Métodos de detección directa e

indirecta de mutaciones
• Diagnóstico de enfermedades genéticas humanas
- Estrategias generales
- Métodos de detección directa de mutaciones
- Métodos de detección indirecta mediante análisis de ligamiento

• Diagnóstico genético: situaciones clínicas

• Diagnóstico prenatal de los trastornos genéticos

• Consejo genético

Cuando conocemos el gen y la mutación que buscamos, usamos métodos de detección directa
de mutaciones. Cuando el gen y/o la mutación son desconocidos, usamos métodos de
detección indirecta. También hay ocasiones en las que se conocen las mutaciones pero tienen
mucha más eficacia los métodos indirectos.

ELECCIÓN DEL MÉTODO DIAGNÓSTICO

Cuando elegimos un método diagnóstico para una enfermedad, tenemos que tener en cuenta
una serie de requisitos:
 VALIDEZ: capacidad de una prueba para diferenciar a los individuos con la enfermedad
de los que no la tienen.
 SENSIBILIDAD: capacidad para identificar correctamente a los afectados por la
enfermedad (verdaderos positivos).
 ESPECIFICIDAD: capacidad para identificar correctamente a los individuos sin la
enfermedad (verdaderos negativos).
Cada método tendrá una serie de características que hará que sea más sensible o más
específico.

PRUEBAS GENÉTICAS POSNATALES

 Cribado en recién nacidos (PRUEBA DEL TALÓN):
 Fenilcetonuria
 Galactosemia
 Hipotiroidismo
 Hemoglobinopatías
 Auditivo
La prueba del talón es un análisis de sangre realizado a recién nacidos, con el que se
diagnostican una serie de enfermedades genéticas que bien son enfermedades que con un
tratamiento muy precoz se puede evitar la aparición del fenotipo, o bien porque son muy
prevalentes en la población en la que ha nacido.
En cada país se eligen una serie de enfermedades en función de la prevalencia en la
población de ese país.

Apuntes descargados de wuolah.com

 Cribado de heterocigotos:
 Tay-Sachs (judíos asquenazíes, poblaciones pequeñas y cerradas)
 Talasemias (todos los grupos étnicos)
 Drepanocitosis (población afroamericana)
 Fibrosis quística (ascendencia europea, es el alelo más abundante en esta población)
En algunas poblaciones ha sido útil hacer un cribado de heterocigotos en adultos. Es
voluntario y trata de detectar individuos heterocigotos de enfermedades graves recesivas,
muy prevalentes en esa población, para que los individuos que portan el alelo mutado lo
tengan en cuenta al tener descendencia.
Por ejemplo, la enfermedad de Tay-Sachs, que es muy grave. Se determinaron los
heterocigotos en estas poblaciones para que así los individuos que diesen heterocigotos, si
su pareja también lo fuese, tendrían una probabilidad alta de descendientes enfermos.
Esto hizo que el número de enfermos se redujese.

Pruebas presintomáticas
Permiten detectar la enfermedad antes de su manifestación.
En familias en las que hay una enfermedad genética, tendremos individuos con la enfermedad
y querremos averiguar quiénes son portadores del alelo enfermo.
Hay que determinar el tipo de patología para elegir el tipo de diagnóstico.

PATOLOGÍA

- Con anomalía cromosómica asociada: para saber si la hay, hacemos un cariotipo.

- Sin anomalía cromosómica asociada: si la enfermedad no está causada por ninguna
anomalía cromosómica, debemos saber si la enfermedad sigue una herencia
mendeliana o no (ej - hay defectos multifactoriales, es decir, no solo tienen una base
genética, sino además tienen una base ambiental).
En el caso de que sea una herencia genética no mendeliana, podemos determinar los
factores de riesgo de la enfermedad y hacer un estudio de los mismos.
Si sigue una herencia mendeliana, depende de si conocemos el locus o no lo
conocemos (en qué cromosoma y banda se encuentra). Sin conocerlos solo podemos
estudiar los patrones de segregación en la familia que se esté estudiando. Si
conocemos el locus, dependerá si el gen está identificado o no; si está identificado
haremos un diagnóstico directo (miramos el gen y buscamos si tiene la mutación o no),
mientras que si no lo está, utilizaremos un método indirecto (este solo nos dice si un
individuo tiene el alelo mutado o no, pero no nos dice qué mutación tiene).
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE MUTACIONES
Cuando utilizamos estos métodos, siempre conocemos el gen, la mutación (mutaciones que
producen la enfermedad que estamos estudiando) y su localización.

