Tecnología de La Elaboración de Vinagre de Yuca

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Tecnología de la elaboración de sidra. Equipamiento industrial
Chapter · January 2010
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Luis A. García Mónica Herrero

University of Oviedo University of Oviedo
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© textos: Varios autores
Edita: Domingo Blanco Gomis, Juan José Mangas Alonso
Imprime: Asturgraf
ISBN:
D.L.: AS.- /10
Índice
Agradecimientos .................................................................................................................. 7
Prólogo ...................................................................................................................................... 9
1. La manzana y su maduración........................................................................................ 11
Juan José Mangas Alonso y Daniel Díaz Llorente
2. Procesos pre-fermentativos ............................................................................................ 39

Juan José Mangas Alonso y Domingo Blanco Gomis
3. Bioquímica de los procesos de transformación del mosto de manzana

en sidra ...................................................................................................................................... 59
Juan José Mangas Alonso
4. Microbiología de la sidra.................................................................................................. 105

Ana Irastorza Iribas y María Teresa Dueñas Chasco
5. La evaluación sensorial .................................................................................................... 137

María Luisa González San José
6. Clarificación y estabilización de la sidra .................................................................. 175

7. Tecnología de la producción de sidra. Equipamiento industrial .................. 197

Mónica Herrero Vázquez, Álvaro Gonzalo Vergara y Luis A. García Díaz
8. Sidras espumosas.................................................................................................................. 221

9. Físico-Química de la espuma. Propiedades espumantes .................................. 235

10. Técnicas instrumentales en el control de proceso de la sidra ........................ 253

Domingo Blanco Gomis, Cristina Botas Velasco y Daniel Díaz Llorente
11. Elaboración de la sidra artesana .................................................................................. 299

Agradecimientos
Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario de Asturias
Los editores quieren agradecer, en primer lugar, a Daniel Díez Llorente y

Alfonso Carballal Samalea por la excelente contribución a la edición de este
libro. También, desean expresar su agradecimiento a los técnicos Jesús Gómez,
Tino Cortina y Tano Collada por sus valiosas aportaciones técnicas.
Así mismo, damos las gracias a las empresas Sidra Trabanco, Sidra Cortina,
Sidra Menéndez, Valle, Ballina y Fernández S.A. y Decavi S.A., por las foto-
grafías que se incluyen en este libro y al Dr. José Luis Meana Fonseca, a
José María Osoro, a M.ª Isabel Alonso Valdés y a Ángel Vitienes Amandi por sus
aportaciones gráficas.
Finalmente, queremos expresar nuestro máximo agradecimiento al inolvida-

ble Mundo Collada.
7
Prólogo
9
10
1. La manzana y su maduración
Juan José Mangas Alonso y Daniel Díaz Llorente
Departamento de Química Física y Analítica de la Universidad de Oviedo
Breve repaso a la estructura de la célula vegetal y sus funciones

En la figura 1 se recoge un esquema simplificado de la estructura de la célula
vegetal. El apoplasto (formado por la pared celular y los espacios intercelulares),
el simplasto (compartimento intracelular formado por los protoplastos interco-
nectados de un conjunto de células) y los plasmodesmos (puentes citoplasmá-
ticos de conexión celular), son las estructuras de transporte de las moléculas que
se descargan desde el floema (elemento de transporte de las moléculas sintetiza-
Figura 1.–Célula vegetal
11
Juan José Mangas Alonso, Daniel Díaz Llorente
das en las hojas al resto de órganos de la planta). La textura de los frutos está
determinada por la lámina media (capa cementante de substancias pécticas entre
dos paredes celulares primarias, que se deposita en la división celular y se lo-
caliza en al apoplasto) y la pared celular (primaria y secundaria), que separa el
apoplasto de la membrana plasmática. Dentro de la célula, conviene destacar la
vacuola (lugar donde se almacenan, por ejemplo, azúcares y ácidos), la mito-
condria (donde se producen los procesos respiratorios), los cloroplastos (donde
se realiza la actividad fotosintética), el aparato de Golgi (formado por dictioso-
mas y donde se sintetizan los componentes de la pared celular), el núcleo, etc.
Composición de la manzana: descripción de sus componentes más relevantes

El manzano pertenece a la familia Rosaceae, sub-familia pomoideae, género Ma-
lus y especie Malus domestica Borkh; en la actualidad, se considera que tiene co-
mo principal ancestro a M. sieversii con influencia de M. sylvestris (Dapena, 1996).
La producción mundial de manzana (datos FAO 2002) está en torno a 58 millo-
nes de toneladas, siendo China el principal productor (36%). Por otra parte, de
acuerdo con la base de datos nutricional del USDA (United States Department of
Agriculture) (Sinha, 2006), la composición porcentual (g/100 g) aproximada de
la manzana es la siguiente:
Agua: 85,56
Proteína: 0,26
Grasas: 0,17
Cenizas: 0,19
Azúcares: 10,40 (2,0 sacarosa; 2,4 glucosa; 6,0 fructosa)
Fibra dietética: 2,40
Calcio: 6 mg
Hierro: 0,12 mg
Magnesio: 5 mg
Fósforo: 11 mg
Potasio: 107 mg
Sodio: 1 mg
Cinc: 0,04 mg
Vitamina C: 4,60 mg
Vitamina A: 54 IU
Colesterol: 0
Calorías: 52 Kcal
A esta composición habría que añadir, por sus posibles efectos beneficiosos
sobre la salud, otros compuestos bioactivos (que tienen impacto sobre el meta-
bolismo humano), entre los que destacan los flavonoides y más concretamente
los flavonoles: quercetina (49 mg/Kg), kamferol (3,3 mg/Kg) e isoramnetina (12
µg/Kg) y el glutatión (6,1 mg/Kg; tripéptido de glicina, ácido glutámico y cis-
teína) (Sluis, 2005).
12
Azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos: biosíntesis. La fotosíntesis y la

respiración son las dos rutas metabólicas más importantes en el reino vegetal.
Mientras los azúcares derivan de la fotosíntesis, los ácidos orgánicos son gene-
rados en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
El sorbitol es el principal material carbonado sintetizado en las hojas del man-
zano y en menor proporción es sintetizada, también, la sacarosa. Una vez trans-
portado a través del floema y descargado en el fruto, probablemente a través de
un proceso apoplasmático (Zhang y col., 2004), este polialcohol se transforma en
otros azúcares como la fructosa, la sacarosa y la glucosa. A partir de la glucosa
se almacena el almidón y esta acumulación es estimulada por el incremento de
la concentración de triosas fosfato en el citosol, como consecuencia de la gli-
colisis de los azúcares. Las triosas fosfato son transportadas a los cloroplastos
donde se produce la síntesis del almidón, que es el polisacárido de reserva por
excelencia.
Por otro lado, los azúcares sencillos, fructosa, glucosa, sacarosa y sorbitol son
acumulados en la vacuola de la célula en el transcurso del desarrollo de la man-
zana. Esta acumulación se produce en virtud de los procesos de transporte que se
dan en el tonoplasto (membrana vacuolar). La actividad de proteínas bombeado-
ras de protones (V-ATPasa con hidrólisis de pirofosfato) del tonoplasto produce
una disminución de pH en el interior de la vacuola respecto al citosol. Esto da
origen a una fuerza protón-motriz que facilita el transporte de sustratos azucara-
dos desde el citosol al interior de la vacuola mediante proteínas antiportadoras de
protones. No obstante, en el caso de los frutos cítricos ha sido propuesto un
mecanismo de transporte de la sacarosa por endocitosis, lo que supone un paso
directo del azúcar desde el apoplasto a la vacuola sin atravesar la membrana
celular (plasmalema) y vacuolar (Etxeberria y col., 2005).
El ácido málico es el principal ácido orgánico presente en la manzana, exis-
tiendo en menores proporciones otros ácidos como el cítrico, isocítrico, succíni-
co, fumárico, quínico y siquímico (Prabha y col., 1990; Ackermann y col., 1992;
Blanco y col., 1992; Arellano y col., 1997; Mangas y col., 1998; Eisele y Drake,
2005). La concentración de málico es muy variable (0,3-1%) y depende funda-
mentalmente de la variedad, el estado de madurez y las condiciones ambientales
durante el crecimiento y almacenamiento del fruto.
El metabolismo de este ácido se compone de diversas rutas que se distribu-
yen entre el citosol y la mitocondria. Por un lado, la síntesis de málico se pro-
duce en el citosol a partir de un precursor glicolítico, el fosfoenolpiruvato. Por
medio de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEP-carboxilasa) y la malato deshi-
drogenasa, el fosfoenolpirúvico se convierte en málico a través de un proceso de
carboxilación y reducción. De este modo, el ácido málico es utilizado para fijar
una proporción del anhídrido carbónico producido en el proceso respiratorio de
la mitocondria. Una vez sintetizado, este ácido difunde hacia el interior de la va-
cuola de manera pasiva a través de un canal iónico específico del tonoplasto
(Lobit y col., 2006).
13
La degradación del ácido málico se puede producir en la mitocondria, incor-

