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COAGULACION.
Técnicas de Coagulación.
Materiales:
Lanceta comercial.
Papel de Filtro.
Cronómetro
La prueba mide:
Lecho vascular.
Plaquetas: a) Cualitativamente.
b) Cuantitativamente.
Retracción del coágulo
Fundamento:
La retracción normal del coágulo, precisa de plaquetas adecuadas, tanto cuantitativa
como cualitativamente, y está afectada por la trombostenina, que es una proteína
plaquetaria contráctil.
Equipo:
Baño de María
Objetivo:
Evaluar la cantidad y calidad de las plaquetas.
Desarrollo de la técnica:
Los tubos empleados para el tiempo de coagulación en sangre total se dejan en el baño
de agua a37 y se examinan1-2 hras después de coagular para que la retracción sea la
adecuada.
Interpretación:
La retracción del coágulo está deteriorada en trombocitopenias graves, tromboastenia
de Glanzman, policitemia, hipofibrogenemia y fibrinolisis. Una retracción del coágulo
deteriorada implica un coágulo frágil, débil e irregular y acompañado de un
desprendimiento y deposición aumentada de hematíes. La correlación entre la
retracción del coágulo y el contage de plaquetas es pobre, puesto que una
trombocitopenia puede no alterar el resultado de la prueba. La retracción del coágulo
de sangre total, es inversamente proporcional al hematocrito, la anemia lo acelera y la
eritrocitosis lo retarda.
Valores normales:
La retracción del coágulo se inicia 30 – 60 min después de coagular la sangre, y se
completa en dos horas, tiempo en el coágulo debe haberse retraido por lo menos de tres
lados del tubo, si fuera necesario hasta 6, 12 ó 24 horas.
La retracción del coágulo se informa como:
Retráctil.
Hiporetráctil.
No retráctil.
Desarrollo de la técnica:
Se punciona el pulpejo del dedo, desechando las dos primeras gotas, tomar de
una gota de sangre, hasta la marca 1 de la pipeta de Thomas, para glóbulos
rojos, completando hasta la marca 101, con oxalato de amonio al 1 %, quedando
así una dilución 1:100 (20µl de sangre total en 2 ml de diluente).
Dejar en reposo de 5 a 10 mints. Agitar desechando las primeras gotas, montar
una cámara contadora de Neubauer, dejar en reposo en cámara húmeda de 5 a
10 mints. para sedimentar las plaquetas.
Posteriormente se cuenta el cuadriculado central completo y se multiplica el
número de células por 1000 o se le agrega al No. contado x 109/l.
Valores Normales:
(Dilución 100) x (altura de cámara) = 1000 ó UI 150 – 350 x 109/l
(10)
Bibliografía:
Brecher. G. Crombite E/P. Morphology and anumeration of human blood platelets J.
Appl Physol 3: 365 1950.
Fundamento:
Cuando en un plasma citratado le agregamos un exceso de tromboplastina y lo
recalcificamos, el tiempo que demora en formarse el coágulo lo podemos tomar como
índice de concentración de los factores que intervienen en la fase extrínseca de la
coagulación (I, II, V, VII, X).
La protombina llamada también factor II, se sintetiza en el hígado; siendo uno de los
factores Vitamina k dependiente (factor II).
Los anticoagulantes que inhiben los factores dependientes de la vitamina k son los
Dicumarínicos (II, VII, IX, X, proteína C y proteína S).
El calcio actúa en forma iónica y no se consume en el proceso de la coagulación.
El citrato previene la coagulación por extracción del calcio de la sangre, mediante
precipitación o unión en forma no ionizada.
Objetivos:
Medir la fase extrínseca de la coagulación sanguínea.
Materiales:
Copillas del Coagulógrafo desechables ó tubos de 12x75 mm.
Pipetas de cristal de 1 ml o automáticas de 100 µl.
Reactivos:
1. Citrato de Sodio (3,8%)
2. Cloruro de Calcio ( 0,025M)
3. Tromboplastina tisular de cerebro humano (curva patrón cada vez que se
prepare)
Equipo:
Baño de María ó coagulógrafo.
Toma de muestra:
Se hace una dilución de 1:10 con citrato de sodio (3,8%), o sea se toma 1 ml de citrato
de sodio (3,8%) para 9 ml de sangre total y se centrífuga a 3500 rpm durante 20 mint.
Desarrollo de la Técnica:
En un tubo añadir:
Valores Normales:
Hasta 3 seg por encima del control.
Bibliografía:
Quick, A. J. Amen. J. Clin Path. 10. 222. 1940
Fundamento:
Al poner en contacto un plasma citratado con el polvo de Kaolín este último es capaz de
activar en un determinado tiempo al Factor XII (factor de contacto) que a su vez en
presencia de fosfolípidos mas un buffer regulador de Ph y aportándole calcio se forma
un coágulo que estará en relación con los factores que intervienen en la fase intrínseca
de la coagulación.
