Citation: Cell Death and Disease (2012) 3, e331; doi:10.1038/cddis.2012.

71
&2012 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 2041-4889/12
www.nature.com/cddis

Canabidiol protege as células progenitoras oligodendrócitos de apoptose induzida por inflamação

atenuando o estresse do retículo endoplasmático
M Mecha1, AS Torrao1,2, L Mestre1, FJ Carrillo-Salinas1, R Mechoulam3 and C Guaza*,1
1
Department of Functional and Systems Neurobiology, Neuroimmunology Group, Cajal Institute, CSIC, Madrid, Spain; 2Department of Physiology
and Biophysics, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazil and 3Medicinal Chemistry Department, Institute of Drug
Research, Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel
*Autor correspondente: C Guaza, Department of Functional and Systems Neurobiology, Neuroimmunology Group, Cajal Institute, CSIC, Avda. Dr.
Arce 37, 28002 Madrid, Brazil. Tel:+34 5854742; Fax:+34 5854754; E-mail: cgjb@cajal.csic.es
Palavras-chave: canabidiol; OPCs; inflamação; estresse oxidativo; ER stress; esclerose múltipla
Abreviaturas:ATF-6, activation transcription factor 6; BrdU, 5-bromo-2’-deoxyuridine; CB1, cannabinoid receptor type 1; CB2, cannabinoid receptor
type 2; CBD, cannabidiol; DCF-DA, 2’,7’-dichlorofluorescein-diacetate; eiF2α, translation initiation factor 2α; ER, endoplasmic reticulum; IFNg,
interferon-gamma; IRE1a, inositolrequiring enzyme 1a; ROS, reactive oxygen species; LPS, lipopolysaccharide; MS, multiple sclerosis; NO, nitric
oxide; NOS-2, nitric oxide syntase-2; OPCs, oligodendrocyte precursor cells; PKR, double-stranded RNA-activated serine/threonine kinase;
PPARg, peroxisome proliferator-activated receptor gamma; RT-PCR, reverse transcription PCR; TRPV1, transient receptor potential cation channel
subfamily V member 1; TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; UPR, unfolded protein response
Recebido 28.2.12; revisto 08.5.12; aceito 11.5.12; Editado por D Bano

RESUMO: Canabidiol (CBD) é o canabinóide mais abundante na Cannabis sativa que não tem propriedades psicoativas. CDB foi
aprovado para tratar a inflamação, dor e espasticidade associados com a esclerose múltipla (MS), de que a desmielinização e
perda de oligodendrócitos são características. Assim, foram investigados os efeitos protetores da CBD contra o dano a células
progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) mediadas pelo sistema imune. Doses de 1µM de CBD protegem as OPCs de estresse
oxidativo, diminuindo a produção de espécies reativas de oxigênio. CDB também protege as OPCs de apoptose induzida por LPS
/ IFNγ através da diminuição da caspase 3 induzida através de mecanismos que não envolvam receptores CB1, CB2, TRPV1 ou
PPARγ. A morte induzida de OPCs por tunicamicina foi atenuada pela CBD, sugerindo um papel do estresse do retículo
endoplasmático (ER) no modo de ação do CBD. Esta proteção contra a apoptose induzida pelo estresse do ER foi associada à
redução da fosforilação do eiF2α, um dos iniciadores da via de estresse do ER. Na verdade, a CBD diminuiu a fosforilação de PKR
e eiF2α induzida por LPS / IFNγ. Os efeitos pró-sobrevivência do CBD em OPCs foram acompanhadas por diminuições na
expressão de efeitos apoptóticos do ER (CHOP, Bax e caspase 12), e o aumento da expressão do anti-apoptótico Bcl-2. Estes
resultados sugerem que a atenuação da via de stress do ER está envolvido nos efeitos “oligoprotetores'' do CBD durante a
inflamação.