Métodos de barrido
Con ellos diferenciamos los individuos que tienen el gen mutado (alelo) de los que no, pero
no dan información sobre la mutación (qué tipo de mutación es, cuál es el sitio exacto de la
mutación…) Solo discrimina entre alelos mutados y alelos normales.

Se utilizan para genes con fuerte heterogeneidad alélica. No sabemos cuál de los alelos
porta, solo se determina si tiene la enfermedad o no. Discriminamos si un individuo tiene la
enfermedad o no, y si sale positivo, usamos otro método para detectar la mutación concreta.

Todas estas técnicas excepto la primera, se basan en que las propiedades de los
heterodúplex son diferentes a las de los homodúplex.
Homodúplex: Fragmento de ADN donde todas las bases complementan.
Heterodúplex: Fragmento de ADN donde 2 o 3 pares de bases no complementan.
Al desnaturalizar una cadena normal y una mutada y volverlas a unir (aleatoriamente), pueden
unirse todas con todas, pudiendo formar homodúplex (dos apareamientos normales de las
cadenas complementarias) o heterodúplex (una cadena normal con una alterada), donde se
produce un desemparejamiento.

• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
• DHPLC (Denaturing HPLC)
• Rotura de desemparejamientos
• PTT (Protein Truncation Test)
• Secuenciación

• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

Se basa en las diferentes conformaciones que adquiere el

ADN cuando tiene diferentes secuencias. Una diferencia en una
sola base hace que cada una de las cadenas simples adquiera
una conformación tridimensional distinta, lo que nos permite
separarlas en un gel.

En azul está la secuencia normal y en naranja la

mutada. Con esta técnica se desnaturalizan las moléculas
produciendo 4 cadenas simples distintas. Se realiza una
electroforesis que hace que cada una, al tener una secuencia
diferente, migre a diferente altura, pues solo un cambio en una base hace que la conformación
tridimensional sea diferente. Sin embrago, siempre habrá un porcentaje de ADN que no está
desnaturalizado (porque aunque estemos en condiciones de desnaturalización siempre
permanece algo sin desnaturalizar), estará en forma de doble cadena e independientemente
de si es homodúplex o heterodúplex, no hay diferencias y aparecen en el mismo nivel.
Sabremos que hay una mutación pero no dónde.
 Por tanto, podemos determinar si un individuo es homocigoto normal, homocigoto
mutante o heterocigoto, pero no sabemos qué mutación exacta tiene. En esta técnica no se
utiliza el distinto comportamiento de los heterodúplex.

• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Este sí se basa en el distinto comportamiento de los heterodúplex. Realizaremos una

electroforesis.

Tenemos la muestra de un paciente, lo mezclamos con un ADN control con la secuencia

normal y desnaturalizamos la mezcla. A continuación vamos a poner condiciones de
renaturalización. Si el individuo tiene de verdad la mutación, se formarán homodúplex y
heterodúplex.

El fragmento de ADN que queremos estudiar tiene una región final rica en CG, las cuales
tardan más en desnaturalizarse, ya que son más estables. El gel puede ser desnaturalizante
porque le añadamos una sustancia química o bien podemos desnaturalizar por temperatura
(TGGE). Cuando la doble cadena se encuentra con estas condiciones comienza a abrirse, pero
se va a abrir sólo una parte, formándose una estructura con un extremo abierto y otro cerrado.
Esto hace que el ADN se pare en el gel, que no siga avanzando. El sitio donde se abre va a ser
diferente dependiendo de la secuencia, ya que cada una tiene un punto específico de
desnaturalización, lo que permite determinar si el individuo es homocigoto o heterocigoto
para un tipo de secuencia.

Lo que obtenemos son patrones de

bandas. Nos indican si es homocigoto o
heterocigoto y si es mutante o no.