porándose en el ciclo de Krebs, o en el citosol, donde se oxida a pirúvico a tra-
vés del enzima málico. El piruvato puede ser utilizado en la síntesis de azúcares
una vez transformado en fosfoenolpirúvico y éste puede fijar más anhídrido car-
bónico y transformarse en aminoácidos.
El resto de ácidos orgánicos detectados en manzana derivan del ciclo de Krebs,
con excepción de los ácidos quínico y siquímico. Éstos se sintetizan en la ruta
del siquimato a partir del fosfoenolpiruvato y la eritrosa 4-fosfato (Herrmann,
1995).
Por lo que se refiere a los aminoácidos, hay que señalar que el 90% del total
de la fracción aminoacídica está constituida por los ácidos aspártico y glutámi-
co, la asparagina, la serina y la glutamina, siendo la asparagina y el ácido aspár-
tico los aminoácidos mayoritarios (Blanco y col., 1990; Ackermann y col., 1992).
Compuestos volátiles: biosíntesis. Varios cientos de moléculas aromáticas
han sido identificadas en los extractos de la manzana y su zumo, siendo los éste-
res el grupo mayoritario (Lea, 1990). De acuerdo con Dixon y Hewett (2000),
Fuhrmann y Grosch (2002) y Sinha (2006), los aromas más significativos de la
manzana son los siguientes: aldehídos (acetaldehído, 3-(metiltio)-propionalde-
hído, hexanal, trans-2-hexenal, cis-3-hexenal, trans-2-octenal, cis-2-nonenal y
trans-2-nonenal), alcoholes (1-butanol, 1-hexanol y trans-2-hexenol) y ésteres
(acetatos de butilo, 2-metilbutilo, pentilo y hexilo; propanoatos de etilo, butilo y
hexilo; butanoatos de etilo, propilo, butilo y hexilo; 2-metilbutanoatos de meti-
lo, etilo, propilo, butilo y hexilo; y hexanoatos de butilo, isoamilo y hexilo).
Otros aromas de importancia son la trans-β-damascenona, la trans-β-damas-
cona, el linalol, el eugenol, el 4-metoxi alilbenceno, la 1-octen-3-ona y la lac-
tona del vino. Los ésteres como el propionato de etilo, acetato de butilo y el
2-metilbutirato de etilo proporcionan un aroma típico de manzana y, en particu-
lar, el 2-metilbutirato de etilo presenta un fuerte impacto aromático con un valor
umbral de detección, en zumo de manzana, de 0,1 µg/L (Lea, 1990); otros com-
puestos volátiles como el acetato de hexilo y 1-butanol aportan notas dulces y
afrutadas, la trans-β-damascenona contribuye al aroma con notas dulces, perfu-
madas y afrutadas y el 4-metoxi alilbenceno tiene aroma anisado.
Los compuestos aromáticos se forman a través de diferentes rutas metabóli-
cas, donde intervienen los ácidos grasos, aminoácidos y carbohidratos. En la
figura 2 se recoge un esquema de la biogénesis de los aromas en los frutos, según
Baldwin (2002).
Los ácidos grasos son importantes precursores de compuestos volátiles. A
partir de estos sustratos, las rutas metabólicas que conducen a la formación de
aromas son: la β-oxidación, la α-oxidación, la lactonización de hidroxiácidos y
la oxidación catalizada por la lipoxigenasa (Dixon y Hewett, 2000). Así, por
ejemplo, la β-oxidación proporciona acil-CoA que da origen a ácidos, aldehídos,
alcoholes y ésteres; el acil-CoA se reduce al aldehído correspondiente mediante
14
Figura 2.–Biogénesis de aromas en frutos (Baldwin, 2002)
la acil-CoA reductasa y el aldehído se convierte en alcohol mediante la alcohol

deshidrogenasa. La reacción entre un alcohol y el acil-CoA, para formar el éster,
es catalizada por la alcohol acil-CoA transferasa.
El mecanismo de β-oxidación de los ácidos grasos insaturados C18, como el
linoleico y linolénico, permite explicar la formación de β-glicoles C8 saturados
e insaturados [(R)-octano-1,3-diol y (R)-5(Z)-octen-1,3-diol], respectivamente
(Dettweiler y col., 1990). Estos glicoles son precursores de aromas (1,3-dioxa-
nos) en la sidra. En este sentido, conviene resaltar la existencia de una gran varia-
bilidad en el contenido total (libre más conjugado) de β-glicoles C8 saturados e
insaturados en manzana de sidra asturiana, desde 2,34 mg/L y 0,63 mg/L para la
variedad ‘San Roqueña’ hasta 94,45 mg/L y 11,48 mg/L para la variedad ‘Clara’,
formas saturadas e insaturadas, respectivamente (Díaz Llorente y col., 2010). El
mayor contenido de los β-glicoles C8 saturados es consecuencia de que la man-
zana presenta más concentración de ácido linoleico que linolénico (Prabha y col.,
1988).
15
Otros ésteres y alcoholes de número impar de átomos de carbono se pueden

formar a partir de la α-oxidación de los ácidos grasos, es el caso del pentanoato
de etilo o el acetato de pentilo. Por otro lado, los aldehídos C6 como el hexanal
y el cis-3-hexenal derivan de la degradación de los ácidos grasos insaturados,
linoleico (18:2) y linolénico (18:3), mediante la acción del oxígeno y las enzimas
lipoxigenasa e hidroperóxidoliasa. La intervención posterior de isomerasas y
alcohol deshidrogenasas transforman el cis-3-hexenal en trans-2-hexenal y los
aldehídos en alcoholes (cis-3-hexenol, trans-2-hexenol y hexanol) (Vick y
Zimmerman, 1987).
Los alcoholes, aldehídos, ácidos y ésteres ramificados son sintetizados a par-
tir de los aminoácidos valina, leucina, isoleucina, alanina y ácido aspártico
(Dixon y Hewett, 2000). El camino que se sigue en esta síntesis es, en primer
lugar, la transferencia del grupo amino (α-aminotransferasa) del aminoácido y
formación de un cetoácido, la descarboxilación de éste para formar un aldehído
o la descarboxilación oxidativa para formar un acil-CoA (α-cetodescarboxilasa
y α-cetoácido deshidrogenasa, respectivamente). En segundo lugar, a partir del
acil-CoA se puede formar el ácido correspondiente o el éster por esterificación
del acil-CoA y un alcohol mediante una alcohol aciltransferasa (Marilley y
Casey, 2004). Finalmente, el aldehído producido por descarboxilación se puede
transformar en alcohol mediante una alcohol deshidrogenasa. Así, por ejemplo,
la isoleucina es la responsable de la síntesis del 2-metilbutanol y los ésteres de
2-metilbutilo y del ácido 2-metilbutanoico.
La síntesis de ésteres en los frutos responde a un balance entre la actividad de
las aciltransferasas y las esterasas, que catalizan su hidrólisis, produciendo los
correspondientes ácidos orgánicos y alcoholes (Dixon y Hewett, 2000). Así, por
ejemplo, las altas concentraciones que presentan algunas variedades de manzana
en 1-hexanol, 1-butanol y 1-pentanol pueden responder a un incremento de la ac-
tividad esterásica en el climaterio del fruto. Por otra parte, los aminoácidos aro-
máticos, como la fenilalanina, son el sustrato para la formación de alilbencenos
como el eugenol; este proceso está catalizado por la fenilalanina amonioliasa
(PAL), la cinamato 4-hidrolasa, la p-cumarato 3-hidrolasa y la metiltransferasa.
Los terpenos derivan del metabolismo de los carbohidratos, vía acetil-CoA y
el ácido mevalónico (Dudareva y col., 2004); este ácido es el precursor del iso-
pentenil difosfato (C5) y su isómero el dimetilalil difosfato (C5). La condensa-
ción de estos compuestos C5 conduce a la formación de monoterpenos (C10),
como el geraniol, monoterpenos cíclicos como el limoneno, sesquiterpenos
(C15) como el α-farneseno y carotenoides (C40, tetraterpenos). La degradación
de algunos carotenoides alénicos, como la neoxantina, conduce a la formación de
norisoprenoides (C13) volátiles como la β-damascenona.
Compuestos fenólicos. La manzana contiene proporciones muy variables de
compuestos fenólicos que afectan tanto a las propiedades sensoriales de ésta
como a la calidad de los productos industriales, por ejemplo, zumos y sidras. El
tipo de variedad y portainjertos, el estado de madurez y la cantidad de luz
16
recibida por el fruto, la temperatura (las variaciones térmicas estimulan la sínte-

