso de derrame de cultivos o rotura de
recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma e informar al profesor. Realice
inmediatamente el siguiente procedimiento: (a) colocar toallas de papel sobre el material
derramado para evitar su dispersión, (b) poner abundante disolución desinfectante sobre las
toallas, (c) dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo
destinado a la eliminación de materiales contaminados.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio
1. Bata de laboratorio limpia y con botones.

2. Guantes de látex y cubre-bocas.
3. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio.
4. Cerillos o encendedor, tijeras, marcador indeleble o etiquetas pequeñas y rollo de servilleta
desechable.
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Práctica No. 1. Esterilización de material utilizado en el

laboratorio de microbiología
INTRODUCCIÓN
En todos los ambientes abiertos, una gran cantidad de microorganismos (principalmente bacterias
y virus), se pueden encontrar, los cuales forman poblaciones que conviven entre sí. Si existen las
condiciones ambientales adecuadas, estos microorganismos pueden crecer y multiplicarse.
Con el objeto de estudiar un tipo específico de microorganismos para utilizarlo en una posible
aplicación o evitar sus efectos nocivos, es necesario disponer de métodos que permitan aislarlos y
propagarlos.
Un ambiente se encuentra estéril cuando se han eliminado todos los microorganismos del mismo.
La esterilidad se puede lograr mediante la ejecución de procedimientos físicos (filtración, calor,
radiaciones) o químicos (etanol, benzal). Un ambiente es aséptico cuando se han eliminado todos
los microorganismos patógenos. Un ambiente aséptico no necesariamente se encuentra estéril. La
asepsia también se puede conseguir por procedimientos físicos y químicos.
La esterilización es el proceso de eliminación de toda forma de vida, incluidas las esporas. Es un

término absoluto que implica pérdida de la viabilidad o eliminación de todos los microorganismos
contenidos en un objeto o sustancia, acondicionado de tal modo que impida su posterior
contaminación.
Los métodos de esterilización incluyen todos los procedimientos físicos y químicos que se emplean
para destruir los microorganismos. Esta pretensión de negación absoluta está sujeta a la cinética
del proceso y depende del control estricto del agente esterilizante, del tiempo de acción, de la bio-
carga presente y de sustancias o eventos que puedan interferir en la acción. El control estricto de
estos parámetros, así como las condiciones de envoltura y almacenamiento del material
supuestamente estéril, garantizan la eficacia real del proceso.
Los materiales y sustancias utilizados en microbiología deben estar estériles para su uso posterior,
lo cual se logra al aplicar los procedimientos descritos a continuación.
La pre-esterilización es un procedimiento en la que el material debe responder a la condición de

“limpio”. Los diferentes procedimientos de esterilización se aplican a objetos limpios. La limpieza se
define como la eliminación de material extraño (polvo, tierra, grasa) de la superficie inerte o viva y
que en su efecto de barrido, elimina también a los agentes biológicos superficiales. El agua, jabón
o detergente y el secado posterior son los elementos básicos de este proceso. El nivel de
temperatura y la eficacia del limpiador químico, que incluye desincrustantes, el pH del medio y la
técnica de lavado son determinantes en la limpieza del material inerte. Es imprescindible la
descontaminación previa, la cual tiene un doble propósito: proteger el material que va a procesarse
para esterilización y proteger al personal para la manipulación de dicho material.
La envoltura que se coloca sobre el material a esterilizar tiene por objetivo protegerlo (cuando ya
está esterilizado) de una re-contaminación microbiana al momento de sacarlo de la cámara de
esterilización, transportación y almacenamiento hasta su uso. La naturaleza del material de
envoltura depende del procedimiento de esterilización empleado y del material a esterilizar. Los
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paquetes a esterilizar deberán tener los siguientes datos: tipo de material, método de esterilización,
fecha de esterilización y de vencimiento, tanda, lote, operador y equipo.
Los materiales y métodos de empaquetamiento son: (a) papel: hoja o bolsa, o combinaciones con
otro material. Se emplea en doble envoltura de papel asociada a otro material, (b) textil: como
envoltura no es suficiente desde el punto de vista bacteriológico, pues no se asegura que los
objetos tengan suficiente protección contra la re-contaminación posterior al proceso de
esterilización. Se utiliza como parte accesoria de un empaquetamiento y (c) metal: usado
fundamentalmente en el laboratorio de microbiología para la cristalería como pipetas volumétricas.
EBULLICIÓN
TYNDALIZACION
CALOR HÚMEDO
PASTEURIZACIÓN
VAPOR A PRESIÓN
(AUTOCLAVE)
FLAMEADO
INCINERACIÓN
CALOR SECO
HORNO PASTEUR
(AIRE CALIENTE)
FÍSICOS
MÉTODOS RADIACIONES
IONIZANTES
DE
RADIACIONES RAYOS GAMMA
ESTERILIZACIÓN RAYOS X
RAYOS UV
FILTRACIÓN
MECÁNICAS
SEDIMENTACIÓN
OXIDO DE ETILENO
GASES
QUIMICOS
OTROS
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Figura 1. Métodos de esterilización más comunes.

OBJETIVOS
1. El estudiante aprenderá y comprenderá las diferentes técnicas de manejo, preparación y

esterilización (calor seco y húmedo) de material, reactivos y equipo utilizado en microbiología.
2. El estudiante observará el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la

contaminación microbiana en el laboratorio.
3. El estudiante desarrollará la capacidad de tomar decisiones para aplicar la técnica más

adecuada.
REACTIVOS, MATERIAL Y EQUIPO
 Cajas de Petri  Gasa

 Matraz Erlenmeyer  Papel Kraft (papel estraza)
 Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml  Masking - tape
 Tubos de ensaye  Marcador
 Hisopos  Autoclave eléctrica
 Papel  Autoclave de gas
 Algodón  Horno Pasteur
METODOLOGÍA
1. Limpiar la mesa de trabajo con una franela, enseguida desinfectar con una disolución
germicida (Benzal), usar pinzas y algodón.
2. Lavar todo el material de vidrio proporcionado por el profesor. El último lavado realizarlo con
agua destilada y dejar escurrir el material sobre papel de envoltura.
3. Preparar paquetes de 5 cajas de Petri de vidrio, envolverlas con papel estraza, procurar que la
tapa de la caja quede hacia arriba. Introducir los paquetes de cajas de Petri en bolsas de poli-
papel para evitar la introducción de humedad durante la esterilización.
4. Hacer un tapón de algodón de acuerdo al diámetro de la boca de un matraz Erlenmeyer y
envolverlo con gasa, tapar el matraz y colocarle un gorro de papel estraza o papel aluminio.
5. La envoltura de las pipetas se realizará de dos maneras: a) colocarlas dentro de un porta-
pipetas de acero inoxidable, o b) envolverlas con papel estraza. En ambos casos colocar un
filtro de algodón en la boca de la pipeta. Si se colocan dentro del porta-pipetas, cerciorarse
que el fondo contenga una cama de algodón o hule espuma, para que no se rompan las
puntas, deben colocarse hacia abajo. Indicar en la superficie del porta-pipetas su capacidad
en ml y la fecha de esterilización. Si se envuelven con papel estraza, cortar tiras de papel de 5
cm de ancho por 45 cm de largo. Se inicia la envoltura por la punta de la pipeta en diagonal
hasta la boca, el sobrante se dobla y se sujeta con cinta masking-tape, indicar el volumen y la
posición de la boca. Esterilizar en autoclave o estufa de Pasteur, de acuerdo a las
indicaciones del profesor.
6. Los tubos de ensayo sin tapa-rosca se sellan con un tapón de algodón, que se envuelve con
gasa y se coloca en la boca del tubo, con un gorro de papel (como se realizó para los
matraces Erlenmeyer). A los tubos de cultivo con tapa-rosca y tapón, agregar la cantidad de
líquido indicada por el profesor, cerrar la tapa-rosca al tope sin forzar, colocarlos en un
recipiente con algodón o gasa en el fondo (vaso de precipitado o bote metálico).
7. Asegurarse de que todo el material a esterilizar esté bien rotulado con la fecha de
esterilización, nombre de la materia, nombre del estudiante o equipo y tipo de material.
8. Agregar agua destilada hasta el nivel indicado en la autoclave y encender los mecheros.
9. Acomodar todo el material preparado en la autoclave y esterilizar a 15 Ibf/in2 y 121 ºC, de 15 a
20 minutos.
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10. Almacenar el material esterilizado hasta su uso, en el lugar indicado por el profesor.
CUESTIONARIO
1. Definir los siguientes términos: esterilización, desinfección, desinfectante, sanitizante,

antiséptico, germicida, fungicida, virucida, bacteriostático y fungistático.
2. Señalar la importancia del control de la eficacia de un proceso de limpieza y desinfección.
3. ¿Cuáles son los factores que influyen en la velocidad de destrucción de los microorganismos?
4. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor seco?
5. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor húmedo?
6. ¿Con qué finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?
7. Anotar sus conclusiones y bibliografía consultada.
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Práctica No. 2. Preparación y esterilización de medios de cultivo
INTRODUCCIÓN
El cultivo de microorganismos en el laboratorio es fundamental para conocer, comprender,

identificar y diferenciar un microorganismo de otro, ya que su identificación sólo por métodos
microscópicos es limitada.
Para lograr la identificación y diferenciación de los microorganismos, es necesario observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Este procedimiento
permite conocer la morfología de las colonias, los requerimientos nutricionales y las características
metabólicas de un microorganismo determinado.
El material nutritivo en el cual se hace crecer el microorganismo en el laboratorio se llama medio de

cultivo, y al crecimiento del mismo se le denomina cultivo. Para el buen crecimiento del
microorganismo no basta con sembrarlo en un medio de cultivo apropiado, también es necesario
darle las condiciones ambientales óptimas para su desarrollo (temperatura, pH, humedad).
Los medios de cultivo se clasifican en naturales y artificiales. Los medios naturales están
constituidos por componentes tales como papa, leche, huevos, sangre. Los medios artificiales
están compuestos de sustancias que son manipuladas en el laboratorio, los cuales a su vez se
clasifican en sintéticos, que son preparado exclusivamente con sustancias de composición química
conocida y los no sintéticos, elaborados con sustancias de composición química desconocida y
cuyos componentes no pueden analizarse.
Composición de un medio de cultivo
Los medios de cultivo pueden componerse de factores orgánicos de crecimiento, que son
compuestos orgánicos específicos requeridos en pequeñas cantidades y que no pueden ser
sintetizados por la célula (vitaminas, purinas y pirimidinas, aminoácidos).
Los suplementos son componentes que sin ser esenciales para el desarrollo del microorganismo,
favorecen de manera significativa su crecimiento (extractos de carne y levadura, infusiones de
cerebro, peptonas, suero, sangre).
De acuerdo con el uso de un medio de cultivo, puede tener distintas consistencias (medios
líquidos, semisólidos y sólidos). El agar-agar es el agente solidificante más usado para los medios
sólidos.
El agar es un polisacárido complejo que se extrae de un alga. Para disolverlo se necesita una
temperatura de 100 °C y al enfriarse permanece en forma de sol hasta los 40 °C. Por debajo de
esta temperatura se transforma en una masa sólida (gel) que es estable por tiempo indefinido.
Un medio líquido no contiene agar-agar, un medio semisólido tiene un 0,8 % de este componente y
un medio sólido contiene una concentración de 1,5 a 2 % de agar-agar.
Los componentes básicos que deben estar presentes en todo medio de cultivo se describen en la
Tabla 1.
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Tabla 1. Componentes básicos de un medio de cultivo.
Fuente de: Autótrofos Heterótrofos Función

Energía Luz solar Compuestos orgánicos
Síntesis de compuestos
Carbono CO2 y CO3 Glucosa, lactosa
carbonados
Proteasas, peptonas, Síntesis de aminoácidos y
Nitrógeno N2, NH3, NO2 y NO3
extractos de carne bases nitrogenadas
Metionina, cisteína, Síntesis de metionina,
Azufre H2S, S y SCO4
cistina cistina, coenzima A
Iones Fe, Ca, Cu, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Co, Ni, Usados como
inorgánicos K, Na, Mg, Mn K, Na, Mg, Mn cofactores enzimáticos
Sulfatos, fosfatos, Sulfatos, fosfatos, Equilibrio iónico y
Sales
cloruros, carbonatos cloruros, carbonatos amortiguadores de pH
Los medios artificiales o sintéticos son los medios que tienen una composición química definida
cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
De acuerdo a su uso, los medios de cultivo se clasifican en:
 Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio
más conocido de este grupo es el agar nutritivo.
 Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos
(sangre, suero, leche, huevo, bilis).
 Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una población poli-microbiana. El fundamento de estos medios consiste en
facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo es
el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonelas.
 Medios inhibidores: Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más
restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por
adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el
desarrollo de una población de microorganismos determinada. Un medio inhibidor es el Mac
Conkey, que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento
de los Gram positivos.
 Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que
ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato
metabolizable se utilizan para este fin. El medio Mac Conkey es un medio diferencial porque
permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen.
 Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que
puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de
poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el
sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.
El TSI, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un
elemento diferencial para un microorganismo, son medios utilizados en identificación.
 Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en
la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-
infusión cerebro-corazón (BHI) es un ejemplo típico de estos medios.
 Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos
interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y
reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar
las cepas de tres formas:
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a) mediante pases periódicos de placa a placa,

b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y
c) congelación de las cepas en leche descremada estéril al 0,1 %.
 Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden
sembrarse inmediatamente. Su utilización debe hacerse al introducir la torunda con la que se
obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de
este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus
constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios
de cultivo deshidratados). Generalmente, el uso de los medios de cultivo deshidratados se prefiere
porque, además de simplificar el trabajo, existe mayor probabilidad de obtener resultados
reproducibles.
Para la preparación de los medios de cultivo se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
 Emplear medios de cultivo deshidratados o a partir de cada uno de sus constituyentes

básicos.
 Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica
adecuada.
 Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada.
 Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben
exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
Almacenamiento de los medios de cultivo
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados en las condiciones
que señale el fabricante. Generalmente, en un lugar fresco se almacenan (entre 15 y 25 °C), con
poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de
autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Los medios de cultivo deshidratados se deben
descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8 °C,
a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien
cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por
encima una envoltura de papel.
Esterilización de medios de cultivo
La esterilización de los medios de cultivo es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos los
microorganismos presentes y solo cultivar los deseados.
La esterilización por calor húmedo
El vapor saturado a presión es uno de los métodos más utilizados para esterilizar los medios de
cultivo, ya que con el ambiente húmedo se favorece la penetración del calor a la célula, lo que
provoca una coagulación de las proteínas. Comúnmente, el autoclave se opera a 121°C y 15 libras
de presión por 15 minutos (el tiempo puede aumentar en función de la carga por esterilizar).
Esterilización por filtración
Este método es útil cuando se requiere esterilizar sustancias termolábiles como vitaminas,
aminoácidos, urea. Estas sustancias deben adicionarse al medio previamente esterilizado y
enfriado, la mezcla se homogeniza con agitación y se vacía a la caja de Petri o al tubo de ensayo.
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Para realizar la filtración se usan membranas o filtros de vidrio como se ve en la Figura 2.
Figura 2. Esterilización por micro-filtración. El material usado para la filtración, como el matraz
Kitasato, porta filtro, agua, se ha esterilizado previamente con calor húmedo en autoclave.
OBJETIVO
El estudiante tendrá la capacidad y destreza de preparar, esterilizar y vaciar los medios de cultivo
en el material adecuado para usarlos o almacenarlos en refrigeración para utilizarlos
posteriormente.
 Medio de cultivo EMB  Espátula

