PRAKTIKUM ANALISIS KADAR TOTAL ANTOSIANIN METODE

SPEKTROFOTOMETRI DAN KADAR PROTEIN METODE BIURET

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN

Anita Wilatika Pratama (240210140008)

Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor

Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022) 7798844,
779570 Fax. (022) 7795780 Email: anitawilatika05@gmail.com

ABSTRACT
Anthocyanins are pigments soluble in water which causes red , purple and blue and is
found in many fruits and flowers . Protein is an important component or main component of
animal or human cells . The purpose of this lab is to determine the anthocyanin content by
spectrophotometric method and protein content by the biuret method . 0 % sugar content derived
anthocyanins levels of 6.3815 % and a sugar content of 20% amounting to 4.9468 % . The protein
content of lentils surly amounted to 27.68 % .

Keywords : Anthocyanins, spectrophotometry , Protein , biuret , absorbance

PENDAHULUAN faktor yang mempengaruhi kestabilan

Antosianin merupakan senyawa
flavonoid yang memiliki kemampuan
sebagai antioksidan. Umumnya senyawa
flavonoid berfungsi sebagai antioksidan
primer, chelator dan scavenger terhadap
superoksida anion. Antosianin dalam bentuk
aglikon lebih aktif daripada bentuk
glikosidanya (Santoso, 2006). Kemampuan
antioksidatif antosianin timbul dari
rekatifitasnya yang tinggi sebagai pendonor
hidrogen atau electron, dan kemampuan
radikal turunan polifenol untuk
menstabilkan dan mendelokasi elektron
tidak berpasangan, serta kemampuannya
mengkelat ion logam (terminasi reaksi
Fenton) (Rice-Evans et al., 1997). Aktivitas
antioksidan antosianin dipengaruhi oleh
sistem yang digunakan sebagai substrat dan
kondisi yang dipergunakan untuk
mengkatalisis reaksi oksidasi (Pokorny et
al., 2001).
Antosianin adalah pigmen yang larut
dalam air yang menyebabkan warna merah,
ungu dan biru serta banyak ditemukan pada
buah dan bunga. Antosianin ini merupakan
zat warna yang bersifat polar dan akan larut
dengan baik pada pelarut polar. Faktor –
antosianin non-enzimatik adalah pengaruh
dari pH, suhu dan juga cahaya (Salisbury,
1991).
Analisis kadar antosianin
menggunakan metode spektrofotometri.
Spektofotometri adalah suatu metode
analisis yang berdasarkan pada pengukuran
serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur
larutan berwarnaa pada panjang gelombang
yang spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi difraksi dan
detector vacuum phototube atau tabung
foton hampa. Alat yang digunakan untuk
menentukan suatu senyawa baik secara
kuantitatif maupun kualitatif dengan
mengukur transmittan ataupun absorban dari
suatu cuplikan sebagai fungsi dari
konsentrasi. Spektofotometer menghasilkan
sinar dari spectrum dengan panjang
gelombang tertentu dan fotometer adalah
alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi (Harjadi,
1990).
Prinsip dari uji antosianin ini
didasarkan pada reaksi penangkapan atom H
oleh DPPH (reduksi DPPH) dari senyawa
antioksidan. Reagen DPPH berperan sebagai
radikal bebas yang direndam oleh senyawa
antioksidan yang terkandung dalam sampel,
selanjutnya DPPH akan tereduksi menjadi