sis pigmentos en determinadas variedades), las condiciones de almacenamiento
de éste y el manejo del cultivo (a menor fertirrigación mayor concentración de
polifenoles; la actividad de la enzima PAL aumenta en condiciones de estrés
hídrico) (Martínez-Ballesta y col., 2008), son factores que determinan la compo-
sición fenólica de la manzana.
Las manzanas de sidra presentan mayor proporción de polifenoles que las
de mesa; su concentración varía entre 0,1 y 5 g/kg de peso fresco, aunque han
sido detectadas concentraciones por encima de 10 g/kg. Los compuestos fenó-
licos de la manzana se pueden clasificar del siguiente modo: a) ácidos hidroxici-
námicos y sus ésteres; b) flavanoles; c) dihidrocalconas; d) flavonoles; y e) anto-
cianinas.
Los ácidos hidroxicinámicos más importantes son: el ácido clorogénico
(5´-cafeoilquínico), que es el ácido fenólico mayoritario de la manzana, los isó-
meros del ácido clorogénico [isoclorogénico (3´,5´-dicafeoil), neoclorogénico
(3´-cafeoil) y criptoclorogénico (4´-cafeoil)] y el 5´-p- cumarilquínico y sus
isómeros; éstos, están presentes en bajas concentraciones. Por lo que se refiere a
los ésteres con azúcares cabe destacar la 1-O-p-cumarilglucosa, la cafeoilgluco-
sa y la feruloilglucosa (Nicolas y col., 1994).
Los flavanoles se pueden dividir en catequinas y procianidinas. La catequina
más importante es la (-)-epicatequina, encontrándose en menor proporción la
(+)-catequina. Las procianidinas (también denominadas taninos condensados)
son oligómeros y polímeros de catequinas, siendo la (-)-epicatequina la unidad
estructural más abundante, por encima del 95%, que se une mediante enlaces
C4β→C8 o C4β→C6 (Bourvellec y col., 2005). El grado de polimerización
medio de las procianidinas se sitúa entre 4 y 8 (Alonso-Salces y col., 2004),
pudiendo alcanzarse valores más elevados (n= 40; 50) para algunas variedades
francesas (Bourvellec y col., 2004) y de la especie Malus sylvestris (n= 17)
(Guyot y col., 1997). La B2 [dímero de (-)-epicatequina] (Guyot y col., 2003) es
la procianidina más representativa de la manzana, encontrándose en menor pro-
porción los dímeros B1 y B5 y el trímero C1 (Nicolas y col., 1994).
En relación con las dihidrocalconas cabe destacar, como las más relevantes
desde un punto de vista cuantitativo, la floricina y el floretín 2’-xiloglucósido,
si bien han sido detectadas otras como el 3-hidroxifloretín 2’-xiloglucósido y
3-hidroxifloretín 2’-glucósido (Tsao y col., 2003). Los flavonoles detectados en
manzana son derivados de la quercetina conjugada con diversos azúcares [ga-
lactosa, glucosa, xilosa, arabinosa (dos conformaciones, furanosa y piranosa),
rutinosa y ramnosa] (Blanco y col., 2001; Tsao y col., 2003; Sluis, 2005) y la
antocianina más importante es el cianidin 3-galactósido.
Los polifenoles están distribuidos por el conjunto del fruto, siendo el cortex
donde existe la mayor proporción (aprox. el 65% del total), seguido de la piel
donde se concentra el 24% de los polifenoles. La presencia de las diferentes
17
familias de polifenoles a lo largo del fruto no es homogénea. Así, por ejemplo,

la concentración de los ácidos hidroxicinámicos disminuye desde el corazón
hasta la epidermis, al contrario de lo que ocurre con las procianidinas, las cate-
quinas se concentran, mayoritariamente, en la pulpa y epidermis, los flavonoles
y antocianinas se localizan preferentemente en la epidermis y las dihidrocalco-
nas en las semillas.
Las plantas tienen la capacidad de desviar importantes cantidades de carbono
procedentes de los aminoácidos aromáticos para la biosíntesis de productos natu-
rales, basados en la estructura fenilpropano, como los compuestos fenólicos. Se
trata de moléculas procedentes del metabolismo secundario de las plantas que se
activa como consecuencia de la interacción de éstas con el medio abiótico y bió-
tico. Así, por ejemplo, los polifenoles tienen diversas funciones como, colorear
los frutos, atraer o repeler insectos, proteger a la planta de la acción de los her-
bívoros, etc. En su biosíntesis confluyen dos vías bioquímicas importantes, por
un lado, la del siquimato y, por otro, el metabolismo del fenilpropanoide. La ruta
del siquimato une el metabolismo de los carbohidratos con la biosíntesis de los
compuestos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano). En una secuencia de
siete pasos, el fosfoenolpiruvato y la eritrosa 4-fosfato, productos derivados
de la glicolisis y de la ruta de las pentosas fosfato, respectivamente, son trans-
formados en corismato y prefenato que son las moléculas precursoras del ami-
noácido aromático fenilalanina. El corismato y determinados intermediarios de
la ruta del siquimato, como el 3-dehidrosiquimato, son precursores de los ácidos
benzoicos y las quinonas (Herrmann, 1995).
La biosíntesis de los compuestos fenólicos se describe en la figura 3. La feni-
lalanina es desaminada para producir el ácido trans-cinámico que, posterior-
mente, a través de hidrolasas, O-metiltransferasas y CoA-ligasas se transforma
en los diferentes ésteres del CoA; éstos, son el punto de partida de la síntesis de
los compuestos fenólicos: ácidos hidroxicinámicos, dihidrocalconas, flavonoles,
flavanoles, antocianos, etc. (Ebel y Hahlbrock, 1982). En esta síntesis concurren
moléculas que derivan del ciclo de Krebs (conversión del acetil-CoA en malonil-
CoA mediante la acetil-CoA carboxilasa) (Awad y col., 2001).
Los compuestos fenólicos y su efecto sobre la salud. Los compuestos fenóli-
cos, junto con otros constituyentes de frutos y vegetales, como carotenoides,
organosulfuros, glucosinolatos, vitaminas E y C, fitosteroles, ácido fólico, fibra
dietética e inhibidores de proteasa, presentan efectos beneficiosos para la salud,
por cuanto pueden influir en la menor incidencia de patologías como el cáncer,
las enfermedades cardiovasculares, el asma y la diabetes.
La manzana y especialmente su piel, donde se concentra la mayor cantidad de
polifenoles, en particular flavonoides (Wolfe y col., 2003), tiene una potente
acción antioxidante, del orden de 83,3±8,9 TOSC (Total Oxyradical Scavenging
Capacity, expresado en µmol/g en equivalencia de vitamina C) (Eberhardt y col.,
2000), lo que supone 1.462 mg de vitamina C/100 g. Teniendo en cuenta que la
concentración promedio de vitamina C en manzana es de 4,6 mg/100 g, lo que
18
HIDROXICINÁMICOS
DIHIDROCALCONAS
FLAVONOLES
FLAVONOLES
ANTOCIANINAS
Figura 3.–Biosíntesis de los compuestos fenólicos. PAL: fenilalanina amonioliasa; CHS: calcona sintetasa; CHI:
calcona flavanona isomerasa; FHT: flavanona hidrolasa; DFR: dihidroflavonol reductasa; ANS: antocianidin
sintetasa; GT: glicosil transferasa; C4H: cinamato 4-hidrolasa; 4CL: 4-cumarato: CoA ligasa (Treutter, 2001)
supone 0,26 TOSC, se deduce que la casi totalidad de la capacidad antioxidante