 Medio de cultivo 110  Cajas de Petri
 Medio de cultivo Verde Brillante  Tubos de cultivo
 Medio de cultivo Mc Conkey (Mc C)  Pipetas volumétricas
 Medio Agar Dextrosa Sabouraud  Filtro de vidrio
 Urea  Porta-filtro
 Matraz Erlenmeyer  Probeta
 Matraz Kitasato  Balanza granataria
 Gasa  Mechero
 Algodón  Bomba de vacío
 Horno de microondas  Autoclave
METODOLOGÍA
germicida (benzal), usar pinzas y algodón.
2. El profesor indicará las cantidades que se prepararán de cada uno de los medios de cultivo.
3. Realizar los cálculos necesarios para la preparación, tomar como base las indicaciones que
cada envase de medio de cultivo tiene en la etiqueta.
4. El matraz Erlenmeyer debe contener máximo el 60 % del volumen del medio de cultivo.
5. Etiquetar los matraces con el nombre del medio de cultivo antes de esterilizar.
6. Marcar las cajas y tubos, indicar el medio que contienen, número de equipo y la fecha de
preparación.
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7. Los medios de cultivo preparados se incubarán a 35 °C por 24 h y posteriormente se

almacenarán en refrigeración para la siguiente práctica.
Medios líquidos:
8. Pesar la cantidad correspondiente del medio en la balanza granataria (de acuerdo al volumen
indicado).
9. Colocar en un matraz Erlenmeyer el polvo del medio de cultivo pesado.
10. Agregar la cantidad requerida de agua destilada al matraz, previamente medida con una
probeta.
11. Disolver el medio con agitación constante, calentar sin llegar a ebullición.
12. Una vez disuelto el medio tapar con un tapón de algodón cubierto con gasa, la boca del
matraz y colocar un gorro de papel estraza o vaciar en frascos y/o tubos de cultivo.
13. Esterilizar a 15 lbf/in2. durante 15 min., enfriar a temperatura ambiente.
14. Almacenar los medios de cultivo en refrigeración para usarlos en la práctica siguiente.
Esterilización por filtración:
15. En base a las indicaciones del profesor pesar la cantidad correspondiente de urea para
preparar 100 ml de una disolución al 1.5% (p/v) de urea.
16. Disolver la urea en un matraz de 250 ml, con 100 ml de agua destilada.
17. Tener ya esterilizado el matraz Kitasato, el porta-filtro, filtro de vidrio, manguera y recipiente en
el cual se guardará la disolución.
18. Montar el equipo para filtrar a vacío en un área estéril, con dos mecheros Fisher alrededor.
19. En condiciones de esterilidad, realizar el filtrado de la disolución.
20. Guardar la disolución en un recipiente estéril y etiquetarlo.
Medios sólidos:
21. Pesar la cantidad adecuada del medio de cultivo en la balanza granataria (de acuerdo al
volumen indicado).
22. Colocar el polvo pesado en un matraz Erlenmeyer.
23. Agregar la cantidad requerida de agua destilada al matraz, previamente medida con una
probeta.
24. Disolver el medio con agitación lenta, calentar sin llegar a ebullición, hasta que el líquido se
vea traslúcido.
25. Tapar con un tapón de algodón cubierto con gasa, la boca del matraz y colocar un gorro de
papel estraza.
26. Esterilizar a 15 lbf/in2 durante 15 min.
Medios de cultivo vertidos en placas:
27. Las cajas de Petri ya estériles se colocarán sobre la mesa de trabajo que se ha limpiado
previamente con una solución germicida (benzal).
28. Mantener el mechero de Fisher encendido para que abarque un radio de esterilidad de 30 a
35 cm.
29. Enfriar el medio de cultivo entre 45 y 50 °C, hasta tolerar con la palma de la mano, y vaciar 20
ml a cada caja de Petri.
30. Para vaciar se retira el tapón del matraz, sin dejarlo en la mesa, y la boca se pasa por la flama
del mechero, luego la tapa de la caja de Petri estéril se levanta lo necesario y se permite la
entrada del cuello del matraz para vaciar el agar.
31. Flamear la boca del matraz y taparlo cuantas veces sea necesario hasta terminar con el
vaciado.
32. Después de verter el medio, tapar y rotar la caja de Petri cuidadosamente para distribuir el
agar en forma homogénea, con cuidado de no salpicar la tapa.
16
33. En el área estéril, destapar la caja con una pequeña abertura para que el vapor de agua no se
condense en la tapa, después de unos minutos tapar completamente.
34. Esperar a que el medio de cultivo solidifique, incubar o refrigerar las cajas de Petri en posición
invertida.
Medios en tubos de ensayo:
35. Vaciar el medio ya disuelto en los tubos, llenar aproximadamente 2/3 de su volumen, tapar y
cerrar al tope sin forzar.
36. Colocar los tubos con el medio en recipientes (vasos de precipitado o botes metálicos) y
esterilizar a 15 lbf/in2 durante 15 min.
37. Si alguno de los medios de cultivo se requiere como agar inclinado, al retirarlos del autoclave
se deben colocar sobre una superficie con el grado de inclinación deseado (sobre una varilla
de vidrio). Esperar a que los medios solidifiquen y almacenarlos en refrigeración.
Nota importante: todas las cajas y tubos que contienen medio de cultivo, deben de estar
etiquetados, indicando el medio y la fecha.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las bacterias?

2. ¿Por qué es necesario cultivar a los microorganismos?
3. ¿Por qué deben ser proporcionales la cantidad de medio de cultivo y el agua?
4. ¿Qué es un medio de cultivo selectivo?
5. ¿Qué es un medio de cultivo diferencial?
6. ¿Qué sucede si se tapa la caja de Petri inmediatamente después de vaciar el medio de
cultivo?
7. ¿Por qué razón las cajas de Petri con medio de cultivos se incuban por 24 hrs. antes de
almacenarlas para su uso?
8. ¿Se pueden esterilizar los medios de cultivo en calor seco? ¿Por qué?
17
Práctica No. 3. Técnicas de siembra y aislamiento de cultivos

puros
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos deben ser cultivados en medios de cultivo adecuados para caracterizar su
crecimiento, identificarlos y determinar su actividad metabólica.
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se
incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento de los microorganismos.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, mediante un asa bacteriológica
(el filamento termina en aro o de punta, según el caso), hisopo o pipeta estéril.
Cultivo en medio líquido
Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por

enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento.
Cultivo en medio sólido
Puede ser en placa o tubo. Cuando el cultivo es en placa, la siembra puede ser en superficie o
vertido en placa (incorporada). El medio de cultivo en tubo puede ser inclinado o vertical. En el
primer caso, El extremo del asa termina en un aro y en el segundo, termina en punta, para sembrar
por picadura.
Las placas se deben incubar invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede
provocar condensación durante la incubación, lo que impide la observación del crecimiento
microbiano, y si cae sobre la superficie del agar, se extiende, lo que da como resultado un
crecimiento confluente.
En medio sólido, cada célula viable dará origen a una colonia y, por lo tanto, la siembra en placa se
puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para aislarlos y contarlos.
Cuando es deseable tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir
la muestra en tubos con suero fisiológico o solución salina estéril.
Aislamiento
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población poli-microbiana. Por lo tanto,
es necesario un procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de
microorganismos presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra
cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada.
Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la

muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, un procedimiento llamado búsqueda se lleva
a cabo, el cual involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo
que se desea aislar en relación al resto de la población. Posteriormente, por el método de estrías o
por dilución se aísla y se identifica. Para aislar un microorganismo, se realizan los siguientes
procedimientos:
a) Aislamiento por estrías en placa
18
b) Aislamiento por dilución
a) Aislamiento por estrías en placa
Para este procedimiento existen distintas técnicas. El objetivo es obtener colonias aisladas.
Técnica A:
Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías

paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa. El asa se
quema y se enfría. La placa se gira 90º y se vuelve a estriar al
tocar 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y otro cuarto de
placa se cubre. Por último, sin quemar el asa, el resto de la
superficie sin sembrar se estría.
Técnica B:
Con el asa cargada, 3 o 4 estrías se hacen. El asa se quema, se

enfría y se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores,
el asa se vuelve a quemar y se repite el procedimiento hasta
estriar toda la placa.
Aislamiento por dilución en medio sólido
Tanto el método de siembra incorporada como siembra en superficie se emplean. En esta técnica
la muestra se debe diluir. Para ello, las diluciones decimales se deben preparar en condiciones
asépticas, con suero fisiológico, algún otro diluyente o con el asa bacteriológica, los resultados
obtenidos con esta técnica se analizan de forma cualitativa o cuantitativa (Figura 1).
Figura 1. Técnica de aislamiento por dilución en medio sólido.
La siembra incorporada se realiza al colocar 1 ml de la muestra en el centro de la caja y sobre ésta,

el medio de cultivo se vierte, con movimientos rotatorios se mezcla con cuidado. Las diluciones
también se pueden preparar en tubos con agar fundido y termostatizado (20 ml). La mezcla se
agita por rotación entre las manos y se vierte en placas de Petri estériles.
19
OBJETIVO
El estudiante tendrá la capacidad y destreza de ejecutar las técnicas básicas de siembra y

aislamiento de microorganismos en cultivo puro, a partir de una muestra con una población poli-
microbiana.
 Cajas de Petri y tubos con medios de  Mechero

cultivo de la práctica anterior  Pinzas para crisol
 Tubos con disolución salina estéril  Varilla de vidrio en forma de L
 Asa bacteriológica de nicromo  Incubadora
 Pipetas de 1 o 2 ml  Algodón
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml  Solución germicida
 Cajas de Petri estériles  Marcador indeleble
 Baño María  Gradilla para tubos de ensaye
METODOLOGÍA
1. El estudiante deberá portar bata blanca y cubre boca para realizar la práctica.
3. Delimitar el área de trabajo y encender el mechero para crear un área de esterilidad.
4. Etiquetar las cajas y tubos preparados en la práctica anterior con los siguientes datos: nombre
del medio de cultivo, nombre de la muestra (indicar de dónde se obtuvo), dilución, número de
equipo y fecha.
Siembra en la superficie de la caja de Petri con varilla en forma de “L” o triángulo de vidrio
estéril
5. A partir de la muestra realizar las diluciones indicadas por el profesor.
6. En el centro de la placa colocar 0.1 ml de la muestra diluida con una pipeta estéril.
7. Esterilizar una varilla o triángulo de vidrio: introducir en una disolución de etanol al 70 % y
colocar con cuidado sobre la flama del mechero, evitar que la varilla se caliente demasiado.
Realizar esta operación por tres ocasiones.
8. Con la varilla o triángulo de vidrio estéril distribuir la muestra en toda la superficie de la placa.
9. Incubar las cajas de Petri sembradas en posición invertida, a la temperatura y tiempo
indicados por el profesor.
Siembra en la superficie de la caja de Petri con asa bacteriológica

10. Esterilizar el asa en la llama del mechero hasta el rojo vivo.
11. Esperar a que el asa se enfrié dentro del área estéril formada por el mechero Fisher o tocar
con la punta del asa el medio de cultivo para enfriar.
12. Con el asa estéril tomar una porción de la muestra y distribuir mediante la formación de estrías
en la superficie del medio de cultivo si rasgarlo (Figura 2). Este procedimiento también se
puede realizar con un hisopo estéril.
20
Figura 2. Pasos de la siembra por estrías en caja de Petri.
Preparación de diluciones y siembra por vertido en placa

14. En una gradilla colocar 5 tubos con 9 ml de disolución salina estéril.
15. Etiquetar cada tubo, indicar la dilución correspondiente (1/10, 1/100, 1/1000).
16. En el área estéril, tomar 1 ml de la muestra original con una pipeta de 1 o 2 ml y vaciar el
contenido en el tubo etiquetado con la dilución 1/10. Flamear la boca del tubo, tapar y agitar
para mezclar. La tapa del tubo no debe dejarse en la mesa.
17. Tomar 1 ml de la dilución 1/10 preparada, con otra pipeta estéril y vaciarla en el siguiente tubo
etiquetado como 1/100. Flamear la boca del tubo, tapar y agitar para mezclar.
18. Repetir el procedimiento hasta la cuarta dilución.
19. A partir de las diluciones previamente preparadas, en el centro de una placa estéril vacía
colocar 1 ml de la dilución indicada por el profesor.
20. Sobre la muestra agregar 20 ml de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45 ºC.
21. Agitar suavemente la caja de Petri con cuidado de no salpicar la tapa, mover 4 veces en
sentido horario, 4 veces en sentido anti-horario, 4 veces de arriba abajo y 4 veces hacia los
costados.
22. Dejar solidificar el medio de cultivo durante 10 minutos,
Siembra en tubo de cultivo

24. Colocar los tubos preparados en la práctica anterior en una gradilla.
25. Las figuras relacionadas con este tema corresponden a la ilustración siguiente que contiene 9
figuras, numeradas del 1 al 9.
26. Rotular los tubos con el nombre del medio, tipo de muestra a sembrar, número de equipo y
fecha (paso 1, Figura 3).
27. Tomar juntos el tubo que contiene la muestra y un tubo nuevo preparado en la práctica
anterior, el cual se inoculará con una parte de la muestra del primer tubo.
28. Sostener los dos tubos con la mano no dominante. Si los tubos tienen taparrosca, aflojarla de
tal manera que solo se necesite levantarla para quitarla. Si el tubo tiene un tapón de algodón,
sacarlo un poco de manera que quede flojo (paso 2, Figura 3).
29. Esterilizar el asa bacteriológica con la flama del mechero. El asa se sostiene con la mano
dominante. Dejar que el alambre se ponga al rojo vivo y enfriar por unos segundos (paso 3,
Figura 3).
30. Retirar las taparroscas de ambos tubos, dejarlas sobre la gradilla cerca del mechero, mientras
se sostiene el asa. Nunca poner las tapas sobre la mesa (paso 4, Figura 3).
31. Flamear la boca de ambos tubos para destruir cualquier microorganismo presente en el aire y
que pueda contaminar la parte superior del tubo durante la manipulación (paso 5, Figura 3).
21
32. Insertar el asa dentro del tubo que contiene la muestra que se sembrará. Los tubos abiertos
deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea menor
(paso 6, Figura 3).
33. Sembrar el medio de cultivo estéril con una porción de la muestra que se tomó con el asa
bacteriológica. En el caso de medios líquidos se inserta el asa en el medio y se agita para
desprender la muestra. En el caso de medios sólidos (agar inclinado), se debe dibujar una
línea en “zig zag” sobre la superficie del agar con el asa (paso 7, Figura 3).
34. Flamear de nuevo la boca de los tubos y taparlos. Mezclar el inóculo con el medio líquido
(paso 8, Figura 3).
35. Esterilizar el asa sobre la llama del mechero hasta el rojo vivo antes de colocarla en la mesa.
36. Incubar los tubos inoculados a la temperatura y tiempo indicados por el profesor.
Figura 3. Pasos para la siembra en tubo de cultivo.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?

2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?
4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inoculo toque la boca del tubo fuente o del
tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una
parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra?
7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?
22
Tipos de crecimiento en tubos con agar
Ramificado Puntiforme Puntiaguda Uniforme Rizoide Extendido
Tipos de crecimiento en tubos con caldo.
23
Práctica No. 4. Morfología de las colonias bacterianas
INTRODUCCIÓN
Para poder identificar y clasificar un microorganismo, se deben determinar con cierto grado de precisión
sus características morfológicas, ecológicas, biológicas, fisiológicas, metabólicas y filogenéticas. La
identificación de algunos microorganismos también puede basarse en caracteres de tipo serológico y
de patogenicidad. Las bacterias son organismos unicelulares, pero agrupadas en colonias proporcionan
un crecimiento típico de cada grupo. Cuando un microorganismo crece en un determinado medio de
cultivo exhibe diferencias morfológicas macroscópicas que permite diferenciarlas de otros grupos
taxonómicos o bien entre sí.
En bacterias, para conocer los caracteres morfológicos se analiza la forma celular (bacilos, cocos,
cocobacilos y espirilos), y el agrupamiento celular (diplococos, racimos, rosarios); características de la
pared celular y otras estructuras especiales (Gram positivas o negativas, ácido-alcohol resistentes,
presencia de flagelos, formación de endosporas).
La morfología macroscópica de las colonias incluye la forma, elevación, color, consistencia, borde y
superficie.
Forma: puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa y rizoide.
Circular Irregular Filamentosa

Puntiforme Alargada Rizoide
Irregular Rizoide Filamentosa Circular
Elevación: convexa, pulvinada, umbonada, elevada y aplanada.
Convexa Pulvinada Umbonada
24
aplanada crateriforme
Borde: continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.
Dentado Filamentosa Digitado Lacerado
Textura: escamosa, rugosa, plegada, granulosa
Escamosa Rugosa Plegada Granulosa
Color: Las colonias presentan una gran variedad de colores (blanco, amarillo, rojo ladrillo,
anaranjado), en algunos casos presentan brillo debido a la luz reflejada en ellas.
Opacidad: Transparente y opaca.
Consistencia: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa y mucosa.
OBJETIVO
El estudiante adquirirá el conocimiento, la capacidad de reconocer, identificar y describir las

características morfológicas de bacterias, levaduras y mohos a partir de cultivos heterogéneos.
 Mechero
 Asas bacteriológicas
 Cajas sembradas previamente
 Lupa
 Estereoscopio
 Cuenta colonias de Quebec
25
METODOLOGÍA
Describir la morfología de los microorganismos de las diferentes muestras sembradas en la práctica

anterior y de cultivos que le proporcione el profesor, llenar las siguientes tablas:
Describir la forma de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
Describir el tipo de elevación de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
Describir el tipo de borde de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
26
Describir la textura de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
Identificar el color/opacidad de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
Describir la consistencia de las colonias:

Medio de Muestra
cultivo
MRS
Verde bilis
brillante
Verde Brillante
Estafilococos
110
Mc Conkey
PDA
Sabouraud
CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tiene hacer la descripción de la morfología colonial?