Objetivo:
Este método mide la actividad procoagulante de la fase intrínseca de la coagulación
sanguínea.
Materiales:
Copillas del Coagulógrafo desechables ó tubos de 12x75 mm.
Pipetas de cristal de 1 ml o automáticas de 100 µl.
Reactivos:
1. Citrato de Sodio (3,8%).
2. Cloruro de Calcio ( 0,025M).
3. Solución de Kaolín (0,5%) en tampón de Imidazol, Salina 0,05 M, Ph: 7,35 o
Buffer Veronal.
4. Cefalina humana.
Equipo:
Baño de María ó coagulógrafo.
Toma de muestra:
Se hace una dilución de 1:10 con citrato de sodio (3,8%), o sea se toma 1 ml de citrato
de sodio (3,8%) para 9 ml de sangre total y se centrífuga a 3500 rpm durante 20 mint.
Desarrollo de la Técnica:
Valores Normales:
Hasta 10 seg por encima del control y 6 seg por debajo del control.
Disponibilidad del Factor plaquetario III. (HARDISTY)
Fundamento:
La incubación del PRP citratado con Kaolín hace posible que alrededor de un 50%
de los fosfolípidos plaquetarios sean aprovechados para coagulación. La máxima
aceleración de la formación del coágulo, inducido por el Kaolín requiere que las
plaquetas y los factores del plasma sean activados simultáneamente.
Objetivos:
Medir la función plaquetaria.
Materiales:
Tubos de 12x75 mm.
Reactivos:
Kaolín de 5 mg con agua.
Cloruro de Calcio (0.033 M)
Desarrollo de la Técnica:
1. Centrifugar a 1500 rpm por 10 mint. para obtener el PRP del paciente y del
control.
2. Decantamos parte del plasma entubos plásticos o siliconados.
3. Se vuelve a centrifugar la sangre restante a 3000 rpm durante 30 mints. para
obtener el PPP del paciente, procediendo de igual forma con el control normal.
4. Se preparan 4 tubos de Kaolín en Baño de María a 37oC procediéndose con cada
una de las muestras y los controles de la forma siguiente.
TUBOS 1 2 3 4
PRPC 0.1 0.1
PRPP 0.1 0.1
PPPC 0.1 0.1
PPPP 0.1 0.1
Valores Normales:
3 seg. sobre el control.
Muestra:
9 ml de sangre.
Reactivos:
1 ml de Citrato (3,8%).
Desarrollo de la Técnica:
1. Se pone a temperatura ambiente hasta obtener 1 ml (aproximadamente 1 hora).
2. Hacer conteo de plaquetas a ese plasma.
3. PPP de Control (Pool).
4. Preparar dos tubos ( 1 control y 1 paciente)
entonces: X= 400
5
X= 80%
Preparación de Trombina.
Preparación:
Se le agrega al frasco 100 ml de agua dstilada (Matriz).
A partir de aquí para preparar:
Trombina 50 u: 2,5 ml de matriz más 22,5 ml de agua destilada.
Trombina 20 u: 1 ml de matriz más 24 ml de agua destilada.
Trombina 10 u: 1 ml de matriz más 48 ml de agua destilada.
Preparación de Tromboplastina. (Tromboplastina de cerebro con solución salina
fisiológica).
Preparación de la Tromboplastina:
100 gr de placenta.
150 ml de Salina buffereada a 370C - 390C.
Mezclar después de dos horas de incubación con la salina buffereada.
Centrifugar 30 mints a 3000 rpm.
Filtrar.
Con el sobrenadante de la centrifugación o con el resultado de la filtración,
utilizarlo para realizar TP a plasmas de pacientes normales.
Nota: el TP debe dar entre 10- 14 seg.
Nota: si el TP da < 19 seg. añadir salina buffereada hasta obtener TP > 10 seg.
Dispensar la tromboplastina en pequeñas alícuotas y almacenar a - 200C
en tubos o viales plásticos.
Introducción:
La detección del anticoagulante lúpico se ha convertido en un procedimiento de rutina
en los laboratorios de coagulación. EL Anticoagulante Lúpico (AL) al igual que el resto de los
anticoagulantes antifosfolipídicos se ha asociado al tromboembolismo venoso y arterial,
trombocitopenia y abortos espontáneos recurrentes, son un grupo heterogéneo de anticoagulante del
tipo IgG y/o IgM y existe la hipótesis de que esta familia de anticoagulantes presentan una afinidad
variable por complejos formados por proteínas y fosfolípidos.
Dada la heterogenicidad de su conducta se ha planteado que un solo ensayo no es suficiente para su
identificación. En estudios comparativos de los diferentes métodos usados para su determinación han
señalado el tiempo de coagulación con kaolín y el tiempo de veneno de víbora de Russell como
particularmente sensibles al AL.
Fundamento:
Se basa en la determinación del tiempo de coagulación de un plasma libre de contaminación con
fragmentos de plaquetas en presencia de un activador (kaolín )y omitiendo el sustituto plaquetario, lo
que lo hace sensible a la presencia de AL.