• DHPLC (Denaturing HPLC): Cromatografía en

condiciones desnaturalizantes
 Este tipo de cromatografía puede detectar de manera
fiable desemparejamientos de una sola base en
fragmentos grandes (entre 350-500 pb). Al igual que los
anteriores, se basa en el distinto comportamiento de los
homo y heterodúplex.

En la cromatografía hay una matriz a la cual se pega el

ADN, el cual después, con diferentes sustancias, podremos
eluir. La concentración de esa determinada sustancia a la
que se eluye el ADN va a depender de la secuencia (de si
es homo o heterodúplex). Desnaturalizamos el ADN y
renaturalizamos de manera que, si hay mutación, se
forman heterodúplex, los cuales salen en un momento
diferente de los homodúplex. Si el ADN de estudio es
normal no se forman heterodúplex y en la cromatografía
solo aparece una molécula.

Hacemos pasar las muestras por una columna y cada una se quedará en una región en
función de sus características. Si se forman varios picos es porque se han formado
heterodúplex, que se quedan en estos sitios.

• Rotura de desemparejamientos

Es una técnica laboriosa pero eficaz, da buenos resultados.

Mezclamos ADN normal con ADN del enfermo, desnaturalizamos y renaturalizamos. Cuando
hay un desemparejamiento de bases, se rompe la molécula.

Al renaturalizar obtenemos dos homodúplex y dos heterodúplex distintos. Cuando tratamos

esa mezcla de ADN con permanganato potásico, este modifica las timinas que no están
emparejadas. Al mismo tiempo, mezclamos otra fracción de la muestra con hidroxilamina, una
enzima que modifica las C no emparejadas.

Luego mezclamos con otra enzima, que es la piperidina, cuya función es detectar bases que no
están emparejadas (anteriormente modificadas) y cortar. Así obtenemos fragmentos de ADN
de distinto tamaño, en caso de que se hayan formado heterodúplex, que detectamos
mediante electroforesis.
 • PTT (Protein Truncation Test)

Es una técnica específica para detectar mutaciones que dan lugar a

un codón de parada, que hacen aparecer una proteína truncada (por lo
que esta técnica solo podremos usarla en estos casos).
Para la técnica de una muestra se extrae ARNm de una célula del
paciente que, por retrotranscripción, se copia a ADNc y mediante PCR
obtenemos el ADN de cadena doble. Partimos del ARNm (maduro: no
tiene intrones y se le han colocado las secuencias necesarias para su
traducción) porque es el que va a dar lugar a la proteína. Una vez
obtenido el ADN de cadena doble se coloca en un plásmido para obtener
la expresión de ese gen in vitro. Una vez tenemos el ADN in vitro y la
proteína, podemos hacerla correr en un gel y ver qué tamaño tiene, si
está completa o le falta un fragmento.

• Secuenciación

Es un método de barrido pero también de

comprobación: puede servirnos para
secuenciar el gen entero, pero al mismo
tiempo nos da la mutación concreta.

Es útil, “fácil” y “barato”, pero solo es

fiable cuando el ADN mutado está en una
proporción alta (de células). Esto no es un
inconveniente en el caso de las enfermedades
genéticas, pues el ADN estará en una
proporción del 100% o por lo menos del 50%,
pero sí es un problema en el caso del cáncer,
pues la mutación solo aparece en algunas
células.

No existe ningún método que sea efectivo en todos los casos, por lo que tendremos
que evaluar la sensibilidad, especificidad, dificultad… de cada uno de ellos. En cada
caso tendremos que determinar y tener en cuenta las ventajas e inconvenientes de
cada técnica.
Métodos de comprobación
Detecta el gen completo: una vez que sabemos que un individuo tienen una mutación,
usamos un método de este tipo para saber exactamente cuál es la mutación.

• PCR-Digestión
• ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
• ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
• OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)
• MLPA (Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification)
• FISH (Fluorescence in situ hybridization)
• Secuenciación

• PCR seguida de digestión

Las enzimas de restricción son enzimas que cortan en una secuencia específica que han
reconocido. Podemos usar esta capacidad para detectar mutación.