2. Reportar en esquemas o imágenes cada una de las colonias observadas, describir la morfología de
estas.
3. ¿Qué aspecto te parece interesante acerca de la morfología colonial y por qué?
4. ¿Para qué te serán útiles estos conocimientos?
5. ¿Qué fue lo que más te gustó o llamó la atención en esta práctica?
27
Práctica No. 5. Tinción simple
INTRUDUCCIÓN
La morfología microscópica de los microorganismos puede estudiarse de dos maneras distintas: (a)
por visualización de los microorganismos vivos sin teñir, lo que permite observar su movilidad y (b)
por visualización de los microorganismos teñidos mediante el uso de colorantes a una
concentración tal que los mata y no permite observar su movilidad; sin embargo, la visualización de
la morfología y de las estructuras intracelulares, de acuerdo con el tipo de tinción, se mejora
notablemente.
En general, la mayoría de los microorganismos vivos son prácticamente incoloros, ya que no

presentan suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidos, por lo cual
no se pueden observar con claridad. Pero si se tiñen, un gran contraste se produce respecto al
medio que les rodea. Además, algunos colorantes pueden teñir estructuras internas que sirven
para su identificación.
Las principales ventajas de las técnicas de tinción son: la observación más detallada su morfología,
proporcionan el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permite diferenciar distintos
tipos morfológicos, ofrecen información complementaria sobre sus estructuras internas y/o externas
que no pueden ser observadas por examen en fresco, contribuyen al conocimiento de sus
características tintoriales, para su clasificación en un grupo taxonómico.
La tinción o coloración de bacterias son procedimientos que ponen de manifiesto diferencias

entre las células bacterianas o partes de estas. Los pasos fundamentales previos a una tinción
son: (1) extendido, (2) secado y (3) fijado. A este proceso se le denomina preparación del frotis.
1. Extendido: una gota de agua se coloca en el centro del portaobjetos limpio. Con el asa
bacteriológica previamente esterilizada, se trasfiere una pequeña cantidad del cultivo
microbiano en medio sólido a la gota de agua. La mezcla se extiende hasta formar una
suspensión homogénea. Si es un cultivo líquido, basta con colocar una o dos gotas de éste y
en ambos casos se extiende sobre la superficie del portaobjetos hasta tener una capa lo
suficientemente delgada, para separar lo más posible los microorganismos, ya que si
aparecen agrupados en la preparación es difícil obtener una imagen clara y nítida (Figura 1).
Figura 1. Preparación del frotis para la tinción simple.
2. Secado: la muestra extendida puede dejarse secar a temperatura ambiente o exponer sobre
la llama del mechero a 30-40 cm, por unos segundos.
3. Fijado: la fijación tiene como finalidad evitar el desprendimiento del preparado durante la
coloración y preservar la forma original de los microorganismos.
28
Existen dos técnicas para fijar la preparación:
A. Fijación por calor: es la más usada en Bacteriología y consiste en pasar tres veces en forma
rápida la lámina con la cara que contiene el frotis hacia arriba, por la parte más caliente de la
llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para algunas tinciones en las
cuales deben utilizarse procedimientos más suaves (Figura 2a).
B. Fijación por sustancias químicas: para algunos tipos de tinciones no se debe usar el calor,
ya que altera la morfología bacteriana. Agentes fijadores como el etanol, metanol, formol,
sales de mercurio, tetróxido de osmio o ácido pícrico, se pueden utilizar (Figura 2b).
(a) (b)
Figura 2. Fijación de un frotis bacteriano. (a) Fijación por calor y (b) fijación con metanol.
Tipos de colorantes
Los colorantes son generalmente sales orgánicas básicas o ácidas que se unen a los aniones o
cationes de las células de las bacterias para teñirlas.
Colorantes básicos. Tienen carga positiva. La porción del cromógeno tiene carga positiva y
poseen gran afinidad por los componentes celulares con carga negativa. Estos tintes son los más
utilizados debido a que las bacterias tienen una superficie con carga negativa. Ejemplos: azul de
metileno, cristal violeta, fucsina básica, safranina y verde malaquita.
Colorantes ácidos. Tienen carga negativa. La porción del cromógeno es negativa y tienen gran
afinidad por los componentes celulares con carga positiva. Las sales de sodio, potasio, calcio o
amoniaco de ácidos con color son ionizados para producir un cromógeno con carga negativa.
Ejemplos: eosina y fucsina ácida.
Tipos de tinción
a) Tinciones simples: azul de metileno, cristal violeta y fucsina.

b) Tinciones dobles, compuestas o diferenciales: tinción de Gram, tinción de Ziehl-Nielsen,
tinción de Tam-Thiam-Hok.
c) Tinciones estructurales: tinción de cápsulas, tinción de flagelos, tinción de esporas, tinción de
corpúsculos metacromáticos.
d) Tinciones especiales: tinción negativa, tinciones fluorescentes, tinción de auramina-rodamina
y tinción con naranja de acridina.
La tinción simple es la técnica más sencilla para observar el tamaño, arreglo y forma de las
bacterias. Un solo tinte se utiliza. La tinción puede ser directa, en la que se tiñe a la bacteria y,
negativa, en la que se tiñe el fondo pero no a la bacteria.
29
OBJETIVO
El estudiante conocerá aplicará y adquirirá la habilidad para preparar un frotis, la técnica de una
tinción simple y establecerá las diferencias entre bacterias basadas en su morfología microscópica
(cocos, bacilos, cocobacilos, espirilos).
 Portaobjetos  Disolución de cristal violeta

 Gradilla  Cubre-boca
 Asa bacteriológica  Lápiz graso
 Mechero Fisher  Puente para porta-objetos
 Hisopos  Charola para tinción
 Aceite de inmersión  Microscopio
 Pizeta con agua destilada  Cerillos o encendedor
 Disolución de safranina  Diferentes cultivos de bacterias
 Disolución de azul de metileno  Guantes de látex
METODOLOGÍA
1. El estudiante deberá portar bata blanca, guantes de látex y cubre boca para realizar la
práctica.
3. Preparar los frotis de los cultivos que indique el profesor. Para realizar la tinción de un frotis,
se efectúan 3 pasos.
Limpieza de los portaobjetos:
4. Limpiar los portaobjetos (laminillas de vidrio) con un paño húmedo.
5. Introducirlos en un frasco de boca ancha que contenga una mezcla de alcohol-cloroformo o
alcohol-cetona. Sacar los portaobjetos con pinzas y sujetarlos con los dedos por los bordes,
secarlos con un paño limpio o papel poroso.
Preparación del frotis:
7. Marcar en un extremo los portaobjetos, limpios y desengrasados, con el nombre de la muestra
a observar al microscopio (usar un portaobjetos para cada muestra).
8. Realizar la extensión de la muestra colocada sobre el portaobjetos según sea el caso: (a)
cultivo sólido: en la superficie del portaobjetos se colocan una o dos gotas de agua destilada.
Una pequeña porción de la colonia bacteriana en estudio se toma con el asa bacteriológica
estéril, se disuelve en la gota de agua y la mezcla se extiende sobre el portaobjetos (Figura
3a), (b) cultivo en medio líquido: con el asa bacteriológica estéril tomar una gota del cultivo y
extenderla sobre el portaobjetos (Figura 3b). En ambos casos, formar una película delgada y
uniforme.
9. Dejar secar el frotis al aire por algunos segundos.
10. Fijar el frotis a la flama por la parte posterior del portaobjetos. El portaobjetos debe pasarse
sobre la llama de manera rápida, realizar esta operación tres o cuatro veces. La temperatura
del portaobjetos debe de ser la que soporte el dorso de nuestra mano sin quemarnos.
11. El portaobjetos se coloca sobre el puente de tinción montado en la charola de tinción.
Técnica de tinción simple (Figura 4):
12. Sobre el puente de tinción colocado en la charola acomodar el portaobjetos y cubrir toda la
extensión del frotis con el colorante de cristal violeta o safranina, por dos minutos dejar actuar
el colorante. Eliminar el colorante.
13. Lavar suavemente con agua destilada, aplicar con una pizeta. Inclinar el portaobjetos y lavar
con el chorro de agua desde la parte superior para que resbale sobre el frotis. No aplicar el
agua directamente sobre el frotis pues podría desprenderlo. Sacudir el portaobjetos.
30
14. Esperar hasta que el líquido se evapore. Este proceso se puede acelerar al secar el
portaobjetos por simple presión entre dos tiras de papel de filtro (no frotar el portaobjetos).
15. Añadir a la preparación teñida una gota de aceite de inmersión (no colocar cubreobjetos).
16. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 100x. Seleccionar un buen campo de
observación y tomar fotografías.
(a) (b)
Figura 3. Pasos para la preparación de un frotis bacteriano. (a) A partir de un cultivo sólido y (b) a
partir de un cultivo líquido.
Figura 4. Pasos para realizar una tinción simple.
CUESTIONARIO
1. Investiga las estructuras moléculas o celulares responsables de la tinción simple. Dar

ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse para la tinción simple.
2. ¿Qué morfología presentan los microorganismos en cada uno de los frotis?
3. Compara las diferentes preparaciones observadas. Menciona las diferencias que pudiste
observar entre los organismos (por ejemplo: células eucariontes y procariontes).
4. En la sección de resultados mostrar las fotografías tomadas.
5. ¿Qué es el aceite de inmersión? ¿Por qué se utiliza para la observación al microscopio?
6. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?
31
Práctica No. 6. Tinción de bacterias con el colorante azul de

metileno
INTRODUCCIÓN
Una de las tinciones más comunes y sencillas para bacterias y hongos (mohos y levaduras) es la
realizada con azul de metileno, el cual es un derivado de la brea de la hulla. El azul de metileno es
un compuesto químico heterocíclico aromático, cuya fórmula química es C16H18ClN3S. Es una
sustancia en forma de cristales o polvo cristalino que presenta un color verde oscuro, con brillo
bronceado, inodoro, estable al aire, sus disoluciones en agua o en alcohol son de color azul
profundo. El azul de metileno es fácilmente soluble en el agua y en cloroformo, pero
moderadamente soluble en alcohol etílico. Es uno de los colorantes de tiazina más importantes,
además es económico y apreciado por su color puro. El azul de metileno tiene múltiples usos.
En Microbiología se usa como colorante en diferentes técnicas de tinción. Es una sustancia que en
disolución tiene carga positiva (colorante catiónico), penetra en el interior de las células y las tiñe.
También se encuentra en la formulación de medios de cultivo. Por ejemplo, el agar EMB (agar
eosina y azul de metileno) es un medio utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos
entéricos Gram negativos. El uso de la eosina y azul de metileno permite la diferenciación de las
colonias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. La sacarosa está incluida en el medio
para detectar a los miembros del grupo coliforme que fermentan más rápidamente la sacarosa que
la lactosa. La eosina y el azul de metileno son colorantes que se combinan para formar un
precipitado a pH ácido. Los colorantes actúan como inhibidores e indicadores. Los carbohidratos
proporcionan la fuente de energía, las fosfatos actúan como buffer y el agar como agente
solidificante.
En Medicina, el azul de metileno se utiliza como antiséptico (bactericida de bajo espectro),

analgésico débil, cicatrizador interno, en el tratamiento del envenenamiento por cianuro y otros
productos, para teñir ciertas partes del cuerpo antes o durante una cirugía, para el tratamiento de
una enfermedad llamada metehemoglobinemia y recientemente la empresa farmacéutica TauRx
Therapeutics ha comprobado que el uso del azul de metileno (Rember©) retrasa el deterioro de
las funciones cognitivas de los enfermos de Alzheimer.
En Química se usa como indicador de pH en volumetría, en medio ácido vira a color azul y en
medio básico es incoloro. En las tiras de papel tornasol se usa en combinación con el rojo de
metilo para determinar si la disolución es ácida o básica.
OBJETIVO
El estudiante aplicará la técnica de tinción con azul de metileno para varios grupos bacterianos
provenientes de diferentes fuentes y adquirirá mayor destreza en la preparación de frotis, tinción y
diferenciación morfológica de los microorganismos.
32
 Microscopio  Aceite de inmersión

 Portaobjetos  Agua destilada
 Cubreobjetos  Azul de metilo en etanol
 Puente de tinción  Planta leguminosa
 Tubos para centrífuga  Madre de vinagre
 Centrífuga  Yogurt
 Charola  Infusión de hierbas secas
 Asa bacteriológica  Disolución de alcohol cloroformo
 Pinzas  Orina
 Escapelo  Heces fecales
 Gotero  Guantes de látex y cubre-boca
 Pipeta de 5 ml
METODOLOGÍA
práctica.
3. Realizar al mismo tiempo todos los frotis de las muestras (para la preparación de los frotis y
tinción ver la metodología de la Práctica 5).
a) Técnica para bacterias nitrificantes de las leguminosas

4. Arrancar del suelo una planta leguminosa con sus raíces. En las raicillas finas se verán unos
nódulos en forma de pequeñas verrugas. Con unas pinzas desprender el nódulo.
5. Lavar las raicillas con os nódulos en un vaso de precipitado con agua para quitarles la tierra o
arena.
6. El nódulo se fracciona sobre el portaobjetos con la pluma del escalpelo.
7. Frotar la cara partida del nódulo sobre el centro del portaobjetos, agregar una gota de agua
estéril y mezclar. Retirar los residuos del nódulo, extender y secar la preparación sobre la
llama del mechero.
8. Colocar el frotis preparado sobre el puente de vidrio que se encuentra en la charola,
impregnar el cubreobjetos con azul de metileno, dejar actuar por 15 minutos y escurrir el
exceso de colorante.
9. Con una pizeta que contenga agua, lavar el portaobjetos inclinado (Figura 1).
10. Escurrir y secar el portaobjetos.
11. Agregar una gota de glicerina, colocar un cubreobjetos sobre la preparación y observar al
microscopio con el objetivo de mayor aumento (100x, inmersión).
Figura 1. Lavado del frotis teñido con azul de metileno.
33
b) Técnica para bacterias de vinagre

12. Con el asa bacteriológica tomar una pequeña porción de la madre del vinagre, depositar en el
centro del portaobjetos, añadir una gota de agua destilada, mezclar perfectamente y extender
con el asa bacteriológica.
13. Secar el frotis sobre la llama del mechero.
14. Teñir con azul de metileno durante 15 minutos y escurrir e exceso de colorante.
15. Con una pizeta que contenga agua, lavar el portaobjetos inclinado.
17. Agregar una gota de glicerina sobre el frotis, colocar el cubreobjetos sobre la preparación y
observar al microscopio con el objetivo de mayor aumento (100x, inmersión).
c) Técnica para bacterias del yogurt

18. Con el asa bacteriológica tomar una pequeña muestra de yogurt, depositar en el centro del
portaobjetos y añadir una gota de agua destilada para diluir.
19. Mezclar perfectamente, extender y secar sobre la llama del mechero.
20. Lavar la preparación con una disolución de alcohol–cloroformo, con el gotero dejar caer las
gotas de la disolución para arrastrar la grasa del yogurt.
21. Secar la preparación al aire.
22. Teñir el frotis con una gota de azul de metileno durante 15 minutos y escurrir el exceso de
colorante.
23. Con una pizeta que contenga agua, lavar el portaobjetos inclinado.
d) Técnica para bacterias de las infusiones

26. Preparar una infusión con hierbas secas y dejar hasta que aparezca una fina película en la
superficie del líquido.
27. Con el asa bacteriológica tomar una pequeña muestra, colocarla en el centro del portaobjetos
y extender.
29. Teñir el frotis con azul de metileno por 15 minutos y escurrir el exceso de colorante.
30. Lavar la preparación con una pizeta que contenga agua destilada y dejar secar.
e) Técnica para bacterias de la cavidad bucal

32. Depositar una gota de agua estéril en el centro del portaobjetos y mezclarlo con una pequeña
cantidad de sarro dental que se debe tomar con cuidado de la boca con una aguja estéril y
extender la muestra.
f) Técnica para bacterias presentes en la orina

37. En un tubo para centrífuga, agregar 2 ml de orina.
38. Centrifugar la muestra por 5 minutos.
39. Desechar el líquido sobrenadante.
40. Con el asa bacteriológica, tomar una pequeña porción de sedimento obtenido, colocarlo en el
centro del portaobjetos, añadir una gota de agua estéril y mezclar perfectamente.
41. Extender y secar el frotis sobre la llama del mechero.
34
g) Técnica para bacterias presentes en las heces fecales

45. Con el asa bacteriológica, tomar una pequeña porción de heces fecales, mezclar con una gota
de agua destilada depositada en el centro de un portaobjetos y extender la muestra.
CUESTIONARIO
1. Dar un ejemplo de algún organismo que de manera típica sea teñido con azul de metileno.
2. ¿Cómo se denomina la tinción en la que interviene la combinación de azul de metileno y
fucsina fenicada? ¿En qué consiste?
3. ¿La tinción con azul de metileno a qué tipo de tinción pertenece? ¿Por qué?
4. Dar un ejemplo de inhibición competitiva en la que el azul de metileno intervenga.
5. Redactar en la sección de resultados las observaciones efectuadas.
35
Práctica No. 7. Tinción de Gram
INTRUDUCCIÓN
El estudio de las bacterias y su estructura es particularmente difícil debido a su pequeño tamaño

