Universidad de Chile.

Facultad de Ciencias.
Departamento de Química.

Asignatura: Química Biológica (Laboratorio)

Práctico: Efecto de la fuerza iónica. Precipitación por salazón y cuantificación de las

Proteínas del suero sanguíneo. Efecto solubilizante del NaCl sobre las
proteínas del suero sanguíneo.

Fecha : 25 de abril de 2013.

Integrantes: Javier Valdebenito.

Sebastián Romero.

Introducción
Un aumento en la concentración de una sal estabiliza los grupos cargados de la
proteína (electrolito multivalente) aumentando por lo tanto su solubilidad. Sin embargo,
a concentraciones altas de sales neutras, disminuye la solubilidad de las proteínas.
Esto se puede deber a que a estas concentraciones, se hacen más fuertes las
interacciones proteína-proteína que las interacciones proteína-agua por la
competencia de la sal y la proteína por las moléculas de agua, haciendo que precipite.
Conocer la concentración de sal que permiten solubilizar una proteína puesto que
generalmente las proteínas precipitan o se desnaturalizan si se disuelven en agua por
lo que deben ser disueltas en soluciones salinas. El método de Biuret se basa en la
formación de complejo de Cu +2 con 4 átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos
de la proteína que da una solución violeta que absorbe a los 540nm. Este método
permite conocer la concentración de proteínas mediante espectrofotometría UV.

Resultados y análisis de resultados

Reacción de Biuret

Con el reactivo de Biuret se reconocen proteínas y péptidos cortos con dos o mas
enlaces peptídicos. Las proteínas son un una mezcla muy compleja de aminoácidos,
los que corresponden a la unidad básica de estas.

Reacción de Biuret: Esta reacción se produce en compuestos que contengan 2

grupos carbamino (-CO-NH-) unidos a través de un solo átomo de carbono o
nitrógeno, y está diseñada para detectar la presencia de proteínas, péptidos cortos y
otros compuestos que tengan 2 o más enlaces peptídicos. La reacción se basa en la
formación de un producto de color violeta que se genera por la coordinación entre los
iones Cu+2 presentes en el reactivo de Biuret, y los pares de electrones no compartidos
del nitrógeno que se encuentran como parte de los enlaces peptídicos.
 En esta reacción, una proteína más un alcalino concentrado forman un Biuret, que
corresponde a un complejo. El reactivo es una solución de CuSO 4 al 1% en solución
acuosa alcalina (NaOH). Cuando el test da positivo, se forma un complejo coordinado
entre los iones Cu+2 y los pares no coordinados del Nitrógeno presente en el enlace
peptídico (-CO-NH-) que es de color violeta.
 Curva de calibración:

Para realizar la curva de calibración, se utilizó el método de Biuret. El reactivo de

Biuret (1,5 g de CuSO4 x 5H2O + 6 g tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500
mL de agua más 300 mL de NaOH 10% y enrasar a 1 L) reacciona con el nitrógeno
del enlace peptídico, específicamente el Cu de la solución, produciendo una coloración
violácea. Se toman 4 mL del reactivo de Biuret, mL de patrón tal que la curva no
supere los 7 mg/mL y el resto de volumen se completa con NaCl 0,5 M hasta un total
de 6 mL. Los resultados de los cálculos se visualizan en la tabla 1.

Tabla 1: Cálculos para realizar la curva de calibración

Volumen Volumen suero Volumen
mg de proteínas Volumen
Tubo reac. Biuret patrón NaCl 0,5 M
a medir (curva) total (mL)
(mL) 10 mg/mL (mL) (mL)
Blanco 4,0 0,0 0,0 2,0 6,0
A 4,0 0,1 1,0 1,9 6,0
B 4,0 0,2 2,0 1,8 6,0
C 4,0 0,3 3,0 1,7 6,0
D 4,0 0,5 5,0 1,5 6,0
E 4,0 0,7 7,0 1,3 6,0

Luego, los tubos de ensayo se calentaron a 50 °C por 5 minutos y se midió la

absorbancia a 540 nm. Los datos se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Medición de curva a 540 nm.