Cell Death and Disease (2012) 3, E331; doi: 10.1038 / cddis.2012.71; publicado on-line 28 de Junho de 2012
Categoria do Assunto: Neurociência

INTRODUÇÃO
O canabidiol (CBD) é o canabinóide mais abundante na
Cannabis sativa que é desprovido de propriedades
psicoactivas. CBD exerce efeitos anti-inflamatórios,
antioxidantes e neuroprotetores, 1 e tem sido aprovado para o
tratamento de inflamação, dor e espasticidade associados com
a esclerose múltipla (MS). 2 Estudos em modelo animal de EAE
têm mostrado que o CBD melhora a gravidade da doença por
meio da atenuação da neuroinflamação e das lesões axonais. 3
Células progenitoras oligodendrócitas (OPCs) são células
relativamente quiescentes derivadas a partir de precursores do
SNC perinatal que formam em torno de 5-8% da população de
células da glia no adulto; no sistema nervoso central lesionado,
podem dividir-se e são levados a se diferenciar em novas
mielinações de oligodendrócitos que substituem os que foram
perdidos em áreas desmielinizantes. 4 OPCs são altamente
vulneráveis à inflamação e estresse oxidativo como eles têm
uma alta taxa metabólica, muito ferro intracelular, e baixas
concentrações de glutationa antioxidante; eles também
expressão um arsenal de moléculas tornando-as susceptíveis a
citoquinas inflamatórias ou níveis elevados de cálcio entre
outros. 5 Sabe-se que a inflamação contribui para danos
oligodendroglial em doenças desmielinizantes tais como
esclerose múltipla. 6 Canabinóides sintéticos, tais como WIN
55212-2 e HU211 podem proteger as células progenitoras
oligodendrócitos (OPCs) da apoptose induzida pela retirada do
suporte trófico, 7 embora a sua utilidade seja limitada devido
aos seus efeitos psicotrópicos indesejados. No entanto, pouco
se sabe sobre os efeitos do CBD na apoptose de OPCs
induzidas por inflamação. Embora CBD induza citotoxicidade
em oligodendrócitos do nervo óptico em condições basais por
aumento do cálcio intracelular, 8 também evita a sinalização
apoptótica em neurónios através da redução do influxo de
cálcio. 9 A base farmacológica dos efeitos de CBD permanece
elusiva, embora múltiplos alvos potenciais de CBD têm sido
propostos em função do tipo de célula e dos estímulos
envolvido. 1
O retículo endoplasmático (ER) responde ao estresse
modulando a resposta dos oligodendrócitos ao estímulo
inflamatório, 10 e isso envolve a ativação da cadeia dupla RNA-
ativada serina / treonina quinase (PKR), que vem sendo
implicado como um importante componente de acolhimento à
respostas a infecção e várias situações de estresse celular. 11
PKR é um dos fatores proteicos ER transmembranares que
coordena um programa de adaptação conhecida como a
resposta de stress integrada que fosforila o factor de iniciação
da tradução 2α (eiF2α). 12. Oligodendrócitos produzem grandes
quantidades de mielina e são altamente sensíveis às
mudanças homeostáticos no ER. 10 A via mais rapidamente
ativada em condições de stress ER envolve repressão de
translação, que pode ser mediada pela ativação de PKR, entre
outros, e resulta na fosforilação de eiF2α. 13 Embora esta via
pareça oferecer citoproteção existe uma variedade de tipos de
células, 14 É também possível ativar a apoptose nos outros 15 ;
particularmente em oligodendrócitos o resultado do stress do
ER pode ser determinada pelo estado de desenvolvimento da
célula, em oligodendrócitos maduros totalmente mielinizadas
ele promove a sobrevivência de células, mas em
oligodendrócitos activos a mielinização / remielinização leva a
morte celular. 10 Assim, o stress do ER tem sido associado com
a apoptose da mielinização de oligodendrócitos induzidas por
IFNγ 16 e durante isquemia. 17 Além disso, várias doenças
humanas que envolvem a desmielinização / hipomielinização
parecem envolver estresse de ER agravado. Na doença de
Charcot-Marie-Tooth, doença de 18 de fuga da massa branca,
19,20 e até mesmo em doenças imunomediadas
desmielinizantes como a esclerose múltipla, 21 grave estresse
no ER e ativação da resposta proteína desdobrada (UPR) são
considerados fundamentais para a patogênese da a doença.
No presente estudo, nós fornecemos evidências de que a CBD
oferece proteção para OPCs contra danos induzidos pela
inflamação, bem como OPCs protectoras contra o estresse
oxidativo, diminuindo a produção de ROS. Finalmente,
demonstramos que os efeitos protetores da CBD contra danos
inflamatórios e estresse de ER estão associados a alterações
na expressão de efeitos apoptóticos da UPR.
RESULTADOS
Estudos de dose-resposta dos efeitos do CBD em OPCs.
Como CBD tem efeitos diferentes em tipos de células distintas,
foram avaliados os seus efeitos sobre culturas primárias OPC
em condições basais. Em experiências de resposta à dose
(0,1, 1, 2,5 e 5 µM) CBD não conseguiu induzir a morte celular
em baixas concentrações (0,1 e 1 µM: Figura 1a), embora
alguma citotoxicidade foi observada em concentrações mais
elevadas, o que resulta na morte de 23,38 ± 3,98% de células
(P ≤ 0.01) após uma exposição de 24 h para 2,5 µM CBD, e de
33,13 ± 5,6% (P ≤ 0.001) a 5 mm. Com base nestes resultados,
uma dose de 1 µM foi selecionada para as experiências
subsequentes. A seguir, investigou o efeito de CBD (1 µM) no
ciclo celular através da avaliação da proliferação de OPC. A
quantificação de células BrdU+ de OPC nas culturas primárias
(n=10 000 células, Figura 1b) revelou que o CBD não
aumentou a proliferação de OPC in vitro (47,65 ± 8,61%) no
que diz respeito aos controles (48,21 ± 10,5%). Estes
resultados foram confirmados por, subsequentemente, a
análise do ciclo celular por citometria de fluxo (Figura 1c), na
qual não foram observadas diferenças entre as fases G0/G1, S
e G2/M. Em doses de 0,1 e 1 µM, CBD tem sido relacionado
com o aumento intracelular Ca2+ e para induzir a morte de
oligodendrócitos do nervo óptico. 8 Assim, nós investigamos se
1µM CBD-induzida Ca2+ liberado dos espaços intracelulares
em OPCs cultivadas carregadas com o corante sensível a Ca 2+
Tessalonicenses, Fluo-4. Não houve diferença no sinal de
fluorescência obtido em condições basais e na presença de
CBD (1 µM: Figuras 1d e e), o que indica que os níveis
intracelulares de Ca2+ não foram significativamente alteradas
pela CBD.