(1-10 µm). El microscopio óptico es necesario para observar estos microorganismos, pero la
principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. La forma más
simple para aumentar el contraste es el uso de colorantes, los cuales pueden emplearse para
distinguir entre diferentes tipos de células o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas y paredes celulares.
La tinción de Gram o coloración Gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos:
Gram-positivas y Gram-negativas. Esta técnica debe su nombre al bacteriólogo danés Christian
Gram, quien desarrolló esta técnica en 1884.
Se denominan Gram-positivas a las bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta. Esta
característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, que comprende a la
membrana citoplasmática y a la pared celular, compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano,
que es la responsable de retener el tinte azul durante la tinción de Gram. Si la pared celular sufre
algún daño, la bacteria se vuelve Gram-negativa. El colorante que se emplea en esta técnica es
azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana).
1. Membrana citoplasmática
2. Peptidoglucano
3. Fosfolípidos
4. Proteínas
5. Ácido lipoteicoico
Figura 1. Envoltura celular de las bacterias Gram-positivas.
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una
fina pared celular de peptidoglucano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una
membrana lipídica y la pared de peptidoglucano es mucho más gruesa. La pared fina de las
bacterias Gram-negativas no retiene el colorante cristal violeta durante la tinción de Gram. El
colorante de contraste es la safranina o la fucsina que confiere al microorganismo una coloración
roja.
36
1. Membrana citoplasmática
2. Espacio periplasmático
3. Membrana externa
4. Fosfolípidos
5. Peptidoglicano
6. Lipoproteína
7. Proteínas
8. Ipopolisacáridos
9. Porinas
Figura 2. Envoltura celular para bacterias Gram-negativas.
(a) (b)
Figura 3. Tinción de Gram. (a) Clostridium perfringens (Gram-positiva),

(b) Escherichia coli (Gram-negativa).
Un frotis es la extensión de una muestra o cultivo, que se realiza sobre un portaobjetos con objeto
de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación,
es difícil obtener una imagen clara y nítida. Posteriormente, este frotis debe ser fijado al
portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción.
OBJETIVO
El estudiante aplicará los conocimientos adquiridos en las prácticas anteriores para la preparación
de un frotis, conocerá y realizará la técnica de Tinción de Gram y Tinción de Gram modificada para
la diferenciación de las bacterias Gram-positivas de las Gram-negativas, mediante observación en
el microscopio.
37
 Cristal violeta  Portaobjetos

 Bicarbonato de sodio  Cubreobjetos
 Lugol  Asa bacteriológica
 Hidróxido de sodio 1M  Puente para tinción
 Alcohol etílico  Pizeta
 Acetona  Charola para tinción
 Fucsina básica  Microscopio
 Aceite de inmersión  Hisopo estéril
 Guantes de látex y cubre-boca  Cultivos de bacterias Gram-positivas
 Algodón  Cultivos de bacterias Gram-negativas
METODOLOGÍA
práctica.
3. Preparar el frotis de los cultivos que indique el profesor y uno de su boca mediante el uso de
un hisopo estéril, de ser necesario, humedecerlo en solución fisiológica estéril,
4. Limpiar los portaobjetos (laminillas de vidrio) con un paño húmedo.
5. Introducir los portaobjetos en un frasco de boca ancha que contenga una mezcla de alcohol-
cloroformo o alcohol-cetona.
6. Sacar de la mezcla cada portaobjetos con pinzas y sujetarlo con los dedos por los bordes,
secar la superficie con un paño limpio o papel poroso.
7. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados (usar un portaobjeto para
cada muestra).
8. Realizar la extensión de la muestra según sea el caso: (a) cultivo sólido: colocar una gota de
agua destilada en el centro del portaobjetos, con el asa bacteriológica estéril tomar una
porción de la colonia bacteriana en estudio, disolver y extender la suspensión en la superficie
del portaobjetos. (b) cultivo en medio líquido: con el asa estéril tomar una gota del cultivo y
extender. En ambos casos, formar una película delgada y uniforme.
9. Dejar secar la preparación al ambiente.
10. Fijar la preparación a la flama del mechero por la parte posterior del portaobjetos. El paso del
portaobjetos sobre la llama debe de ser rápido, basta con hacerlo tres o cuatro veces. La
temperatura del portaobjetos debe de ser la que soporte el dorso de la mano sin quemar.
11. Colocar el portaobjetos sobre el soporte que está montado en la charola de tinción.
38
Figura 4. Preparación de un frotis bacteriano.
Técnica de tinción de Gram:
12. Colocar el portaobjetos en la charola con el puente de tinción y cubrir toda la extensión del
frotis con el colorante primario cristal violeta (Figura 5).
13. Dejar actuar por un minuto y escurrir la laminilla.
14. Lavar la superficie del portaobjetos suavemente con agua destilada. Inclinar el portaobjetos y
en la parte superior aplicar el chorro de agua, permitir que resbale sobre el frotis. No dirigir el
agua directamente sobre el frotis para evitar desprenderlo. Sacudir el portaobjetos.
15. Colocar el portaobjetos en el puente de tinción, añadir la solución de lugol (mordiente) y cubrir
toda la extensión.
16. Dejar actuar por un minuto y escurrir la laminilla.
17. Lavar nuevamente con agua, como en el paso 14.
18. Inclinar el portaobjetos y decolorar el frotis con unas gotas de alcohol por 5 a 10 segundos
para retirar el exceso de lugol.
19. Lavar nuevamente con agua, como en el paso 14.
20. Colocar portaobjetos en el puente de tinción, agregar la solución de fucsina básica o safranina
(colorante de contraste).
21. Cubrir toda la extensión del frotis, dejar actuar por 45 segundos y retirar el colorante.
22. Lavar con agua, como en el paso 14.
23. Dejar secar la preparación y observar al microscopio con los diferentes objetivos.
39
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
Alcohol
(10 seg)
11 12
13 14
15 16
Figura 5. Pasos de la tinción de Gram.
40
CUESTIONARIO
1. ¿En qué se basa la tinción de Gram?

2. ¿Por qué es importante fijar el fotis?
3. ¿Qué otros métodos de fijación se pueden emplear?
4. Investiga 5 enfermedades producidas por bacterias.
5. Investiga 5 aplicaciones en las que las bacterias son útiles para el hombre.
6. Presentar las fotografías de los mejores campos observados, indicar el cultivo al que
pertenecen.
41
Práctica No. 8. Técnicas especiales para tinción de orgánulos

(tinciones estructurales)
INTRODUCCIÓN
Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre distintos tipos de microorganismos, las
tinciones estructurales incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen las endosporas, flagelos y cápsulas.
Las esporas bacterianas son estructuras ovales o esféricas que se pueden encontrar dentro o
fuera de la célula bacteria. Las esporas se forman cuando las bacterias (principalmente los
géneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces) se encuentran en condiciones
adversas, lo que desencadena una serie de cambios genéticos, metabólicos y estructurales, y da
origen a formación de esporas. Este proceso se denomina esporulación o esporogénesis.
En general, las esporas difícilmente se tiñen, ya que requieren determinados colorantes

concentrados, así como la exposición al calor para facilitar su penetración (Figura 1). Las técnicas
de tinción de esporas más utilizadas son: (a) método de Wirtz-Conklin, (b) método de Moeller y (c)
método de Schaeffer y Fulton.
Figura 1. Endosporas de Bacillus subtilis teñidas en verde.
Los flagelos son apéndices filiformes de mayor longitud que la bacteria que permiten su locomoción.
Estas estructuras se presentan en número y disposición variable y están formados por fibrillas
proteicas compuestas de una proteína llamada flagelina. El número y disposición de los flagelos es
variable en las diferentes bacterias, pero generalmente es constante para cada especie. Algunas
bacterias poseen solo un flagelo, otras dos o más y pueden ser polares o peritricos (Figura 2).
Figura 2. Disposición de los flagelos bacterianos:

A. Monotrico, B. Lofotrico, C. Anfitrico, D. Peritrico.
42
Cuando las bacterias flageladas están suspendidas en una gota de líquido son activamente
móviles. Sin embargo, es importante distinguir entre el movimiento debido a los impulsos
originados por los flagelos, que permiten el desplazamiento de la bacteria dentro del campo
microscópico, y el llamado movimiento browniano que se produce cuando una partícula se
suspende en un líquido.
Debido a su diámetro tan pequeño, los flagelos se pueden teñir mediante técnicas especiales. Los
flagelos de organismos eucarióticos, como algas y protozoarios, son más gruesos y pueden
observarse en preparaciones en fresco o con tinciones simples. Para observar los flagelos al
microscopio se han desarrollado varias técnicas: (a) observación en fresco en gota pendiente, (b)
método de Leifson, (c) método de Loffler.
Las fimbrias o pili son filamentos huecos, delgados y rectos, situados en la superficie de
determinadas bacterias y cuya función no está relacionada con la locomoción, sino con la adherencia
a los sustratos o superficies y el intercambio de fragmentos de ADN durante la conjugación (p. ej.
Salmonella typhi y Shigella flexneri).
Figura 3. Fimbrias de Salmonella typhi.
La cápsula es una estructura superficial que presentan muchas bacterias en su ambiente natural,
que consiste en la acumulación de material mucoso o viscoso, el cual generalmente contiene
glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, que incluyen polialcoholes y
aminoazúcares. La cápsula está situada externamente respecto a la pared celular (Figura 4).
Figura 4. Cápsula del neumococo (Streptococcus pneumoniae).

Las cápsulas resaltan como un halo denso alrededor de la célula bacteriana.
Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de función metabólica, pero que confieren
a las bacterias importantes propiedades: (a) adhesión a células hermanas, generan microcolonias
y consorcios, (b) adhesión a sustratos inertes o vivos, lo que les permite `la colonización de sus
nichos ecológicos (p. ej. tejidos de organismos superiores), (c) propiedades antifagocíticas, y (d)
protección contra agentes antibacterianos.
43
Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teñidos con las técnicas usuales porque
son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijación al calor y lavado las
disuelven.
Los métodos de observación más comunes son la tinción negativa con tinta china y la tinción por el
método de Maneval modificado.
OBJETIVO
El estudiante aprenderá y realizará las técnicas de tinción esporas, flagelos y cápsulas.
 Portaobjetos  Juego de colorantes para la tinción de Schaeffer y

Fulton
 Portaobjetos excavado  Juego de colorantes para la tinción de Maneval A
 Asa bacteriológica  Colorante de contraste (Maneval B)
 Cubreobjetos  Tinta china filtrada
 Puente para laminillas  Cultivo de Staphylococcus aureus
 Charola para tinción  Cultivo de Clostridium sp.
 Pizeta  Cultivo de Escherichia sp.
 Aceite de inmersión  Microscopio
 Cubrebocas
METODOLOGIA
Tinción de esporas
a) Técnica de Wirtz
2. Realizar el frotis, fijarlo con calor.
3. Cubrir la superficie del portaobjetos con disolución de verde malaquita, calentar hasta
evaporar por 5 minutos aproximadamente, impedir que el colorante se seque o se queme.
4. Lavar con agua destilada, arrastrar el colorante con el agua de la pizeta.
5. Sacudir la laminilla para eliminar el exceso de agua.
6. Cubrir la preparación durante 2 o 3 minutos con safranina o fucsina diluida como colorantes de
contraste.
7. Lavar abundantemente con agua destilada.
8. Secar la superficie del portaobjetos.
9. Observar al microscopio con el objetivo de 100x (inmersión).
b) Método de Moeller
10. Realizar un extendido del material a examinar. Secar y fijar con alcohol, dejar encender y
apagar.
11. Cubrir la preparación con disolución de ácido crómico al 5 % durante 5 minutos para
sensibilizar.
12. Lavar y cubrir con disolución de fucsina fenicada (fucsina Ziehl-Neelsen) en caliente durante
10 minutos (calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta la emisión de vapores y
volver a calentar ocasionalmente para mantener la temperatura).
13. Lavar con agua.
14. Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la decoloración
con alcohol.
15. Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
44
16. Lavar, secar y observar con objetivo de 100x (inmersión).
c) Método de Schaeffer y Fulton

17. Preparar una extensión a partir del cultivo bacteriano.
18. Colocar la extensión sobre un soporte y agregar suficiente disolución de verde de malaquita al
5 %.
19. Flamear la extensión, pasar por encima del mechero Bunsen o lámpara de alcohol hasta
observar una ligera emisión de vapores por espacio de minuto y medio, evitar que el colorante
se evapore totalmente.
20. Lavar vigorosamente al chorro del agua, hasta eliminar el exceso de colorante.
21. Cubrir la preparación con disolución de contraste, safranina al 5 % y dejar actuar el colorante
durante un minuto y medio.
22. Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante.
23. Secar al aire o utilizar papel absorbente.
24. Observar al microscopio con objetivo de 100x (aceite de inmersión).
25. Interpretación: Las esporas deberán estar teñidas de color verde y los cuerpos bacilares en
rojo.
d) Método de Dorner
26. Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de agua destilada.
27. Añadir 1 ml de fucsina fenicada (disolución acuosa de fucsina al 1 % y fenol al 5 %) y colocar
la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
28. Tomar una asada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una asada de una
disolución acuosa saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en
forma de óvalo.
29. Dejar secar y observar con objetivo de 100x (inmersión).
Tinción y observación de flagelos
a) Observación al fresco en gota pendiente

1. Los cubreobjetos deben estar limpios y libres de grasa. Para tenerlos en estas condiciones, se
pueden frotar cuidadosamente entre los dedos con agua y jabón y enjuagar en agua caliente,
luego sumergirlos en alcohol y secarlos con una franela limpio sin pelusa. Finalmente, el
calentamiento suave a la flama quitará los últimos restos de grasa.
2. Depositar en condiciones asépticas tres o cuatro asadas de la suspensión bacteriana en el
centro del cubreobjetos limpio y libre de grasa. También, una pipeta Pasteur estéril se puede
usar para este fin, procurar que la gota quede lo suficientemente grande para facilitar la
observación.
3. Cuando se trata de un cultivo sólido, colocar una gota de agua destilada estéril en el centro
del cubreobjetos limpio y suspender una pequeña cantidad de la colonia.
4. Con un aplicador colocar un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetos.
5. Invertir y colocar el portaobjetos sobre el cubreobjetos que contiene la gota de la suspensión
bacteriana, cuidar que quede bien centrado para que la excavación quede directamente
encima de la gota. La gota no debe tocar el portaobjetos.
6. Presionar suavemente para que se adhieran perfectamente el cubre y el portaobjetos.
7. Invertir rápidamente. La gota que contiene el material a examinar penderá del cubreobjetos
sobre la excavación del portaobjetos (Figura 5).
8. Observar al microscopio con el objetivo seco débil (10x) y enseguida con el seco fuerte (40x).
Al localizar la marca hecha en el cubreobjetos, el borde de la gota se encontrará fácilmente.
9. Determinar si hay movilidad real (desplazamiento de las células de un lado a otro dentro del
campo microscópico) o movimiento browniano.
10. Si se pretende observar células individuales, colocar una gota de aceite de inmersión sobre el
cubreobjetos y observar con objetivo de inmersión (100x).
45
Figura 5. Preparación de una muestra en gota pendiente.
b) Tinción por el método de Leifson

1. Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente limpio, para lo cual previamente se
sumerge en mezcla crómica durante 24 horas, posteriormente se lava con agua destilada, se
enjuaga con alcohol y se seca con un trozo de tela limpio. Desengrasar el portaobjetos
pasándolo por la flama varias veces.
2. Dentro del círculo marcado, colocar con pipeta Pasteur una gotita de la suspensión bacteriana
(cultivo de menos de 24 horas) e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la
muestra.
3. Fijar la preparación al aire, ya que si esta operación se realiza con la flama del mechero, los
flagelos se pueden destruir.
4. Humedecer la preparación con el colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura
ambiente durante 10 minutos en clima caluroso o en la incubadora en clima frío.
5. Lavar con agua corriente.
6. Secar y observar con objetivo de inmersión (100x).
c) Tinción por el método de Loffler

1. Realizar el frotis de un cultivo joven (menos de 24 horas).
2. Secar al aire (fijar sin calor).
3. Cubrir el frotis con solución de Loffler, (se prepara al instante) formada por:
Disolución acuosa de ácido tánico al 20 % 10 partes

Disolución saturada de sulfato ferroso 5 partes
Disolución alcohólica saturada de fucsina 1 parte
4. Dejar actuar la solución durante 1 minuto, calentar suavemente.

5. Lavar con agua destilada y escurrir el exceso de líquido.
6. Cubrir con fucsina ó violeta de genciana al 5 % en agua de anilina alcalina, dejar actuar de 1 a
2 minutos con exposición suave de calor.
7. Lavar y secar al aire.
8. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x).
46
Tinción de cápsulas
a) Tinción con tinta china. (La técnica no requiere fijación)
1. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado una gota de agua destilada.

