PARTE III. BIOCONTROL.

APUNTES DE PEPE PALACIOS

Suelos supresores
Los suelos supresores, son aquellos en los cuales el desarrollo de la enfermedad está reprimida o
contenida. Esta resistencia es de origen biológico y se asocia con suelos maduros en los que los
componentes físico-químicos y microbiológicos han tenido tiempo de estabilizarse. La mezcla
de un suelo resistente o supresor con un suelo sensible transmite la resistencia.
En el sistema del suelo aparecen
microorganismos que compiten
con el patógeno. En los suelos
supresores, no es que la planta sea
resistente al patógeno, sino que
está protegida por los
microorganismos que compiten
con los patógenos.
Conforme aumentan los años de
monocultivo disminuye la
severidad de la enfermedad
porque una mayor proporción de
los microorganismos del suelo
son protectores contra el patógeno.
Tipos de suelos supresores (las diferencias dependen del rango de enfermedades que protegen):
- De tipo general: La población conjunta (suelo+microorganismo) es la que es supresora.
Esto se puede caracterizar mediante metagenómica. Los targets son más amplios y es
más difícilmente transferible porque como depende de una población completa es muy
complicado replicarla (es complicado llevar una población tan diversa a otro campo).
Los microorganismos presentes en un suelo dependen del tipo de suelo, las condiciones
ambientales… Para reducir el suelo supresor debemos insuflar vapor de agua a alta
temperatura.
- De tipo específica: Se activa contra algunos patógenos concretos. Este tipo de suelo es
transferible ya que podemos coger una parte del primer suelo (suelo supresor) y
mezclarlo con el segundo suelo, haciéndolo resistente (transferibilidad de 0,1-10%
dilución). Se puede eliminar por pasteurización que es un tratamiento suave donde se
aplican alrededor de 80ºC para eliminar los microorganismos que son potenciales
patógenos vegetales (no elimina esporulados, es decir que destruye células vegetativas
pero no esporas). El carácter supresor aumenta después de monocultivos repetidos ya
que la presencia del cultivo aumenta la población supresora, esto quiere decir que están
bien adaptados a este tipo de cultivos.
Los suelos supresivos se se han descrito contra diferentes enfermedades:
- Mal del pie del maíz Gaeumannomyces graminis var. Tritici
- Enfermedad de la sarna de la patata (Streptomyces scabies)
- Enfermedad del marchitamiento por Fusarium de varias especies de plantas
- Rhizoctonia damping-off de la remolacha azucarera
- Ralstonia solanacearum
- Meloidogyne incognita (nematodo)
En los años 60 se creía q la planta era capaz de aumentar la cantidad de bacterias PGPR y
controlar el crecimiento de patógenos.
Ej. Fusarim oxysporum en fresa:
- C: Suelo conductivo.
- S: Suelo supresor
- CS: Suelo conductivo+supresor: Mayor control de la enfermedad. Conforme pasan los
años desciende la tasa de enfermedad.
- S80: Suelo supresor pasteurizado. La pasteurización hace que aumente el índice de

enfermedad pero se va recuperando

conforme pasan los años.
Take-all decline (TDA) (detener todo)
- Supresión específica inducida por Take all (Gaeumannomyces graminis) (trigo-cebada)
- Seguimiento del monocultivo después de la fuerte incidencia inicial
- TDA presente en diferentes suelos (0.8 Mha en EE. UU. NW)
- Diferentes tasas de reactivación mediante la reinstalación de cultivos
Base microbiana del biocontrol TAD:
- Cepas de Pseudomonas fluorescents productoras de DAPG.
- Nº elevados (>105/g raíz).  Sube la producción del antibiótico conforme
mayor es la población. DAPG es esencial para el biocontrol.
- Mutantes DAPG-minus no controlan el TA.
- El propio patógeno es capaz de producir estos DAPG (inducción de la síntesis
de DAPG por el patógeno).
- No se han desarrollado resistencias significativas.
Ej.1 Bacillus puede biocontrolar el crecimiento del hongo por emisión de biocompuestos.
Agentes de biocontrol (BCA)
Los agentes de biocontrol
existen y lo que nos interesa es
caracterizarlos.
Los agentes de biocontrol son
un sector de negocio que sube
en ventas el 10% cada año. Interesa utilizar este tipo de productos porque nos permiten evitar el
uso de fertilizantes. Cada vez hay menos alternativas químicas nuevas y es más costoso poner
en el mercado un producto nuevo.
BioAg Alliance (Novozymes & Monsanto)
- Novozymes: Experiencia en fermentación de enzimas a partir de cultivos microbianos.

- Monsanto: Experiencia en ensayos agrícolas y análisis de compuestos químicos.

How to get advantge of BCA?