Muestra
Plasma pobre libre de plaquetas.
Medidas de seguridad:
La extracción debe ser limpia, no traumática, desechándose toda muestra
hemolizada o con mallas de fibrina.
Evitar la formación de burbujas de aire en la jeringuilla y verter la sangre con
cuidado en el tubo que contiene el anticoagulante e invertir rapidamente.
Centrifugar lo antes posible después de extraída la muestra y decantar el plasma
rápidamente.
Es esencial realizar la doble centrifugación del plasma durante el tiempo
establecidoya que es importante obtener un recuento de plaquetas inferior a
10x109/l.
El controlnormal debe ser rigurosamente preparado al igual que el plasma del
paciente.
Esta prueba deberá realizarse de ser posible con plasma fresco, de utilizarse
plasma congelado deberán extremarse los cuidados de en su preparación.
Mantener el plasma en frío (40C) hasta la realización de la técnica.
Hacer la determinación en las 3 horas siguientes a laextracción, de lo contrario
congelar el plasma rapidamente a – 700C.
Chequear la temperatura del baño de maría.
Chequear que el material esté perfectamente limpio.
Mezclar bien la solución de Kaolín antes de usar.
Si se realiza la técnica manual, mover el tubo con un ángulo fijo y
uniformemente.
Respetar los tiempos de incubación.
Materiales:
Jeringuillas plásticas de 10 ml con aguja de 20.
Tubos de 12 x 75 mm.
Tubos plásticos graduados.
Cronómetro.
Centrífuga.
Baño de María a 370C.
Pipetas.
Gradillas.
Torundas de gasa o algodón.
Alcohol.
Reactivos.
Citrato de sodio 3,8%.
Tampón de Owren:
5,825 gr de dietilbarbiturato de sodio. ( No.47)
7,335 gr de Cloruro de Sodio. (No. 51)
Disolver en 750 ml de agua desionizada.
Añadir HCL (0,1 molar) hasta alcanzar un Ph de 7,35.
Llevar volumen hasta 1000 ml con agua desionizada.
Kaolín 5 mg/ml en tampón de Owren: pesar 2 gr de kaolín llevar a 100 ml con
tampón de Owren.
CLCa (0,025 M).
Procesamiento técnico:
Extraer sangre por punción venosa con citrato de sodio al 3,8% en una
proporción de 1:10.
Invertir el tubo rápidamente de forma suave.
Centrifugar por 15 min. a 4000 rpm.
Decantar el plasma a un tubo de centrífuga plástico evitando perturbar la
interfase célula-plasma.
Volver a centrifugar el plasma por 15 mint a 4000 rpm.
Decantar en tubo plástico .
Preparar un control normal de la misma forma que el plasma del paciente.
Colocar 0,2 ml de plasma del paciente o control en un tubo de ensayo a37C.
Adicionar 0,1ml de Kaolin,agitar por inclinación suave del tubo.
Incubar durante 3 min. a 37C ,pasado los cuales se añade 0,2ml de
ClCa(0,025M).Poniendo en marcha simultáneamente el cronómetro.
Agitar suavemente y a los 60 seg sacar el tubo del baño y mirar la formación
del coágulo.
Realizar el mismo procedimiento con una mezcla constituida por una parte de
plasma del paciente y 4 partes del plasma normal.
Interpretación
Calcular la relación de los tiempos de coagulación del plasma del paciente y el plasma
normal y la relación de los tiempos de la mezcla 4:1 y el plasma normal como sigue:
Relación de la =T de coagulación del plasma del paciente(seg)
prueba T de coagulación del plasma normal control(seg)
Medidas de bioseguridad
Control de Calidad:
-Plan de mantenimiento y revisión de equipos por el departamento de electromedicina
-Técnicas de control de calidad del procedimiento :
a) Todas las determinaciones deberán hacerse por duplicado y la diferencia entre
estos no deberá exceder del 10%
b) Con cada grupo de muestras de paciente debe realizarse la técnica con una
mezcla de plasmas normales o un plasma normal adecuadamente preparada.
(como se indica en el procedimiento,un tiempo de coagulación en el control
inferior a 60 seg.sugiere contaminación con fragmentos plaquetarios e invalida el
resultado.
Condiciones de almacenamiento y conservación de reactivos
Los reactivos químicos se conservan en el estante dispuesto al efecto.
La cefalina se almacena a menos 300 C.
La solución de Kaolín es estable a temperatura ambiente al igual que CACL2
La mezcla de plasmas normales se guarda a menos 300 C.
Bibliografía:
Exuer T. , Richard A, Kronberg H A sensitive test demonstration lupus anticoagulant
and its behavioural patterns Br J Hematology 40: 143,1978.
Mach in SJ,Gedding JC,Greave M, Hutton RA, Mackine IJ, Malia RJ, Tobernes DA.
Guidelines on testing for the lupus anticoagulants , I Clin Pathol 44: 885,1991.