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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida como
ingeniería genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha
revolucionado la biología. El campo de la salud es uno de los más beneficiados con el
desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones que se realizan en este área están
enfocadas al diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible tratamiento a
través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la
manipulación de genes proporcionará en el futuro una herramienta fundamental para la
eliminación de enfermedades mortales para el hombre.

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos
de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que
permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro
diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria,
hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala,

ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una
superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida
por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las
bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de
proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. A esto justamente
se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de sus productos
con fines prácticos.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de
investigación:

1) El conocimiento de las enzimas de restricción.

2) La replicación y reparación de ADN.
3) La replicación de virus y plásmidos.
4) Síntesis química de secuencias de nucleótidos.
4.1 Generalidades

La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los
ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus. La utilización del ADN recombinante es una
herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas
de ADN a partir de una población de secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos
incluyen una serie de pasos:

1. Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas denominadas

endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de ADN por
secuencias nucleotídicas específicas.

2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se

unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores. Los vectores pueden
replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la
molécula de ADN recombinante recién creada.

3. La molécula de ADN recombinante, formada por un vector que lleva un segmento

de ADN insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la
molécula de ADN recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas
conocidas como “clones”.

4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el ADN

recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la
secuencia clonada.

5. Los segmentos de ADN clonados pueden recuperarse de las células huésped,

purificarse y analizarse.

6. Potencialmente, el ADN clonado puede transcribirse, su ARN puede traducirse, y el

producto génico puede aislarse y examinarse.
4.2 Fabricación del ADN recombinante.

El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante ofrece nuevas oportunidades para la

investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de ADN que codifican
genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión
génicas.

Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria

biotecnológica, que está suministrando un número creciente de productos al mercado. El
ADN recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de ADN
específicos, incluyendo genes.

Enzimas de restricción.

La piedra angular de la tecnología del ADN recombinante es un tipo de enzimas

denominadas endonucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben
este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido
nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de
nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de ADN de doble cadena, y
cortan el ADN por esa secuencia.

TIPOS

Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta
distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de
la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan
ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios
específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas
(“palindrómicas”), es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' Ö 3' es
la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'.

La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de
reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas,que tienen secuencias
nucleotídicas idénticas, son “pegajosas” (cohesivas), ya que pueden unirse a colas
complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrógeno.
Vectores

Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de ADN puede llegar

a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente,
moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de ADN debe tener
unas determinadas características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que

transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo
una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de
restricción y se utilizan para insertar segmentos de ADN cortados con la misma
enzima.
3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a
antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir
las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos
y los cósmidos.

Plásmidos.

Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas de origen

natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las
células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o
diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de
restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos.

Bacteriófagos lambda (fago λ)

Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de ADN recombinante. Se han

identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia
nucleotídica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede
reemplazarse por ADN exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y
formar calvas. Se han desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda,
eliminando diversas porciones del grupo génico central.

Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el ADN del fago con una enzima de
restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una
región central. Se aíslan los brazos y se ligan (utilizando la ADN ligasa) a un segmento de
ADN obtenido tras cortar ADN genómico con la misma enzima de restricción (en este
ejemplo, con EcoRI).

Cósmidos

Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago
lambda y de ADN plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda,
necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, y
secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que
permiten identificar las células huésped que los contienen. El ADN de los cósmidos que
contiene insertos de ADN se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar
partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como
un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos
pueden transportar insertos de ADN mucho más grandes que los que lambda puede llevar.
4.3 Aplicaciones de la tecnología del DNA recombinante.

La ingeniería genética y la biotecnología están contribuyendo y contribuirán aún mucho más

en el futuro a la medicina, la industria y la agricultura, además de al campo de la
investigación básica.

4.3.1 Aplicaciones en investigación y medicina.

Es evidente que la producción de proteínas de utilidad médica como la somatostatina, la

insulina, la hormona del crecimiento humana y los interferones, es de gran importancia
práctica. Por ejemplo, en el pasado, la hormona del crecimiento humana para el tratamiento
del enanismo hipofisario se extraía de hipófisis obtenidas durante las autopsias y estaba
disponible sólo en cantidades limitadas.

Un avance especialmente interesante es el uso de maíz y soja transgénicos para producir

anticuerpos monoclonales para uso médico. También puede ser posible utilizar plantas
desarrolladas mediante ingeniería genética para producir vacunas orales.
4.3.2 Terapia génica.

Los métodos de aislamiento y clonación de genes específicos desarrollados originalmente

como una herramienta de investigación se están utilizando actualmente para tratar
enfermedades genéticas mediante transferencia de alelos normales humanos en un
proceso denominado terapia génica. Durante décadas se han utilizado algunos productos
genéticos, como la insulina, para tratamientos terapéuticos. La terapia génica lleva este
proceso un paso más adelante, y persigue modificar el genoma de las células somáticas
transfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades adecuadas del
producto génico normal, cuya acción corregiría la enfermedad genética. La expedición de
estos genes estructurales y de sus secuencias reguladoras se consigue utilizando
vectores o sistemas de transferencia de genes.

Pueden utilizarse diversos métodos para transferir genes y sus secuencias reguladoras a
células humanas. Estos métodos incluyen la utilización de vectores víricos, las
transferencias asistidas químicamente que fomentan la transferencia de genes por las
membranas celulares, y la fusión de células con vesículas artificiales que contienen
secuencias clonadas de ADN.

Actualmente, el método más común de transferencia de genes utiliza el virus de la

leucemia murina de Maloney como vector para transportar los genes a transferir.

4.3.3 Aplicaciones industriales.

Entre las aplicaciones industriales de la tecnología del ADN recombinante se encuentra: la

fabricación de productos proteicos utilizando bacterias, hongos y células de mamíferos
cultivadas como verdaderas factorías; la mejora de cepas para bioprocesos ya existentes;
y el desarrollo de nuevas cepas para bioprocesos adicionales. Como se ha mencionado
anteriormente, la industria farmacéutica ya está produciendo diversos polipéptidos de
importancia médica mediante esta tecnología. Además, existe interés en sintetizar con
bacterias recombinantes enzimas caras e importantes desde el punto de vista industrial.
Se han desarrollado bacterias que metabolizan petróleo y otros materiales tóxicos. Estas
bacterias pueden construirse ensamblando los genes catabólicos necesarios en un único
plásmido y a continuación transformando el microorganismo adecuado. También existen
muchas aplicaciones potenciales en las industrias química y alimentaria.
4.3.4 Aplicaciones en agricultura.

También es posible evitar los métodos tradicionales de mejora genética y transferir

directamente las características deseables a animales y plantas importantes desde el
punto de vista de la agricultura. Estas técnicas tienen la capacidad de aumentar las tasas
de crecimiento y la producción global de proteínas de los animales de granja.

Se ha invertido un esfuerzo considerable en la transferencia a otras plantas de cultivo de

las capacidades fijadoras de nitrógeno de las bacterias asociadas a las leguminosas. Los
principales genes responsables de este proceso se han clonado y transferido al genoma
de las células de plantas; sin embargo, las células receptoras no han sido capaces de fijar
el nitrógeno. Si se tuviera éxito en este proyecto, los beneficios potenciales para plantas
de cultivo tales como el maíz serían importantes. No obstante, existe cierta preocupación
en torno al hecho de que las nuevas variedades fijadoras de nitrógeno pudieran
propagarse de forma indiscriminada como malas hierbas o alterar el ciclo de nitrógeno del
suelo.
LINKS

 http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%2
0recombinante.pdf
 http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html