Tenemos un fragmento de ADN con dos

secuencias diana para una enzima de
restricción. Cuando se produce un cambio de
nucleótido aparece una diana para un enzima
de restricción que no estaba antes, lo que
permite, amplificando y usando la enzima de
restricción para digerir el ADN, detectar
individuos homocigotos mutantes, normales o
heterocigotos. 1 y 2 son alelos. El alelo 1 no
tiene la diana intermedia; el 2 sí.

Si el individuo es homocigoto para el alelo 1, la enzima no corta, si es homocigoto para el alelo

2, tendríamos dos trozos cortados y si fuese heterocigoto tendríamos los tres fragmentos.

También puede ocurrir lo contrario, que una

secuencia tenga varias dianas para una enzima
de restricción y cuando se produce la mutación
desaparezca la diana. Esto nos dará también un
distinto patrón de banda.

• ASO: Oligonucleótidos específicos de alelo

Tenemos un ADN normal y otro mutado. Necesitamos una sonda que hibride con el ADN
normal y otra con el mutado (Una sonda es un fragmento de ADN complementario a una
secuencia). Para ello necesitamos saber cuál es la mutación exacta que queremos detectar.
Conociéndola, sintetizamos dos oligonucleótidos: uno es específico del alelo normal y otro del
mutado.
 Desnaturalizamos e hibridamos las muestras de ADN con las sondas. El individuo que sea
homocigoto normal hibridará con la sonda normal, el homocigoto mutante con la sonda
mutante y el que sea heterocigoto hibridará con las dos. Las condiciones de hibridación deben
ser muy restrictivas, pues solo hay un cambio de base y necesitamos que la mutada solo
hibride con el alelo mutante y la normal solo con el ADN normal. De esta forma no se formarán
heterodúplex.

El individuo 1 hibrida
con la sonda 1 pero no
con la 2, por lo que era
homocigoto para el
alelo normal, el 2 será
enfermo (homocigoto
para el alelo mutado) y
el 3 será heterocigoto,
pues hibrida con los
dos.

• ARMS: Sistema de mutación resistente a la amplificación

Es muy parecida a la anterior pero en

lugar de sondas usamos cebadores para
amplificar la región donde se produce la
mutación. Tenemos dos cebadores, uno que
amplifica el ADN mutado y otro el normal y
que van en direcciones contrarias (2 en cada
dirección).

Uno de los cebadores (o primers) hibrida

completamente y el otro hibrida todo menos
la última base. La Taq polimerasa se encarga
de reconocer los extremos 3’ y amplificar el
fragmento a partir del cebador. En el caso en
el que las últimas bases no están apareadas, la
muestra no se amplificaría. De esta manera conseguimos determinar qué individuos tienen los
dos alelos mutados, los dos normales o si es heterocigoto.

En la primera imagen, de los dos que se usan, uno de ellos es

más largo y puede amplificar aunque haya un bucle y el otro es
más corto, por lo que sólo amplifica si la secuencia es totalmente
complementaria con el ADN.
Podemos utilizarlo para detectar el mutante o el normal.

Esta técnica se usa más que la ASO porque es más simple.

• OLA (ensayo de ligación de oligonucleótidos)

Es una técnica muy compleja pero

que da muy buenos resultados. Se usan
varias sondas y hay varias posibilidades:

Las líneas en azul son las muestras

de ADN y lo demás son sondas distintas.

En el primer dibujo: Hay una

mutación puntual. Tenemos una sonda
común (a la dcha en cada caso), que tiene
una región que hibrida con el ADN muestra a
partir de la mutación y otras dos sondas que
son diferentes: una es complementaria con
la timina (fluorocromo en rojo + la región del
cebador) y otra con la guanina (tiene un
fluorocromo verde).

La mezcla de las tres sondas se hibrida y se incuba con la muestra de ADN. En aquel
individuo homocigoto para la timina, la sonda que es complementaria con la timina sí hibridará
y con una ligasa se une esta sonda con la común (une siempre que haya habido
complementariedad). De igual manera, la sonda que es complementaria con la guanina no
hibrida y la ligasa no puede unirla. Una vez ligado hacemos PCR y solo se amplificará la
secuencia ligada, de manera que cuando obtengamos la señal va a ser solo de color rojo. Si
fuera heterocigoto obtendríamos una señal amarilla (rojo + verde) y si fuera homocigoto para
la guanina, solo verde. “Tiramos” de la zona que no tiene la fluorescencia (dcha en la imagen,
de manera que solo veremos con fluorescencia aquellas en las que haya habido ligamiento.

