Professional Documents
Culture Documents
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
•Clonagem
•ELISA
•PCR
•Probind and Blotting (Western blotting)
•Arrays
•Oligonucleotídeos específicos
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
•Anticorpo ou Ag ligado
•Enzima ativa
•Substrato
•Produtos solúveis
2 Enzyme-linked Ab
Serum Ab
Antigen
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços
dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual
Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.
2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Elementos necessários para a realização:
2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)
3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)
4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos
5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado)
– nos ensaios quantitativos
6Amostras a serem testadas
7Placa de poliestireno
8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag
ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes
9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima
10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação
enzimática, produz cor
11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade
de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de
densidade óptica - DO)
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Vantagens
•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades
mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na
ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.
•Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste
em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor
risco de falsos-positivos.
•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio
em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Desvantagens
•Necessidade de mão de obra especializada.
•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com
exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.
•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito
susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de
incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
PRINCIPAIS TIPOS
•INDIRETO: detecta principalmente Ac
•DIRETO: detecta principalmente Ag
•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular
(monovalentes)
•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a
ação do fator reumatóide)
1. ELISA INDIRETO
4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos
Ags
www.labimuno.org.br
ELISA INDIRETO
1Aplicações na medicina humana e veterinária:
2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a
detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.
3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da
Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.
4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite
Caseosa e da Leishmaniose.
5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação
do fator reumatóide.
www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
1Interpretação dos resultados:
2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração
de Ag da amostra pesquisada.
3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção
de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir
da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno
a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para
deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
HIV
Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) três ou
quatro semanas apó s o contato.
Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por
outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta
proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
Os exames de anticorpos são relatados como positivos ou negativos.
O desempenho destes exames é descrito em termos de:
■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serão
positivos quando o HIV estiver presente.
■especificidade — a percentagem dos resultados que serão
negativos quando o HIV não estiver presente.
Todos os exames de diagnó stico têm limitaç ões, e, algumas vezes, o
seu uso pode produzir resultados errô neos ou questionáveis.
■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,
quando, na verdade, não está.
■falso negativo — os resultados não identificam o HIV, que está
presente.
www.youtube.com/watch?v=elisaUb4vmt0