- Aislamiento y caracterización
- Selección de la cepa
- Uso para el control de la enfermedad
- Mejora de características
- Diseño de Condiciones de tratamiento
Los microorganismos deben estar en la superficie de la raíz y deben tener una buena habilidad
colonizadora porque si no se requerirá inocular una gran cantidad de microorganismo para que
tenga efecto. Es esencial la capacidad de colonizar y multiplicarse a nivel de superficie.
Características de un buen agente de biocontrol
Para muchos agentes de biocontrol es esencial:
- Uso rápido de exudados de raíz y semillas.
- Colonización y multiplicación en los ambientes de rizosfera y espermosfera y en el
interior de la planta.
- Producción de un amplio espectro de metabolitos bioactivos (antibióticos, sideroforos,
volátiles y sustancias promotoras del crecimiento).
- Competidor agresivo con otros microorganismos.
- Adaptación a estreses medioambientales.
 - Producción de esporas (Bacillus).
Características comerciales:
- Rápido crecimiento in vitro y producción en masa.
- Estabilidad genética.
- Efectivo a bajas concentraciones.
- Crecimiento en medio no caro.
- Fácil de dispensar.
- Larga vida útil.
- Resistente y compatible con otros procedimientos agroquímicos y de procesamiento.
- No detrimentales para la salud humana.
Proceso general para la obtención de microorganismos útiles como agentes de biocontrol
- Aislamiento de los microorganismos de los suelos supresores: Allí donde se encuentra
la enfermedad habrá zonas específicas donde la planta tendrá una mayor resistencia. Por
lo que extraemos y estudiamos el material de estas zonas.
- Observación de las actividades in vitro y ensayos en microcosmos.
- Ensayos piloto a nivel de parcela pequeña para ver disfunción.
- Realización de formulaciones, es decir que vamos a buscar la forma de hacer que
funcione en condiciones de campo.
- Pasar por los diferentes estándares de la UE.

- Explotación comercial.
Agentes de biocontrol
Bacterias:
- Pseudomonas:
o Ps. fluorescens CHAO (Keel et al, 1996)
o Ps. fluorescens Pf5 (Bender et al., 1999)
o Ps. fluorescens F113
o Ps. fluorescens WCS365
o Ps. chlororaphis
 - Bacillus
o B. cereus UW85 (Handelsmann &
Stabb, 1996)
o B. subtilis
o Paenibacillus polimixa
- Hongos: Trichoderma harzianum T-22
Los candidatos deben usarse en relación al patógeno,
el huésped y el suelo. Debemos ser capaces de ver los
mecanismos de biocontrol. El biocontrol se encuentra en el medio de interacciones complejas.
Mecanismos de biocontrol
Antagonismo:antibiosis, sideróforos, enzimas líticos
Antagonismo
El principal mecanismo es el antagonismo que se basa en la capacidad de producir compuestos
que inhiban el crecimiento de los patógenos. Estos compuestos antimicrobianos deben:
- Generarse en el micronicho correcto.
- Competir con otros microorganismos.
- Escapar de los predadores (protozoa).
Un antagonista suele ser un antibiótico. Los antibióticos son metabolitos secundarios
producidos por un organismo concreto que son capaces de inhibir el crecimiento y la
proliferación de un tipo de organismo concreto.
Nos interesa que el microorganismo produzca antibióticos y consiga inhibir el crecimiento; esto
debe darse tanto a nivel in vitro como in vivo, en el nicho donde va a encontrarse con el
patógeno.
Antibióticos producidos por agentes de biocontrol:
- Bacterias gram-:
o HCN
o Phenazines (phenazine-1-carboxylic acid, phenazine-1-carboxamine
o 2,4-DiacetylPhloroglucinol (DAPG)
o Pyoluteorin
o Pyrrolnitrin
o ZwittermycinA
o Kanosamine
- Volatiles: 2,3-butanediol, sulfur dimetil compounds
- Sulfactantes de tipo lipopéptido
Antibióticos en control biológico
Determinantes relevantes del biocontrol:
- Efecto de los filtrados: Miramos si hay filtrados que funcionen a nivel del medio. Una
vez se demuestra que hay una sustancia soluble capaz de inhibir el crecimiento se debe
pensar en mejorar la producción para ver si mejora así el biocontrol.
- Análisis de los mutantes deficientes en antibiótico.
- Potenciamiento de la producción: Mejora del biocontrol.
- Expresión heteróloga (constructos basados en plásmidos).
Detección de la producción de antibióticos in situ:
- Uso de genes reporteros.
- Técnicas analíticas: TLC y HPLC (PCA, surfactina, DAPG).
Factores que afectan la producción de antibióticos:
- Regulación interna: GacA/GacS, QS, factores sigma.
- Factores externos:
o Factores abióticos: Condiciones de temperatura, pH, mezcla de suelo y
componentes del suelo (ej. Glucosa, nitrógeno…).
o Factores bióticos: Exudados de la planta huésped (kanosamina/alfalfa),
determinantes genéticos de compatibilidad con BCA.
Diversidad de cepas productoras de antibióticos
- Amplia diversidad en la población de agentes de biocontrol.
- Diferenciación de grupos a través de técnicas moleculares (RAPD).
- Selección de cepas superiores.
Una vez tenemos los genes podemos hacer screenings genéticos para saber que organismos lo
producen y que organismos lo producen en
mayor cantidad.
2,4-Diacetylpholoroglucinol (DAPG)
Acoplado al descenso de la prevalencia de la
enfermedad, hay un aumento de la
concentración de Pseudomonas spp. productoras
de DAPG.
DAPG es un antibiótico de Pseudomonas que
controla a fitopatógenos.
- Es un compuesto de tipo polikétido.
- Phloroglucinol y derivados son
ampliamente utilizados en diferentes campos:
o >700 derivados conocidos.
o Farmacia: Relajante muscular.
o Explosivos (trinitro-PG).
- Síntesis química establecida.
- Los componentes PG se sintetizan como metabolitos secundarios a partir de
Poliketide sintasas.
- En bacterias solo es sintetizado por Pseudomonas.
- PG es producido en E.coli por expresión heteróloga.
- Son activos contra hongos y bacterias fitopatogénicas y fitotóxico anti-helmíntico.
-
- Espectro bastante amplio, en alta concentración puede ser fitotóxico. El modo de
acción no se comprende del todo bien:
o En eucariotas (levaduras) es tóxico a nivel de mitocondrias y en bacterias a
nivel de membrana celular.
o Inhibe zoospore swimming.
 o Responsable de la ISR en plantas.
Es una estrategia general y amplia dentro Pseudomonas fluorescens.
Los principales genes implicados en la síntesis de DAPG son phIA,B,C que producen por
acción conjunta el compuesto final. Y también es importante phID que es el productor inicial. El
resto de genes son reguladores.