Hay variaciones en esto, en ocasiones en vez de usar la señal para que se pueda
amplificar por PCR (fragmento antes de la sonda), se marca la sonda común con biotina, la cual
podemos recuperar con estreptavidina. Si tenemos una matriz de estreptavidina, la biotina se
pega de manera que, si se ha ligado, dará el color que sea (homocigotos) y si no se ha ligado no
dará color (heterocigoto).

• MLPA Amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple (¿)

Se usa para detectar la variación en el número de copias. Es muy parecida al OLA. Tenemos
una secuencia de la que queremos saber cuántas copias hay. Tenemos dos sondas:

1- Una marcada con un fluorocromo, complementaria con un fragmento de ese ADN de

estudio y que tiene una secuencia para que podamos amplificarla con un cebador
universal.
 2- Otra que es complementaria con la otra parte del ADN de
estudio, tiene una secuencia de relleno (en gris; no
complementa con nada) y termina en otra secuencia que es
complementaria con el primer reverso (permite la
amplificación).
Cuando incubamos estas dos sondas con el ADN, hibridan,
usamos una ligasa y luego amplificamos los fragmentos. Como están
marcados, podemos detectar estos fragmentos.

Tenemos una mezcla con muchas sondas que solo se diferencian

en el tamaño de la secuencia de relleno. Así, amplificaremos sondas
con tamaños distintos y podremos calcular cuántas veces está
repetida una determinada secuencia del ADN en estudio (por
probabilidad de hibridación con estas sondas).

Nos da igual en el tamaño exacto de la secuencia relleno, pues no

va a hibridar, sino que solo nos interesa tener sondas de distinto
tamaño.

Tenemos distintas repeticiones en tándem y a cada repetición se

une una sonda. Dependiendo de la concentración de cada sonda y por
probabilidad, podemos calcular cuántas veces está repetida la
secuencia. No podemos usar todas las sondas del mismo tamaño porque según los
matemáticos, si lo hacemos así, no sale.

Cuantas más secuencias haya, más sondas distintas se unirán y dependiendo de cuántos
tamaños distintos nos den (los podemos separar al tener tamaños diferentes), esto nos indica
proporcionalmente cuántas veces está repetida la secuencia. Las sondas se ponen en
concentraciones mínimas para que cuantas más copias haya, más sondas diferentes se unan.
Es algo estadístico.

• FISH (Hibridación in situ)

Esta técnica se usa para detección directa de pequeñas

deleciones o ganancia de secuencias. Se puede hacer en
cromosomas metafásicos (imagen) pero también se puede
hacer con interfásicos. Hay que desnaturalizar el ADN, hibridarlo
con una sonda marcada con fluorocromo y ver si aparecen
señales o no.

La imagen es de un individuo con síndrome de Prader

Willis (una de las causas de esta enfermedad es una
microdeleción del cromosoma 15). Podemos observar tres
sondas: una verde que marca el centrómero y que es control,
para asegurarnos de que estamos marcando el cromosoma 15; otra sonda roja que marca una
banda casi terminal del brazo largo (también es una sonda control) por último está otra sonda
que detecta la región que se pierde en este síndrome. Vemos que hay un cromosoma que
tiene la banda y otro que no. Con esta técnica no se puede saber si es el síndrome de Prader
Willis o el de Angerman, habría que saber si el cromosoma que lleva la deleción proviene del
padre o de la madre.

Usaremos el análisis de ligamiento para detectar de forma indirecta mutaciones.

Usamos marcadores específicos para identificar cuál de los dos progenitores lleva la mutación
y en cuál de sus dos cromosomas. Una vez que sepamos esto podemos determinar si sus
descendientes han heredado el cromosoma que lleva la mutación o el que no y predecir si son
enfermos o no. Para ellos usaremos marcadores moleculares. Un marcador molecular es un
sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que
se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular.

Para que sea un buen marcador necesitamos que la frecuencia de recombinación entre
el locus de la enfermedad y el locus del marcador sea lo más cercana a cero posible para que
estén lo más ligados posibles y sea mayor la probabilidad de que segreguen juntos.
Generalmente se deben usar varios marcadores y la mejor opción es buscar marcadores que
estén situados a ambos lados de donde posiblemente está la mutación.