Figura 1. Efeitos do CBD na citotoxicidade OPC. (a) Embora CBD não tenha sido capaz de induzir a morte celular em
concentrações baixas (0,1 e 1 µM), efeitos citotóxicos foram observados a 2,5 e 5 µM. OPCs foram expostas a CBD e a morte
celular foi quantificada 48 horas mais tarde, usando o método de LDH. Os dados representam a média ± S.E.M. de n=3 culturas
analisadas em triplicata. A significância estatística foi determinada por um one-way ANOVA: **P≤0.01 e P≤0.001 contra células
não tratadas. (b) CBD não aumentou a proliferação OPC evidente como um aumento na incorporação de BrdU. OPCs foram
incubadas com BrdU (10 µM) durante 24 h e, pelo menos, 10 000 células foram então quantificadas por imunocitoquímica. (c) A
análise de citometria de fluxo revelou que o CBD não afeta a progressão do ciclo celular de OPCs. OPCs recentemente isoladas
foram incubadas durante 24 h na presença ou ausência de CBD (1 µM), e o ciclo celular de um mínimo de 10 000 células foi
analisada num citómetro de fluxo FACSAria após coloração PI. (d, e) CBD não alterou os níveis de Ca2+ intracelular em condições
basais. OPCs foram carregadas com o corante sensível a Ca 2+ de Fluo-4 e o sinal de fluorescência foi monitorizada num
microscópio confocal de varrimento em condições basais e após a adição de CBD (1 µM: n=5 lamelas). (d) Imagens pseudocolor
representativas mostrando níveis de Ca2+ no OPCs cultivadas sob condições basais e na presença de CBD (1 µM). Barra de
escala = 50µm. (e) Traços de fluorescência que mostram a evolução no tempo de Ca2+ OPCs individuais (n=8) a partir da
experiência mostrada em (d), ambos em condições basais e na presença de CBD.
CDB protege OPCs de estímulos inflamatórios e de
apoptose de um modo independente do receptor de
canabinóide.
Como já relatado anteriormente que o estímulo inflamatório
LPS / IFNγ induzida citotoxicidade em OPCs, 22 , foi digno de
nota que OPCs CBD (1 µM) protegidos contra os efeitos
nocivos da inflamação (P≤0.001, Figura 2a), diminuindo a
morte celular de 37,84 ± 4,95% para 10,41 ± 4,41%. De fato, a
indução da apoptose pelo efeito caspase 3 (Figura 2b), por LPS
/ IFNγ foram invertidos pelo tratamento com o CBD (P≤0.05), e
o número de células TUNEL+ (24,35 ± 1,54%) caiu para os
níveis de controle na presença da CBD (3,34 ± 0,96%,
P≤0.001), quando quantificados 24 h pós-tratamento (Figuras
2c e d). Para investigar os mecanismos subjacentes a
oligoproteção oferecido pela CBD, os antagonistas de
receptores CB1, CB2, TRPV1 e PPARγ foram administradas
antes da ofensa LPS / IFNγ na presença e ausência de CBD.
Nenhum destes antagonistas reverteu os efeitos protetores do
CBD observadas em condições inflamatórias, sugerindo que os
efeitos do CBD não são mediadas por estes receptores (Figura
2a).
CDB resgata OPCs de morte induzida por H2O2, diminuindo
a produção de ROS.
CBD é um composto à base de resorcinol com propriedades
antioxidantes potentes e diretas; 23 Assim foi investigado se o
CBD atua como um antioxidante em OPCs submetidos a stress
oxidativo por meio da avaliação dos seus efeitos na morte
celular e a produção de ROS induzidos por peróxido de
hidrogénio (100 µM). CDB impediu o desprendimento e inchaço
de OPCs induzidas pelo stress oxidativo directo (figura 3a), e
diminuição da morte celular de 84,89 ± 6,93% para 39,12 ±
1,82% (P≤0.01, Figura 3b). Além disso, este efeito foi
acompanhado por uma diminuição na produção de ROS,
conforme determinado no DCF-DA ensaios 1 h pós-tratamento
(H2O2 + veículo, 216,63 ± 15,7%; H2O2 + CBD, 151,59 ± 5,10%:
P≤0.001, Figura 3c). Para separar as propriedades
antioxidantes da CBD de seus possíveis efeitos citoprotetores
em OPCs durante a inflamação, que também avaliou os efeitos
do CBD na produção de NO em resposta a LPS / IFN-γ por
nitritos de medição e por western blot para avaliar a expressão
de NOS-2, mas CBD não foi capaz de modificar a produção de
NO (dados não mostrados).

Figura 2. CBD protege contra danos inflamatórios, diminuindo a apoptose e diminuindo o número de TUNEL + OPCs através de um mecanismo
que não envolve receptores CB1, CB2, PPARγ ou TRPV1. (a) Citotoxicidade induzida por LPS / IFNγ em OPCs foi atenuada pela CBD, uma dose
de 1 µM revela-se a mais eficaz. A administração de antagonistas CB1, CB2, TRPV1 ou PPARγ (SR1, AM639, CPZ: 1 µM e GW9662: 50 nM) 30
min antes do estímulo não teve nenhum efeito, indicando que nenhum destes receptores estão implicados nos efeitos protetores da CBD. Os
dados representam a média ±S.E.M. de n=3 culturas independentes analisadas em triplicata, e a análise estatística foi realizada utilizando ANOVA
de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Mann-WhitneyUtest: *** P≤0.001 contra células não tratadas, # P≤0.05 e ### P≤0.001 contra células
expostas a LPS / IFNγ sozinho. (b) Clivada caspase3 western blot mostra que o tratamento com LPS / IFNγ induz a ativação da via da apoptose,
enquanto que o co-tratamento com o CBD reduz esta indução. OPCs foram incubadas com LPS / IFNγ na presença ou ausência de CBD (1 µM).
