UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Dosagem de proteína e determinação da

atividade enzimática do lisado de
Saccharomyces cerevisiae

Disciplina: QBQ1453 – Bioquímica Experimental

Docentes: Fabio Luís Forti
Ronaldo Bento Quaggio

Grupo 13:
Letícia
Rafael
Thainá

São Paulo, 19 de setembro de 2017

1. Objetivos

A presente prática tem como objetivo introduzir a técnica de dosagem de

proteínas utilizando um corante (Comassie Blue G-250) capaz de formar
complexos estáveis com as cadeias laterais de aminoácidos essenciais para a
formação de proteínas. Para a detecção tem-se como objetivo utilizar a
colorimetria, baseada nas propriedades de absorção de luz de produtos
coloridos resultantes de reações entre o complexante e os compostos de
interesse. (incluir neste texto os objetivos da prática 4 tbm)

2. Resultados e discussão

Para conseguir dosar as proteínas do lisado de Saccharomyces

cerevisiae, foi preciso antes construir uma curva padrão com soluções de
concentrações diversas de albumina na presença do reagente de Bradford. Este
último é um composto muito importante para dosagem, pois complexa-se com
cadeias laterais de lisina, arginina, tirosina ou triptofano, formando um composto
que absorve luz à 595 nm, podendo ser usado como indicador colorimétrico. A
Tabela 1 mostra os resultados obtidos na leitura da absorbância a 595 nm das
soluções das soluções de albumina.

Tabela 1 – Valores das absorbâncias a 595 nm para as soluções de albumina

Massa de Abs595
Tubos
proteína (mg) 1 2 ẋ
1 0,002 0,120 0,144 0,132
2 0,004 0,172 0,138 0,155
3 0,006 0,258 0,298 0,278
4 0,008 0,282 0,332 0,307
5 0,010 0,373 0,392 0,383
6 0,012 0,483 0,515 0,499
7 0,014 0,529 0,555 0,542
8 0,016 0,632 0,652 0,642
 Para todos os valores de absorbância, foi calibrado o equipamento
utilizando um branco contendo apenas água e reagente de Bradford com o
objetivo de eliminar as interferências da matriz da solução. A Figura 1 mostra a
curva padrão da proteína, apresentando a absorbância em função da massa de
proteína.

Figura 1 – Curva padrão de proteína

A curva padrão construída é do tipo A = ma + b onde “A” é a absorbância

lida, “m” é a massa de proteínas, “a” o coeficiente angular igual a 37,164 e “b” o
coeficiente linear igual a 0,0327. Sabendo que o R2 desta reta foi de 0,9848,
pode-se dizer que o modelo é explicativo, e se ajusta bem à amostra.
Após a leitura da absorbância da curva, foram preparadas 4 soluções de
concentrações diversas a partir uma alíquota 100 vezes diluída da amostra
original de lisado da levedura. A essas soluções foi adicionado o mesmo volume
de reagente de Bradford e as absorbâncias foram lidas a 595 nm em duplicata.
Os resultados obtidos estão expressos na Tabela 2.

Tabela 2 – Concentração de proteína das soluções de amostra

Massa de
Volume da [Proteína] [Proteína] no
Tubo A540’ A540’’ A540m proteína Diluição
amostra (mL) (mg/mL) lisado (mg/mL)
(mg)
A1 0,239 0,234 0,237 0,0055 0,10 0,0548 100 5,4838
 A2 0,181 0,167 0,174 0,0038 0,05 0,0760 100 7,6041
A3 0,104 0,096 0,100 0,0018 0,03 0,0604 100 6,0363
A4 0,095 0,103 0,099 0,0018 0,02 0,0892 100 8,9199