Regulación de la biosíntesis de DAPG

- Regulación compleja:
o Cascada de regulación postrancritional a partir de RNAs regulatorios (Gac /
Rsm)
o PsoR, un regulador LuxR solo sensible a compuestos de plantas. LuxR es un
regulador típico de QS que va en pareja con LuxY.
o Factores sigma rpoS y rpoD: Tienen la función de unirse a la caja TATA
durante el proceso de transcripción. Es el componente de la RNA-Pol que le da
la especificidad del reconocimiento. Hay diferentes tipos de factores sigma y
cada uno reconoce unos genes u otros. Controlan los genes que se transcriben o
no en un momento especifico, llevando a la RNA-Pol allí donde se encuentra el
gen que nos interesa
o Otros reguladores: represor PsrA
o Chaperona de RNA Hfq
- Síntesis también autorregulada por DAPG (autoinductor)  Induce a un aumento
rápido de la producción de DAPG.
- Biosíntesis controlada por algunos compuestos del suelo (salicilato, pioluorina, ácido
fusárico) que antagonizan la autorregulación
- Las fuentes de carbono exudadas de las plantas afectan la síntesis de DAPG
Regulation of DAPG synthesis by PsoR in Pseudomonas fluorescens
PsoR responde a compuestos de la planta (loops R solos). La inducción de este antibiótico es
compleja. Mutantes en el regulador son incapaces de producir defensa a la planta.
PsoR potencia la expresión de genes phl en P.fluorescens en células de vida libre y en raíces de
trigo pero no en raíces de pepino.  Esto es así porque la interacción bacteria-planta es
específica y varía de unas especies a otras.

Lipopéptidos cíclicos los mayores determinantes del biocontrol en cepas de Bacillus

- Péptidos cíclicos de origen no-ribosómico.
- Sintetizados por NRPS (péptidos no ribosómicos sintetasa) en Bacillus y Pseudomonas.
- Clusters de cinco genes para NRPS han sido encontrados en Bacillus amyloliquefaciens
FZB42, hecho que permite producir 5 lipopéptidos distintos.
- Alta variabilidad en:
o Tipo y secuencia de los
residuos áá.
o Naturaleza de la ciclación
del péptido.
o Naturaleza, longitud y
ramificación de la cadena
de ácidos grasos.
- Funciones múltiples:
 o Buenos sulfactantes: Disminuyen la tensión superficial del agua y hace que el
líquido esté dispuesto de forma homogénea sobre la superficie, lo que permite
una mayor dispersión de sí mismo y de los nutrientes que produce.
o Antibióticos directos sobre bacterias.
o Producción de biofilms: Si faltan los lipopéptidos cíclicos su producción se ve
alterada.
o Motilidad en superficie (twitching).
o Inducción de ISR en plantas.
- 3 familias principales:
o Surfactina
 Heptapéptidos con β-ácidos grasos (12-15 C).
 Entra bien en las membranas, inhibido por colesteroles.
 Activos contra virus y bacterias pero no contra hongos.
Los genes de la surfactina son muy grandes y cada uno consta de diferentes módulos (sfrA-A,
sfrA-B, srfA-C, sfrA-D). Cada módulo del operón es capaz de captar diferentes áá (ej. srfA-C
capta Leu). Según la combinación de módulos

tendremos una secuencia u otra.

- Iturina:
o Heptapéptidos con β-ácidos grasos (14-17C).
o Forman poros en las membranas.
o Activos contra hongos, poco activos frente a bacterias.
- Fengicinas:
o Decapéptidos con β-ácidos grasos (14-18C).
o Interacción con membranas.
o Activo contra hongos.
Los lipopéptidos inhiben el crecimiento del
hongo en la superficie de la planta. Tienen un
efecto sobre la estabilidad y mantenimiento de
membrana
s.
Por otro
lado,
participan
en el
proceso de
swarming. El swarming es el movimiento en forma de hélice del flagelo de un conjunto de
bacterias, este permite el movimiento de las bacterias en medio semi-sólido.
La surfactina es la más importante porque permite el crecimiento y el movimiento vía
swarming.
Los lipopéptidos también alteran la formación de biofilm. La surfactina es la más importante
para el mantenimiento de los biofilms. Los biofilms facilitan la colonización y otorgan
protección contra agentes externos.
Los lipopéptidos tienen un papel relevante en la competencia a nivel de rizosfera ya que no
dejan de ser compuestos bioactivos que tienen diferentes efectos sobre patógenos; están
orientados a que la planta sea infectada por menos bacterias.