Diethyl Picry Hydrazine (DPPH-H).
Reduksi DPPH menjadi DPPH-H
menyebabkan perubahan ungu menjadi
kuning (Legowo, 2004).
Protein merupakan makromolekul
yang terususun oleh asam-asam amino yang
mengandung unsur-unsur utama C, O, H,
dan N (Legowo, 2004). Prinsip protein
menggunakan metode biuret adalah dalam
larutan basa, Cu2+ membentuk kompleks
dengan ikatan peptida (-CO-NH-) dari suatu
protein yang membentuk warna ungu
dengan absorbansi 540 nm. Besarnya
absorbansi tersebut berbanding langsung
dengan konsentrasi protein dan tidak
tergantung pada jenis protein, karena semua
protein pada dasarnya mempunyai jumlah
ikatan peptide yang sama persatuan berat
(Legowo, 2004).
Analisis protein menggunakan
metode biuret ini terdapat beberapa hal yang
harus diperhatikan yaitu (Legowo, 2004) :
1. Jumlah sampel harus mengandung
protein sebesar 1-10 mg/ml
2. Terdapat senyawa pengganggu yang
dapat diantisipasi yaitu :
a. Urea, karena mengandung gugus –
CO-NH-
b. Gula pereduksi, yang akan
bereaksi dengan ion Cu2+ .
METODOLOGI
Alat dan Bahan
Analisis Antosianin Metode
Spektrofotometri
Peralatan yang digunakan adalah labu
ukur, kuvet, spektrofotometer, inkubator,
neraca analitik, gelas ukur,
Bahan yang digunakan adalah serbuk
bunga telang 0%, 10 %, 20 %, aquades,
larutan buffer KCl 0,0025 M (pH = 1), dan
larutan buffer Na-asetat (pH = 4,5).
Analisis Protein Metode Biuret
Peralatan yang digunakan adalah
neraca analitik, gelas ukur, tabung
sentrifugasi, vortex, inkubator, tabung
reaksi, pipet volume, kertas saring, corong
dan gelas kimia.
Bahan yang digunakan adalah tepung
koro bunguk 1 gram, aliquot, TCA (Tri
Chlor Acid) 10 %, etileter, pereaksi biuret
(CuSO4.5H2O, NaKtartat, KI), larutan
NaOH 0,2 N dan larutan protein standar
BSA (Bovin Serum Albumin).
Prosedur
Analisis Antosianin Metode
Spektrofotometri
Penetapan antosianin dilakukan
dengan metode perbedaan pH yaitu pH 1,0
dan pH 4,5. Pada pH 1,0 antosianin
berbentuk senyawa oxonium dan pada pH
4,5 berbentuk karbinol tak berwarna. Hal
tersebut dapat dilakukan dengan membuat
suatu alikuot larutan antosianin dalam air
yang pH-nya 1,0 dan 4,5 untuk kemudian
diukur absorbansinya.
a. Pembuatan larutan pH 1,0 dan pH 4,5
Pembuatan larutan pH 1,0 dengan
cara menimbang 1,86 gram KCl,
menambahkan 980 ml aquades, mengatur
pH sampai 1 dengan menambahkan HCl
pekat , dan menepatkan sampai 1 liter.
Pembuatan larutan pH 4,5 dengan
cara menimbang 54,43 gram Na-asetat,
melarutkan 960 ml aquades, mengatur
pH sampai 4,5 dengan menambahkan
HCl pekat, dan menepatkan sampai 1
liter.
b. Pengukuran dan Perhitungan
konsentrasi antosianin total
Dua larutan sampel disiapkan dari
masing-masing filtrat, pada sampel
pertama digunakan larutan pH 1,0 dan
untuk sampel kedua digunakan larutan
pH 4,5, kemudian absorbansi dari setiap
larutan diukur pada panjang gelombang
510 dan 700 nm. Absorbansi dari sampel
yang telah dilarutkan (A) ditentukan
dengan rumus:
A = (A510 – A700) pH 1,0 – (A510 –
A700)pH 4,5
Konsentrasi A (M) % bb :
𝐴 𝑥 𝐵𝑀 𝑥 𝐹𝑃 𝑥 100
=
𝜀𝑥𝑏
Keterangan :
 A : (A510-A700)pH 1,0 – (A510 - Analisis antosianin menggunakan
A700)pH4,5 spektrofotometri visible karena kemampuan
