Biología Molecular III

Amplificación del fragmento del gen gap A, mediante

la Reacción en Cadena en Polimerasa
David Flores, Gabriel Guamán, Carolina Panchana, Janine Peralta, Sasha Sigüenza,
Josué Villota
Laboratorio de Biología Molecular III
Ingeniería en Biotecnología
Departamento de Ciencias de La Vida y La Agricultura
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
daflores10@espe.edu.ec, gaguamnp@espe.edu.ec, cjpanchana@espe.edu.ec,
svsiguenza@espe.edu.ec, jnvillota@espe.edu.ec

Resumen

I. INTRODUCCIÓN Según Fonseca et al. (2010), el interés de esta técnica

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un
método inventado por K. B. Mullis, el cual es un
procedimiento de síntesis in vitro usado para
amplificar fragmentos de ADN mediante su incubación
sucesiva a diferentes temperaturas (Damián et al.,
2013). En la técnica de la PCR se requiere de un molde
o ADN matriz, unos primers o iniciadores que
delimitan la zona del ADN que será copiado,
nucleótidos que serán adicionados a la nueva cadena y
la enzima ADN Taq pol, la cual es termoestable a altas
temperaturas, que se encargara de hacer la síntesis
química en presencia de iones de magnesio (Fonseca et
al., 2010). Generalmente, es emplea una doble cadena
de ADN la cual es desnaturalizada por calentamiento a
94-95 °C, lo que permite el alineamiento de los primers
complementarios en los extremos 3’ de cada cadena,
esto se da a una temperatura dependiente de los
primers, y finalmente, la elongación de las cadenas a
una temperatura de 72-74 °C (Damián et al., 2013);
todo este proceso se conoce como un ciclo.
es que no importa la cantidad de sustrato de la que se
parte, ya que si el número de ciclos de amplificación
de ADN es suficiente se obtendrá una cantidad de
producto elevado, debido a que se trata de un fenómeno
de amplificación exponencial. Cabe destacar que la
sensibilidad de la técnica es muy alta, presentando
algunos inconvenientes como es la elevada
probabilidad de obtener falsos positivos debido a
contaminación, ya que no es una técnica cuantitativa
sino semi-cuantitativa (Damián et al., 2013).
El gen gapA presente en Klebsiella pneumaniae,
traduce la enzima gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa (EC: 1.2.1.12), la cual cataliza la
fosforilación oxidativa del gliceraldehído 3-fofato
(G3P) a 1,3 bifosfoglicerato (BPG) usando el cofactor
NAD. La primera etapa de reacción implica la
formación de un intermedio hemiacetal entre G3P y un
resto de cisteína, y este intermedio hemiacetal se oxida
luego a un tioéster, con reducción concomitante de
NAD a NADH. El NADH reducido se intercambia
luego con el segundo NAD, y el tioéster es atacado por
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un fosfato inorgánico nucleófilo para producir BPG. Prime 0.167u 0.498uL

Esta proteína está involucrada en el paso 1 de la vía r L
30μM 0,2μM
secundaria que sintetiza piruvato a partir de D- Rever
gliceraldehído 3-fosfato. Las proteínas (UNIPROT, se
2013). Taq 0.20uL 0.6uL
5U/μL 1U/μL
Pol
II. MATERIALES Y MÈTODOS Agua 14.96u 47.14uL
ultra ---- ---- L
A. Preparación de reactivos y muestras
pura
Después de haber realizado el protocolo de limpieza 1,5ng/μ 2.5uL 5
ADN 15ng/μL
de cabinas de flujo laminar, se procedió a la L
obtención de todos los reactivos necesarios para el Vf= 25 VMM=74.9
master mix en distintos eppendorf. μL 7uL

Las muestras para la amplificación del gen gap A,

fueron proporcionadas por el Laboratorio de Se prepararon 3 reacciones por grupo, ya que la
Biotecnología Humana de la Universidad de las amplificación del fragmento gapA se realizó en
Fuerzas Armadas - ESPE. dupletas, por lo que se rotuló 3 tubos eppendorf M1
(Master Mix), M2 (segunda reacción) y el C(-)
Los reactivos para PCR fueron proporcionadas por (control sin ADN).
el Laboratorio de Biotecnología Humana.
La enzima es agregada como último paso, ya que al
Se toma en cuenta la Tabla 2, para agregar la tener contacto con el DNA comienza a actuar.
cantidad de reactivos necesarios para el master mix.
Se debe tomar en cuenta que se harán 3 tubos de B. PCR
preparación, uno con cada muestra de ADN, además Se configuró el programa mostrado en la Tabla 3 en
de un control que no contendrá ADN, por lo cual los el termociclador.
cálculos se multiplican por 3.
Tabla 1. Programa utilizado en el termociclador
Tabla 2. Información sobre los volúmenes de
reacción del ensayo Temperatur Tiemp Ciclo
Concent Concen Volum Master a (°C) o (min) s
React ración tración en Mix (3 Desnaturació
94 2 1
ivos Stock inicial Inicial Rx) n Inicial
(Cs) (Ci) (Vi) Desnaturació
94 30 seg
Buffer 5uL 1.5uL n
35
GoTa 5X 1X Annealing 60 30 seg
q Extensión 72 1
dNTP 0.5uL 1.5uL Extensión
20mM 0,4mM 72 30 seg 1
s Final
MgCl 1.5uL 4.5uL Conservación 4 - 1
25mM 1,5mM
2
Prime 0.167u 0.498uL
r L Posteriormente se colocó la gradilla con los tubos
30μM 0,2μM eppendorf en el termociclador.
Forwa
rd
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Por último, se realizó el protocolo de limpieza de la

cámara de flujo laminar.
C. ELECTROFORESIS

Primero se preparó un gel de agarosa al 1,5% en 80

mL de buffer TBE 1X de acuerdo al protocolo del
laboratorio. Posteriormente se cargó el marcador de
peso molecular de 100bp de la siguiente manera:
3µL de buffer de carga + 7µL de marcador.