Biocontrol en antibióticos de Pseudomonomas fluorescens

Componentes antibióticos producidos por Pseudomonas
fluorescens que son relevantes para el biocontrol:
- Cianídico o cianido hidrogen (HC-N): Tiene un carácter volátil.
Algunos compuestos volátiles orgánicos son capaces de inhibir
el metabolismo y crecimiento de los hongos. En el experimento
trabajan con placas que dividen en dos secciones separadas. Se
ve que continua habiendo microcontrol a pesar de la separación,
esto es así porque la transferencia se da a nivel de compuestos
volátiles.
Por otro lado, los
compuestos volátiles
promueven el crecimiento
en plantas. Se ha visto que
Pseudomonas induce al
crecimiento de plantas
Medicago, a su vez que
inhibe el crecimiento de Botrytis.
Compuestos volátiles que contienen Azufre:
- Di-metil Sulfito
- Di-metil disulfito
- Di-metil trisulfito
- Metanotiol
Se producen en cantidades pequeñas y se ha visto que algunos tienen efecto sobre el biocontrol.
Producción de hidrógeno cianida (compuesto volátil):
- La producción de CN es tóxica para la planta porque bloquea el transporte de electrones
a través de la cadena respiratoria.
o El crecimiento de la planta se ve inhibido debido a la cianogénesis producida
por P. fluorescens.
Sideróforos y biocontrol
El hierro (Fe) es una molécula muy abundante en la Tierra, pero también es altamente insoluble
bajo condiciones oxidantes. Es un poco inestable en medio sólido, se requieren agentes solubles
para captar este hierro y para ello es necesario acidificar el suelo o bien utilizar sideróforos.
Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular (400-1500 Da) con alta afinidad (Kd <10-
20
M) y bastante diversas (>500 conocidas, 270 estructuras resueltas).
Hay 3 tipos de estructuras sideróforas – hidroxamatos, catecolatos, carboxilatos – que constan
de oxígenos en los extremos que les permiten unirse con Fe3+. Su entrada en la célula requiere
de receptores específicos que reconocen la unión de sideróforos y Fe3+.

Tipos de sideróforos
Los sideróforos participan tanto en patógenos como de agentes de biocontrol. El Fe3+ es
necesario para todos los tipos de organismos.
 - Pioverdina: Molécula siderófora compleja. Este compuesto se produce en medios con
bajas concentraciones de Fe.
Detección de sideróforo en placa: Para saber si se está produciendo un quelante de hierro se
utiliza el medio CAS, medio que consta de Blue agar-cloroazurol. El medio es azul y tiene
unido Fe, si la bacteria digiere el Fe que está unido al medio este cambia de color y adquiere un
tono anaranjado. Este es un método cualitativo que nos permite saber que bacterias ingieren
Fe3+, por densidad óptica podemos saber qué cantidad de Fe ha sido ingerida.
Transporte de sideróforos
Los genes implicados en la captación son muy importantes. La captación se da a dos niveles,
dependiendo del tipo de bacterias:
- Bacterias Gram-: Captación de los
sideróforos a través de la membrana externa.
Este tipo de transporte suele requerir energía
(ATP), por lo que suele estar unida con la
membrana interna mediante TBD.
Constan de un sistema de internalización
que participa en la captación de Fe3+. Este
sistema está conectado con el espacio
periplásmico a través de sistemas ABC que
constan de un receptor en la membrana
externa y una molécula periplásmica que
permite la entrada la molécula del exterior,
al interior celular. Una característica
general del metal en las células es que la mayoría de iones están quelados con
moléculas de unión de elevada afinidad.
- Bacterias Gram+: Permeasa que consta de transportador de tipo ABC. Pueden constar
de un membrane-anchored binding protein que facilita el proceso de captación. Una vez
 se ha producido la entrada del sideróforo con el Fe, se da la reducción del Fe (Fe3+ 
Fe2+).

Competencia basada en sideróforos

Lo ideal sería que nuestro organismo constará de sistema de síntesis de sideróforos, junto con
un sistema de captación. Pero podemos encontrar algunos organismos que solo consten del
sistema de captación y tengan mutado el sistema de síntesis.
Estos organismos serán más competitivos porque captarán
los sideróforos del medio, de otras bacterias, y no tendrán
que invertir tanta energía en el proceso. Por otro lado,
también hay bacterias que solo constan del sistema de
captación.
- Hay sideróforos con afinidad por el Fe3+ elevada y
baja. Tener mayor afinidad, les permite crecer más
que las otras bacterias porque tienen una mayor facilidad de captación de Fe3+.
Ej. Reducción del crecimiento de Colletotrichum debido a la acción del sideróforo Burkholderia
que actúa captando el Fe3+ e inhibiendo el crecimiento del hongo.
Producción de enzimas líticas en biocontrol
Otro agente directo del antagonismo, es la
producción de enzimas hidrolíticas. Estas
enzimas son producidas sobre todo por hongos,
especialmente Trichoderma, que están
implicados en el biocontrol. Estos producen
glucanasas, proteasas, quitinasas y oxidasas
que son
capaces
de
degrada
r
estructu
ras
externa
s y
parar el crecimiento.
La mayor parte de las enzimas son quitinasas (21%) pero también hay otras que desestabilizan
la membrana como las glucosaminidasas, glucanasas y las proteasas. Estos mismos enzimas se
han utilizado a nivel de planta para controlar el crecimiento patogénico.
Tricoderma es capaz de perforar la pared, hecho que induce a la salida de nutrientes por el
orificio. Esta salida de nutrientes hace que la planta no pueda crecer (inhibición del
crecimiento).
En este caso, el agente antagonista es directamente una enzima que degrada la pared externa del
hongo. La expresión excesiva de alguno de estos componentes puede afectar a la planta.
Interferencia de moléculas señalizadoras
Consiste en la capacidad que tienen algunas moléculas señalizadoras para interferir en la
capacidad de interacción entre patógenos. Este mecanismo está basado en la degradación de las
señales de comunicación célula a célula (AHL):
- La acumulación de señales de Quorum sensing (QS) es esencial para la coordinación
del comportamiento del patógeno (Quorum sensing, QS), hace que se comporten de la
misma forma simultáneamente. La interferencia con la señalización (QS) induciría a un
descenso de la eficacia del patógeno.
Apantallamiento del QS vía:
- Interferencia con la señal de QS, haciendo que sea reconocida en menor proporción.
- Eliminación de las señales, haciendo que no puedan acumularse.
El QS es un sistema de regulación de 2 componentes que consta de un autoinductor y un
regulador de la respuesta que detecta la señal. Este es un sistema que regula la expresión génica
en función de la densidad celular. El hecho que dependa de la concentración general hace que se
activen las diferentes células de forma simultánea.
De este sistema dependen muchos otros como: generación de factores de virulencia, motilidad,
producción de antibióticos y biofilms, inhibición del crecimiento. (*)Todo son características
relacionadas con la capacidad de infectar.

