bmp4 y morfológicas La variación de picos en

Los pinzones de Darwin

Arhat Abzhanov, Meredith protas, B. Rosemary Grant, Peter R. Grant y Clifford J.

Tabin

Material de apoyo en línea

MATERIALES Y MÉTODOS

sistema de estadificación para analizar el desarrollo del canto de aves

Un sistema de clasificación directa ya existe para el pollo casero, se describe

por Hamburguesa y Hamilton ( S1), y nos basamos nuestra sistema de estadificación del pinzón en él.

Sin embargo, el pollo (un pájaro precoces, orden Galliformes) es bastante divergentes de

pájaros cantores, tales como los pinzones (aves altricial, orden Passeriformes). No sólo es su

período de incubación diferentes, pero también diversos aspectos de la embriogénesis avanzan a distinto

las tasas relativas de los pinzones en comparación con el pollo. Por lo tanto, hemos utilizado marcada con DIG

sondas de ARN antisentido contra varios genes conocidos por estar involucrados en craneofacial

desarrollo para establecer etapas en las que, en particular, los primordios craneofacial pinzón

correspondido a diversas etapas en el desarrollo de pollo como se refleja en los patrones de expresión.

Para tener acceso a un gran número de embriones, hemos hecho uso de una especie fácilmente disponibles

de pájaros cantores, la Zebra Finch ( Taeniopygia guttata) que tiene una incubación idéntica

periodo de pinzones de Darwin. Mientras que originalmente la intención de aislar sondas para esta Finch

propósito, descubrimos que las sondas dirigidas contra genes de pollo fácilmente-reaccionaron cruz

con embriones Zebra Finch, por lo que aquellos fueron empleados para todas las hibridaciones. Residencia en

1
estos datos moleculares, así como características craneofaciales morfológicos, hemos sido capaces de

desarrollar un sistema de estadificación robusto para Finch desarrollo craneofacial (Fig S1;. S2).

El examen posterior de los embriones del pinzón de Darwin verificó que su craneofacial

el desarrollo fue muy similar a la de T. guttata por tanto morfológica y molecular

criterios (datos no mostrados).

Recogida y tratamiento de material embrionario de los pinzones de Darwin

Bajo un acuerdo con el Parque Nacional Galápagos, recibimos las cuotas de recogida de embriones de Geospiza

magnirostris, G. fortis, G. fuliginosa, G. scandens, G. conirostris,

G. difficilis y olivacea Certhidea en las islas de Santa Cruz y Genovesa. los machos que cantan y sus nidos fueron

identificados al comienzo de la estación húmeda. Después de la cría había comenzado nidos se verificaron todos los días.

Pinzones de Darwin hembras ponen garras de 3-5 huevos, uno por día. Para evitar la interrupción de la cría, se recogieron

sólo el tercer huevo que se establezcan y se incubaron al 100 o F. Los embriones se recogieron a E5 (st.26) y E6.5 (st.29) de

acuerdo con nuestra serie altricial puesta en escena desarrollo aviar. La serie de estadificación para el desarrollo songbird se

describirá en detalle en otra parte. material embrionario se fijó en 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino (PBS)

durante 2-3 horas a temperatura ambiente y se almacenó en el reactivo RNAlater (Ambion) a aproximadamente 5 o C durante

2-5 semanas. Las cabezas se rehidrataron en PBS, se congelaron en OCT y se saggitally cryosectioned medial (Fig. S3).

ribosondas antisentido polluelo se prepararon y utilizaron en embriones Finch de Darwin como se ha descrito previamente ( S2)

( Fig. S4). Se analizaron 19 jefes de pinzones de Darwin: G. magnirostris ( N = 3), G. fortis ( N = 4), G. fuliginosa ( N = 4), G.

conirostris

(N = 3), G. scandens ( N = 2), y G. (difficilis N = 3). Un polluelo bmp4 sonda se utilizó para en el lugar hibridaciones.

2
manipulaciones de embriones de pollo y el análisis estadístico

Los huevos fertilizados se obtuvieron de SPAFAS (Norwich, CT), se incubaron a 100F, y se organizaron los embriones de

acuerdo con la hamburguesa y Hamilton ( S3). El RCAS :: bmp4 y RCAS :: Vaso constructos se han descrito previamente ( S4,

S5). Para infectar embriones para estudios in vivo que o bien inyectamos la parte distal del proceso frontonasal de embriones

de pollo st.24 o virus concentrado de alto título agrupados en el espacio semicerrado que rodea la cabeza de la etapa 15

embriones. RCAS (B) :: AP (fosfatasa alcalina) virus de alto título similares representada infección del epitelio y dermis

subyacentes de la cabeza después de 36 horas de infección (etapa 20) y 48 horas (etapa 22) (no mostrado) que varió de

irregular (10-20% de la superficie de la cabeza) al fondo (60-70% de la superficie de la cabeza). Los embriones infectados se

recogieron en las etapas 30 y 36, fijado durante la noche en paraformaldehído al 4% en PBS y se congelaron en OCT para la

sección sagital. Las cabezas de embriones fueron fotografiados y medidos en NIH Image 1.62. Estas unidades arbitrarias

fueron utilizados para el análisis de la función de la varianza (ANOVA caja de herramientas) en Excel X para calcular las

desviaciones estándar y pvalues para los datos. Para los huevos de etiquetado BrdU de la etapa 30 de tipo salvaje y los

embriones de pollo infectados se inyectó con 300 metro l de 50 metro g / ml de BrdU y se incubaron durante 60 minutos.