A tabela apresenta a massa de proteína da amostra calculada a partir dos

valores médios de absorbância e, sabendo os volumes de amostra utilizados no
preparo das soluções, é possível calcular a concentração das amostras e do
lisado original.
Observando os valores médios das absorbâncias das soluções A3 e A4,
de 0,099 e 0,100, respectivamente, é possível perceber que eles se encontram
fora da região de linearidade da solução, compreendida entre 0,132 e 0,642,
sendo assim, esses pontos são desconsiderados no cálculo da concentração de
proteína no lisado.
Com esses valores apresentados, pode-se calcular a média das
concentrações das proteínas no composto, com o objetivo de encontrar
resultados mais aproximados à realidade. Considerando os dados que se
enquadraram na linearidade obtida, obtém-se 6,5439 mg/mL de proteínas no
lisado clarificado.
Para poder então determinar a atividade enzimática da α-glicosidase
presente no lisado da levedura, primeiro foram feitas as diluições da amostra em
10, 50 e 250 vezes. A partir destas soluções, foram preparadas quatro amostras
na presença do substrato p-nitrofenil-α-glicosídeo para serem encubadas a 30ºC
a diferentes tempos, incluindo os brancos. Os resultados obtidos estão
expressos na tabela 3.

Tabela 3 – Resultados obtidos nas análises espectrofotométricas

A420
Tubos
L10X L50X L250X
1 1,945 1,189 0,292
2 2,120 1,173 0,505
3 1,932 1,756 0,740
4 1,978 1,878 0,802
Branco Enz. 0,100 0,059 0,062
Branco Sub. 0,051
 Tendo os valores das absorbâncias das soluções de p-nitrofenol
fornecidos pelo professor (tabela 4), é possível gerar a curva de calibração desta
substância, como foi demonstrado na figura 2, para poder, então, calcular a
massa de produto nas amostras.

Tabela 4 – Absorbâncias das diferentes soluções de p-nitrofenol

Volume de p- Número de mol
A420
nit 5mM (μl) de p-nit (ηmol)
1 5 0,08
5 25 0,15
10 50 0,37
20 100 0,45
30 150 0,50
40 200 0,65
50 250 0,88
60 300 1,04
70 350 1,18
80 400 1,37
90 450 1,40
100 500 1,41
110 550 1,60
120 600 1,83
130 650 1,86
140 700 1,94
150 750 1,99
160 800 2,02
170 850 2,03
180 900 2,10
190 950 2,21
 Curva padrão de p-nitrofenolato
3

2,5

2
Absorbância

1,5

0,5

0
0 200 400 600 800 1000
Numero de mol de p-nitrofenolato (ηmol)

Figura 2 – Curva padrão de p-nitrofenolato

Esta curva padrão também é do tipo A = ma + b onde “a”, o coeficiente

angular, é igual a 0,0023 e “b”, o coeficiente linear, é igual a 0,2615. Esta curva
também é um modelo bem explicativo, uma vez que o R2 obtido é de 0,9642.
Com a curva padrão agora é possível calcular a quantidade produto, ou
seja, de p-nitrofenol nas amostras, como demonstrado na tabela 5. Os valores
de absorbância utilizados já tiveram os brancos devidamente descontados.

Tabela 5 – Numero de mols de produtos

L10x L50x L250x
Tempo
Tubos Produto Produto Produto
(min) A420 A420 A420
(nmol) (nmol) (nmol)
1 5 1,794 666,30 1,079 355,43 0,179 -35,87
2 10 1,969 742,39 1,063 348,48 0,392 56,74
3 15 1,781 660,65 1,646 601,96 0,627 158,91
4 20 1,827 680,65 1,768 655,00 0,689 185,87

Pode-se construir um gráfico a partir dos dados de tempo de incubação

versus mols de produto (Figura 3). A inclinação da reta corresponde à velocidade
da reação e pode ser diretamente convertida em unidades de atividade
enzimática.
 Numero de mols x tempo de incubação
0,8000

Numero de mols de produto (µmol)

0,7000
0,6000
0,5000 L10x
0,4000
L50x
0,3000
L250x
0,2000
0,1000
0,0000
0 5 10 15 20 25
-0,1000
Tempo (min)