MÉTODOS DE DETECCIÓN INDIRECTA MEDIANTE ANÁLISIS

DE LIGAMIENTO

Con los métodos directos podemos asegurar que un individuo sea sano o enfermo (que
tenga el alelo mutado o no), mientras que con los indirectos solo podremos calcular la
probabilidad de que sea enfermo o no.

Usaremos el análisis de ligamiento para detectar de forma indirecta mutaciones. En estos

lo que usamos son marcadores específicos de ADN que nos permitan identificar qué
cromosoma de los progenitores es el que lleva la mutación. Una vez que sepamos esto,
podemos determinar si sus descendientes han heredado el cromosoma que lleva la mutación o
el que no y predecir si son enfermos o no. Para ello usaremos marcadores moleculares. Un
marcador molecular es un sitio con una alta heterocigosidad del ADN, no asociado
necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus
cromosómico particular (para saber en cada momento qué cromosoma ha recibido cada
individuo de sus progenitores).

Un buen marcador será aquel que tenga una frecuencia de recombinación entre el locus
de la enfermedad y él cercana a 0, es decir, que estén muy cerca físicamente (estén lo más
ligados posible) y, por tanto, siempre o casi siempre segreguen juntos, pudiendo así calcular la
probabilidad de segregación del alelo que estemos estudiando.

Generalmente, se deben usar varios marcadores y la mejor opción es buscar marcadores

que estén situados a ambos lados de donde posiblemente está la mutación, porque si la
probabilidad de que recombine uno es baja, la de que recombinen dos será todavía más baja y
además, si uno de los dos recombinase podríamos verlo (sabemos que hay recombinación
porque se mezclan los dos marcadores). Aunque no siempre es posible usar dos marcadores.
PROCESO GENERAL EN EL DIAGNÓSTICO INDIRECTO

1. Distinguir los dos cromosomas de los progenitores. Por ello, un buen marcador es
aquel que es heterocigoto en los dos progenitores y además no coinciden los de un
progenitor con los de otro (los dos alelos del padre son distintos de los dos alelos de la
madre). Ej – 1,2 y 3,4. Aunque estos sea lo más conveniente no siempre es posible. Por
eso es muy importante encontrar zonas con alta heterogeneidad.
2. Resolver la fase de ligamiento en el individuo transmisor: con qué alelo del marcador
va el alelo transmisor de la enfermedad.
3. Determinar el alelo marcador que ha recibido el descendiente, para calcular la
probabilidad de que haya recibido el alelo mutado.

Ejemplos:
1. Se usa un marcador para estudiar la transmisión del
alelo mutado en esta familia. Este marcador tiene 4 alelos
diferentes. Madre: M1 y M2; Padre: M3 y M4 (es un buen
marcador ya que es heterocigoto en los dos y los alelos del
padre no coinciden con los de la madre).

El alelo de la enfermedad estaría ligado al M2 (está en

todos los enfermos y en ninguno de los sanos). Están en
fase.

Si la pareja va a tener otro hijo y se comprueba que no

tiene el alelo M2 no se podría asegurar al 100% que no
vaya a ser enfermo, ya que puede haber recombinación.
Podremos calcular la probabilidad de que ese nuevo
individuo sea enfermo si tenemos la frecuencia de
recombinación entre el gen y el marcador.

2. En este otro árbol se usan como alelos marcadores minisatélites.

F y H se heredan siempre juntos, lo que puede indicar que están ligados.

A y B, en todos los descendientes o tienen uno u otro, por lo que pueden ser alelos del mismo
marcador.
A y D aparecen con todas las combinaciones, lo que indica que no están ligados.
F, H y E, siempre aparecen o F y H o E. Podemos pensar que están ligados en trans. Un
cromosoma FH y el otro E pero cerca. Otra posibilidad es que F o H y E pueden ser alelos de un
gen.

Podemos ver que el alelo de la

enfermedad debe estar ligado
al I y al C, porque todos los
enfermos llevan I y C y ninguno
de los sanos lleva ni el I ni el C.