- Inhibición del QS mediante el uso de moléculas capaces de eliminar o inhibir los

receptores (AHL lactonasas y AHL acilasas) que reconocen el compuesto (no funcionan
en base de la densidad poblacional).
- Quenching: Degradación de las señales que hacen que no aumente la cantidad de señal
y no se activen estos mecanismos.
- Producción de miméticos por parte de la planta, que generan interferencias con la señal.
- Generación de plantas transgénicas que expresen QS o funciones QS.  Generación de
plantas degradadoras de AHL para separar la señal que producen las diferentes células
entre sí. La falta de AHL hace que la proliferación sea menos efectiva.
Estos sistemas de síntesis son muy importantes para el desarrollo y la regulación global de las
bacterias fitopatógenas; Pseudomonas consta de muchos sistemas. En el caso de AHL, este
actúa regulando muchos procesos y vías (ej. Hrp, sistema de secreción tipo III). La interferencia
en AHL y, por tanto, en la señal de densidad poblacional tiene efecto en muchos procesos.
Biological control of pathogen communication in the rhizosphere: A novel approach applied
to potato soft rot due to Pectobacterium atrosepticum
En el caso de Pectobacterium, productor de muchos enzimas hidrolíticos en patata, la
acumulación de señales es la que induce a la producción de enzimas hidrolíticos. Este hecho
puede tener una aplicación a nivel del medio/suelo: la introducción de análogos de inductores de
AHL en el medio, llevaría a un enriquecimiento del suelo en bacterias capaces de degradar el
compuesto que se encuentre en el suelo.
El suelo se vio enriquecido de bacteria quelante: El 70% de la población aislada era capaz de
degradar GCLs y AHLs.  Esto lleva a una eliminación de las señales de QS y evita que las
bacterias patógenas puedan sincronizarse e infectar a la planta.
GCL y AHL son similares en estructura, por eso las bacterias que hemos introducido en el suelo
son capaces de eliminar el AHL y evitar la proliferación de la infección.
Estudio 2: Expression of AHL synthases on transgenic plants
Inducimos a una sobreexpresión de AHL en la planta, hecho que puede despistar a las bacterias
y hacer que produzcan la enfermedad a destiempo. Aplicando este mecanismo, se pudo ver que
las bacterias eran más susceptibles ya que a dosis más bajas se inducía la infección (aumento de
la virulencia).

Predación y parasitismo
El fitopatógeno Trichoderma es capaz de crecer sobre Neurospora y matar las hifas a base de
producir lesiones, eliminar la pared y parasitar directamente las hifas.
Se ha visto que durante el proceso de micoparasitismo se dan intercambios de señales entre el
hongo patógeno y Trichoderma. El hongo patogénico produce principalmente enzimas
hidrolíticos como hidrolasas que hacen que la hongo emita
péptidos o pequeñas moléculas y produzca ROS y
metabolitos secundarios. Al final, Trichoderma consigue
producir roturas en la pared de las hifas que inhibirán el
crecimiento del hongo.
Hay bacterias que son capaces de parasitar hongos, algunas bacterias son capaces de alimentarse
a partir de hongos.

Las bacterias constn de tres estrategias para conseguir nutrientes de los hongos (participan los
sistemas de quimiotaxis y QS):
- Necrotrofia extracelular: Consiste en la digestión de la pared.
- Internalización y biotrofía (biotrofía endocelular).
- Biotrofía extracelular o producción de exudados por parte de la hifa: Exudación de
ácidos orgánicos, proteínas y otros para alimentar a la bacteria.
Diálogo entre Collimonas-Aspergillus:
- Bacteria capaz de detectar presencia del hongo. Se aprovecha de los exudados fúngicos,
los cuales producen una respuesta relacionada con la producción de antifúngicos.
Cada bacteria puede constar de diferentes sistemas de protección. Otro sistema importante es el
de capacidad de colonización, por lo que se tiene que seleccionar de forma simultánea por la
capacidad de colonización y los mecanismos de protección.