Extratos de proteína total foram preparados 24 h mais tarde e clivados da caspase 3 (19 kDa) foi avaliada em western blots sondados com
anticorpos específicos. Os dados representam a média ± S.E.M. densidade óptica normalizada para tubulina de três culturas independentes
analisadas em triplicata, e a análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Bonferroni: ** P≤0.01 em
comparação com células não tratadas, em comparação com # P≤0.05 grupo LPS / IFNγ. (c e d) A2B5 e TUNEL coloração mostra que o número
LPS / IFNγ dimuníram os OPCs através da indução de apoptose, um efeito que foi revertido pela CBD como anteriormente confirmado em
medição por caspase3. OPCs foram expostas durante 24 h para o estímulo citotóxico, na presença ou ausência de CBD (1 µM), e 6000 células
OPCs foram contadas. Os dados representam a média ± SEM, e a significância estatística foi determinada utilizando o teste de Kruskal-Wallis
ANOVA, seguido por Mann-WhitneyUtest: *** células P≤0.001 contra células não tratadas, e ### P≤0.001 contra células expostas à LPS / IFNγ
sozinhas.
Figura 3 Estresse oxidativo induzido por H2O2 induz o descolamento e morte de OPC, um efeito que foi atenuado pelo CBD, diminuindo a produção
de ROS. (a) As imagens de contraste de fase (X 10) mostram que o tratamento com H2O2 induziu o edema e descolamento de OPCs, um efeito
prevenida pelo tratamento com CBD. (b) CBD protege OPCs de estresse oxidativo. OPCs foram tratados com H 2O2 na presença ou ausência de
CBD (1 µM) e a morte celular foi quantificada 18 horas mais tarde, usando o método de LDH. Os dados representam a média ± S.E.M. de quatro
culturas independentes analisadas em triplicata, e a significância estatística foi determinada utilizando ANOVA de uma via seguida pelo teste
Bonferroni post-hoc: *** P≤0.001 contra células não tratadas, ## P≤0.01 contra células expostas a H2O2 sozinho. (c) CBD diminuiu a produção de
ROS em condições de estresse oxidativo. Foram carregados com OPCs DCF-DA durante 30 minutos e estimuladas com H2O2 na presença ou
ausência de CBD (1 µM). A fluorescência foi medida 2 h após a 485/530nm num leitor de microplacas e os resultados representam as médias ±
SEM de n=3 culturas independentes analisadas em triplicata. A significância estatística foi determinada utilizando análise de variância de Kruskal-
Wallis seguido pelo teste de Mann-Whitney Utest: *** P≤0.001 contra células não tratadas, ## P≤0.01 contra células expostas a H2O2 sozinho.

Estresse do ER induz a morte de OPC, um efeito que é
atenuado pela CBD através de uma diminuição da
fosforilação eiF2α.
Como stress do ER está implicada em várias doenças com
componentes inflamatórios, tais como a MS, 21 analisamos a
morte de OPC primária em resposta à ativação deste programa
celular. Induzida por tunicamicina stress de ER levou a morte
de OPC 24 horas após o tratamento (45,81 ± 4,7%: Figura 4a),
que foi atenuada por tratamento com o CBD (20,39 ± 2,54%,
P≤0.01). A exposição a CBD também diminuiu a fosforilação da
proteína eiF2α (P≤0.05), um iniciador da via apoptótica
induzida por estresse de ER (Figura 4b). Curiosamente,
induzida por tunicamicina, o estresse de ER não foi mediado
pela fosforilação de PKR, um dos potenciais ativadores de
eiF2α em ER (dados não mostrados).
CBD atenua a activação da via do ER apoptótica em
condições inflamatórias.
Dada a ligação entre os mecanismos subjacentes inflamação e
estresse de ER informadas recentemente, 24 investigamos a
resposta ao estresse induzido por LPS ER / IFNγ. Quando
examinamos o efeito de LPS / IFN e eiF2α PKR na fosforilação
de OPCs, um aumento na fosforilação destas proteínas foi
evidente em transferências de Western (Figuras 4C e D).
Curiosamente, a CBD prejudica esse aumento na PKR e na
fosforilação eiF2α, que se manteve em níveis de controle
(P≤0.05), sugerindo que um dos efeitos protetores da CBD em
OPCs envolve a redução do estresse ER durante
neuroinflamação.