Después se midieron 10 uL de producto de

amplificación de cada tubo eppendorf (M1, M2 y
C(-)) y se cargaron a continuación del marcador de
peso molecular.
Se corrió el gel de electroforesis durante una hora a
100 voltios y 300mA, hasta que indicador amarillo
del marcador de peso molecular de 1Kb se encuentre
a 1cm del borde inferior.
Figura 2: Secuencia del gen gap A
 Amplificación
Resultados obtenidos en el ensayo de amplificación
del gen gapA (gliceraldehido-3- fosfato
deshidrogenasa) de Klebsiella pneumonie.

III. RESULTADOS

 Análisis del gen gapA de Klesbsiella pb

pneumanie en el programa NCBI
La figura 1 indica el locus, y el tamaño del gen gapA
el tamaño en bp analizados a partir de los primers
Locus NC_0168451
Tamaño 101 bp
Primer F 5´CTTCAGAAGCTCCACTCACGG 3´
Primer R 5’ 300
CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT´
200
Figura 1: Análisis del gen gapA en NCBI-Blast
C(-) M1 M2 M

La figura 2 indica la secuencia completa del gen
gapA de Klebsiella pneumonie obtenida en NCBI-
Blast.
Figura 3: Electroforesis de la amplificación del gen gapA de
Klebsiella pneumonie. En agarosa 1.5 % TBE.C(-): Control
Negativo, M: Marcador, M1 y M2: Muestras con el DNA
 Amplificación en el software In silico.

Figura 4: PCR in silico del gen gapA de Klebsiella
pneumoniae HS11286
IV. DISCUSIÓN
Según Genómica Médica (2015) “la primera etapa
para realizar una reacción en cadena de polimerasa
es la preparación del master mix, esta etapa es
crucial para obtener buenos resultados (2015). El
master mix con las cantidades exactas tiene la
ventaja de que el costo por cada reacción disminuye
considerablemente (Pacheco, 2014). En la Tabla 2
podemos encontrar las cantidades exactas de los
componentes del coctel para el PCR, que fueron
usados en esta práctica de laboratorio. Y según la
Figura 3 la muestra corrida en el gel de
electroforesis de amplificación del gen gapA de
Klebsiella pneumonie presentó una banda bien
definida en el carril M1 y otra igual de definida en
el carril M2, la calidad de esta reacción está
estrechamente relacionada con la pureza y
características intrínsecas de todos los componentes
del master mix preparado.
A. PCR
La PCR es un ensayo enzimático simple. Dentro del
proceso de elongación de la cadena de ADN se unen
Biología Molecular III
los cebadores que debe detectar a la cadena de DNA
diana para amplificarse (Garibyan, 2015).
Según Balari (2015), la concentración optima de los
primers en la mayoría de reacciones de PCR se
encuentra entre 0.2-0.5 𝜇𝑀, lo que nos garantiza la
correcta reacción de amplificación, y como se
observa en la figura 3, los resultados obtenidos tras
la electroforesis en el gel de agarosa se evidencia la
amplificación del gen gap A en la que se utilizó 0.2
𝜇𝑀, a esto se suma lo descrito por (Louis, 2017)
sobre la importancia de un buen diseño de primers,
en figura 1 y 2 el análisis del gen se pudo realizar a
partir de los primers previamente diseñados y
colocados dentro del master mix, dando como
información el locus, el tamaño, la secuencia del gen
que se va amplificar (Klesbsiella pneumanie)
comprobando la defectibilidad de los primers
utilizados.
B. ELECTROFORESIS
Para observar los amplicones generados tras el
procedimiento de PCR se utilizó electroforesis en
gel de agarosa 1.5% con la tinción del bromuro de
etidio, observando en la figura 3 dos bandas cuyos
tamaños del fragmento amplificado en teoría deben
ser idénticos a los predichos a partir de la secuencia
de nucleótidos obtenida con el programa NCBI,
cabe destacar que en el control negativo no presento
banda alguna y según lo descrito por Garibyan
(2015) los cebadores en la reacción especifican el
producto de ADN exacto que se enriquecerá, al
tener una secuencia complementaria al ADN diana
que debe detectarse y amplificarse es por esta razón
que el control negativo al no tener en su reacción
templado de DNA los primers no pueden unirse y
obviamente la enzima Taq – polimerasa no actúa
uniendo los dNTP’s y por eso no hay amplificación.
V. CONCLUSIONES

VI. BIBLIOGRAFÍA

 Balari, K. (2015). A fast and reliable method
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