Resistencia inducida en plantas

Bacterias no patogénicas que inducen una respuesta en plantas y las hacen más resistentes. Por
otro lado, no dispara directamente los mecanismos de defensa, sino que lleva a la planta a un
estado de priming (pre-emergencia) que hace que sea más eficiente frente a una infección
posterior. La activación de estos mecanismos por la presencia de bacterias no patógenas, induce
a una mejoría de la resistencia.
Muchos investigadores se plantean sí… ¿Puede ser que la ISR sea una situación normal porque
la raíz siempre está en contacto con bacterias no patógenas? Es decir que se cree que es un
sistema que la planta presenta activo por defecto.
En ISR no se inducen directamente proteínas de defensa, sino que se induce un priming que
hace que las plantas estén pre-inducidas. Las fases que inducen a ISR están presentes en
cualquier sistema. Se sabe que alguno de los productos de las bacterias (ej. DAPG) puede
inducir a esta respuesta ISR.
No solo la presencia de bacterias induce a ISR, también es inducida en ausencia de bacteria, por
productos o compuestos de estas.
En condiciones de riego o sequía, el tipo de bacterias que aparece es distinto. Vemos
inducciones de diferentes bacterias o agentes de biocontrol. Esto indica que ISR no es una
respuesta homogénea y probablemente está modulada.
Muy probablemente la planta tenga activa la ISR de forma normal, pero podemos inducir a una
mayor expresión del sistema mediante la producción de compuestos o la interacción con
bacterias u hongos.
La colonización infectiva impide que otro organismo llegue. Pero, ¿cómo podemos saber que
una bacteria es una buena colonizadora?
Debemos crecer las bacterias a nivel de raíz y ver cuál es su proliferación.
Inicialmente tenemos las bacterias de la rizosfera que inocularemos en la planta a nivel de raíz.
Posteriormente, aislaremos a partir de la punta de la raíz; juntaremos todas las muestras y
repetiremos el proceso. Después de varios ciclos, podremos seleccionar los microorganismos
que mejor capacidad colonizadora tengan, es decir, aquello que se encuentran en mayor nº de
ciclos y en mayor proporción en la punta de la raíz.
Mediante la maceración del pie de la raíz, seleccionamos las bacterias que son capaces de llegar
primero a la punta de la raíz. Estos agentes de biocontrol tienen una serie de ventajas que son
distintas de las vistas hasta ahora (los anteriores eran agentes canónicos).
Las cepas que se han utilizado aquí, son capaces de biocontrolar pero no tienen un efecto
antifúngico en placa. Por lo tanto, no tienen efecto de toxicidad. No producen muchos de los
productos que podríamos pensar que interfieren en el crecimiento de la planta. Por ello, se les
conoce como microorganismos de bajo riesgo. Tienen la capacidad de tapizar las raíces por la
acción de múltiples genes, hecho que facilita el crecimiento y la defensa de la planta.
- Relacionado con: quimiotaxis, motilidad, adhesión… Son bacterias más suaves para el
sistema ya que no se llevan por delante otras bacterias ni el conjunto del sistema.