de este fruto proviene de otros compuestos distintos de la vitamina C (Boyer y
Liu, 2004), como los polifenoles.
Los flavonoides son potentes antioxidantes, ya que inhiben la peroxidación
lipídica, complejan metales, estabilizan los radicales libres (O2•-; OH•; NO•;
alquilo, R•; peroxilo, ROO•) por donación de un electrón y/o un átomo de hi-
drógeno y limitan la producción de moléculas no radicalarias como el oxígeno
19
singulete (1O2), el peróxido de hidrógeno (H2O2) o el ozono (O3); este conjunto

de moléculas, denominadas sustancias reactivas de oxígeno (ROS), es conside-
rado uno de los factores importantes en el desarrollo de determinadas patolo-
gías, al dañar biomoléculas como el ADN, los lípidos y las proteínas y la bio-
membrana. Estos daños se producen en situaciones de estrés oxidativo en donde
la producción de especies moleculares de oxígeno, muy reactivas, es superior a
la capacidad que tienen para transformarlas las moléculas antioxidantes, tanto
endógenas como las que provienen de la dieta, así como los sistemas antioxi-
dantes como la superóxido dismutasa (SOD: 2 O2→- + 2 H+ → H2O2 + O2), la
catalasa (CAT)/peroxidasa (PX) (CAT: 2 H2O2 →2 H2O + O2; PX: ROOH + H2A
→ ROH + H2O + A) y la glutatión peroxidasa [GPX: ROOH + 2 GSH (glutatión
reducido) → ROH + H2O + GSSG (glutatión oxidado)].
El efecto de los polifenoles sobre la oxidación de los lípidos se basa en la for-
mación de un radical fenoxilo, relativamente estable por resonancia, que inte-
rrumpe la cadena de producción de radicales libres. En este sentido, destaca el
ácido clorogénico como un fitoquímico con elevada capacidad de inhibir la for-
mación de radicales alquilo y peroxilo, los cuales pueden promover la carcino-
génesis (Boyer y Liu, 2004). Por otra parte, los compuestos fenólicos limitan la
producción de radicales hidroxilo (OH•), que se forman a partir del peróxido de
hidrógeno producido en el metabolismo respiratorio, al complejar metales, como
el hierro y el cobre, que actúan como elementos de transferencia electrónica en
la reacción de Fenton y Haber-Weiss (figura 4).
Por otro lado, el 1O2 (especie muy reactiva y electrófila/oxidante) es transfor-
mado en oxígeno triplete (estado basal del oxígeno, menos reactivo, 3O2)
mediante un proceso de amortiguación (“quenching”) por transferencia de ener-
gía desde el oxígeno singulete a la molécula antioxidante. En este proceso los
carotenos son más eficientes que los flavonoides (Beutner y col., 2001).
Macromoléculas estructurales y enzimas de la pared celular. La pared celu-
lar juega un papel muy relevante en la textura de los frutos. De hecho, la inte-
gridad de éstos está relacionada con la adhesión intercelular, a través de la lámi-
na media, y la fuerza de la pared primaria de la célula. En el caso de los frutos,
como la manzana, a diferencia de otros con texturas más blandas como el kiwi,
H2O2 + Fe (II) → OH• + OH- + Fe (III)

H2O2 + Fe (III) → Fe (II) + 2 H+ + O2→-
2 H2O2 → OH• + OH- + 2 H+ + O2→- (reacción de Fenton)
Fe (III) + O2→- → Fe (II) + O2
Fe (II) + H2O2 → Fe (III) + OH• + OH-
O2→- + H2O2 → O2 + OH• + OH- (reacción de Haber-Weiss)
Figura 4.–Reacción de Fenton y Haber-Weiss para la producción del radical hidroxilo (OH•)
20
tomate, etc., la cohesión entre células por medio de la lámina media es muy fuer-
te. No obstante, los cambios en la textura también son atribuibles a la modifica-
ción estructural de la pared de la célula. En el caso de la manzana, la pared celu-
lar puede ser descrita por el modelo I (ver figura 5) de Carpita y Gibeaut (1993)
que consiste en tres dominios que interaccionan entre sí. Por un lado, una estruc-
tura de celulosa-xiloglucano (primer dominio fundamental), donde las microfi-
brillas de celulosa están entrelazadas por fucogalactoxiloglucanos; este dominio
está embebido en una matriz péctica (segundo dominio) y de glicoproteínas
estructurales (tercer dominio).
Desde el punto de vista molecular, la pared celular está compuesta por car-
bohidratos (celulosa, xiloglucano y pectina), proteínas (enzimas y glicoproteí-
nas), lignina, compuestos fenólicos e iones inorgánicos (calcio y boro, funda-
mentalmente).
La celulosa se presenta como un agregado de fibras formadas por cadenas
lineales de β- (1→4)-D-glucosa. Con el fin de favorecer las interacciones por
puentes de hidrógeno entre cadenas y dentro de ellas y evitar impedimentos esté-
ricos entre grupos funcionales adyacentes, se produce de manera alternante la
inversión (giro de 180º) de una molécula de glucosa. La celulosa aporta resis-
tencia mecánica, habiéndose establecido que la ordenación de las microfibras de
celulosa como, por ejemplo, la celulosa no amorfa, podría ser la causa de la tex-
tura que presentan algunos frutos como la manzana.
Figura 5.–Modelo de pared celular de acuerdo con Carpita y Gibeaut (1993)
21
El xiloglucano forma parte del grupo de las hemicelulosas. La mayoría de los

xiloglucanos están formados por unidades heptasacáridas, consistentes en cuatro
unidades de β-D-glucosa enlazadas en las posiciones (1→4) y tres unidades de
α-D-xilosa unidas al glucano, de manera consecutiva, en las posiciones (1→6).
En la manzana, la principal hemicelulosa es un fucogalactoxiloglucano acompa-
ñado de mananos (β-D-manosa unida en las posiciones 1,4) de pequeña masa
molecular (Renard y col., 1991). En esta hemicelulosa, la β-D-galactosa se une
a la α-D-xilosa mediante un enlace β-(1→2) y la α-L-fucosa se enlaza a la galac-
tosa a través de un enlace α-L-(1→2); la galactosa, a su vez, puede estar aceti-
lada en las posiciones 3 y 4 (Carpita y Gibeaut, 1993). Dentro del grupo de las
hemicelulosas, también, hay que considerar a los xilanos.
Recientemente, ha sido descrita la presencia en mostos de manzana y sidra de
glucuronoxilanos y glucuronoarabinoxilanos (Hubert, 2008). Estos xilanos están
formados por un esqueleto central de β-D-xilopiranosa, enlazada en las posicio-
nes 1,4, que está ramificada en las posiciones 2 o 3 por azúcares ácidos, como el
α-D-glucurónico y el 4-metil-α-D-glucurónico y por la α-L-arabinofuranosa,
pudiendo estar la xilosa acetilada en las posiciones 2 o 3.
La hemicelulosa se asocia con la celulosa a través de puentes de hidrógeno
que se establecen entre el oxígeno del enlace glucosídico del xiloglucano y el
grupo hidroxilo ubicado en el carbono seis de una unidad de glucosa del gluca-
no, cumpliendo la función de servir de puente entre las microfibras de celulosa
y contribuyendo, con ello, a la integridad de la estructura de la pared celular. La
rigidez de ésta está condicionada por la integridad de la red formada por hemi-
celulosas y celulosas (Pérez y Carpita, 2006) que está inmersa en una matriz péc-
tica formada por una mezcla compleja de homogalacturonano y ramnogalactu-
ronanos I y II (RGI y RGII). No obstante, las hemicelulosas no están restringi-
das solamente a las regiones de celulosa sino que pueden estar por otras zonas de
la pared o de la lámina media.
El término pectina abarca un grupo diverso de polisacáridos ubicados tanto
en la pared celular como en las regiones intercelulares. Se caracterizan por pre-
sentar, al menos, un 65% de ácido galacturónico (Willats y col., 2006).
Constituyen un tercio de la pared, a la que confieren su porosidad y carga eléc-
trica y contribuyen a la cohesión intercelular. La unidad más abundante es el
ácido α-D-galacturónico que forma una cadena lineal (homogalacturonano)
enlazada mediante uniones (1→4), pudiendo estar acetiladas las posiciones 2 y
3. El ácido α-D-galacturónico está parcialmente metilado, habiéndose determi-
nado un grado de metilación superior al 80% en la pectina presente en los mos-
tos de manzana (Hubert, 2008). Esta metilación puede producirse de manera ale-
atoria o en bloques, en función de que se trate de pectinas localizadas en las
zonas de unión celular o en la pared primaria, respectivamente.
La pectina presenta una disposición alternante de regiones sin ramificar
(homogalacturonano) con zonas muy ramificadas (ramnogalacturonano I, RGI)
(Schols y Voragen, 2000). RGI consiste en unidades repetidas de un disacárido,
22
α-L-ramnosa y α-D-galacturónico, enlazados del modo siguiente: (1→2)-α-L-