Para confirmar os efeitos do CBD na luta contra o stress do ER
associado com inflamação, analisamos os mediadores ER da
via apoptótica. CDB atenua significativamente a indução de
moléculas pró-apoptóticos do ER por LPS / IFNγ, além do
iniciador CHOP, um importante marcador de stress do ER, e a
efetora caspase 12, como é evidente pelo tempo real (RT)-
PCR (P≤0.01: Figura 5). Além disso, o equilíbrio de pró-
apoptótico (Bax) e anti-apoptótica (Bcl-2) proteínas, que é
desregulada pelo tratamento LPS / IFNγ, retornam ao estado
basal na presença de CBD (P≤0.05). Além disso, a expressão
de GADD34, uma proteína de feedback negativo nesta via está
aumentada quando OPCs foram tratados com CBD (P≤0.001),
sugerindo que este canabinóide reprime este programa
apoptótico.
DISCUSSÃO
Neste estudo, nós mostramos que o canabinoide não-
psicotrópico, CBD, impede OPCs de morte induzida por
processos inflamatórios, ou estresse oxidativo ER direto. CBD
não modifica o ciclo celular OPC e seu efeito protetor é
inalterado por canabinóides clássicos, vaniloides ou
antagonistas dos receptores PPARγ. Além disso, o efeito anti-
apoptótico do CBD parece ser mediado pela diminuição da
expressão de efeitos pró-apoptóticos e amortecendo a
atividade da via de stress do ER. Estes resultados definem um
novo modo de ação para o CBD nas OPCs, apoiando o seu
potencial terapêutico para proteger OPCs em patologias que
envolvem a desmielinização.
Neuroinflamação é um dos principais mecanismos subjacentes
a patogênese da MS, e mediadores pró-inflamatórios são
considerados efetores principais de danos em desordens
desmielinizantes. De fato, estudos anteriores mostraram que
os estímulos inflamatórios induzem apoptose em OPCs. 6,22
Quando inicialmente estudaram os efeitos do CBD em culturas
primárias de OPC, efeitos citotóxicos só foram observados em
doses >2.5µm. Em doses de 0,1 e 1 µM, a CBD foi
previamente relatado para aumentar o cálcio intracelular e
provocar efeitos citotóxicos, 8 embora nenhum influxo de Ca2+
foi observado neste trabalho com a exposição a 1 µM de CBD.
Figura 4. A morte de OPCs é mediada pelo estresse ER, um efeito que é atenuado pela CBD através da diminuição da PKR e fosforilação eiF2α
em condições de inflamação. (a) CBD atenuando a morte de OPCs induzida por tunicamicina. OPCs foram incubadas com tunicamicina (1µg/ml)
na presença ou ausência de CBD (1 µM), e a morte celular foi quantificada 24 horas mais tarde pelo método de LDH. Os dados representam a
média ± S.E.M. de três culturas independentes analisadas em triplicata, e a significância estatística foi determinada utilizando análise de variância
de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Mann-WhitneyUtest: *** P≤0.001 contra células não tratadas, ## Pµ0.01 contra células expostas a
tunicamicina sozinha. (b) Tratamento com tunicamicina induziu a fosforilação eiF2α, um efeito que foi atenuado pelo CBD. OPCs foram incubadas
com tunicamicina (1 µg / ml) na presença ou ausência de CBD (1 µM). Extratos de proteína total foram preparados cinco minutos mais tarde e a
eiF2α fosforilada (38 kDa) e total (38 kDa) foram avaliadas em western blots sondados com anticorpos específicos. Os dados representam a média
± S.E.M. densidade óptica normalizada para tubulina de quatro culturas independentes analisadas em triplicata, e a significância estatística foi
determinada utilizando análise de variância de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Mann-WhitneyUtest: ** P≤0.01 contra células não tratadas, #
P≤0.05 contra células expostas a tunicamicina sozinho. (c e d) inflamação induzida por PKR e fosforilação eiF2α, um efeito que foi atenuado pelo
CBD. OPCs foram tratados com LPS / IFNγ na presença ou ausência de CBD (1 µM). Extratos de proteínas totais foram preparados 5 min mais
tarde e PKR (fosforilada, 68 kDa; total, a 68 kDa) e eiF2α (fosforilada, 38 kDa; total, a 38 kDa) foi avaliada em transferências de Western sondadas
com anticorpos específicos. Os dados representam a média ± S.E.M. densidade óptica normalizada para tubulina de cinco culturas, e a
significância estatística foi determinada utilizando análise de variância de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Mann-WhitneyUtest: ** P≤0.01
contra células não tratadas, # P≤0.05 contra células expostas a LPS / IFNg sozinho.

Estes resultados conflitantes podem refletir uma fonte diferente
de oligodendrócitos (nervo óptico contra encéfalo) e / ou o
estado de diferenciação das células (oligodendrócitos maduros
contra progenitores), apontando para um efeito diferente do
CBD, dependendo do estado de desenvolvimento da célula.