2. Tomar con el asa una pequeña cantidad de muestra y mezclarla con la gota de agua.
3. Añadir una gota de tinta china a la preparación anterior.
4. Mezclar cuidadosamente con el asa sin extender.
5. Poner el portaobjetos sobre papel absorbente.
6. Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión, evitar que se formen burbujas de aire. Sobre el
cubreobjetos poner papel absorbente y presionar con los dedos suavemente, de forma que el
papel absorba el exceso de suspensión (Figura 6).
7. Observar al microscopio.
b) Tinción con el método de Maneval modificado
1. Colocar una gota de Maneval A (rojo Congo) en el centro del portaobjetos.

2. Tomar con el asa una pequeña cantidad de cultivo y mezclarla con la gota de Maneval A,
hacer movimientos giratorios con el asa. Extender la suspensión de manera que quede una
película delgada.
3. Dejar secar a temperatura ambiente. NO FIJAR EL FROTIS AL CALOR.
4. Cubrir la preparación con Maneval B (fucsina ácida), dejarla actuar por 1 minuto.
5. Lavar con agua.
6. Secar el frotis con papel absorbente mediante un ligero contacto.
7. Observar al microscopio.
8. Las cápsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa de un
color oscuro y las células bacterianas de color rojo.
Figura 6. Pasos para la tinción de cápsulas con tinta china.
Nota: los portaobjetos y cubreobjetos usados en las tinciones deben de colocarse en un recipiente
con disolución antiséptica.
47
Práctica No. 9. Cultivo anaeróbico
INTRODUCCIÓN
Las bacterias pueden mostrar variedad de respuestas al oxígeno atmosférico libre por lo que se
pueden clasificar en: aerobias, anaerobias, anaerobias facultativas y microaerófilas (Figura 1).
Figura 1. Clasificación de bacterias de acuerdo con su necesidad de oxígeno.
Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones)
como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren
para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%).
A estas bacterias se las califica como microaerófilas. Algunas microaerófilas lo son
permanentemente (microaerófilas estrictas). Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando
crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas
condicionales).
Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que
pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente
fermentativo.
Bacterias anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa y
peroxidasa. Por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno. (Por
ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas).
Bacterias anaerobias aerotolerantes: Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo

energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores.
Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes.
Bacterias anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio,

dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las
enterobacterias como Escherichia coli. Para algunas el oxígeno es bactericida y para otras es
bacteriostático.
El género Clostridium comprende aquellos bacilos que son esporulados y anaerobios. Algunas de
las especies de este género son importantes en la producción de disolventes orgánicos y de otros
productos metabólicos de interés industrial. La acetona y el butanol, utilizados como disolventes
son productos de la fermentación realizada por el Clostridium spp (Tabla 1).
48
Tabla 1. Tipos de fermentaciones de varios microorganismos.
Tipo de fermentación Productos Organismos

Alcohólica Etanol + CO2 Levadura (Saccharomyces)
Bacterias del ácido láctico
Ácido láctico Ácido láctico (Streptococcus,
Lactobacillus)
Ácido láctico, ácido acético, Bacterias entéricas
Acido mixto
etanol, CO2 , H2 (Escherichia, Salmonela)
Butanediol, ac. láctico,
Bacterias entéricas
Butanediol ácido acético, etanol, CO2 ,
(Aerobacter, Serratia)
H2
Ac. Butírico, ácido acético, Algunos clostridios
Ácido butírico
etanol, CO2 , H2 (Clostridium butyricum)
Algunos clostridios
Acetona - Butanol Acetona, butanol, etanol
(Clostridium acetobutylicum)
Ácido propiónico Ácido propiónico Propionibacterium
Entre los miembros más importantes para el hombre desde el punto de vista patógeno se
encuentran el grupo de la gangrena gaseosa: C. perfringens, C. novy y C. septicum; C. tetani que
causa el tétanos y C. botulinum, responsable de una seria y a menudo fatal intoxicación alimenticia
(botulismo), en la cual la exotoxina botulínica preformada es ingerida junto con los alimentos.
Las características específicas de estas bacterias como son la formación de esporas y su

metabolismo anaerobio facilitan su aislamiento mediante diversas técnicas que pueden ser físicas,
químicas y biológicas, para lo cual es necesario eliminar las formas vegetativas o no esporuladas.
Los microorganismos esporulados se aíslan fácilmente eliminando las formas vegetativas mediante
un tratamiento térmico que sólo las esporas pueden resistir; los microorganismos contaminantes no
esporulados morirán, en tanto que las esporas se desarrollarán al ponerlas en un medio favorable.
Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos
En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el
agua y forman H2O. Estos agentes son cisteína o tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es
bombeando CO2 o N2 libre de O2 al medio, mediante burbujeo.
En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas−Pak (Figura 2). Su tamaño es
similar al de un termo. En su interior se colocan las placas petri invertidas. El recipiente se cierra
con una tapa hermética. En la parte inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la
anaerobiosis, se introducen sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio.
Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno presente se reduce a agua. Para verificar la
anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira de papel impregnada con azul de metileno.
En condiciones aeróbicas, la tira es azul, en anaeróbica es transparente.
En la tapa hay un manómetro con el que se mide la presión interna, ya que se desprenden CO2 y
H2.
49
Figura 2. Jarras de anaerobiosis Gas−Pak.
Figura 3. Método mecánico de incubación y sustitución.
Los medios de cultivo y caldos más comunes para anaerobiosis son agar nutritivo, agar
anaeróbico, agar infusión de cerebro-corazón (BHI-Agar), caldo de tioglicolato e infusión de
corazón (BHI-caldo).
OBJETIVO
El estudiante conocerá y realizará la técnica más sencilla empleada en el cultivo de bacterias

anaerobias. Aplicará los conocimientos de las prácticas anteriores como la preparación de medios
de cultivo, esterilización del material, siembra y preparación de frotis de los cultivos obtenidos para
observarlos al microscopio.
 Mechero  Cubrebocas
 Cajas de Petri estériles  Guantes de látex
 Tubos de cultivo  Agua destilada o solución salina estéril
 Matraz Erlenmeyer  Caldo de tioglicolato
 Asa bacteriológica  Caldo BHI
 Pipetas estériles  Agar nutritivo
 Vaso de precipitado de 600 ml  Agar para bacterias anaeróbicas
 Gradilla  Solución de azul de metileno
 Espátula  Papel filtro
50
 Recipiente de vidrio con tapa  Colorantes y reactivos para tinción de Gram

 Baño María  Tierra del jardín
 Vela de parafina
 Vaselina líquida
METODOLOGÍA
2. A partir de una muestra de suelo de jardín y en condiciones asépticas, pesar 1 g y transferirlo
al matraz que contiene 100 ml de disolución salina estéril a 50 °C y mezclar.
3. Calentar en baño de agua a 85 °C durante 10 minutos para eliminar las formas vegetativas.
4. A partir del matraz, preparar dos diluciones decimales en los tubos con disolución salina estéril
y homogeneizar.
5. Inocular con pipeta estéril 1 ml de cada una de las diluciones a las cajas Petri previamente
marcadas.
6. En condiciones asépticas, agregar a las cajas el agar fundido a 45 °C.
7. Homogeneizar y dejar solidificar.
8. Colocar en forma invertida las cajas Petri con cada dilución en la jarra de anaerobiosis.
9. Sobre las cajas de Petri sembradas e invertidas, colocar una caja vacía para sentar una vela.
10. Introducir una tira de papel filtro impregnada con azul de metileno y la vela encendida sobre la
caja vacía colocada en la parte superior (Figura 4)
11. Cerrar perfectamente la cámara de anaerobiosis e incubar a 28 °C durante 24-48 horas.
12. Transcurrido el tiempo de incubación, revisar cuidadosamente las cajas Petri, señalar con
lápiz graso las colonias aisladas.
13. Preparar frotis a partir de las colonias seleccionadas y teñir con técnica de Gram.
14. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y determinar la pureza del cultivo,
considerar puras a las que muestren un solo tipo de bacteria.
15. Colocar los portaobjetos utilizados en un frasco con disolución antiséptica.
16. Esterilizar cajas, tubos con medios, diluciones al terminar la práctica.
Figura 4. Cámara de anaerobiosis.
51
CUESTIONARIO
1. Describir otra técnica útil en el aislamiento de bacterias anaerobias.

2. Basándose en los resultados obtenidos, indicar ¿cuál de los métodos empleados fue el más
eficiente?
3. ¿Cuál fue el objetivo de calentar a 85 °C el matraz con la solución salina y la tierra de jardín?
4. ¿Qué características especiales deben cumplir los medios de cultivo para las bacterias
anaerobias?
5. Describir la morfología de las colonias y de las bacterias.
6. Ilustrar con dibujos o fotografías lo observado.
7. Mencionar 5 ejemplos de bacterias anaerobias diferentes a los que se aluden en la práctica.
52
Práctica No. 10. Pruebas bioquímicas
INTRODUCCIÓN
Con frecuencia, la identidad de una especie microbiana requiere del uso de técnicas para evaluar
de manera detallada su actividad bioquímica, debido a que otras características físicas no son
suficientemente distintivas o diferenciales.
La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las
bacterias, por medio de las cuales se puede realizar la identificación final de las especies, se lleva
acabo con sub-cultivos del aislamiento primario por transferencia a una serie de medios para
pruebas diferenciales, las cuales pueden ser interpretadas después de uno o más días de
incubación adicional.
La identificación bacteriana preliminar puede efectuarse observando las características de las

colonias y la morfología de la coloración de Gram. No obstante la caracterización final de un
aislamiento bacteriano desconocido en género y especie se logra usualmente mediante la
detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada especie, que sirven como
marcadores de identificación inoculando una pequeña porción de una colonia aislada a una serie
de medios de cultivo que contienen substratos específicos e indicadores químicos que detectan
cambios de pH o la presencia de subproductos específicos.
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los
cuales nos permiten identificar distintos microorganismos presentes en función de la reacción que
presentan.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía

metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al
crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar
de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
Algunos de los medios de cultivo que con más frecuencia se utilizan en los laboratorios de
enseñanza son:
Agar Kliger Hierro. Frecuentemente usado en Microbiología de Alimentos, para la diferenciación

de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa y, a la producción de ácido
sulfhídrico (H2S). En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico,
el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante. Por fermentación
de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira
al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Siembra: a partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo,
picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubación: A 35-37 °C durante 24 horas en aerobiosis.
53
Figura 1. Agar Kligler Hierro.
Agar TSI. Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados
para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico,
el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo
de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro
de color negro.
Siembra: a partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picar el fondo y extender sobre la superficie
del medio.
Incubación: a 35-37 °C durante 24 horas en aerobiosis.
Figura 2. Agar TSI.
Agar Lisina Hierro. Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
entre especies, basado en la descarboxilación/desaminación de la lisina y en la producción de
ácido sulfhídrico. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes
para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y desaminasa. El citrato
de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido
sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual
o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
54
Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce el viraje del indicador al color violeta. La descarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio
ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hr de
incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo
amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y
algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el
cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del
medio.
Siembra: por punción con aguja de inoculación.
Incubación: a 35-37 °C durante 24 horas en aerobiosis.
Figura 3. Agar Lisina Hierro.
Medio SIM. Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de

sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae. El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En
el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina
con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las
cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la
formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio
se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con
aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en línea recta.
Incubación: durante 24 horas a 35-37°C en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas
de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Figura 4. Medio SIM.
55
Medio Christensen (Agar Urea Base). Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base
a la actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus
spp., otras enterobacterias y estafilococos. En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan
los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de
la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio
haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo.
Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del tubo inclinado. Algunos
microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación. Se recomienda no punzar la capa
profunda para controlar el color.
Incubación: durante 24-48 horas a 35-37 °C en aerobiosis.
Limitaciones: Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, viran al color rojo-rosado de todo el
medio de cultivo luego de varios días de incubación. No calentar o sobrecalentar el medio de
cultivo porque la urea se descompone fácilmente.
Figura 5. Medio Christensen (Agar Urea Base).
Agar Citrato Simmons. Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. En el medio de cultivo, el
fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de
carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio
alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con
la consiguiente producción de alcalinidad.
Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero, con un
asa sin arrastrar el agar.
Incubación: de 35-37 ºC durante 24-48 horas en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden

requerir hasta 4 días de incubación.
Limitaciones:
 Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del
verde al amarillo-amarronado.
 Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización
azul de un resultado positivo.
 Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
 Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe
esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla
primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.
56
Figura 6. Agar Citrato Simmons.
Medio MR-VP. Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias. En el medio de cultivo, la
pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el
hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a
través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos
(ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador
como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e
hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido
de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se
debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio
para dar un color rojo.
Siembra: por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubación: de 35-37 °C por 3 días en aerobiosis.
Revelado de pruebas bioquímicas:
a. Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%,
observar el color del medio.
b. Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y
0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y
dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del
medio.
Figura 7. Prueba Rojo de Metilo Figura 8. Prueba Voges Proskauer
Agar Fenilalanina. Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2,
Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae,
en base a la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa. En el medio de cultivo, el extracto de
levadura aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El aminoácido
fenilalanina sufre la desaminación oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina desaminasa (es
una flavoproteína), para producir ácido fenilpirúvico y amoníaco. La presencia del ácido
fenilpirúvico se demuestra con el agregado de cloruro férrico en medio ácido, con el cual se forma
57
un quelato de color verdoso entre el ácido fenilpirúvico y los iones Fe 3+. Además, en este medio se
suele poner en evidencia la producción de pigmentos melánicos, como en el caso de Morganella
morganii y Pseudomonas aeruginosa.
Siembra: a partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inóculo denso por estriado de la
superficie del medio.
Incubación: a 35-37 °C de 18 a 24 horas en aerobiosis. Luego, se debe realizar el revelado:

agregar unas gotas de una solución acuosa de cloruro férrico al 10 %.
Resultado: El análisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos.
Limitaciones: No se recomienda realizar la lectura de la prueba después de los 5 minutos, debido a

que disminuye la intensidad del color verde.
Figura 9. Agar Fenilalanina.
OBJETIVO
El estudiante identificará diferentes bacterias a nivel de género y especie mediante el uso de

pruebas bioquímicas. Aplicará sus conocimientos en la preparación y esterilización de los medios,
aislamiento y siembra de microorganismos para la identificación por medio de pruebas bioquímicas
y tinción.
Aprenderá a interpretar las pruebas bioquímicas y aplicará el proceso de identificación al comparar

los resultados en las tablas que existen para este propósito.
 Cultivo de bacterias sembradas 24 h  7 tubos con rosca y tapa para pruebas

antes de la prueba bioquímicas
 Asa microbiológica de punta recta  TSI (agar de hierro triple azúcar)
 Mechero de Bunsen  Citrato de Simmons
 Matraces Erlenmeyer  SIM (H2S, indol, movilidad)
 Algodón  Medio Christensen (Agar Urea Base)
 Gasa  Gelatina
 Pinzas  Agar Fenilalanina
 Desinfectante  Medio MR-VP
 Kit de material para filtración a vacío  Bomba de vacío
58
METODOLOGÍA
Preparación de los medios de cultivo

1. Limpiar la mesa de trabajo con una franela.
2. Leer las indicaciones de cada medio, realizar los cálculos y preparar la cantidad suficiente
para el número de tubos que se necesitan.
3. La urea se esteriliza por filtración (Práctica No. 2) y el agar en autoclave junto con los tubos
vacíos que van a contener este medio de cultivo.
4. Esterilizar en autoclave los tubos que contienen los diferentes medios de cultivo (con un
marcador escribir el nombre del medio en el tubo), la base de agar para la urea, el Kit para
filtración a vacío y los tubos vacíos para colocar el agar urea base.
5. El medio de cultivo solidificado en el tubo puede ser inclinado o vertical, según sea el caso.
TSI inclinado, citrato inclinado, urea inclinado, SIM vertical, gelatina vertical, fenilalanina
inclinado y MR/VP vertical.
6. A partir de una colonia joven (24 horas) y aislada, realizar las siembras en los medios para las
pruebas bioquímicas, de acuerdo con las siguientes indicaciones: (a) TSI, siembra por
picadura y después estriar en la superficie, citrato, siembra por estría, urea, siembra por
estría, SIM, siembra por picadura, gelatina, siembra por estría, fenilalanina, siembra por estría
y MR/VP, siembra por suspensión y/o agitación.
7. Escoger la colonia que se desea estudiar y realizar la siembra en cada uno de los medios para
las pruebas bioquímicas.
8. Incubar de 18 a 24 horas a 35-37 °C en aerobiosis.
9. Marcar los tubos sembrados en el Kit de pruebas bioquímicas, para hacer la correspondencia
y relacionarlos con la morfología de la colonia y tinción de Gram, para cada colonia que se
pretende identificar.
10. Para la identificación, analizar las reacciones de cada tubo del Kit de pruebas bioquímicas
para cada colonia. Las pruebas se consideran positivas o negativas, según sea el caso y se
interpretan en las tablas que existen para este propósito (ver Anexo 3).
CUESTIONARIO
1. Investigar el fundamento de cada una de las pruebas realizadas.