ramnosil-(1→4)-α-D-galacturónico (Rodríguez-Palenzuela y col., 1998). La ra-
mificación de este heteropolímero (RGI) se produce a nivel de la ramnosa, prefe-
rentemente en el C4, aunque también se puede ramificar en la posición C3. Los
polisacáridos neutros que se ramifican son arabinanos, galactanos y arabinoga-
lactanos del tipo I y II. Algunos modelos consideran que el homogalacturonano y
el xilogalacturonano formarían parte, también, de la estructura ramificada del RGI
(Willats y col., 2006); de hecho, existen evidencias de que el xilogalacturonano
está unido covalentemente al ramnogalacturonano I (Coenen y col., 2007). En la
manzana, ha sido detectado un xilogalacturonano de 20-30 kDa de masa molecu-
lar, cuyo porcentaje de moléculas de ácido galacturónico enlazadas a la xilosa es
elevado (70%) (Redgwell y Fischer, 2002). Se trata de un homogalacturonano,
parcialmente esterificado por el metanol, donde residuos simples de β-D-xilopi-
ranosa se unen mediante un enlace β-1,3 en la posición C3 del ácido galacturónico.
Los arabinanos son homopolímeros de α-L-arabinofuranosa unida lineal-
mente a través de las posiciones (1→5) y que se ramifica a nivel de los carbonos
C2 y C3. Esta ramificación consiste en unidades de α-L-arabinofuranosa que pue-
den presentar una estructura lineal mediante uniones (1→3) o ramificada por
medio de uniones (1→2 y 1→3) (Schols y Voragen, 2000).
Los galactanos presentan escasa ramificación y están formados por uniones
(1→4) de β-D-galactosa. Los arabinogalactanos I están basados en una estructu-
ra lineal de galactano [β-D-galactosa con uniones (1→4)] con ramificaciones de
pequeño tamaño, en el carbono C3 de la galactosa, de unidades de α-L-arabino-
sa enlazadas en las posiciones (1→3) (Carpita y Gibeaut, 1993). Los arabinoga-
lactanos II presentan una cadena lineal de β-D-galactosa con uniones (1→3) y
con ramificaciones, a nivel del grupo hidroxilo del carbono C6 de la galactosa,
de unidades de β-D-galactosa enlazadas con uniones (1→6); este galactano con-
tiene unidades de α-L-arabinosa enlazadas a la β-D-galactosa por uniones (1→3)
y (1→6) (Carpita y Gibeaut, 1993; Schols y Voragen, 2000).
El ramnogalacturonano II es un galacturonano muy ramificado cuya estruc-
tura está altamente conservada. La unidad estructural de este heteropolímero
contiene nueve unidades de α-D-galacturónico mediante uniones (1→4) y cua-
tro cadenas laterales que tienen diversos carbohidratos como: apiosa, ácido glu-
curónico, galactosa, arabinosa, fucosa, ramnosa, xilosa, ácido galacturónico,
ácido acérico, etc. Puede dimerizarse a través de un enlace diéster de borato pro-
moviendo, de igual manera que los puentes de calcio entre los ácidos urónicos
(Vicente y col., 2007), la integración de la estructura péctica en la pared; de
hecho, se piensa que está asociado al homogalacturonano. Su función estructural
está relacionada con la resistencia a la tensión de las paredes vegetales.
Las proteínas presentes en la pared celular son de dos tipos, estructurales y
enzimáticas. Las proteínas estructurales son glicoproteínas, destacando dos tipos
fundamentalmente, las extensinas o glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y los
proteoglicanos, en los que la parte azucarada es un arabinogalactano (Showalter,
23
1993; José-Estanyol y Puigdomènech, 2000). En las primeras, la hidroxiprolina

está presente en una proporción elevada (40%) (Seibel y Del Pino, 2008), aun-
que también existe serina y otros aminoácidos como la valina, tirosina, lisina e
histidina. La mayor parte de la hidroxiprolina está glicosilada con arabinosa (de
una a cuatro unidades) y algunos residuos de serina se glicosilan con una unidad
de galactosa. Además de hidroxiprolina, se pueden encontrar glicoproteínas con
altos contenidos de prolina y lisina, la cual, por medio del grupo ε-amino puede
asociarse a los ácidos pécticos por interacción electrostática o a los carbohidra-
tos por medio de puentes de hidrógeno. De hecho, hay evidencias de que estas
proteínas están enlazadas a polisacáridos pécticos del tipo RGI.
Por otra parte, la existencia del ácido ferúlico y sus dímeros (por ejemplo el
5,5-dehidrodiferúlico) ha sido detectada en manzana, teniendo como función
establecer puentes entre las macromoléculas estructurales de la pared celular,
proteínas y polisacáridos (Liyama y col., 1994). Los proteoglicanos que contie-
nen arabinogalactanos presentan una elevada proporción de azúcares, ya que la
parte proteica puede suponer de un 2 a un 10% y está formada por hidroxiproli-
na, serina, alanina, treonina y glicina, fundamentalmente. La parte glicosídica es
un arabinogalactano tipo II que se enlazaría al núcleo proteico a través de un
enlance β-D-galactosa-hidroxiprolina.
Las proteínas enzimáticas afectan al desarrollo y crecimiento del fruto. Así,
por ejemplo, han sido detectadas en manzana las siguientes: la endo-poligalactu-
ronasa (Wu y col., 1993) (cataliza la hidrólisis del α-1,4-D-galacturonano lineal
no esterificado), la exo-poligalacturonasa (hidroliza el ácido galacturónico en
posición terminal) (Johnston y col., 2002), la ramnogalacturonasa A (cataliza la
hidrólisis de las uniones α-1,2 ramnosa-ácido galacturónico de los ramnogalac-
turonanos), su actividad origina fragmentos pécticos que estimulan la síntesis de
etileno (Redgwell y Fischer, 2002), la pectín metilesterasa (hidroliza los grupos
metilo de pectinas esterificadas) (Denes y col., 2000), la β-galactosidasa (separa
los residuos de galactosa en posición terminal de pectinas y hemicelulosas)
(Bartley, 1974), la α-L-arabinofuranosidasa (separa los residuos de arabinosa de
las pectinas), la endo-glucanasa (hidroliza las uniones β-(1,4)-D glucano de la
celulosa y hemicelulosa) y la xiloglucan-endotransglicosilasa (XET, hidroliza
y/o transfiere azúcares en el xiloglucano) (Percy y col., 1996). La XET modula
las propiedades mecánicas y, en consecuencia, la presión que ejerce la pared
celular a través de la modificación de la red establecida entre la celulosa y las
hemicelulosas (puede aumentar o disminuir el tamaño de los polisacáridos hemi-
celulósicos), permitiendo, con ello, la expansión de la célula.
En lo referente a la estructura de la lámina media, conviene resaltar que ésta
contiene polímeros pécticos lineales con pequeñas ramificaciones de azúcares,
como la arabinosa y galactosa, que se enlazan al ramnogalacturonano a través de
la ramnosa; las pectinas de la lámina media presentan una baja proporción de
ramnosa en relación con el ácido galacturónico, si se compara con los polisacá-
ridos pécticos de la pared celular (Fisher y col., 1994a,b), lo que pone de relieve
24
la menor ramificación que presentan las pectinas de la lámina media en relación