Embora CBD anteriormente tenha sido implicado na regulação
do ciclo celular, 1 o que descartamos por estudarmos a
possibilidade de incorporação de BrdU e progressão do ciclo
celular. É importante ressaltar as evidentes doses baixas de
CBD para proteger OPCs de morte celular induzida por LPS /
IFNγ, pela redução da caspase 3 e o número de células
TUNEL+. Embora OPCs sejam protegidos pelo CBD de danos
inflamatórios, não observamos alterações nem em nitritos nem
NOS-2 indução por LPS / IFNγ, indicando a falta de
participação do NO os efeitos protetores da CBD. Embora os
receptores CB1 e CB2 tenham sido expressos em OPCs, 7 a
proteção induzida por CBD em OPCs não foi mediada pela
ativação destes receptores. O bloqueio dos receptores
vanilóides e dos receptores nucleares PPARγ também não
teve efeito sobre a capacidade de CBD para proteger OPCs
contra danos inflamatórios, o que impede o envolvimento
desses receptores. Estes resultados são consistentes com
relatos de outros efeitos de CBD que ocorrem de forma
independente de receptores de canabinóides clássicos e
alternativos. 25
CDB protege OPCs de estresse oxidativo induzido por peróxido
de hidrogénio por diminuição da produção de ROS, consistente
com as propriedades antioxidantes atribuídas a este composto
em diferentes modelos experimentais. 26 Esta é uma
descoberta importante, pois OPCs são muito vulneráveis ao
estresse oxidativo, 27 considerado um dos mecanismos
patogénicos subjacentes da desmielinização e lesão axonal na
MS. Os oligodendrócitos são muito sensíveis às alterações na
homeostase ER. Proteínas deformadas geram stress do ER e
contribuem para a morte celular nas condições fisiopatológicas,
enquanto as mutações que afetam a dobragem dos
componentes da mielina levam a morte de oligodendrócitos. 28
Figura 5 Inflamação ativa a apoptose via ER em OPCs, um efeito que foi atenuado pela CBD. (a) CBD atenuou o aumento induzido por inflamação
na expressão CHOP. (b) A regulação positiva da expressão da caspase 12 em condições de inflamação foi atenuada pela CBD. (c) CBD restaura
o equilíbrio de Bcl-2 / Bax nas OPCs tratados com LPS / IFNγ. (d) CBD aumenta a expressão do regulador negativo de feedback GADD34 em
condições de inflamação. Em todos os casos, OPCs foram incubadas com LPS / IFNγ na presença ou ausência de CBD (1 µM). A expressão do
mRNA de cada gene foi medida 24 h mais tarde por RT-PCR quantitativa e normalizado para a expressão do gene 18S. Os dados representam a
média ± S.E.M. de três culturas independentes analisadas em triplicata, e a significância estatística foi determinada utilizando Kruskal-Wallis
ANOVA seguido de Mann-WhitneyUtest: * P≤0.05, *** Pp≤.001 contra células não tratadas; e # P≤0.05, ## P≤0.01 contra células expostas a LPS /
IFNγ sozinho.

Nós investigamos o papel do estresse ER na morte OPC in
vitro. Tunicamicina, um estressor ER, induziu citotoxicidade
OPC através de um mecanismo que envolve a fosforilação de
eiF2α, sem alterar a fosforilação de PKR, o que sugere que a
indução da via UPR o tratamento com tunicamicina pode ser
mediada por outros fatores proteicos ER transmembranares,
tais como IRE1α ou ATF6 . A ativação desta via tem sido
associada com o estado de desenvolvimento da célula 10 e aqui
apresentamos provas dos efeitos nocivos do estresse ER em
OPCs. A capacidade de CBD para proteger OPCs contra os
danos causados pelo stress ER através da diminuição da
fosforilação eiF2α destaca as potenciais propriedades
terapêuticas deste composto em estados patológicos em que
ER é comprometida pela homeostase, tal como proposto em
doenças neurodegenerativas e desmielinizantes. 29,30
Há evidências substanciais que liga a inflamação com o
estresse ER através de várias vias intracelulares. 11,24 Em
modelos animais de MS, IFNγ induz stress do ER em
oligodendrócitos mielinização ativamente, que conduz à
apoptose e anormalidades na mielinização neuronal. 31 Nossos
resultados apontam para a interação entre a inflamação e o
estresse ER em OPCs, como morte celular induzida por LPS /
IFNγ envolveu a fosforilação de PKR e eiF2α e, portanto, a via
apoptótica ativada pelo UPR. Esta via tem sido associada com
a expressão aumentada dos fatores pró-apoptóticos, tais como
o fator de transcrição CHOP (proteína homóloga C / EBP) 32
que promovem primeiramente a apoptose, reprimindo a
expressão de Bcl-2 33 ou através da indução de caspase 12. 34
Em OPCs, nós encontrado que a inflamação envolve a
ativação de caspase 3, induzindo a expressão de CHOP e
caspase 12, e alteração do equilíbrio entre Bax e Bcl-2,
implicando o stress de ER na apoptose celular.
Nossos resultados constituem a primeira evidência de que a
CBD protege OPCs de apoptose induzida por inflamação,
bloqueando estresse ER. Em condições inflamatórias, CBD
diminuiu os níveis de fosforilado PKR e eiF2α em OPCs. Além
disso, este efeito foi acompanhado pela restauração de CHOP,
caspase 12, Bcl-2 e Bax para controlar os níveis de mRNA,
juntamente com um aumento na expressão GADD34, um
regulador de feedback negativo desta via. 35
Em resumo, os resultados aqui apresentados indicam que
doses baixas de CBD exercem efeitos oligo-protetores em
OPCs, sob condições de inflamação e stress oxidativo do ER.
Em condições de stress oxidativo, o efeito protetor do CBD foi
mediado por uma diminuição na produção de ROS, enquanto
que sob condições neuro-inflamatórias, CDB combate a
apoptose através da diminuição do stress ER através da
modulação da via PKR-eiF2α. Propomos que o CBD, um
derivado C. sativa que não tem propriedades psicoactivas, é
um bom candidato para proteger OPCs de diferentes insultos
citotóxicos, com potencial terapêutico para o tratamento de
patologias desmielinizantes.