Competencia por nutrientes y nichos

El genoma de Pseudomonas no consta de rutas de síntesis de compuestos antimicrobianos y
proteolíticos. Hecho que hace que sean moléculas de biocontrol muy interesantes ya que tienen
un buen efecto sin tener una gran toxicidad.
Generaron una genoteca con 100.000 inserciones para inocular plantas y ver cuáles son estables.
Para hacer el experimento, inocularon Arabidopsis y determinaron su capacidad de colonización
el medio. Realizaron una comparativa con un medio wt para buscar alteraciones, es decir,
determinar cuáles no consiguen colonizar (bacterias no presentes). Seleccionamos los casos en
que no ha habido colonización, para ver la función del gen truncado que ha impedido el proceso.
- Hay que poner un nº de bacterias/planta suficiente para tener una buena representación.
Actualmente, se está trabajando mucho con mutantes de rizosfera para determinar aquellos
genes que son importantes para la colonización y el biocontrol.
Principalmente interesan aspectos de la motilidad: La motilidad es un carácter con una
regulación compleja. Interesa obtener bacterias con una elevada motilidad celular ya que así
tienen una mayor capacidad de llegar a nuevos lugares y colonizar. Se han estudiado mutantes
en reguladores como SadB, QuinB. En mutantes simples no vemos efecto, mientras que en
mutantes dobles y triples tenemos un aumento de la motilidad ya que tienen una mayor
disfunción en placa.
Posteriormente, estudiaron si estas mutaciones tenían algún efecto en caracteres de biocontrol
como la producción de vioperdina y producción de exoproteasas, ambos caracteres se
mantienen. Interesa que los mutantes de motilidad no vean alteradas sus características en otros
caracteres.
Se ha visto que el triple mutante KSW es capaz de colonizar mejor y controlar mejor que el wt.
Aquellos que no tienen variaciones en caracteres de producción de compuestos secundarios son
buenas líneas y nos interesan.
Otro ejemplo. En otro caso vemos que nuestro organismo no ejerce biocontrol en placa ya que
no vemos producción de compuestos antibióticos, pero si induce biocontrol en planta. Esto
indica que estos microorganismos son menos tóxicos y tienen una mejor colonización que los
patógenos, no gracias a la producción de compuestos tóxicos sino a su gran motilidad.
Ej. El Penibacillus aumenta el biocontrol, disminuyendo los niveles de hongo; gracias a una
mayor capacidad colonizadora y no debido a los filtrados de los cultivos.
En algunos estudios se ha visto que hay competencia por los nutrientes, es decir que la bacteria
es capaz de utilizar los componentes de forma más eficaz que el patógeno. En función de la
cantidad de sustrato que pongamos (ej. Jugo de naranja) habrá un mayor o menor biocontrol.
Contra mayor sea la concentración de alimento más dificultoso será el biocontrol.
En el caso de la mandarina, la adición de diferentes compuestos favorece el crecimiento del
hongo. Se produce una competencia de la levadura con los patógenos por la adquisición de
compuestos limitantes.
La competencia por nicho y nutriente es una estrategia relevante en ausencia de alguno de los
factores que hemos tratado al inicio.
Interferencia con otras actividades del patógeno
Las Pseudomonas actúan reduciendo aspectos específicos de la fisiología de hongos ya que
compite por exudados, se alimenta a partir de exudados de hongos y es capaz de reducir el nº de
esporas y conidios que produce el hongo, haciendo que su crecimiento y extensión sean
menores.
Frasco de Ruggs: Sistema que consta de paja húmeda que es donde crece de forma adecuada el
hongo. Además consta de una parte donde se encuentra el tratamiento o microorganismo, junto
con una trampa de esporas.  Este sistema nos permite determinar la capacidad de expansión
del hongo.
Cepas de biocontrol de interés comercial
Selección de cepas para biocontrol
- Para obtener el material de partida debemos ir a la zona donde está presente la
enfermedad y buscar suelo supresor, es decir, aquella área donde se encuentren los
árboles más sanos dentro del perímetro donde hay enfermedad.
- Estrategias de screening y orden de uso:
o Procedimientos in vitro
o Ensayos de colonización, capacidad de infectar endófitos, capacidad de PGPR.
o Uso de marcadores moleculares.
Ej. Búsqueda de agentes de biocontrol para una enfermedad en patata:
1. Búsqueda en suelo donde puede haber agentes de biocontrol, es decir en suelo donde
estaba presente la enfermedad (seleccionar patatas con buen crecimiento, resistentes).
2. Uso de suelo irradiado para el estudio.
3. Inocular patatas con mezcla de tierra.
4. Selección de las patatas con mejor capacidad colonizadora y de biocontrol.
Este tipo de estudios se ha hecho en muchos sistemas y se han estudiado los mecanismos, la
mayoría son de antibiosis.
¿Cuál es la mejor estrategia?
- Estrategia de protección directa: Consiste en coger una muestra de suelo y la aplicamos
como biocontrol sobre las plantas.
- Estudio de la capacidad antagonista en planta: Nos interesa ver que plantas son capaces
de biocontrolar en placa.
- Selección de sistemas de buenos colonizadoras.
Las estrategias de colonización y biocontrol son más multigénicas ya que seleccionamos un
carácter que depende de muchas cosas. En este caso, estamos seleccionando individuos con
muchos caracteres positivos simultáneamente. La selección en placa nos permite seleccionar
para un carácter muy concreto como sería la producción de un antibiótico o un agente volátil.
Además, suele requerir muchas más pruebas y no nos indica que la colonización vaya a darse
adecuadamente.
Biocontrol en post-cosecha
- Es un sistema más sencillo ya que no entra en juego el factor suelo, por lo que no
requiere el estudio de la rizosfera.
- Hay que tener en cuenta la producción de antibióticos y tóxicos ya que ponemos los
compuestos sobre la superficie de la planta/fruta, la cual suele ingerirse.
En post- cosecha se producen pérdidas del 5-20% en USA. Se puede realizar control químico
pero este puede dejar residuos y tener problemas bioacumulativos.
A nivel de post-cosecha, tenemos un sistema específico que es la superficie de los frutos. En
este caso, requerimos de una colonización rápida por un microorganismo que evite la
colonización de patógenos. Nuestro microorganismo debe tener:
- Condiciones óptimas similares a las del patógeno: Esto permite que crezca en las
mismas condiciones que el patógeno, generando así una competencia.
- Compatibilidad con manejo químico.
- Compatibilidad con el consumo humano.
- Susceptibles de formulación
- Aplicación sencilla
Enzimas hidrolíticos, parasitismo, producción de IRS (capacidad defensiva).  Los
microorganismos que cumplen estas características podrían ser las levaduras porque son agentes
mucho más seguros y su hábitat normal es la superficie de las frutas. Las levaduras están
bastante adaptadas a crecer en condiciones de alto azúcar, baja temperatura, son capaces de
sobrevivir en condiciones duras y muchas levaduras son seguras (se hacen test específicos de
crecimiento a 37ºC para evitar trabajar con ellas e infectarnos).
Para seleccionar cual es el mejor agente de biocontrol es necesario realizar un análisis mixto, es
decir que hay que tener en cuenta el ambiente, el agente de biocontrol, la planta y el patógeno.
Es un sistema donde intervienen estos cuatro compuestos diferentes.