con las de la pared celular primaria. Las pectinas de la lámina media tienen un
alto grado de metoxilación, particularmente cuando el fruto está maduro, pre-
sentando, también, regiones no esterificadas que estarían complejadas por el cal-
cio a través de puentes salinos, formando una estructura tipo “eggbox”, que man-
tiene unidas a las cadenas pécticas formando geles insolubles.
En relación con la biosíntesis de las macromoléculas estructurales de la pared
celular, conviene resaltar que ésta tiene lugar en el aparato de Golgi, de acuerdo
con los trabajos llevados a cabo por el grupo de investigación del CCRC
(Complex Carbohydrate Research Center, USA). En el citoplasma celular se pro-
duce la formación e interconversión (epimerización) de los glicósidos de uridín
difosfato (UDP). Éstos, son transportados hacia el aparato de Golgi mediante un
antipuerto UDP-azúcar/UMP (uridín monofosfato). Una vez en el interior, se
produce la polimerización y esterificación mediante glicosiltransferasas y pectín
metiltransferasas, respectivamente, y el polímero formado es transportado hacia
la membrana celular por medio de vesículas; posteriormente, las macromolécu-
las son liberadas al espacio exocelular e incorporadas a la pared celular primaria
(ver figura 6).
Figura 6.–Modelo para la biosíntesis del poligalacturonano de acuerdo con el Complex Carbohydrate Research
Center (http://www.ccrc.uga.edu/~mao/biosyn/text.htm). PGA-MT: poligalacturonato 4α- metiltransferasa;
PGA: poligalacturonato 4α; PGAE: poligalacturonato 4α esterificado; PGA-GalAT: poligalacturonato 4α-
galacturonosiltransferasa. 1: hexoquinasa; 2: fosfoglucomutasa; 3: UDP-Glc fosforilasa; 4: UDP-Glc deshi-
drogenasa; 5: UDP-GlcA 4-epimerasa; 6: antipuerto UDP-GalA/UMP. Glc: glucosa; GlcA: ácido glucurónico;
GalA: ácido galacturónico. UTP: uridín trifosfato UDP: uridín difosfato; UMP: uridín monofosfato; PP: piro-
fosfato; P: fosfato.
25
El etileno. La hormona de maduración

La manzana es un fruto climatérico cuya maduración está condicionada por
la presencia de etileno. Esta hormona es responsable de los cambios observados
en la manzana durante su maduración. Los frutos climatéricos experimentan un
cambio brusco en la producción de etileno (de 25 a 2.500 µl/L en un fruto cli-
matérico como la manzana vs. 0,13 a 0,32 µl/L en uno no climatérico como la
naranja) que conduce a su maduración, la cual se caracteriza por una modifica-
ción del color (pérdida de clorofila, acumulación de carotenoides y pigmentos
antociánicos), la textura (solubilización de celulosas y pectinas, degradación del
almidón y alteraciones en la composición de las paredes celulares), el aroma y
sabor (acumulación de azúcares y producción de compuestos volátiles), el meta-
bolismo (incremento respiratorio, producción de etileno, ....) y la expresión géni-
ca (síntesis de enzimas y nuevo ARN).
El etileno es un regulador del crecimiento, el desarrollo y la senescencia
(etapa final del desarrollo donde ocurren cambios irreversibles que conduce a la
ruptura y muerte celular), siendo su papel más significativo el de regular la
maduración de los frutos que ocurre en las primeras fases de su senescencia. El
fruto crece a diferentes velocidades, al principio es un proceso lento, marcado
por la división celular, continúa una etapa de rápido crecimiento donde ocurre la
expansión celular y finalmente se ralentiza, de nuevo, cuando se inicia la fase de
maduración (figura 7).
El etileno es un sencillo hidrocarburo gaseoso que fácilmente puede difundir
hacia dentro o fuera de los tejidos vegetales. La ruta metabólica que conduce a
su formación se describe en la figura 8.
Figura 7–Crecimiento, respiración y producción de etileno a lo largo del desarrollo y maduración del fruto
(Hartmann y col., 1987; Recasens, 1990; Janssen y col., 2008). Madurez fisiológica (0); niveles de producción
de etileno (1, 2, 3).
26
Figura 8.–Biosíntesis del etileno. SAM: S-adenosilmetionina; ACCS: 1-aminociclopropano-1-carboxilo sinte-

tasa; ACCO: 1-aminociclopropano-1-carboxilo oxidasa.
En la biosíntesis del etileno concurren tres enzimas importantes: la S-adeno-

silmetionina sintetasa (SAM-sintetasa), la 1-aminociclopropano-1-carboxilo sin-
tetasa (ACCS) y la 1-aminociclopropano-1-carboxilo oxidasa (ACCO). La
SAM-sintetasa transforma la metionina en S-adenosilmetionina, que es una
molécula de gran relevancia en la transferencia de grupos metilo, por ejemplo,
en el caso de los ácidos nucleicos, proteínas y lípidos y es un precursor de polia-
minas como la espermidina y la espermina. A través de la S-adenosilmetionina y
el ciclo de Yang se recicla la metionina (ver figura 8), lo que posibilita mantener
una concentración celular de metionina adecuada aún cuando se sintetice una
gran cantidad de etileno. La ACCS cataliza la etapa que controla la síntesis de
etileno, convirtiendo la S-adenosilmetionina en el ácido 1-aminociclopropano-1-
carboxilo (ACC). La ACCS está inhibida por el ácido aminooxiacético y la ami-
noetoxivinilglicina y se estimula por la senescencia, las auxinas y el estrés. El
ACC es, posteriormente, transformado en etileno por medio de la ACCO con la
participación del O2 y la estimulación del CO2, que actúa como activador, (Dong
y col., 1992) y la producción autocatalítica del etileno. Por otra parte, el ACC
puede ser transformado en 1-(malonil-amino) ciclopropano-1-carboxilo (MACC)
(Jakubowicz, 2002), proceso que supone una disminución del contenido de ACC
y una posible autoinhibición de la síntesis de etileno. La conversión de ACC en
MACC es más elevada en manzana preclimatérica que cuando los frutos están
en la fase climatérica; y, en particular, esta conversión es especialmente elevada en
la piel de la manzana (Mansour y col., 1986).
La producción autocatalítica de etileno diferencia los frutos climatéricos de
los que no lo son; este proceso se desarrolla en el manzano con posterioridad al
27
aumento de la tasa de respiración que acompaña al proceso de maduración de

los frutos climatéricos (Rhodes, 1986). El término “respiración climatérica” se
define como una fase del desarrollo del fruto donde la maduración comienza a
producirse acompañada de un súbito incremento de la respiración. Este máximo
respiratorio viene precedido por un valor mínimo denominado “mínimo climaté-
rico”. Este momento separa dos procesos bien diferenciados, por un lado, la
madurez del fruto ligada a su fase final de crecimiento y, por otro, la entrada de
la senescencia marcada por el proceso de maduración que conduce a los cambios
irreversibles en la célula. Hoy en día, sin embargo, el carácter climatérico se
corresponde más con la producción autocatalítica de etileno que con el incre-
mento respiratorio.
Por otro lado, Hartmann y col. (1987) establecieron para los frutos climatéri-
cos diferentes fases vinculadas a la producción de etileno, definiendo varios
niveles de éste que están relacionados con el inicio de la maduración, donde se
produce una importante síntesis de ARN y ribosomas (nivel 1), la producción
autocatalítica de etileno y la promoción de la maduración (nivel 2) y el manteni-
miento y desarrollo final del proceso de maduración (nivel 3) (figura 7). Con
anterioridad al nivel 1 se produce la madurez fisiológica del fruto (nivel cero)
que, una vez conseguida, permite alcanzar el punto de inicio de la maduración
que forma parte de la senescencia. En los estadios anteriores a la madurez fisio-
lógica, el fruto es incapaz de poner en marcha el proceso de maduración, inclu-
so en presencia de etileno.
Evolución de los componentes bioquímicos y estructurales en el desarrollo y
maduración del fruto. El crecimiento de la manzana puede ser dividido en cua-
tro etapas (Percy y col., 1997): a) división celular y expansión que dura, aproxi-
madamente, de tres a cuatro semanas; b) expansión celular; c) pequeño incre-
mento del tamaño del fruto cuando se aproxima la madurez; y d) maduración
plena e inicio de la senescencia. La duración de este proceso de crecimiento y
desarrollo es variable en función de la variedad así, por ejemplo, mientras la
variedad Gala madura entre 18 y 19 semanas después de la floración, el cultivar
Gold Rush lo hace entre 26 y 27 semanas (Peña y Carpita, 2004).
Está bien establecido que el principal azúcar sintetizado en la hoja del man-
zano es el sorbitol, a través de un proceso catalizado por la NADP-sorbitol
deshidrogenasa, si bien, hay que señalar que una proporción de la sacarosa que
contiene el fruto proviene, también, de la fotosíntesis. Ambos carbohidratos se
transforman en el fruto en otros azúcares como la glucosa y la fructosa (Berüter,
1985). En concreto, el sorbitol, transportado desde las hojas en la etapa de expan-
sión celular, se transforma en fructosa y glucosa con la intervención de diferen-
tes sistemas enzimáticos, la NAD-sorbitol deshidrogenasa, la O2 –sorbitol oxida-
sa y la NADP-sorbitol deshidrogenasa.
Como se puede observar en la figura 9, el contenido de sorbitol en el fruto
disminuye a lo largo de las etapas de división y expansión celular hasta el cli-
materio y, por el contrario, la sacarosa se acumula a lo largo del proceso de
28
desarrollo de la manzana, como consecuencia de la fotosíntesis y de la transfor-