2. ¿Por qué es importante realizar las pruebas bioquímicas?
3. Tomando en cuenta la transferencia electrónica asociada a la producción de energía, se
puede establecer tres categorías de bacterias, ¿Cuáles son?
4. Reportar los resultados obtenidos en las pruebas realizadas (con imágenes de las pruebas
bioquímicas obtenidas).
5. Elaborar conclusiones y anotar bibliografía consultada.
59
Práctica No. 11. Aislamiento de hongos de diferentes fuentes
INTRUDUCCIÓN
Los hongos son un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que, a diferencia de
las plantas y los animales, se alimentan mediante la absorción directa de nutrientes, que obtienen
mediante la degradación de moléculas de alimento del medio (nutrición absortiva). Los alimentos
se disuelven mediante enzimas que secretan los hongos.
Las evidencias fósiles ponen de manifiesto que los hongos han estado presentes en nuestro
planeta desde hace al menos 600 millones de años e incluso antes. En la actualidad, miles de
especies de hongos crecen y absorben los nutrientes del suelo, la madera, la materia orgánica
muerta o de las plantas y otros organismos.
Su tamaño varía desde los hongos microscópicos unicelulares hasta algunos de los organismos
más grandes que existen. En Michigan, por ejemplo, el cuerpo subterráneo de un hongo Armillaria
ocupa un área de más de 12 hectáreas. La disciplina que estudia los hongos se llama micología.
Los hongos constituyen un grupo de organismos numeroso y extensamente distribuido, cuya

actividad resulta esencial en el funcionamiento de todos los ecosistemas. Son los causantes, junto
con las bacterias, de la putrefacción y descomposición de toda la materia orgánica. Son seres
vivos descomponedores que degradan los restos de organismos muertos y devuelven el carbono y
otros elementos de nuevo al ambiente, para que puedan ser reutilizados.
La importancia de los hongos para los seres humanos es inestimable. Ciertos hongos, entre los
que se incluyen algunos mohos, tienen un valor probado en la síntesis de antibióticos y hormonas
empleados en medicina, así como de enzimas utilizados en determinados procesos industriales.
Algunos hongos, como las trufas, son considerados un alimento exquisito. Sin embargo, no todos
los hongos resultan beneficiosos, algunos son parásitos de organismos vivos y producen graves
enfermedades en los humanos, animales y plantas.
Algunos expertos estiman que hay aproximadamente 1,5 millones de especies, de las cuales
aproximadamente unas 100.000 han sido identificadas. Las características propias de estos
organismos hacen necesario incluirlos en un reino propio; el reino Fungi.
Figura 1. Tipos de hongos.
Forma de alimentarse
Los hongos carecen de clorofila, el pigmento verde que permite a las plantas realizar la fotosíntesis
y fabricar sus propios compuestos orgánicos. Los hongos son seres vivos heterótrofos que
obtienen el alimento por absorción, secretan enzimas digestivas que degradan las moléculas de
alimento en el ambiente, fuera de sus cuerpos. El hongo absorbe los productos degradados.
60
Algunos hongos son parásitos, los cuales se alimentan de humanos, animales y plantas (Figura 2).
Figura 2. Hongos parásitos.
La mayoría son saprófitos pues obtienen el alimento de la materia orgánica muerta y son capaces
de degradar la celulosa y la lignina, presentes en las paredes celulares de las células vegetales.
Algunos hongos establecen relaciones simbióticas con otros organismos. Por ejemplo, las raíces
de muchas especies de plantas desarrollan una asociación beneficiosa con los hongos formando
una micorriza. Las micorrizas incrementan la capacidad de las raíces de la planta para absorber
nutrientes; el hongo le suministra a la planta minerales y absorbe compuestos orgánicos de su
compañero fotosintético. Los hongos también forman asociaciones mutualistas con diversos
animales. Por ejemplo, las hormigas cortadoras de hoja, llevan los trozos de hojas a sus nidos,
donde alimentan a ciertos hongos. Los hongos viven en los nidos y las hormigas se alimentan de
los hongos.
Figura 3. Micorrizas.
61
En la fotografía, la tierra de la maceta de la

izquierda fue tratada para destruir los hongos.
En las macetas central y derecha, los hongos

están presentes en forma de micorrizas asociadas
a las raíces.
Hormigas que cultivan hongos en sus

nidos.
Figura 4. Hábitats de algunos hongos.
Estructura
A excepción de las especies unicelulares, la mayoría de los hongos están constituidos por
filamentos tubulares que reciben el nombre de hifas. Cada hifa está rodeada por una pared celular
que normalmente contiene quitina. La mayoría de las hifas no están divididas en células separadas
y los núcleos y orgánulos están esparcidos por todo el citoplasma. Sin embargo, algunas hifas
pueden estar divididas por tabiques llamados septos, pero, incluso en estas hifas, los septos
poseen unos poros que permiten el movimiento de orgánulos dentro de la hifa.
Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La proliferación de
hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio. Cuando el micelio se desarrolla puede llegar
a formar grandes cuerpos fructíferos, tales como las setas. Normalmente, los cuerpos fructíferos
son la parte más visible del hongo y suelen crecer por encima del suelo o de otras superficies, de
manera que las esporas pueden ser dispersadas por las corrientes de aire o mediante otros
mecanismos. Por el contrario, el micelio normalmente permanece enterrado. Por ejemplo, el
micelio de una seta está encerrado bajo el suelo, mientras que el cuerpo fructífero, la estructura en
forma de paraguas que nos resulta tan familiar, brota por encima del suelo.
62
Mohos Levaduras
Figura 5. Morfología macroscópica y microscópica de los hongos.
Figura 6. Tipo de esporas y estructuras fructificantes de hongos.
63
Figura 7. Estructuras con esporas externas
Figura 8. Estructuras con esporas internas.
Figura 9. Estructuras teleomórficas (sexuales) de hongos con micelio continuo.
64
Figura 10. Estructuras con meiosporas internas.
Figura 11. Esquema de un ascoma (apotecio).
65
Figura 12. Estructuras reproductoras de los basidimicetos.
Clasificación – Evolución
A pesar de que en muchos textos se emplean sistemas de clasificación relativamente complicados,

los micólogos utilizan por lo común un sistema sencillo, que tiene la ventaja de ser cómodo de
usar. Según este sistema, las cuatro divisiones principales son: Oomicetes (Oomycota),
Zigomicetes (Zygomycota), Ascomicetes (Ascomycota) y Basidiomicetes (Basidiomycota) y sus
respectivos individuos forman oosporas, zigosporas, ascosporas y basidiosporas. Una gran
variedad de especies se coloca, de forma arbitraria, en un quinto división: Deuteromicetes
(Deuteromycota), también llamados hongos imperfectos. La razón para clasificar una especie
dentro de este grupo es porque no se conoce la forma en que se producen las esporas por fusión
de los núcleos. Sin embargo, la mayoría de esas especies están emparentadas con los
ascomicetes.
Los primeros hongos habrían sido organismos eucarióticos unicelulares que al parecer no tienen
representantes vivientes. Se supone que estos organismos dieron nacimiento a tres linajes
distintos, uno que condujo a los quítridos modernos, otro a los oomicetes y un tercero a los
zigomicetes. Estos tres grupos se caracterizan por una organización cenocítica y no hay
compartimentalización de los micelios. En los ascomicetes y en los basidiomicetes las hifas son
tabicadas, por lo que se piensa que derivan de un antepasado común.
División Oomycota (Oomicetes)
La división Oomicetes se compone de hongos que se parecen a las algas. Abarca desde
organismos unicelulares hasta complejas masas de hifas que no están tabicadas por septos
(micelios no septados). Además de producir oosporas, los oomicetes forman zoosporas que se
mueven por medio de dos flagelos. Se incluyen en la división los mohos acuáticos, las royas
blancas y los mildius vellosos. La mayoría de los mohos acuáticos viven sobre materia orgánica
muerta, aunque Saprolegnia parasitica, parasita peces vivos. Las royas blancas y los mildius
vellosos, pertenecientes al orden Peronosporales, son parásitos de plantas. En algunos mildius
vellosos, por ejemplo en los géneros Phytophthora y Peronospora, los receptáculos que contienen
las zoosporas pueden estar modificados; en ese caso, los receptáculos se parecen a los conidios y
funcionan como tales.
66
División Chytridiomycota (Quítridos)
Los quitridiomicetes son considerados parientes cercanos de los oomicetes. En algunos sistemas
de clasificación se colocan entre los protistas, en lugar de entre los hongos.
División Zygomycota (Zigomicetes)
Los hongos pertenecientes a la división Zigomicetes se caracterizan por formar zigosporas con
gruesas paredes, de origen sexual y esporangiosporas no nadadoras, de origen asexual. El moho
negro del pan (Rhizopus nigricans), produce masas de hifas sobre pan, fruta y otros alimentos
envejecidos. Otros son parásitos de las moscas y de otros insectos. Tienen esporangiosporas
sencillas dentro de unos receptáculos; en el interior de cada uno de estos receptáculos se
desarrollan unas estructuras que llegan a independizarse y funcionar como conidios. Esta división
también comprende hongos parásitos de amebas, nematodos y artrópodos.
División Ascomycota (Ascomicetes)
Los hongos de la división Ascomicetes, también llamados hongos con forma de saco, producen un
número determinado de ascosporas en el interior de unas bolsas semejantes a vesículas,
denominadas ascas. Con la excepción de algunas levaduras y otros pocos organismos, los
ascomicetes tienen hifas bien desarrolladas, por lo general con un único núcleo en cada hifa.
Ciertas células se transforman en binucleadas poco antes de la formación de los sacos esporales.
La unión de los núcleos se da en las ascas jóvenes; tras la posterior división, suelen producirse
ocho núcleos, los cuales darán lugar a las ascosporas. Algunos ascomicetes tienen sólo una
ascospora; otros pueden tener varios cientos.
División Basidiomycota (Basidiomicetes)
La división Basidiomicetes comprende numerosos y variados tipos de hongos, cuyas estructuras

reproductoras son basidios que se localizan en las puntas de las hifas, sobre unos salientes con
forma de tallo. Lo normal es que, en cada basidio, se formen cuatro basidiosporas. Los basidios
pueden ser con forma de maza, cilíndricos u ovales.
División Deuteromycota (Hongos imperfectos)
Son hongos sin ciclos sexuales conocidos. Entre sus miembros se encuentran parásitos que
enferman a las plantas y animales. Las enfermedades humanas más comunes causadas por este
grupo son infecciones de la piel y de las membranas mucosas. Algunos revisten importancia
económica porque se emplean para producir ciertos quesos y antibióticos (penicilina).
La clasificación anterior se resume en la Tabla 1:
67
Tabla 1. Clasificación de los hongos.
División Rasgos distintivos Enfermedades Usos

comerciales
En su mayoría Vena grande de la Ninguno
acuáticos; esporas y lechuga; infección del
gametos flagelados; maíz.
las paredes celulares
Quítridos
tienen quitina; el
cuerpo vegetativo
suele ser un talo,
raramente una hifa.
Algunos acuáticos; Tizones y mildius de Ninguno
esporas flageladas; las plantas;
formación de huevos infecciones de los
Oomicetes y espermatozoides peces.
en gametangios
especiales; las
paredes celulares
contienen celulosa.
Formación de Pocas Ninguno
zigosporas (esporas
fuertes y resistentes
Zigomicetes
por fusión de
gametangios); sin
células flageladas.
Formación de finas Cáncer del castaño; Alimentos (setas,
esporas asexuales enfermedad del olmo; trufas); elaboración
(conidios); esporas cornezuelo del de vinos, cerveza,
sexuales en ascos; centeno. pan (levaduras)
Ascomicetes
hifas divididas por
tabiques perforados;
sin células
flageladas.
Esporas sexuales en Royas; tizones. Alimentos (setas)
basidios; hifas
divididas por tabiques
Basidiomicetes
perforados;
dicariones; sin
células flageladas.
Hongos sin ciclos Tiña, muguet. Queso, antibióticos
sexuales conocidos;
Deuteromicetes
sin células
flageladas.
OBJETIVO
El estudiante descubrirá la distribución de los hongos en el medio ambiente y caracterizará la

morfología de las colonias (color, forma, textura) obtenidas de diferentes fuentes.
68
Microscopio 5 cajas con agar Sabouraud

Portaobjetos Lugol
Asa bacteriológica KOH al 10 %
7 pipetas de 1 ml estériles Azul de algodón
6 tubos con tapa y 10 ml de disolución salina Mezcla de antibióticos Penicilina -
estéril Estreptomicina 1:1
8 cajas de Petri estériles Medio de cultivo Agar Sabouraud
5 tubos con tapa estéril Muestras de frutas o verduras
Mechero Bunsen Hipoclorito
METODOLOGÍA
práctica.
3. Preparar la cantidad necesaria de medio de cultivo de agar Sabouraud (en tubo y en caja) y
esterilizar junto con el material que se va a ocupar para la realización de la práctica (tubos,
pipetas). Seguir las indicaciones del profesor.
Aislamiento de hongos del aire

4. Exponer al aire libre por 15 min una caja con agar Sabouraud.
5. Incubar la placa invertida a temperatura ambiente.
6. Observar y reportar las características macroscópicas de las colonias aisladas.
7. Tomar fotografía de cada caja de Petri para vincular su reporte.
Aislamiento de hongos de suelo

8. Mantener fundido el agar Sabouraud en los tubos de cultivo a 45 °C para las diluciones que se
van a preparar.
9. Agregar a cada uno de los tubos 2 gotas de una mezcla de antibióticos.
10. Cernir o tamizar una muestra de tierra de jardín seca.
11. Pesar 0.5 g de muestra de tierra y agregarlos a un tubo con 4.5 ml de disolución salina estéril
(dilución 1:10).
12. De la mezcla anterior, realizar 5 diluciones (1/100, 1/1000, 1/10,000, como se indicó en la
Práctica No. 3).
13. Tomar un tubo con agar fundido para la primera dilución (1/100) y agregar 2 gotas de mezcla
de antibióticos y mezclar.
14. En una caja Petri estéril depositar 1 ml de la dilución y agregar el medio de cultivo fundido,
tapar la caja con mucho cuidado.
15. Realizar movimientos horizontales, verticales y circulares en la mesa para homogenizar
(Figura 13).
16. Repetir la misma operación para las siguientes diluciones.
17. Etiquetar cada una de las cajas con la dilución correspondiente.
18. Incubar las cajas invertidas a temperatura ambiente.
19. Reporte las características macroscópicas de las colonias observadas.
69
Figura 13. Técnica de mezclado para diluciones en cultivo sólido.
Aislamiento y purificación de hongos por dilución de cultivos

20. Preparar 6 tubos con 10 a 15 ml de Sabouraud Dextrosa o agar Czapek Dox.
21. Colocar los tubos en agua hirviendo para fundir el medio de cultivo.
22. Colocar los tubos con el medio en un baño de agua a 45 °C.
23. Tomar una pequeña porción de muestra del suelo o de un cultivo contaminado que se desee
purificar y macerar ligeramente.
24. Introducir con asa estéril algunos fragmentos de la muestra en uno de los tubos con el medio
de cultivo fundido.
25. Rotar enérgicamente el tubo entre las palmas de las manos, evitar que se formen burbujas de
aire.
26. Verter el contenido del tubo en una caja de Petri estéril.
27. Verter el medio de otro tubo en el primer tubo y mezclar.
28. Verter el contenido de este tubo en una segunda caja de Petri.
29. Verter el contenido del tercer tubo en el primero y mezclar.
30. Continuar con este procedimiento hasta obtener 6 cajas.
31. Después que haya solidificado el medio, invertir las cajas e incubar durante 3 a 5 días a 26-28
°C.
32. Revisar las cajas de Petri diariamente para evaluar el desarrollo de los hongos.
33. Una vez concluido el periodo de incubación, verificar la pureza de las colonias de hongos en
las dos últimas cajas.
Aislamiento de hongos de productos vegetales

34. Cortar un pequeño fragmento de fruta o verdura que esté contaminado con hongos.
35. Sumergir unos minutos en hipoclorito. Si el crecimiento es pulverulento, este paso no es
necesario.
36. Sembrar en una caja con agar Sabouraud. En este caso, la siembra se realiza al inocular el
hongo en el centro de la placa.
37. Incubar durante 3 a 5 días a 26-28 °C.
38. Revisar las cajas diariamente para evaluar el desarrollo.
39. Reportar las características macroscópicas de las colonias observadas.
Nota: Observar diariamente las cajas Petri para llevar un seguimiento de su crecimiento.
Se debe reportar de cada muestra obtenida: lugar donde se obtuvo, medio de aislamiento y fecha
de aislamiento. Con la lupa, observar y describir y anotar las siguientes características
macroscópicas: pigmentación de colonias, del centro, periferia, el haz y el envés, diferentes zonas
aéreas en distintos períodos de incubación, consistencia (algodonosa, pulvurenta, filamentosa,
compacta, cremosa, reseca), coloración, tipo de crecimiento (radial, lento, rápido).
70
Observación microscópica de hongos
Tinción de preparaciones en fresco