La levadura es uno de los principales agentes de biocontrol, por ello en algunos estudios buscan
caracterizar la defensa de las levaduras, es decir que estudian el funcionamiento de las levaduras
en condiciones controladas.
Ya hay productos comerciales de levaduras: Diapo
Principalmente, se utilizan levaduras en cerezas y fresas ya que son productos muy delicados.
En este tipo de estudios se ha visto que la protección es mayor a 0ºC que a temperatura
ambiente. Es decir que las levaduras tienen un control más efectivo a bajas temperaturas.
Mejora
- Control de las condiciones ambientales que acompañan el tratamiento: Temperatura,
humedad, concentraciones de sal adecuadas que mejoran la actividad de los agentes de
biocontrol.
o Chalara elegans + Vapor = Efecto sinérgico que induce a un mayor biocontrol
por parte de la levadura.
o Agente de biocontrol + Sales de Calcio (Cl2Ca)
- Uso de cultivos mixtos que puedan expandir el rango de acción.
- Manipulación genética y fisiológica (no aceptación general): Adaptación a sequedad y
mayor eficiencia en la captación de hierro (producción de sideróforos).
- Aplicaciones en pre-cosecha. PROB: Si hay alguna herida
- Formulaciones:
o Sólido: Más fácil de empaquetar y vida más larga en no refrigerado.
o Liquido
 Se suele utilizar con co-adjuvantes como quitosán, SA, JA los cuales
mejoran la respuesta, actúan sobre la planta.
Productos para el biocontrol
Se requieren 3-4 años para poner en el mercado un producto de biocontrol y se requieren una
media de 10 millones.
- Bacilus thuringiensis: Uso como bioinsecticida.
- Agrobacterium, B.subtilis, Pseudomonas sp.
BIOCOMES: Proyecto que quiere desarrollar once productos de biocontrol distintos que
participan en:
- Control de enfermedades de hongos.
- Antagonistas.
- Tecnologías de producción
- Control de enfermedades de insectos.
Biocontrol por A.tumefaciens
K84 interfiere a nivel de la síntesis de la carga de los tRNA de Leu. Este sistema está basado en
un plásmido al que se le ha eliminado la capacidad de transferencia para mejorar el rendimiento
del proceso.
Este es un producto de uso estándar en viveros: se usa en rosales y en frutales, donde se
sumerge la planta en turba con al menos 109 bacterias/g.
Bacillus y Pseudomonas
Hay varios productos en el mercado.
Legislación de los agentes de biocontrol
Todos estos productos para ser comercializados deben pasar por una fase de registro. El sector
de los agentes de biocontrol está creciendo mucho y requiere una serie de caracterizaciones y
definiciones:
- Pesticidas: Compuestos capaces de destruir las pestes u organismos dañinos para la
planta.
- Productos de protección (agentes de biocontrol): Otorgan protección a la planta.
El procedimiento de autorización es similar al de otros compuestos. Actualmente, los agentes de
biocontrol se consideran como materia activa y su aprobación consta de 3 niveles: generación de
informe local, informe zonal e informe de los estados miembros.
Los compuestos low risk que son aquellos que están basados en la colonización y exclusión de
nichos y no producen toxinas, se suelen aprobar más rápido.
Los organismos que actúan como agentes de biocontrol, a efectos de aprobación, se consideran
sustancias activas y requieren un mínimo de 3 años.
Algunos son declarados como fertilizantes o bioestimulantes porque constan de este papel. En
este caso, el criterio de aprobación es mucho más relajado y nos saltamos la parte más compleja
de aprobación de los compuestos de protección de cultivos.
Muchos de los compuestos que se venden como bioestimulantes, se dice que también son
agentes de biocontrol pero no se puede asegurar completamente debido a que no está legitimado
por la legislación.
- Aislamiento de nuevos sistemas. Son muy importantes los sistemas de formulación y el
timing de formulación (cuando, donde se deben aplicar).
- Implementación de estrategias IPM
- Faltan mecanismos que aseguren el uso de estos microorganismos, sobretodo para saber
el efecto que tienen sobre otros organismos.
- El registro de microorganismos de bajo riesgo facilita el sistema y permite la venta del
producto de una forma más sostenible.
Este es un sector que se tiene que afianzar a nivel de legislación.

Perspectivas de futuro
Microbioma
Uno de los problemas principales del uso de agentes de biocontrol en suelo es la competencia.
La respuesta en condiciones naturales varia por efecto de la competencia ya que en condiciones
naturales hay una mayor concentración de bacterias del mismo tipo y, por otro lado, hay cepas
que están adaptadas a condiciones de laboratorio pero no a condiciones de campo.
Es necesario tener en cuenta la comunidad bacteriana que comparte nicho con nuestro agente de
biocontrol.
Se ha visto que las plantas son capaces de modular la microbiota que hay a su alrededor. Las
plantas son capaces de atraer compuestos de biocontrol como los benzoxazinoides.
Hay una gran diversidad de microorganismos y se ha visto que los microorganismos que se
encuentran en la rizosfera no son muy distintos de aquellos que se encuentran en el microbioma
intestinal. Se cree que se pueden hacer extrapolaciones de un sistema al otro.
Como responde un microbioma de rizosfera a una infección especifica:
- La infección induce a la expresión de transportadores de malato a nivel de raíz. El cual
induce a la producción de ácido malato, el cual atrae a Bacillus que es un organismo
potencialmente beneficioso que lleva a una reducción de la infección.
En algunos trabajos se expone que se debe modular el microbioma, modular los diferentes
agentes involucrados en el biocontrol. Los agentes de biocontrol pueden actuar directamente
sobre el patógeno por antibiosis, sobre el huésped o bien por interacciones en el microbioma.
Bacillus NJN-6 (Banana): Presenta un mejor control de la incidencia de la enfermedad.

PRÁCTICAS
Actinomicetos: Bacterias filamentosas gram+ con alto contenido de GC