BM : Berat molekul (448,8 g/mol) panjang gelombang hanya mencapai 750 nm
FP : Faktor Pengenceran (Mulja, 1989).
ε : Absorptivitas molar sianidin – 3 Penetapan antosianin dilakukan
- glukosa dengan metode perbedaan pH yaitu pH 1,0
b : Tebal kuvet ( 1 cm) dan pH 4,5. Pada pH 1,0 antosianin
berbentuk senyawa oxonium. Keadaan yang
Analisis Protein Metode Biuret semakin asarn apalagi mendekati pH 1 akan
1. Preparasi Sampel menyebabkan semakin banyaknya pigmen
a. Pembuatan pereaksi biuret yaitu antosianin berada dalam bentuk kation
dengan menambahkan 0,3 gram flavilium atau oxonium yang berwarna dan
CuSO4.5H2O, 0,9 gram NaK-tartat, pengukuran absorbansi akan menunjukkan
0,5 gram KI, lalu melarutkan dalam jumlah antosianin yang semakin besar
100 ml NaOH 0,2 N. (Tensiska, 2006). Pada pH 4,5 yak,ai pada
b. Pembuatan Kurva Standar yaitu asam yang lemah kation flavilium berubah
memasukkan larutan protein standar ke bentuk yang lebih stabil hemiketal yang
(BSA 5 mg/ml) ke dalam tabung tak berwama dan bentuk kalkon (Jordheim,
reaksi 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8. Lalu 2007). Perbedaan absorbansi antara dua
menambahkan aquades sampai 4 ml sampel diukur pada panjang gelombang 510
dan menambahkan pereaksi biuret dan 700 nm. Menurut Tensiska (2006) pada
sebanyak 6 ml dan dihomogenkan. panjang gelombang 510 nm adalah panjang
Lalu diamkan pada suhu ruang, gelombang makasimum untuk sianidin-3-
kemudian disaring. Setelah itu glikosida, sedangkan panjang gelombang
diukur absorbansi pada 520 nm dan 700 nm untuk mengoreksi endapan yang
plotkan kedalam grafik. masih terdapat dalam sampel. Jika sampel
2. Penetapan kadar protein pada benar-benar jernih, maka absorbansi pada
sampel, yaitu menimbang 1 gram 700 nm adalah 0. Hasil praktikum
sampel menggunakan neraca menunjukan nilai absorbansi pada panjang
analitik , lalu menepatkan dalam 25 gelombang 700 nm adalah 0, ini berarti
ml, menambahkan aliquot 0,5 ml. sampel benar-benar jernih.
Lalu menambahkan 1 ml TCA (Tri Dari hasil penetapan senyawa
Chlor Acid) 10 %. Lalu dilakukan antosianin dengan menggunakan
sentrifugasi dengan kecepatan 3000 spektroskopi visible, maka diperoleh data
rpm selama 10 menit. Setelah di sebagaimana tertera pada tabel 1.
sentrifugasi selama 10 menit,
supernatant dibuang dan Tabel 1. Hasil Pengamatan Kadar
ditambahkan 2 ml etileter ke dalam Antosianin Metode
tabung sentrifugasi. Lalu Spektrofotometri
disentrifugasi kembali. Setelah itu Kadar
Sa-
dilakukan vortex selama 1 menit. pH A510 A700 Antosianin
mpel
Biarkan sampel mongering diudara, %
lalu ditambahkan 4 ml aquades, dan 1 0,670 0,07
dilakukan vortex kembali selama 1 20 % 5,3889
4,5 0,364 0,023
menit. Selanjutnya dtambahkan 6 1 0,668 0,016
ml pereaksi biuret, lalu dimasukkan 20 % 4,5047
4,5 0,399 0,017
ke dalam incubator pada suhu ruang 1 0,850 0,009
(30 0C) sampai membentuk warna 10 % 6,7240
4,5 0,459 0,021
ungu. Lalu baca absorbansi 520 nm. 1 0,45 0,017
10 % 3,4035
4,5 0,241 0,021
HASIL DAN PEMBAHASAN 1 1,122 0,019
Analisis Antosianin Metode 0% 8,3920
4,5 0,632 0,032
Spektrofotometri
 1 0,569 0,003
0% 4,3710
4,5 0,321 0,017