Materiais e métodos
Animais. Manipulação e cuidados com os animais foram
realizadas em conformidade com as orientações da União
Europeia (86/609 / CEE) e regulamento espanhol (BOE67 /
8509-12; BOE1201 / 2005) sobre o uso e tratamento dos
animais de laboratório, e todos os protocolos foram aprovados
pelo Animal Care local e Comitê de Ética do CSIC.
Reagentes. Reagente de Griess (sulfanilamida, N- (1-naftil)
etilenodiamina), BrdU, DCFDA, peróxido de hidrogênio, LPS e
tunicamicina foram adquiridos de SigmaAldrich (Madrid,
Espanha). IFNγ foi adquirida da Peprotech (Londres, Reino
Unido), CPZ de Alexis Biochemicals (Lausen, Suécia), CBD,
AM630 e GW9662 de Tocris (Bristol, Reino Unido) e SR1
foram gentilmente cedidos pela Sanofi-Aventis (Montpellier,
França).
Cultura de progenitores oligodendrócitos. As culturas
primárias de OPCs derivadas de ratos Wistar P0-P2 foram
preparados como descrito anteriormente, 22,36 com algumas
modificações em doi: 10.1038 / protex. 2011.218 (protocolos de
intercâmbio de natureza aberta apenas na linha). As células
foram plaqueadas em placas de poli-D-lisina-revestidas com 50
000 células / cm2 para transferência de western ou 25 000
células / cm2 para os outros ensaios, e foram mantidas durante
3 dias a 37ºC e 5% de CO2 em meio definido isento de soro
contendo 5 ng / ml de factores de crescimento (bFGF e PDGF-
AA).
Toxicidade celular. A morte de oligodendrócitos foi
quantificada através da medição da libertação de
desidrogenase de lactato (LDH) a partir de células danificadas
para o meio de banho de 18, 24 e 48 h após a exposição ao
peróxido de hidrogénio, a tunicamicina e LPS / IFNγ,
respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante
(kit de detecção de citotoxicidade, Roche, Manhein,
Alemanha). Todas as experiências compararam a morte celular
induzida com os níveis basais de morte de células nas culturas.
Ensaio TUNEL. OPCs foram semeadas em poli-D-lisina-
revestidas lamelas e mantidas durante 24 h com LPS / IFNγ e /
ou CBD. Depois de terem sido fixados em 4% de PFA, pós-
fixadas em EtOH / ácido acético durante 5 min a 20ºC e
mantida em tampão de equilíbrio durante 1 min, que foram
incubadas com a enzima TdT em um tampão de reacção
durante 1 hora a 37ºC (kit de detecção de apoptose, Chemicon,
Millipore Ibérica, Madrid, Espanha). Após a lavagem, as
lamelas foram incubadas com o anticorpo anti-DIG em solução
de bloqueio e contrastadas com DAPI. Os dados representam
as células de TUNEL+ como uma percentagem do número total
de células.
Imunocitoquímica. Para a análise de BrdU, OPCs foram
semeadas em lamelas de poli-Dlysine-revestidas e incubadas
com BrdU (10 mM) durante 24 h na presença ou ausência de
CBD. As células foram depois fixadas em PFA a 4% durante 20
min, tratou-se com HCl 2 N durante 10 min, bloqueados e
incubados com anticorpo anti-BrdU (DSHB, 1: 1000). Após
lavagem, as células foram incubadas com um anticorpo
secundário anti-rato (1: 1000) e contra-coradas com DAPI.
Para a coloração A2B5, as células foram tratadas durante 24 h
com LPS / IFNg na presença ou ausência de CBD, incubadas
in vivo com o marcador anti-A2B5 (R & D Systems, Mineapolis,
MN, EUA, 1: 200), fixado em 4% PFA e incubadas com o
anticorpo secundário (1: 1000).
Citometria de fluxo. OPCs recém isoladas foram mantidas em
placas não revestidas por 24 h com veículo ou CBD. As células
foram então colhidas, fixadas em etanol frio a 70% durante 30
min, ressuspensas em tampão salino de fosfato (PBS) e
incubadas com 100 mg / ml de ribonuclease A (Sigma-Aldrich)
e 50 mg / ml de iodeto de propídio (PI; Sigma-Aldrich) durante
30 min. Excitação com laser de Argon a 488 nm foi utilizado
para medir a fluorescência de PI através de um filtro 616/23 nm
passa-banda utilizando um citómetro de fluxo FACSAria (BD
Biosciences, San Diego, CA, EUA). Detritos e dupletos foram
excluídos da análise e um mínimo de 10000 células foram
adquiridas em cada experiência. Software de análise
FACSDiva (BD Biosciences) foi usada para definir as fases do
ciclo celular.
Medição de Ca2+ intracelular. As células foram semeadas em
lamelas e incubadas durante 20-30 min a 37ºC em PBS
contendo Fluo4-AM (0,3 mM, Invitrogen, Barcelona, Espanha)
e Pluronic F-127 (0,04%, Sigma-Aldrich). As lamelas foram
depois transferidas para a câmara de microscópio e banhado
num meio extracelular que contém (em mM): NaCl 140, KCl 5
mM, MgCl2 4, HEPES 10, glucose 10 e sacarose 6 (pH 7,35).
