Fundamento de coloraciones basicas para el área de Microbiología.

Coloración de Endospora.
Reactivos:

 Verde de malaquita flameable o no flameable al 5%

 Safranina
Procedimiento:
- Tomar cepas del genero Bacillus (B. subtilis o B. cereus) y en una placa porta objeto
colocar una gota de agua destilada, con un asa bacteriológica tomar parte de la cepa
y diluirla en la gota de agua, esperar a que se seque y luego proceder a la coloración.
- A la placa ya antes preparada, adicionar verde de malaquita y dejarlo entre 5 a 8
minutos (con verde de malaquita inflamable, dejar 5 min. Con verde de malaquita
no inflamable, dejar más de 5 min. Con ambos tipos de colorante, hacer un flameo
constante). Luego lavar la placa con abundante agua de chorro.
- Para la utilización de verde de malaquita flameable: Flamear con mechero debajo
de la placa hasta que la placa emita vapores. Hacer esto por intervalos
(aproximadamente de 3 a 5 veces). Cuidar de que el verde de malaquita no se seque,
si es así, adicionar más colorante. Posteriormente lavar con abundante agua.
- Adicionar safranina de 1 a 2 min, también lavar con abundante agua de chorro y
dejar secar para su posterior observación al microscopio.

Coloración de endosporas.

Fundamento:

Las endospora poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan
en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
 La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endospora, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con

agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Coloración simple procedimiento y fundamento

La coloración con azul de metileno lo que hace es teñir a todas las bacterias por igual. Este
colorante se utiliza para teñir las estructuras presentes en el citoplasma de la bacteria. No
es diferencial porque al colorearlos se comporta de la misma forma con una bacteria u otra.
Reactivos:

 Azul de metileno al 0.5%

Procedimiento:

 Tomar cepas de cualquier bacteria y en una placa porta objeto colocar una gota de
azul de metileno, con un asa bacteriológica tomar parte de la cepa y diluirla en la
gota del reactivo, colocar sobre la muestra un cubre objeto y proceder a observar
al microscopio.

Coloración simple en azul de metileno

Coloración negativa y su fundamento

Reactivos:

 Nigrosina al 10 %
Procedimiento:

 Tomar cepas de cualquier bacteria (capsula) o levaduras y en una placa porta objeto
colocar una gota de Nigrosina en el extremo de la placa, con un asa bacteriológica
tomar parte de la cepa o levadura y diluirla en la gota del reactivo, con la ayuda de
un cubre objeto se extiende la muestra hasta la mitad del porta objeto y cubrir para
proceder a observar al microscopio.


Coloración negativa

La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la

microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas
alrededor de las células bacterianas. La tinta china o Nigrosina permite observar células
levaduriformes capsuladas (Cryptococcus).

Coloración con azul de Lactofenol

Reactivo:
Azul de Lactofenol al 2.5%
Procedimiento y fundamento:

Tomar cepa de cualquier hongo, colocar en una placa porta objeto una o dos gotas del
reactivo, luego con una asa tomar muestra de la cepa y diluirla en el reactivo, colocar el
cubre objeto o laminilla y proceder a observar al microscopio.
 Coloración simple con azul de Lactofenol.

Se trata de una tinción simple usado para la observación de hongos.

-El azul de Lactofenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del
tipo mohos obtenidos por aislamiento o de medios inoculados.-El fenol destruye la flora
acompañante.

-El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio degradiente
osmótico con relación al interior del fúngico generando una pelicular por así llamarlo
protectora.

-Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que es una técnica rápida que
permite visualizar perfectamente las estructuras fúngicas.

-El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de miceliomicólico, el

cual toma un delicado color azul claro.

Técnica de Coloración de Gram y su fundamento.

Reactivos:
.Cristal violeta al 5% teniendo en cuenta que se unen la solución A y la B.
.Lugol al 5%
.Alcohol acetona al 3%
.Safranina al 5%

Procedimiento:
Esta coloración es diferencial permite observar los diferentes tipos de bacterias según la
coloración de su superficie (gram positivas y gram negativas) con una asa tomar cepa de
cualquier bacteria y en un porta objetos depositar de 2 a 3 gotas de agua destilada y
diluir el inoculo en el agua destilada homogenizando bien, secar por método físico, con
mechero flameando lentamente, una vez este seca proceder a colorear.
- paso 1 colocarle a la placa el reactivo de cristal violeta por espacio de 1 minuto lavar con
abundante agua de chorro.
-paso 2 una vez juagada adicionarle el reactivo de Lugol por 1 minuto luego juagar con
abundante agua de chorro.
-paso 3 adicionarle el alcohol acetona por 30 segundos e inmediatamente juagar, este es
el paso más importante ya que si se pasa de tiempo con este reactivo la placa se puede
decolorar, solo se dejara el tiempo estipulado, juagar con abundante agua de chorro.
Paso 4 por último adicionarle el reactivo de safranina por 1 minuto y luego juagar, en
ocasiones se podrá reemplazar la safranina por la fucsina ambas arrojan el mismo
resultado. Se dejara secar y una vez esté lista se observara al microscopio.

Coloración de gram (gram positivos y gram negativos)

Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante
y quitar el alcohol-acetona.

1. El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por
sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria. Por lo que
bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.
2. Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una
superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared celular
bacteriana usando de mordiente al Lugol, en la pared bacteriana el Lugol forma un complejo
con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante
durante el enjuague. Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos
teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los
mordientes por ejemplo el Lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en
dar un carácter más acidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por
el colorante básico cristal violeta.

3. La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana

disolviendo el complejo cristal violeta-Lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias
Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los
microorganismos Gram positivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una
barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-Lugol. En la pared de las
bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos
últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal
violeta-Lugol.
-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de
peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales
son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared
bacteriana que no permite la salida del complejo cristal violeta-Lugol por ende se retiene el
cristal violeta-Lugol en la pared en el proceso de decoloración.

4.La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se
tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su
pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la
safranina.