Berdasarkan Tabel 1 terlihat bahwa Tabel 2. Hasil Pengamatan Kadar Protein

pada kadar gula 0 % diperoleh kadar Metode Biuret
antosianin dengan hasil duplo sebesar Konsentrasi
Adsorbansi
6,3815 %, sedangkan pada kadar gula 20 % BSA % Protein
(y)
diperoleh kadar antosianin dengan hasil Ppm (x)
duplo sebesar 4,9468 %. Sampel dengan 619,33 0,175 27,86
penambahan gula 0 % memperoleh hasil 612,66 0,173 27,52
kadar antosianin terbesar, sedangkan sampel 616,00 0,174 27,67
dengan penambahan gula sebesar 20 %
memperoleh hasil kadar antosianin terendah. Berdasarkan hasil pengamatan
Hal ini menunjukkan bahwa kadar gula didapatkan rata-rata hasil analisis kadar
dapat mempengaruhi stabilitas warna protein kacang koro benguk adalah sebesar
pigmen antosianin, dimana terjadi 27,68 % sementara menurut Wanjecke
penurunan stablitas dengan semakin (2010) kadar protein kacang koro benguk
meningkatnya kadar gula yang ditunjukkan 28,81 gram protein. Hasil praktikum dengan
dengan semakin menurunnya nilai kadar literature sudah hapir mendekati. Terdapat
antosianin. Hal ini diperkuat oleh hasil perbedaan hasil yang disebabkan karena
penelitian Winarti (2008) yang menyatakan adanya kesalahan ketika membaca
bahwa dengan adanya kadar gula yang tinggi absorbansi pada spektrofotometer, dan
akan menyebabkan degradasi warna menjadi adanya konsentrasi NH4+ yang tinggi
semakin pudar. Menurut deMan (1997), sehingga reaksi dapat terganggu.
konsentrasi gula yang lebih tinggi dan Dari hasil penetapan konsentrasi BSA
adanya oksigen akan mengakibatkan terhadap nilai absorbansi nya, maka
kerusakan pigmen yang lebih besar. Hal ini diperoleh data sebagaimana tertera pada
didukung juga oleh Sudarmanto (1990) tabel 3.
bahwa beberapa faktor yang mempengaruhi
laju kerusakan antosianin selain lama Tabel 3. Hasil Penetapan Konsentrasi BSA
penyimpanan dan suhu yang tinggi, terhadap Nilai Absorbansi
peningkatan kadar gula juga akan Konsentrasi BSA Absorbansi
mengurangi kandungan pigmen. (PPM) (x) (y)
0 0
Analisis Protein Metode Biuret 250 0,044
Pengujian ini digunakan larutan 500 0,118
protein standar seperti larutan BSA (Bovin 750 0,135
Serum Albumin). Menurut Herawati (2011) 1000 0,234
BSA mengandung protein sekitar 5 mg. Hal 1250 0,303
tersebut menjadi dasar dalam pembuatan 1500 0,336
kurva standar. 1750 0,439
Fungsi penambahan TCA (Tri Chlor
Acid) yaitu untuk menghilangkan komponen
Berikut ini adalah grafik dari hasil penetapan
pengganggu seperti glukosa sehingga
konsentrasi BSA terhadap nilai absorbansi :
protein dapat terdenaturasi (Herawati,
2011). Sentrifugasi dilakukan dua kali
karena untuk menghilangkan sisa TCA
(Herawati, 2011).
Dari hasil penetapan kadar protein
dengan menggunakan metode biuret, maka
diperoleh data sebagaimana tertera pada
tabel 2.
 6. Hasil analisis kadar protein kacang
Kurva Standar BSA koro benguk adalah sebesar 27,68 %.
y = 0.0003x - 7. Semakin tinggi konsentrasi suatu
0.5 0.0108 sampel, maka absorbansi yang
0.4 R² = 0.9969
Kurva BSA dihasilkan dalam pengukuran pun
Absorbansi