3
Leyendas de las figuras SOPORTE

Adicional Figura 1.

Comparación del desarrollo prenatal de altricial (pájaros cantores, orden Passeriformes) y precoces (aves de corral, Orden

Galliformes) y la serie de puesta en escena de los pájaros cantores. Las comparaciones de tamaño de embriones del pinzón de

cebra ( T. guttata) y pollo ( G. gallus) de Hamburger-Hamilton ST.18 (A), st.24 (B) y st.26 (C). (D) Una parte de la serie de estadificación

Zebra Finch utilizado para la etapa embriones de pinzones de Darwin. Tenga en cuenta, que el tiempo de incubación de

T. guttata es idéntica a la de todas las especies de Darwin pinzones. (E, F) Las diferentes estructuras, como las extremidades y las

mandíbulas, se desarrollan a diferentes velocidades relativas de pájaros cantores y aves de corral. Por lo tanto, se utilizaron los

datos moleculares para correlacionar etapas de desarrollo craneofacial entre T. guttata y G. gallus, por ejemplo, patrón de expresión

de Shh en embriones de pollo y Zebra Finch. (G, H) Los patrones de expresión de Tbx2

en las estructuras craneofaciales de polluelo y el pinzón cebra embriones. Barras de escala: 1 mm en A; 3 mm en B; 4 mm de

C; 1 mm en E, F; 0,1 mm en G, H.

Adicional Figura 2. (AD) diferencias específicas de las especies aparecen relativamente pronto durante el desarrollo y se

mantienen en los embriones de G. scandens a medida que desarrollan picos largos y poco profundos y puntiagudas y estas

características se mantienen a través de etapas posteriores del desarrollo. ( B, E, F)

características específicas de las especies son fácilmente reconocibles por la etapa 33 en embriones de G. scandens ( SEGUNDO),

G. fortis ( MI), y G. magnirostris ( F). Las barras de escala son: BG 5 mm.

4
Adicional Figura 3.

cabezas embrionario de la etapa 26 embriones de pinzones de Darwin seccionadas y mostradas en la Figura 1B. ( AF) Lider

de G. difficilis, G. fuliginosa, G. fortis, G. magnirostris, G. scandens y G. conirostris embriones se seccionaron medialmente

como se revela por la presencia de la bolsa de Rathke la (RP; punta de flecha roja) y la apertura telencephalic (te). Tanto la

parte superior (UB) y picos (lb) inferiores se muestran. Muy alta Nomarski se utilizó de manera que las secciones de bajo

fondo podrían ser fotografiados a bajo aumento. La intensidad es un reflejo de la densidad celular y no de bmp4 señal. Las

barras de escala: 1 mm en A.

Adicional Figura 4.

Análisis comparativo de bmp2 y Bmp7 dominios de expresión en especies de Geospiza.

( UN) Las seis especies de Geospiza mostrar formas distintas pico y tamaños. ( SEGUNDO) bmp2 fue expresado en el

epitelio ventral y las áreas inmediatamente adyacentes del mesénquima ventral en la etapa 26 embriones de G. fortis y G.

magnirostris, y G. scandens y G. conirostris.

La expresión fue más fuerte G. magnirostris y G. conirostris embriones, las dos especies más grandes. ( DO) Bmp7 se

expresó en la ventral-más mesénquima de la FNP de todas las especies de la muestra ( RE) dominios de bmp4 expresión

en la prominencia del pico superior G. magnirostris en las etapas 26 y 29. Las barras de escala: 1 mm en B, C.

Adicional Figura 5.

Comparación de Col II expresión en st. 30 embriones cuyo epitelio ( UN) y el mesénquima ( SEGUNDO) estaban infectados con

RCAS :: bmp4 con st. 30 de tipo salvaje de embriones ( DO). (RE-

MI) misexpression epitelial de RCAS :: bmp4 provoca la expansión de la facial lateral

5
estructuras. vistas frontal y lateral de la cabeza de todo el embrión con el epitelio infectados con RCAS :: Bmp4. Las

cápsulas nasales rodeadas por el tejido MXP se indican con puntas de flecha blancas. La prominencia pico superior fue

muy reducida (flecha blanca). Barras de escala: 1 mm en A, de 2 mm en D.

Adicional Figura 6.

Propagación de la infección RCAS tal como se muestra con la sonda RSCH en pollo picos superior ilustrados

en la Figura 4D, H, L. ( UN) No hay infección RCAS en el control de los embriones de tipo salvaje. Fuerte

RCAS :: bmp4 ( SEGUNDO) y RCAS :: noggin ( DO) la infección puede ser detectada con RSCH en el lugar

hibridación.

6
Figura S1

7
Figura S2

8
Figura S3

9
Figura S4

10
Figura S5

11
Figura S6

12
R EFERENCIAS

S1. Hamburguesas, HL Hamilton, J. Morphol. 88, 49 (1951).

S2. AE Brent, R. Schweitzer, CJ Tabin, Celda 113, 235-248 (2003) ..

S3. V. hamburguesas, HL Hamilton, J. Morphol. 88, 49 (1951) ..

S4. RE. Duprez, EJ Bell, MK Richardson, CW Archer, L. Wolpert, PM Brickell,

Francis PH-Oeste. Mech Dev. 57, 145 (1996).

S5. J. Capdevila, RL Johnson, Dev Biol. 97 ,: 205 (1998).

13