1. Colocar una gota de colorante (azul de algodón, eritrosina al 1% o fucsina ácida) en el centro
de un portaobjetos.
2. Tomar una pequeña porción del cultivo con unas pinzas o asa estéril y colocarla sobre la gota
del colorante, extender la preparación cuidadosamente con un par de agujas de disección.
3. Cubrir con un cubreobjetos.
4. Observar al microscopio con el menor y mayor aumento (10x y 40x, respectivamente).
CUESTIONARIO
1. Indicar algunos factores que impiden el crecimiento de hongos en frutas críticas, compotas,
gelatinas, libros de encuadernados.
2. ¿Cómo afecta la temperatura al crecimiento de los hongos?
3. ¿Qué factores de cultivo facilitan el crecimiento de hongos?
4. ¿Por qué se realizan diluciones para el aislamiento de hongos de suelo?
5. ¿Para qué se usan antibióticos en el aislamiento de hongos de suelo?
6. Nombrar 5 medios de cultivo para hongos y sus principios activos.
7. Enlistar 5 nombres de hongos superiores venenosos.
8. Mencionar por lo menos 5 procesos industriales donde se utilizan hongos.
9. Mencionar 5 géneros de hongos que crezcan principalmente en frutas y hortalizas.
10. Existen métodos de cuantificación de hongos, ¿cuáles son?
71
Práctica No. 12. Microcultivo de hongos filamentosos
INTRUDUCCIÓN
Los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres grupos importantes: Los
mohos, las levaduras y las setas.
Los mohos son hongos microscópicos, multicelulares, filamentosos, dotados de un micelio

verdadero, están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Presentan una gran variedad de
formas, tamaños y colores. Son habituales los alimentos como en pan viejo, queso, frutas, tortillas,
etc., Se les conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso.
Figura 1. Mohos contaminantes de alimentos.
Identificación de mohos
Un hongo se identifica en primer lugar por la morfología macroscópica de la colonia, color, textura y
velocidad de crecimiento. Para observar la estructura microscópica, se coloca una pequeña
fracción de la colonia en un porta y contrastando con un colorante, permitirá confirmar la sospecha
de un hongo levaduriforme o filamentoso.
Los hongos filamentosos (mohos), se identifican a nivel género especie por la morfología del
micelio, pero sobre todo por las características de sus esporas asexuadas y los elementos que los
originan.
Las estructuras reproductoras asexuadas son muy frágiles y para poder observarlas al microscopio
sin distorsionarlas o destruirlas se emplean técnicas especiales como el microcultivo. La técnica de
microcultivo nos permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo porque el arreglo
y acomodo de sus partes permanecen intactos.
Los mohos presentan una estructura vegetativa denominada micelio, el cual está formado por una
serie de tubos rígidos ramificados, dentro de los cuales se encuentra el citoplasma multinucleado.
Estos tubos reciben el nombre de hifas. A partir de una espora en germinación se desarrolla una
hifa, esta se ramifica y forma un micelio.
La clasificación de los hongos se hace según las características de las hifas, la formación de
esporas asexuales, las estructuras que contienen éstas y la capacidad de producir esporas
sexuales.
Para la identificación de un moho se necesita una descripción completa del organismo. El examen
de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y segunda semana de
incubación. Las observaciones macroscópicas deben realizarse con la ayuda de una lupa. En
general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de hongos es filamentosa o
levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un aspecto velloso o acordonado,
mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con superficies lisas.
72
Figura 2. Aspergilus flavus.
Figura 3. Aspergillus fumigatus (causante de enfermedades inmunodepresivas).
Figura 4. Alternaria alternata.
Figura 5. Penicillium chrysogenum.
Figura 6. Penicillium notatum.
Figura 7. Curvularia lunata.
73
OBJETIVO
Conocer e identificar la morfología microscópica de los hongos filamentosos mediante la técnica de

microcultivo y el examen directo de los mismos.
Caja de Petri Papel filtro

Portaobjetos excavado Papel estraza
Cubreobjetos Mechero Bunsen
Tubo de vidrio en forma de “V” Agar Sabouraud
Asa bacteriológica Pipeta estéril de 5 ml
Vaselina sólida o silicona Microscopio
Bisturí
METODOLOGÍA
1. El estudiante deberá portar bata blanca y cubre boca para realizar la práctica.
Cultivo de hongos en portaobjetos

3. En una caja de Petri de vidrio, colocar un disco de papel de filtro en el fondo, un tubo de vidrio
en forma de "V", un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.
4. Envolver y esterilizar el material anterior con el resto del material que se necesite para realizar
la práctica.
Método A
5. Con pipeta Pasteur estéril, añadir en 1 gota de agar Sabouraud (medio fundido a 45 ºC) en la
concavidad del portaobjetos excavado. Esperar 2 minutos a que el agar solidifique.
6. Con asa bacteriológica, sembrar las esporas del hongo a estudiar.
7. Con un palillo añadir silicona o vaselina a los 3 lados alrededor de la horadación, dejar el
cuarto sin silicona para permitir la entrada de aire.
8. Colocar un cubreobjetos.
9. Añadir agua destilada hasta empapar el papel de filtro y colocar en su posición el portaobjetos
con el inóculo. Tapar la caja de Petri.
10. Incubar a 25 ºC y revisar el cultivo diariamente, hasta que se considere que el crecimiento es
adecuado para la observación al microscopio (añadir agua si es preciso, para mantener
húmedo el ambiente en la caja de Petri).
11. Observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x.
Método B
12. Colocar un cuadrado de Agar Sabouraud (de poco grosor) de 0,5 cm. de lado sobre un
portaobjetos.
13. Tomar con asa de micología (o con asa de picadura) una pequeña muestra de micelio de la
colonia a investigar. Inocularla en el centro del cuadrado y cubrir con un cubreobjetos estéril.
14. Añadir agua destilada hasta empapar el papel de filtro y colocar en su posición el portaobjetos
con el medio inoculado. Tapar la caja de Petri.
15. Incubar a 25 ºC y revisar el cultivo diariamente, hasta que se considere que el crecimiento es
adecuado para la observación al microscopio (añadir agua si es preciso, para mantener
húmedo el ambiente en la caja de Petri)
16. Observar al microscopio con el objetivo 10x y 40x.
74
CUESTIONARIO
1. Reportar para cada muestra obtenida la descripción de características macroscópicas de la

colonia madre (tomar fotografías), la pigmentación de colonias, el centro, periferia, el haz y el
envés, diferentes zonas aéreas en distintos períodos de incubación y la consistencia
(algodonosa, pulvurenta, filamentosa, compacta, cremosa, reseca).
2. Reportar el desarrollo diario del microcultivo, tomar fotografías, describir el tipo de hifas y
esporas.
75
Práctica No. 13. Estudio de un virus
INTRODUCClÓN
Un virus (de la palabra latina virus, toxina o veneno) es una entidad biológica que para
reproducirse necesita de una célula huésped. Cada partícula de virus o virón es un agente
potencialmente patógeno compuesto por una cáspide o cápsida (estructura proteica formada por
una serie de monómeros llamados capsómeros) de proteínas que envuelve al ácido nucleico, que
puede ser ADN o ARN. La forma de la cápside puede ser sencilla, típicamente de tipo helicoidal o
icosaédrica (poliédrica o casi esférica), o compuesta, típicamente comprendiendo una cabeza y
una cola. Esta estructura puede, a su vez, estar rodeada por la envoltura virica, una capa lipídica
con diferentes proteínas, dependiendo del virus.
Figura 1. Tres tipos de virus: un virus bacteriano, llamado bacteriófago (centro izquierda), un virus animal
(arriba a la derecha) y un retrovirus (abajo a la derecha)
El ciclo vital de un virus siempre necesita de la maquinaria metabólica de la célula invadida para
poder replicar su material genético, produciendo luego muchas copias del virus original. En dicho
proceso reside la capacidad destructora de los virus, ya que pueden perjudicar a la célula hasta
destruirla. Pueden infectar células eucariotas (plantas, animales, hongos o protistas) o procariotas
(en cuyo caso se les llama bacteriófagos, o simplemente fagos). Algunos virus necesitan de
enzimas poco usuales por lo que las cargan dentro de su envoltorio como parte de su equipaje.
76
Los biólogos debaten si los virus son o no organismos vivos. Algunos consideran que no están
vivos, puesto que no cumplen los criterios de definición de vida. Por ejemplo, a diferencia de los
organismos vivos (macroscópicos o microscópicos), los virus no tienen células. Sin embargo, sí
tienen genes y evolucionan por selección natural. Otros biólogos los han descrito como organismos
en el borde de la vida, en el límite entre la materia viva y la materia inerte.
Las infecciones virales en humanos y animales por lo general dan como resultado una respuesta
inmune del organismo invadido y, a menudo, enfermedades o incluso la muerte. Entre los
padecimientos se incluyen el resfriado común, la gripe, la varicela, el sarampión, la rabia, el SIDA,
etc. Muchas veces, el virus es completamente eliminado por el sistema inmunológico. Los
antibióticos, destinados a combatir a las bacterias, no tienen ningún efecto sobre los virus, pero se
han desarrollado medicamentos antivirales para el tratamiento de las infecciones por virus. Las
vacunas pueden prevenir las infecciones virales produciendo inmunidad durante tiempo
prolongado.
Virus de la gripe Virus obesidad Virus rubeola
El virus del mosaico del tabaco o TMV es un virus ARN que infecta plantas, especialmente al
tabaco y a otros miembros de la familia Solanaceae. La infección produce patrones característicos
en las hojas (de allí su nombre). Fue el primer virus descubierto. Aunque se sabía desde fines del
siglo XIX que esta enfermedad infecciosa dañaba las cosechas de tabaco, no fue hasta 1930 que
pudo determinarse que el agente infeccioso era un virus.
77
Figura 2. Virus del tabaco.
Figura 3. Virus que infectan otros cultivos.
Tabla 1. Clasificación de los virus.

VIRUS ADN
Familia Género Ejemplo Comentario
Herpes simplex
Encefalitis, estomatitis aguda, llaga
Herpesviridae Alphaherpes-virinae virus type 1 (aka
labial del resfriado.
HHV-1)
Herpes simplex
virus tipo 2 (aka Herpes genital, encefalitis
HHV-2)
Varicella zoster
Varicela, Herpes Zóster
virus (aka HHV-3)
Gammaherpes- Epstein Barr virus Mononucleosis hepatitis, tumores
virinae (aka HHV-4) (BL, NPC)
Sarcoma de
Kaposi, asociado Probablemente: tumores, inc.
al herpesvirus, Sarcoma de Kaposi (KS) y algunos
KSHV (aka Human linfomas de células B
herpesvirus 8)
Cytomegalovirus
Mononucleosis, hepatitis,
Betaherpes-virinae Humano (aka
neumonitis, congénitas
HHV-5)
Human Roséola (aka E. subitum),
herpesvirus 6 pneumonitis
Human
Algunos casos de roséola?
herpesvirus 7
Adenovirus 49 serotipos (especies); infecciones
Adenoviridae Mastadeno-virus
Humano respiratorias.
Papillomavirus
Papovaviridae Papilloma-virus 70 especies; verrugas y tumores
Humano
usualmente poco graves; JC causa
Polyoma-virus JC, BK viruses
PML en SIDA
Virus de la Hepatitis (crónica), cirrosis, tumores
Hepadnaviridae Hepadna-virus
Hepatitis B hepáticos.
Poxviridae Orthopox-virus Vaccinia virus Virus de la vacuna de la viruela
78
Enfermedad como la viruela,

zoonosis muy rara (un brote
Monkeypox virus
reciente en el Congo; 92 cases
desde 2/96 - 2/97)
Parapox-virus Orf virus Lesiones dérmicas ("pocks")
Exantema. infecciosa. (5ª
Parvoviridae Parvo-virus B19 parvovirus enfermedad), crisis aplástica,
pérdida fetal.
Virus Adeno- Útil para terapia génica; se integra
Dependo-virus
asociado en el cromosoma
VIRUS ARN

3 tipos; meningitis aséptica,
Picornaviridae Entero-virus Polioviruses
poliomielitis paralítica
32 tipos; Meningitis aséptica,
Echoviruses
erupciones
29 tipos; meningitis aséptica,
Coxsachieviruses
miopericarditis
Virus de la Hepatitis aguda (propagación fecal-
Hepato-virus
Hepatitis A oral)
Human
Rhino-virus 115 tipos; Resfriado común
rhinoviruses
Caliciviridae Calici-virus Norwalk virus Enfermedad gastrointestinal.
Virus de la Hepatitis aguda (propagación fecal-
Hepe-virus
Hepatitis E oral)
Parainfluenza 4 tipos; Resfriado común,
Paramyxoviridae Paramyxo-virus
viruses bronquiolitis, neumonía
Virus de las Paperas: parotitis, meningitis
Rubula-virus
Paperas aséptica (raro: orquitis, encefalitis)
Virus del Sarampión: fiebre, exantema (raro:
Morbilli-virus
sarampión encefalitis, SSPE)
Virus Sincitial Resfriado común(adultos),
Pneumo-virus
respiratorio bronquiolitis, neumonía (niños)
Flu: fiebre, mialgias, malestar
Orthomyxoviridae Influenza-virus A Influenza virus A
general, tos, neumonía
Flu: fiebre, mialgias, malestar
Influenza-virus B Influenza virus B
general, tos, neumonía
Rabia: incubación larga y después
Rhabdoviridae Lyssa-virus Virus de la Rabies
enfermedad del SNC y muerte.
Virus de
Filoviridae Filo-virus Fiebre hemorrágica, muerte
Ebola and Marburg
No muy claro; relacionado con
Borna disease
Bornaviridae Borna-virus enfermedades tipo: esquizofrenia
virus
en algunos animales.
Human T- Leucemia de células T del adulto.
Retroviridae Onco-virinae lymphotropic virus (ATL), paraparesia espástica
type-1 tropical (TSP)
Spuma-virinae Human foamy No se conoce patología
79
viruses
Virus type1 y 2 de
la
Lenti-virinae SIDA, enfermedad del SNC
inmunodeficiencia
humana
Virus de la Exantema; malformaciones
Togaviridae Rubi-virus
Rubeola congénitas.
Virus de la
Encefalitis Transmitida por mosquitos,
Alpha-virus
equina (WEE, encefalitis
EEE, VEE)
Virus de la Fiebre Mosquito-born; fever, hepatitis
Flaviviridae Flavi-virus
Amarilla (yellow fever!)
Transmitida por mosquitos; fiebre
Virus del Dengue
hemorrágica
Virus de la
Transmitida por mosquitos;
Encefalitis de San
encefalitis
Luis
Virus de la Hepatitis (con frecuencia: crónica),
Hepaci-virus
Hepatitis C cáncer hepático
Reoviridae Rota-virus Rotavirus Humano 6 tipos; Diarrea
Virus de la Fiebre
Colti-virus de Garrapatas de Transmitido por garrapatas; fiebre
Colorado
Ortho-reovirus Reovirus Humanos Enfermedad leve
Síndrome Propagado por roedores;
Bunyaviridae Hanta-virus Pulmonar enfermedad pulmonar (puede ser
por Hantavirus letal, Ej. brote de las "4 esquinas")
Propagado por roedores; fiebre
Hantaan virus
hemorrágica con síndrome renal.
Phlebo-virus
OBJETIVO
Estudiar el carácter infeccioso del virus del tabaco en una planta de jitomate y las lesiones que
causa.
2 plantas jóvenes de jitomate Asa bacteriológica

1/2 cigarrillo de cualquier marca Tubos de ensayo
Solución de fosfato dibásico de potasio 0.1 M Agitador de vidrio
(K2HPO4)
Lija de agua 1500 (fina) Mortero
Vaso de precipitado de 100 ml Gasa
80
METODOLOGÍA
1. Vaciar el tabaco del cigarrillo en un mortero y agregar 6 ml de K2HPO4 0.1 M; moler el tabaco.
Este extracto constituye la solución del virus.
2. Humedecer la lija en la solución de K2HPO4 0.1 M
3. Frotar suavemente la superficie de varias hojas de la planta de tomate con la lija. El material
abrasivo hará pequeños rasguños en la superficie de las hojas.
4. Lavar con agua destilada las hojas que han sido tratadas y marcar la planta con la palabra
“testigo”, anotar la fecha del tratamiento.
5. Colocar la planta en un área del laboratorio donde permanezca aislada durante el periodo de
observación (dos semanas).
6. Repetir el mismo procedimiento con una segunda planta, utilizar esta vez una asa humedecida
con el extracto del virus y espolvoreada con el material abrasivo.
7. Colocar esta planta en un área del laboratorio alejada del sitio donde esté la planta testigo.
8. Lavarse cuidadosamente las manos para eliminar los restos del extracto del tabaco.
9. Observar las 2 plantas diariamente durante 2 semanas y registrar sus observaciones,
comparar diariamente las 2 plantas durante este período (tomar fotografías).
10. Limpiar con cuidado y perfectamente el área del laboratorio donde se trabajó.
CUSTIONARIO
1. ¿Qué hace suponer que en el tabaco del cigarrillo se encuentra el virus?