0.3 semakin besar

0.2
0.1 Linear
DAFTAR PUSTAKA
(Kurva
0 deMan, M.J. 1997. Kimia Makanan.
BSA)
-0.1 0 1000 2000
Penerjemah K. Padmawinata. ITB-
konsentrasi (ppm) Press. Bandung.
Gambar 1. Grafik konsentrasi BSA Hidayati, Nur dan Mardiyono, 2009,
terhadap absorbansi Pengaruh waktu Pengasinan
Terhadap Kadar Protein Putih Telur,
Berdasarkan data diatas, dapat Biomedika, Vol. 2, No.1, Hal, 81-
dinyatakan bahwa semakin tinggi 82.
konsentrasi suatu sampel, maka absorbansi
yang dihasilkan dalam pengukuran pun Harjadi, W. 1990. Ilmu Kimia Analitik
semakin besar, hal ini didukung oleh hasil Dasar. PT Gramedia Pustaka
penelitian Hidayati (2009). Utama. Jakarta.
Kelemahan dari metode biuret ini
adalah sifatnya yang kurang sensitive Jordheim; Monica. 2007. Isolation
dibandingkan dengan metode Lowry serta
Identification and Properties of
NH4+ dalam konsentrasi tinggi dapat Pyranaoanthocyanins and
mengganggu reaksi antara larutan biuret Athocyanin Forms. University of
dengan sampel (Purwaningsih, 2009). Bergen, Norway.
KESIMPULAN Legowo, Mohamad Anang. 2004. Diktat
1. Analisis antosianin menggunakan Kuliah Analisis Pangan. Program
spektrofotometri visible karena Studi Teknologi Hasil Ternak.
kemampuan panjang gelombang hanya Semarang: UNDIP.
mencapai 750 nm.
2. Kadar gula 0 % diperoleh kadar
Mulja, M., Syahrani, A., 1989. Aplikasi
antosianin dengan hasil duplo sebesar Analisis Spektrofotometri UV-Vis.
6,3815 %. Mephiso Grafika : Surabaya.
3. Kadar gula 20 % diperoleh kadar
antosianin dengan hasil duplo sebesar Pokorny JN, M Yanishlieva, Gordon. 2001.
4,9468 %. Antioxidants in Food. Boca Raton
4. Kadar gula dapat mempengaruhi Boston New York Washington, DC:
stabilitas warna pigmen antosianin, CRC Press.
dimana terjadi penurunan stablitas
dengan semakin meningkatnya kadar Purwaningsih, D. 2009. Teknologi
gula yang ditunjukkan dengan semakin Pembuatan Susu dari Tempe
menurunnya nilai kadar antosianin. Benguk. Universitas Negeri
5. Prinsip protein menggunakan metode Yogyakarta.
biuret adalah dalam larutan basa, Cu2+
membentuk kompleks dengan ikatan Rice-EvansC, NJ Miller and G Paganga.
peptida (-CO-NH-) dari suatu protein 1997. Antioxidant Properties of
yang membentuk warna ungu dengan Phenolic Compounds. Trends in
absorbansi 540 nm. Plant Science. 2. 152 – 159.
Santoso U. 2006. Antioksidan. Yogyakarta.
Yogyakarta: Sekolah Pasca Sarjana
Universtias Gadjah Mada.

Sudarmanto. 1990. Bahan Pewarna Alami

dalam Tanaman Pangan. PAU
Pangan dan Gizi. UGM.
Yogyakarta.

Tensiska., Sukarminah, Een., dan Natalia,

Dita. 2006. Ekstraksi Pewarna
Alami dari Buah Arben (Rubus
idaeus (Linn.)) dan Aplikasrnya
pada Sistem Pangan.

Wanjekeche E, Imungi JK and Karuri EG.

2010. Effect of Soaking on the
Cookability and Nutritional Quality
of Mucuna Bean. Proceeding of the
12th KARI Biennial Sciencetific
Conference theme : Transforming
Agriculture for improved livehoods
through Agricultural Product Value
Chains. KARI Headquarters
Kaptagat Road Nanobi, Kenya, 8-12
November 2010.

Winarti, Sri., Ulya, S., Dhini, A. 2008.

Ekstraksi dan Stabilitas Warna Ubi
Jalar Ungu (Ipomoea batatas L.,)
Sebagai Pewarna Alami. Jurusan
Teknologi Pangan Fakultas
Teknologi Industri. UPN Veteran :
Surabaya.