mación del sorbitol, presentando su valor más bajo en la fase de división celular
en la que la actividad de la invertasa ácida es máxima (figura 9). En esta fase, el
fruto presenta una tasa respiratoria elevada y la sacarosa es la principal fuente de
carbono utilizada en la respiración. La fructosa es el azúcar mayoritario de la
manzana y se acumula a lo largo del proceso de desarrollo y maduración del
fruto (Blanco y col., 1992), especialmente durante la expansión celular, deca-
yendo su acumulación cuando disminuye la actividad de la NAD-sorbitol deshi-
drogenasa (figura 9).
El incremento de la fructosa y la sacarosa está regulado por el etileno y estos
azúcares, junto con la glucosa, disminuyen en la fase de almacenamiento del
fruto como consecuencia del aumento de la tasa de respiración (Ackermann y
col., 1992; Defilippi y col., 2004). Por otra parte, el almidón es un polisacárido
de reserva que interviene en el proceso de osmorregulación. Su concentración se
acumula hasta la fase climatérica, momento a partir del cual se hidroliza por lo
que su concentración disminuye (Blanco y Mangas, 1997). Con anterioridad a la
máxima acumulación de almidón se produce un incremento de la concentración
de glucosa, por lo que la síntesis de este polisacárido de reserva está condicio-
nada por el nivel de glucosa existente y la concentración de ésta también esta
influida por la síntesis e hidrólisis del almidón, de hecho se observa un incre-
mento de la glucosa en el momento en que el almidón disminuye (figura 9).
Los ácidos orgánicos, en general, disminuyen a lo largo del proceso de des-
arrollo y maduración del fruto; este comportamiento puede ser atribuible al fenó-
meno de expansión celular y al incremento de la respiración que se produce en
la etapa climatérica (Ackermann y col., 1992), si bien en el caso del ácido quí-
nico su disminución estaría relacionada con el metabolismo de los compuestos
Figura 9.–Evolución de los carbohidratos y diversos sistemas enzimáticos a lo largo del desarrollo y madura-
ción del fruto.
29
fenólicos (Morán, 1990; Blanco y col., 1992). La reducción del contenido de

ácido málico a lo largo del desarrollo y maduración de la manzana ha sido bien
constatada en variedades de manzana de sidra (Mangas, 1992), estando este pro-
ceso regulado por el etileno (Defilippi y col., 2004). Por otra parte, la concen-
tración de los aminoácidos disminuye durante el desarrollo del fruto, lo que es
una consecuencia de la síntesis proteica, los procesos catabólicos y el efecto de
dilución de la expansión celular (Ackermann y col., 1992). No obstante, Picinelli
(1990) detectó un máximo en la concentración de serina en las fases previas al
momento óptimo de maduración de la manzana de sidra.
El contenido de los compuestos fenólicos, tanto global como individual
(ácido clorogénico, (-) epicatequina y (+) catequina), disminuye a lo largo del
desarrollo de la manzana (Murata y col., 1995), si bien en los trabajos llevados a
cabo por Mangas (1992) en seis variedades de manzana de sidra, se detectó un
mínimo en el contenido total de polifenoles en el entorno del momento de madu-
ración óptimo. En general, se ha observado que la composición fenólica en los
frutos jóvenes es más elevada que en los maduros, lo cual es una consecuencia
de la mayor actividad enzimática que se detecta en los primeros en relación con
las enzimas PAL (fenilalanina amonioliasa), CHI (calcona flavanona isomerasa)
y DFR (dihidroflavonol reductasa). De acuerdo con Treutter (2001), la actividad
de estas enzimas disminuye a lo largo del desarrollo del fruto, detectándose un
aumento de la actividad de la CHI y la DFR en la fase de maduración, lo cual
puede estar asociado a la síntesis de compuestos antociánicos.
Por otro lado, los cambios que experimenta el fruto en la etapa de maduración
afectan a la permeabilidad de la membrana y, en consecuencia, a su composición
lipídica; de hecho, Bartley (1985) detectó durante este proceso una disminución
de la relación esteroles/fosfolípidos y un incremento de la ratio entre los fosfolí-
pidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. En el proceso de maduración de la
manzana se produce una desorganización y degradación de los sistemas de mem-
brana, originando precursores lipídicos del aroma del fruto. Sin embargo, parece
que la síntesis de novo de ácidos grasos C18, como el ácido linoleico, como con-
secuencia de la elevada tasa de respiración (producción de ATP) que se produce
en el pico climatérico, podría ser un mecanismo de formación de aromas impor-
tante a través de los sistemas de degradación (β-oxidación y la lipoxigenasa) de
los ácidos grasos sintetizados (Song y Bangerth, 2003).
En relación con los contenidos de clorofilas y carotenoides en la piel de la
manzana, estimados a partir de métodos no destructivos de Reflectancia (Rλ)
[fórmulas para la estimación de clorofilas: (R800/R678)-1 y carotenos: R800 *
(1/R520-1/R700); λ: longitud de onda en nm], conviene resaltar los trabajos des-
arrollados por Solovchenko y col. (2005, 2006); estos autores ponen de mani-
fiesto que durante la maduración en el árbol ambos tipos de pigmentos disminu-
yen, detectándose un ligero incremento de la ratio carotenoides/clorofilas. En los
estados finales de la maduración en el árbol, particularmente en frutos con fuer-
te incidencia de la luz solar, los carotenoides mayoritarios son la violaxantina
30
y los ésteres de los ácidos grasos con xantofilas (Solovchenko y col., 2006). Una
vez que la manzana es cosechada se produce un incremento brusco en el conte-
nido de carotenoides y una degradación de las clorofilas, lo que es consecuencia
de un cambio en el equilibrio hormonal con especial incidencia del etileno.
La producción de aromas en la manzana está muy relacionada con el proceso
de maduración y la acción del etileno. Defilippi y col. (2005a, 2005b) concluye-
ron que esta hormona de la maduración está implicada en la biosíntesis de los
ésteres, a través de la regulación de la actividad de la enzima alcohol aciltrans-
ferasa y en la formación de precursores aromáticos, como la isoleucina, en la piel
de la manzana. Estos autores determinaron que la producción de ésteres (bu-
tanoatos y 2-metilbutanoatos de butilo y hexilo y hexanoato de hexilo) se in-
crementó de modo muy significativo una vez cosechada la manzana, si bien,
también detectaron un aumento notable de aldehídos (particularmente trans-2-
hexenal) y alcoholes (1-butanol, 2-metilbutanol y 1-hexanol). Otras enzimas
implicadas en la biosíntesis de sustancias aromáticas, como la alcohol deshidro-
genasa (ADH) y lipoxigenasa (LOX) parece que no están reguladas por el etile-
no (Defilippi y col., 2005b).
El ablandamiento del fruto es uno de los síntomas más evidentes de su madu-
rez, y la estructura más afectada por este proceso es la lámina media que experi-
menta un proceso de disolución (Ben-Arie y col., 1979). La resistencia que ofre-
ce un tejido a la compresión está determinada por la adhesión intercelular, las
fuerzas de cizalla entre polímeros y la presión de turgor que ejerce la membrana
contra la pared celular (Vicente y col., 2007). En el caso de la manzana, cuando
el fruto emblandece, se produce una reducción de los residuos azucarados de
galactosa y arabinosa y un incremento de la pectina soluble en agua (Knee, 1973;
Bartley, 1974; Mangas y col., 1992; Johnston y col., 2002). Por tanto, las enzi-
mas implicadas en la ruptura de las cadenas laterales de las pectinas contribuyen
al ablandamiento del fruto.
Por otro lado, las estructuras pécticas del tipo “egg-box” (puentes de calcio
entre los grupos carboxilo de los ácidos urónicos) y los diésteres de borato que
enlazan las cadenas de ramnogalacturonano II afectan a la firmeza del fruto. De
acuerdo con Fisher y col. (1994a), durante el desarrollo y maduración de la man-
zana se produce una disminución más acusada del contenido de galactosa que de
arabinosa en el residuo insoluble al alcohol. La pérdida de arabinosa y galactosa
es un indicador de la despolimerización de las sustancias pécticas y, por tanto, de
la desestructuración de las conexiones intermoleculares en la pared celular pri-
maria, si bien la eliminación de estos azúcares no tiene por qué estar necesaria-
mente ligada al proceso de solubilización de las pectinas. De hecho, Fisher y col.
(1994b) no detectaron pérdidas significativas en los contenidos de galactosa y
arabinosa en las pectinas de la lámina media de los frutos recogidos en su
momento óptimo de maduración. Sin embargo, estos mismos autores encontra-
ron, en el momento de la recolección de la manzana, pérdidas de estos azúcares
en las fracciones pécticas provenientes de la pared celular.
31
La solubilización de la pectina podría estar justificada por la síntesis de nue-