Figura 3 – Gráfico do numero de mols versus o tempo de incubação para as

três diluições

Para a solução diluída 10 vezes foi obtido uma reta com o coeficiente
angular de -0,0008 e coeficiente linear de 0,6972 com um R2 de 0,0177. Para a
solução diluída 50 vezes o coeficiente angular da reta obtida foi de 0,023 e o
coeficiente linear de 0,2022 com um R2 de 0,8521. Por sua vez, a solução diluída
250 vezes teve uma reta cujo coeficiente angular foi de 0,0153 e coeficiente
linear de -0,1 com um R2 de 0,9535.
Nestas equações, o coeficiente angular é a inclinação da reta e, portanto,
equivale a atividade enzimática dada em micromols por minuto (µmol/min) ou
unidade de atividade enzimática (U).
A diluição de 10 vezes obteve uma reta praticamente paralela ao eixo x,
isso indica que houve um consumo excessivo de substrato e ele se tornou um
limitante de modo que a velocidade da reação catalisada pela enzima deixou de
ser constante. A diluição de 50 vezes apresentou uma reta com um R2 baixo,
sendo possível perceber que os pontos se distribuem em forma de uma curva
hiperbólica o que também sugere que o substrato se tornou limitante ao decorrer
do tempo de modo que a velocidade da reação também variou. Essas hipóteses
podem ser confirmadas uma vez que a reta obtida para a solução mais diluída
se mostrou satisfatoriamente linear, indicando que as soluções 10 e 50 vezes
diluídas não estavam mais em condições de velocidade inicial, sendo assim,
suas inclinações não poderão ser utilizados para o cálculo da atividade
enzimática. A concentração de atividade enzimática (U/mL) da amostra é obtida
levando em consideração o volume de amostra utilizado em um tubo de ensaio
e a diluição prévia, como foi demonstrado na tabela 6.

Tabela 6 – Atividade enzimática das amostras

Atividade [Atividade
Volume da [Atividade
enzimática Diluição enzimática] do
Amostra amostra enzimática] da
da amostra prévia lisado original
(mL) amostra(U/mL)
experimental (U) (U/mL)
L250x 0,0153 0,2 0,0765 250 19,125

Sabendo que a concentração da atividade enzimática do lisado original é

19,125 U/mL e que a concentração de proteínas total da célula é 6,5439 mg/mL,
conforme calculado na primeira parte deste relatório, é possível dividir um pelo
outro e obter a atividade específica da enzima. Sendo, neste caso, igual a 2,9225
U/mg.

De acordo com os resultados mostrados acima, ainda se vê que os

números podem apresentar diferenças em relação aos ideais, explicitando
características não só de falhas inerentes a qualquer experimento, como erros
sistemáticos, tanto de execução, quanto instrumental, mesmo que leves. Um dos
problemas que pode ocorrer é a desnaturação de algumas das proteínas
presentes na célula, devido à exposição à temperatura ambiente por tempo
maior que o indicado, tanto no processo de lise quanto na análise acima exposta.
Outro fator a ser levado em consideração são os erros instrumentais, onde
o grupo se utilizou de um equipamento que apresentava, durante a prática, uma
descalibragem frequente dos valores de branco, o que leva a possíveis erros na
construção não só da curva de calibração, (usada para embasamento de todos
os valores) assim como nas próprias medidas obtidas para as amostras em
questão.

Discutir os resultados obtidos na prática 4 e fontes de erro

 Revisar

3. Conclusão

Conclui-se que, mesmo com algumas dificuldades na utilização do

espectrofotômetro, a curva padrão construída apresentou uma boa linearidade,
o que permitiu um estudo mais preciso das amostras de lisado. As duas diluições
mais concentradas geraram valores dentro da curva, enquanto as menos
concentradas geraram valores menores que o primeiro ponto. Com isso, pode-
se perceber que a solução de lisado não possui uma quantidade excessiva de
proteínas totais, e, para uma posterior análise, seria interessante considerar ler
as absorbâncias de amostras de lisado menos diluídas.
Incluir as conclusões da prática 4

4. Referências

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6 ed. São

Paulo: Sarvier, 1995. 839p.