Concentración
Tubo Proteínas Absorbancia
(mg/6 mL)
Blanco 0,0 0,000
A 1,0 0,182
B 2,0 0,296
C 3,0 0,408
D 4,0 0,485
D 5,0 0,570
 Con los datos de la columna 2 y 3, se realiza el gráfico de la curva de calibración y
su respectivo ajuste lineal.

Gráfico 1: Absorbancia v/s concentración de proteína y el ajuste lineal respectivo.

Determinación de la concentración de proteínas de suero sanguíneo y del

sobrenadante de la precipitación de la seroglobulina:

Para determinar la cantidad de proteínas totales, se adicionaron 0,2 mL de muestra

de suero sanguíneo a 4 mL del reactivo de Biuret y se completaron 6 mL de solución
con 1,8 mL de NaCl 0,5 M y se siguió el mismo procedimiento que la curva de
calibración antes de medir la absorbancia.

Por otro lado, para precipitar la seroglobulina, se tomó 0,5 mL de suero y se

adicionó 9,5 mL de una solución de (NH 4)2SO4. Se calentó a 37 °C, centrifugó y se
tomó una alícuota de 2 mL del sobrenadante al cual se le agregaron 4 mL del reactivo
de Biuret, y se siguió el mismo procedimiento que la curva de calibración antes de
medir la absorbancia.

Las mediciones de absorbancia se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: Absorbancias de muestras de suero

Muestra Absorbancia
Suero total 0,309
Sobrenadante 0,148
 Con los datos de las concentraciones obtenidos de la ecuación proporcionada por el
gráfico se realizan los cálculos respectivos, dependiendo del tratamiento de la
muestra, y se encuentra, finalmente, la cantidad de proteínas totales, seroalbúmina y
seroglobulina que había en los 2 mL de muestra de suero. El resultado final se
expresa en g/100 mL. Los resultados finales se muestran en la tabla 4.

Tabla 4: Composición de proteínas del suero sanguíneo, en g/100 mL.

concentración
concentración
concentración en 2 mL
Fracción Absorbancia proteína
(mg/6 mL) muestra (mg/2
(g/100 mL)
mL)
Suero total 0,309 2,18 65,4 3,27
Seroalbúmina 0,148 0,51 30,6 1,53
Seroglobulina* - 1,67 34,8 1,74

concentración Proteína total Porcentaje

Fracción
(mg/mL) (mg) proteína (%)
Suero total 0,363 3,63 100
Seroalbúmina 0,085 0,85 23,42
Seroglobulina* 0,278 2,78 76,58

La cantidad de seroglobulina se calcula por diferencia entre suero total y

seroalbúmina.

Conclusión
Se pudo obtener una curva de calibración mediante el método de Biuret para la
determinación de la concentración proteínas en Suero Sanguíneo.

Se pudo determinar la concentración de cantidades de proteínas totales, de

Seroalbúmina y de Seroglobulina en una muestra de Suero Sanguíneo mediante el
mismo método.

Se logró utilizar la absorbancia de la solución de suero sanguíneo en medio salino y

reactivo de Biuret para la obtención de la concentración de proteínas.

Durante esta experiencia de laboratorio, se utilizó como disolvente una solución

saturada de sulfato de amonio, cuyo papel consiste en precipitar proteínas solubles.
Esto sucede porque el sulfato de amonio produce la competencia del agua, entre la
disolución de esta sal o de las proteínas, causando que éstas últimas sean las que
precipiten.

También fue utilizada una solución de NaCl como disolvente, cuyas características
tienen un efecto solubilizante sobre las proteínas del suero patrón, ya que al agregar
este disolvente a la solución de proteínas, éstas tienden a solubilizarse. Pero, si
aumentamos la concentración de NaCl, éstas no van a precipitar.