Todas as experiências foram realizadas à temperatura
ambiente. As células foram fotografadas com um Olympus
(Barcelona, Espanha) FV3 microscópio confocal de varrimento
equipado com uma objectiva X40 (NA, 0.8) e de emissão de
laser a 488 nm foi utilizado para excitar Fluo-4. O sinal
fluorescente gravado é apresentado como uma imagem de
pseudocor tabela de consulta a utilizado é indicado em cada
figura. O frame de aquisição foi de 1,12 s.
Determinação ROS. OPCs foram carregados com
diclorodihidrofluoresceindiacetato éster de acetilo (DCFDA, 2
µM) durante 30 min, lavadas e estimuladas com peróxido de
hidrogénio durante 2 h, ou com LPS / IFNγ para 24 h na
presença ou ausência de CBD. A fluorescência foi medida a
485/530 nm num leitor de microplacas e normalizada para o
controlo negativo.
Análise de Western blot. A análise por Western blot foi
realizada tal como anteriormente descrito 7 utilizando 30-40mg
de extracto de proteína OPC e um anti-caspase 3 clivada (Asp
175; 1: 1000, Cell Signaling Technology, Denvers, MA, EUA),
anti-fosfo (Ser 51) eiF2α (1: 1000; Cell Signaling Technology),
eiF2α anti-total (1: 1000; Cell Signaling Technology), anti-fosfo
(Thr 446) PKR (1: 1000, Upstate, Ibe'rica Millipore, Madrid,
Espanha) e anti-total de PKR (1: 1000, Millipore, Madrid,
Espanha). Antia-tubulina (1:40 000, Sigma-Aldrich) foi usado
como um controle de carga.
Extracção de RNA, transcrição reversa e RT-PCR. Todo
RNA OPC foi extraído utilizando o RNeasy mini-colunas kit
(Qiagen, Crawley, Reino Unido) e tratada com a DNsel
(Qiagen), e a concentração de RNA e a pureza foram
determinadas num espectrofotómetro Nanodrop (Nanodrop
Technologies, Wilmington, DE, EUA). O DNA total (1 µg) foi
transcrito de forma inversa utilizando o kit de transcrição
reversa da Promega (Promega, Madrid, Espanha) e RT-PCR
foi realizada em 1 µl de cDNA (que corresponde a 50 ng de
ARN de entrada) com 200 nM dos iniciadores listados abaixo
(Applied Biosystems , Warrington, UK), a quantificação de
expressão utilizando SYBR Green (Applied Biosystems). Os
ciclos de amplificação é um passo de ativação inicial ao 50ºC
durante 2 minutos e um passo de desnaturação a 95ºC durante
10 min, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95ºC durante
15 s e emparelhamento / extensão a 60ºC durante 1 min. Os
ensaios de PCR foram realizados em placas de 96 poços
utilizando um sistema de PCR em Tempo Real 7500 (Applied
Biosystems). Cada amostra foi analisada em duplicata e uma
curva padrão de 6 pontos foi executado em paralelo. A razão
entre os valores obtidos para cada gene e o gene de
manutenção da casa 18S fornecida uma quantificação relativa
de expressão. As sequências de primers 5’-3’ utilizados foram
os seguintes:
CHOP (forward 5’-CCAAAATAACAGCCGGAACCT-3’; reverse
5’-CAAAGGCGAAAGGCAGAGACT-3’),
GADD34 (forward 5’-AGCATGGACACGCCTTAGAAA-3’;
reverse 5’-AGGCTGGGAGGAGGGATTT-3’),
Bax (forward 5’-GGGTGGCAGCTGACATGTTT-3’; reverse 5’-
TGATCAGCTCGGGCACTTTA-3’),
Bcl-2 (forward 5’-TGAGAGCAACCGAACGCCCG-3’; reverse
5’-CCGTGGCAAAGCGTCCCCTC-3’),
caspase 12 (forward 5’-GAAGGAAGGCCGAACCCGCC-3’;
reverse 5’-TGCTCTGGACGGCCAGCAAAC-3’) e
18S (forward 5’-ATGCTCTTAGCTGAGTGTCCCG-3’; reverse
5’-ATTCCTAGCTGCGGTATCCAGG-3’).
Análise de dados. Todos os dados são expressos como a
média ± S.E.M. (n), onde n corresponde ao número de culturas
ensaiadas, cada uma obtida a partir de um grupo diferente de
animais e avaliada em triplicata. One-way ANOVA seguido por
teste post-hoc de Bonferroni, ou de Kruskal-Wallis ANOVA
seguido pelo teste de Mann-WhitneyUtest foi utilizado para
determinar a significância estatística de todos os casos. O nível
de significância foi estabelecido em P≤0.05.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos. Agradecemos o apoio financeiro do

Ministério da Ciência e Inovação (MICINN, projeto SAF-
2010/17501), Instituto de Salud Carlos III (RD07 projecto /
0060/0010 programa RETICS, Red Espanola de Esclerosis
Mu'ltiple, REEM). Mecha M é apoiado por REEM.
Agradecemos a Alfonso Araque e Eduardo D Martı'n por sua
ajuda com estudos eletrofisiológicos. Também somos gratos a
Joaquı'n Sancho e Elisa Baides Rosell por sua assistência
técnica excelente.