2. ¿Por qué es necesario que la superficie de la hoja sea rasguñada?
3. ¿Qué relación existe entre la operación que se realiza al rasguñar la hoja y lo que sucede
cuando una persona cae y se raspe las rodillas o los codos?
4. ¿Qué puede decirse a cerca del virus del mosaico del tabaco en estas plantas?
5. ¿Por qué razón se deben de poner separadas las 2 plantas?
6. ¿Qué es un agente antiviral?
7. Para describir sus observaciones, ilústrelas con fotografías.
81
Anexo 1. Preparación de disoluciones y colorantes

Reactivos para la tinción de Gram
Colorante primario
Cristal violeta: 2.5 g
Agua destilada: 1.0 g
Solución sensibilizante
Bicarbonato de sodio: 12.5 g
Agua destilada: 1.0 L
Mordiente (lugol)
Yodo: 20.0 g
Hidróxido de sodio 1 M: 100.0 g
Decolorante
Alcohol etílico: 750.0 ml
Acetona: 250.0 ml
Colorante de contraste
Fucsina básica (solución saturada en alcohol etílico) 100.0 ml
Agua destilada: 900.0 ml
NOTA:
Estos colorantes deben madurar por un mínimo de 30 días para obtener mejores resultados.
Solución de Loffler
Solución acuosa de ácido tánico al 20 % ---- 10 partes
Solución saturada de sulfato ferroso ---------- 5 partes
Solución alcohólica saturada de fucsina ------ 1 parte
COLORANTES PARA LA TINCION DE MANEVAL MODIFICADO
Colorante de Maneval “A” (colorante primario)

Solución acuosa de rojo Congo al 1%
Colorante de Maneval “B” (colorante de contraste)

Solución acuosa de fenol al 5% ------------------------ 30 ml
Solución acuosa de ácido acético glacial al 20% ---- 10 ml
Solución acuosa de cloruro férrico al 30% ----------- 4 ml
Solución acuosa de fucsina ácida al 1% ------------ 2 ml
Fucsina básica de Ziehl

Composición:
Fucsina básica---------- ----1 g
Acido fénico------------------5 g
Alcohol etílico 96º----------10 ml
Mezclar en un mortero hasta conseguir un homogeneizado completo; una vez ligado añadir
lentamente:
Agua destilada--------------90 ml
82
Colorante para flagelos de Leifson
Solución A
Fucsina básica ........................................1,2 g
Etanol 95 %.............................................100 ml
Solución B
Ácido tánico.............................................3 g
Agua destilada........................................100 ml
Solución C
Cloruro sódico..........................................1,5 g
Agua destilada.........................................100 ml
Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se

guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas.
Soluciones para prueba de Voges Proskauer:
Solucion A
5% de α-naftol en etanol absoluto.
Solución B
Hidróxido de Potasio al 40%
Tinción especial de esporas
Técnica: 1. realizar frotis y fijación de la muestra

2. cubrir el frotis con papel filtro
3. teñir con verde malaquita a emisión de vapores por 10 a 15 min
4. dejar enfriar el porta objeto y lavar con agua
5. teñir con safranina por 1 min
6. lavar con agua y dejar secar al aire
7. observar al microscopio con objetivo de inmersión
Fundamento de la tinción de esporas. Las endoesporas son estructuras de resistencia a

condiciones adversas como por ejemplo: altas temperaturas, radiaciones UV, etc. Como
estructuras de resistencia, poseen, entre otras características, tres gruesas cubiertas protectoras,
las cuales las hacen impermeables a los colorantes. Debido a esto, para teñir una endoespora es
necesario aplicar el colorante con calor para “ablandar” sus capas protectoras. Además, el
colorante vaporizado penetra, los microporos que se forman con el calor, más fácilmente que en
estado líquido. Al enfriar y lavar el portaobjeto con agua, los microporos se cierran quedando el
colorante (verde malaquita), atrapado dentro de la endoespora. Finalmente, en esta tinción se usa
un colorante de contraste, la safranina, que tiñe la célula vegetativa de color rojo, contrastando con
las endoesporas que se observan de color verde.
83
Anexo 2. Estructura y manejo del microscopio óptico

Introducción
El microscopio, de micro- (pequeño) y scopio (observar), es un instrumento que permite observar

objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común es el
microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o varias lentes que
permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.
La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.
Estructura del microscopio óptico
A. Oculares
B. Revolver
C. Objetivos
D. Platina
E. Tornillos para desplazar la
preparación sobre la platina
en sentido longitudinal y
transversal
F. Condensador
G. Tornillo macrométrico
H. Tornillo micrométrico
I. Diafragma Iris
J. Tornillo para regular el tornillo
del Condensador
K. Interruptor
L. Regulador de intensidad de
luz
M. Pinzas para ajustar la
preparación sobre la platina
N. Pie o soporte
Parte mecánica del Microscopio
Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en él se encuentra la fuente de iluminación.
Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio
que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el
portaobjetos con la preparación, y unas escalas que ayudan a conocer qué parte de la muestra se
está observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la
misma, que permiten desplazar la preparación sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal
respectivamente.
84
Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y
objetivos.
Revólver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos.
Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomar el microscopio para
trasladarlo de lugar.
Tornillo macrométrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la

muestra al utilizarse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma
perceptible.
Tornillo micrométrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez
que se ha realizado el enfoque con el macrométrico. También desplaza verticalmente la platina,
pero de forma prácticamente imperceptible. Es el único tornillo de enfoque que se utiliza, una vez
realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento.
Parte óptica del Microscopio
Oculares: son los sistemas de lentes más cercanos al ojo del observador, situados en la parte
superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se
reseña en la parte superior de los mismos (normalmente 10X. Dependiendo de que exista uno o
dos oculares, los microscopios pueden ser mono o binoculares.
Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo,
mediante el revólver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma
creciente según sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo
de los aumentos de cada objetivo, que también van reseñados en el lateral del mismo. Algunos
objetivos no enfocan bien la preparación al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersión
(normalmente van marcados con un anillo rojo).
Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la
preparación, de manera que proporciona mayor o menor contraste. Se regula en altura mediante
un tornillo (letra J de la figura).
Fuente de iluminación: el aparato de iluminación está constituido por una lámpara halógena de
bajo voltaje (12V), situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un
reflector que envía los rayos luminosos hacia la platina.
Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminación. Abriéndolo o cerrándolo permite

graduar la intensidad de la luz.
Regulador de intensidad de luz: es un potenciómetro para regular la intensidad de la luz (letra L

de la figura).
Montaje y enfoque de una preparación microscópica
Antes de observar la preparación al microscopio, esta debe de ser montada sobre vidrio. Para ello
existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que, como su nombre indica, es el
soporte sobre el que va la muestra, y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la
muestra, Una vez colocada la muestra en el portaobjetos.
Enfoque del microscopio
Los pasos a seguir para la perfecta utilización del microscopio son las siguientes:
85
1. Enchufar el microscopio a la corriente (SIEMPRE QUE NO SE ESTÉ MIRANDO POR EL

MICROSCOPIO HAY QUE APAGAR LA LUZ).
2. Con el mando macrométrico hay que separar lo máximo posible la platina del tubo, o sea,
bajar la platina. A continuación, se coloca y ajusta una preparación.
3. Colocar la preparación sobre la platina deteniéndola con el sujetador de portaobjetos (letra M
de la figura), de forma que la estructura a observar quede en el orificio central de la platina.
4. Poner el objetivo de menor aumento cuyo amplio campo visual facilita el hallazgo de
estructuras importantes.
5. Subir la platina accionando el tornillo macrométrico y mirando la preparación desde fuera
hasta alcanzar el tope superior. En ningún caso tocar la preparación con los objetivos.
6. Mirando por los oculares, bajar lentamente la platina con el tornillo macrométrico hasta
conseguir ver el objeto lo más nítido posible.
7. Ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico hasta verlo claramente.
8. Para observar la preparación a mayores aumentos cambiar de objetivo con un simple giro del
revólver (SIN MOVER EN NINGÚN CASO EL TORNILLO MACRO). Las pequeñas
variaciones que se observen en el enfoque se producen al cambiar de objetivo y se corrigen
con el micro.
9. Para observar otros campos, desplazar la preparación moviendo los tornillos de la platina.
Para cambiar la preparación:

 Bajar la platina
 Colocar el objetivo de menor aumento
 Quitar la preparación y colocar la siguiente
Cálculo del sistema de aumentos:

Situado un determinado objetivo del revólver en la posición próxima a la muestra, multiplicar el
número que aparece en él por el del ocular.
nº objetivo x nº ocular = nº total de aumentos
Mantenimiento del microscopio
El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo.
Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa
plástica o campana de vidrio.
Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede
humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que
hayan caído sobre las citadas partes.
La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse
papel "limpiante" que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio. Nunca deben
tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican
la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas.
Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con éter y luego
pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro que queda sobre la lente
frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de finalizada la
observación. Para ello se puede pasar el papel "limpiamente" impregnado con una gota de xilol.
Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado
hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con
alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la
formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias químicas que producen emanaciones
fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.
86
Anexo 3. Interpretación de pruebas bioquímicas para bacterias

Gram negativas
El presente material didáctico se elaboró con la finalidad de facilitar a los alumnos, la interpretación
de las pruebas bioquímicas, empleadas durante el proceso de identificación de los diferentes
géneros bacterianos, aislados en las muestras procesadas durante las prácticas impartidas como
apoyo a los diferentes módulos y áreas integradoras.
TSI
Composición básica:
Glucosa, lactosa, sacarosa
Rojo de fenol
Sulfato ferroso
1 2 3 4 5 6
Fermentación de: Glucosa, Lactosa, Sacarosa.
No fermentación de Glucosa, Lactosa, Sacarosa.
Producción de ácido sulfhídrico (H2S).
87
CITRATO
NORMAL (+) UTILIZACIÓN DE (-) NEGATIVO

CITRATO COMO ÚNICA
FUENTE DE CARBONO
UREA
Determinar la habilidad de los microorganismos de hidrolizar la urea, por acción de la enzima
ureasa, con producción de amoníaco y CO2.
NORMAL (+) POSITIVO (-) NEGATIVO
NH2
||
COOH + CO2 2NH3
||
NH2
88
FENILALANINA (PD)
La fenilalanina es convertida por desaminación oxidativa en ácido fenil-pirúvico, el cual es
identificado por la incorporación de 5 gotas de cloruro férrico, observándose una coloración
verdosa.
NORMAL (+) POSITIVO (-) NEGATIVO
S I M
Normal H2S (Ácido sulfhídrico) indol color rojo

Negro
Cuando se agregan 5 gotas de cloroformo y 5 gotas de reactivo de Kovac’s. El indol se forma a

partir de la degradación del triptófano.
Movilidad
POSITIVO: Opacidad del medio.
NEGATIVO: Color amarillo transparente.
89
GELATINA
Determina la acción proteolítica de la enzima bacteriana sobre la proteína de la gelatina,
alterando su estructura química.
Después de refrigerarse cuatro minutos
NORMAL (+) LICUEFACCIÓN (-) MEDIO SÓLIDO
90
MR-VP
MR:
Agregar 4 gotas de ROJO DE
METILO
ROJO (+) AMARILLO (-)
VP:
Agregar 12 gotas de “sol. A”,
agitar.
Agregar 4-5 gotas de “sol. B”;
agitar y reposar 15 minutos.
(+)ANILLO ROJO = POSITIVO (-) CAFÉ = NEGATIVO
91
TINCION DE GRAM
(Modificada)
1. Fijar al calor la preparación pasándola 2 a 3 veces por la flama del mechero.
2. Agregar gotas de Cristal violeta más solución sensibilizante en la misma cantidad, esperar 20
seg., lavar y escurrir.
3. Agregar gotas de mordiente yodo, esperar 20 segundos, lavar y escurrir.
4. Agregar gotas de alcohol cetona, espera 5 a 10 segundos, lavar y escurrir.
5. Agregar gotas de fucsina básica, esperar 20 segundos, lavar y escurrir.
6. Dejar secar el frotis, observar al microscopio con lente de 100X, agregar aceite de inmersión.
Observación
Formas Moradas = Gram. (+)
Formas Rojo naranja = Gram. (-)
92
BIBLIOGRAFÍA
Bailey-Scott Diagnóstico Microbiológico. Finegold-Martin. Editorial Médica Panamericana.
Diagnostico Biológico. Texto y Atlas Color Koneman/ Allen/ Dowell/ Sommers, Editorial Médica
Panamericana S.A. 1985.
Fundamentos y Técnicas de Análisis Microbiológicos. Gustavo A. Díaz Martín Profesor

Técnico de Formación Profesional Curso 2008-2009, I. E. S. Jaime Ferrán Clúa San Fernando de
Henares. (28830 Madrid) Código 28038616.
Introducción a la Microbiología. John L. Ingraham/ Catherine A. Ingraham. Editorial Reverté,

S.A., 1998.
Manual de Practicas de Microbiología. Tecnológico de Morelia. Q.F.B. Irma Hernández Tovar.
Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz/ C. Gamazo/ I. López-Goñi. 2a edición. Editorial:

Masson.
Microbiología. Pelczar/ Reid/ Chan. 4a edición, Editorial: Mc Graw Hill.
Microbiología de Laboratorio. Dr. L. Jack Bradshaw. Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Mac Faddin

Editorial Médica Panamericana S.A. 1984.
Tablas del material didáctico para las Prácticas en el Área de Bacteriología de la Escuela de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UMSNH. Q.F.B. Irma Rentería Solórzano y Q.F.B.
Rosalva Mejía Alfaro.
93

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”

Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica

Q.F.B. Miriam Rosa María López Nieto

D.C. Mariana Álvarez Navarrete

M.C. Ivone Huerta Aguilar

Director del Instituto

Jefe del Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica

Titular de la Asignatura de Microbiología

Primera Edición: 2015

El objetivo general del curso práctico de Microbiología es que el alumno se inicie en el

Reglamento general de los laboratorios de la carrera de Ingeniería

1. Los equipos de trabajo serán de dos personas.

 Indicar el número y nombre de la práctica.

Manejo del material y equipo

1. Se prohíbe realizar manipulaciones con equipo o materia del cual se desconozca su

Actividades que no deben realizarse dentro del laboratorio

1. Alterar el orden, gritar y distraerse durante las horas de práctica.

Reposición del material por extravío o destrucción

Cuando ocurra extravío o destrucción de material o equipo, se deberá reponer en un plazo no

Continuación de prácticas no concluidas

Recomendaciones para el estudiante

Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio

1. Bata de laboratorio limpia y con botones.

Práctica No. 1. Esterilización de material utilizado en el

La esterilización es el proceso de eliminación de toda forma de vida, incluidas las esporas. Es un

La pre-esterilización es un procedimiento en la que el material debe responder a la condición de

Figura 1. Métodos de esterilización más comunes.

1. El estudiante aprenderá y comprenderá las diferentes técnicas de manejo, preparación y

2. El estudiante observará el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la

3. El estudiante desarrollará la capacidad de tomar decisiones para aplicar la técnica más

REACTIVOS, MATERIAL Y EQUIPO

 Cajas de Petri  Gasa

1. Definir los siguientes términos: esterilización, desinfección, desinfectante, sanitizante,

Práctica No. 2. Preparación y esterilización de medios de cultivo

El cultivo de microorganismos en el laboratorio es fundamental para conocer, comprender,

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El material nutritivo en el cual se hace crecer el microorganismo en el laboratorio se llama medio de

Composición de un medio de cultivo

Tabla 1. Componentes básicos de un medio de cultivo.

Fuente de: Autótrofos Heterótrofos Función

De acuerdo a su uso, los medios de cultivo se clasifican en:

a) mediante pases periódicos de placa a placa,

 Emplear medios de cultivo deshidratados o a partir de cada uno de sus constituyentes

Almacenamiento de los medios de cultivo

Esterilización de medios de cultivo

La esterilización por calor húmedo

Esterilización por filtración

Para realizar la filtración se usan membranas o filtros de vidrio como se ve en la Figura 2.

REACTIVOS, MATERIAL Y EQUIPO

 Medio de cultivo EMB  Espátula

7. Los medios de cultivo preparados se incubarán a 35 °C por 24 h y posteriormente se

Esterilización por filtración:

Medios de cultivo vertidos en placas:

Medios en tubos de ensayo:

1. ¿Qué son las bacterias?

Práctica No. 3. Técnicas de siembra y aislamiento de cultivos

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