vos homogalacturonanos muy metilados (lo que debilitaría las interacciones
iónicas) o por la actuación de exo-poligalacturonasas sobre los homogalacturo-
nanos menos metilados. Por otra parte, de acuerdo con los trabajos de Peña y
Carpita (2004), en la fase de expansión del fruto se pierde galactosa, que pro-
viene probablemente de galactanos (1,4) no ramificados que están enlazados al
ramnogalacturonano I (RG I) y esta pérdida se produce en menor medida en la
etapa de maduración; lo contrario se observa con la arabinosa, que disminuye en
esta fase con una pérdida de arabinanos ramificados que también están unidos al
ramnogalacturonano I, hecho que precede al ablandamiento del fruto. Por tanto,
la acción de sistemas enzimáticos que originen la pérdida de arabinanos muy
ramificados y/o la desramificación del RGI está relacionada con la disminución
de la textura de la manzana. También, ha sido descrita la presencia de arabina-
nos no ramificados (1,5) asociados a la celulosa que son menos susceptibles de
ser degradados por las enzimas (Peña y Carpita 2004).
El xiloglucano forma una red con las microfibras de celulosa de notable
importancia en la estructura de la pared celular. Por tanto, la modificación estruc-
tural de esta red puede estar relacionada con el proceso de ablandamiento. Percy
y col. (1997) no detectaron cambios en el peso molecular del xiloglucano duran-
te el desarrollo de la manzana y la posible acción de endo-β-1,4 glucanasas o de
xiloglucan-endotransglucosidasa-hidrolasas (XTH) sobre el xiloglucano sería
compensada por una nueva síntesis de éste. De hecho, la acción transglucosida-
sa de la enzima xiloglucan-endotransglucosidasa (XET) ocasiona cambios en la
estructura del xiloglucano que posibilitan la expansión de la célula.
Control de la maduración. Una de las etapas relevantes del proceso de ela-
boración de la sidra es el control de la maduración de la manzana. Así, por ejem-
plo, los frutos recolectados en un momento temprano se caracterizarán por la
ausencia de flavor, excesiva acidez, alto contenido en polifenoles y baja concen-
tración de azúcares; y, por el contrario, si los frutos son recolectados en épocas
tardías tendrán bajos contenidos en acidez, elevada concentración de pectinas
solubles y estarán blandos, presentando, por ello, una vida media de conserva-
ción más corta.
Existe un número variado de parámetros para el control de la maduración
(índice de almidón, firmeza, contenido en azúcar y acidez del mosto, color de la
semilla, concentración interna de etileno, índice de Streif, etc.). En general, salvo
el contenido interno de etileno, que requiere el uso de la cromatografía gaseosa
para su evaluación, el resto de indicadores son de fácil medida.
Así, por ejemplo, Streif (1996) definió un sencillo índice (Streif Index, SI)
que incorpora información sobre la firmeza del fruto, el contenido en almidón
(el índice de almidón varía entre 1 y 9; 1, alto contenido en almidón; 9, bajo con-
tenido en almidón) y la concentración de sólidos solubles, por medio de la expre-
sión, SI= [firmeza/sólidos solubles x índice de almidón]. Cada una de las va-
riables que intervienen en la estimación del SI son, en sí mismas, indicadores
32
relevantes del nivel de maduración del fruto. Como se puede deducir de la expre-
sión que lo define, a medida que el fruto madura este índice disminuye, ya que,
la firmeza es menor y el contenido de sólidos solubles e índice de almidón
aumentan.
Si bien el contenido de sólidos y el índice de almidón se pueden medir sin
dificultad, en el caso de la medida de la firmeza hay que tomar algunas precau-
ciones. Así, por ejemplo, los frutos afectados por la alteración “watercore” (cora-
zón acuoso) no deberían ser muestreados, las manzanas de mayor tamaño, por lo
general, son más blandas que las más pequeñas (la muestra de frutos debe ser,
por tanto, lo más homogénea posible en cuanto a su tamaño) y la velocidad con
la que se aplica la fuerza para evaluar la firmeza es una variable crítica en la
determinación de este parámetro. Los índices de maduración están altamente
correlacionados con parámetros como el flavor, el aroma, la textura, el potencial
de conservación del fruto, etc.
También, se suele utilizar, para la detección del nivel de maduración óptimo
del fruto, el tiempo transcurrido desde la caída del botón floral (DAFB, Days
After Full Bloom). Este parámetro debe ser utilizado como una referencia, ya que
puede variar entre cosechas. Se dispone de datos para el caso de variedades de
mesa comerciales como ‘Gala’ o ‘Fuji’, 110-120 y 170-185 días, respectivamen-
te (Sinha, 2006)
En relación con la manzana de sidra, Blanco-Gomis y col. (1998) y Mangas
y col. (1998), han llevado a cabo estudios quimiométricos enfocados a determi-
nar las variables químicas que son significativas en la determinación del momen-
to óptimo de madurez del fruto destinado a la elaboración de la sidra. Los estu-
dios analíticos (azúcares, polifenoles, pectinas, ácidos orgánicos y aminoácidos)
realizados en seis variedades de manzana de sidra (‘Collaos’, ‘Durón Arroes’,
‘Meana’, ‘Coloradona’, ‘Raxao’ y ‘Picona Rayada’) en diferentes estadios de
maduración, junto con la aplicación de modelos quimiométricos fiables y robus-
tos (éxitos de predicción del nivel de maduración, por encima del 92%), ponen
de relieve que la fructosa y las pectinas son las variables más relevantes en la
estimación del momento de maduración óptimo.
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Zhang, L.-Y.; Peng, Y.-B.; Pelleschi-Travier, S.; Fan, Y.; Lu, Y.-F.; Lu, Y.-M.; Gao, X.-P.; Shen, Y.-
Y.; Delrot, S.; Zhang, D.-P. 2004. Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing
apple fruit. Plant Physiology, 135, 574-586.
38
2. Procesos pre-fermentativos
Introducción
La etapa pre-fermentativa engloba un conjunto de procesos de relevante
importancia en la elaboración de la sidra. Comienza con la recolección de la
manzana, condicionada por la maduración del fruto, continúa con la extracción
del mosto y finaliza con la clarificación (etapa optativa). La figura 1 recoge un
esquema que ilustra la interrelación existente entre las diferentes fases del pro-
ceso pre-fermentativo y los factores que influyen en la composición del mosto.
Figura 1.–Factores que influyen en la composición del mosto en el proceso pre-fermentativo (FA: fermenta-
ción alcohólica; FML: fermentación maloláctica).
39
Juan José Mangas Alonso, Domingo Blanco Gomis
Mezcla de manzana
Las variedades de manzana utilizadas en la elaboración de la sidra (varieda-
des de sidra) se clasifican en tipos o bloques tecnológicos. Éstas presentan, con
relación a las variedades de mesa, algunas ventajas para elaborar la sidra. Así,
por ejemplo, pueden presentar elevados contenidos de azúcar (hasta el 15%), tie-
nen un elevado intervalo de acidez (0,1-1%, ácido málico), su estructura fibrosa
facilita la extracción e incrementa el rendimiento en mosto, en algunos casos
presentan elevados contenidos de polifenoles (taninos) y la maduración comple-
mentaria que experimentan, cuando son separadas del árbol, facilita la conver-
sión del almidón en azúcar sin que exista una pérdida importante de firmeza
(Lea, 1995).
El agrupamiento de las diferentes variedades de sidra en bloques tecnológi-
cos es muy útil para realizar una adecuada mezcla de la materia prima en el pro-
ceso de elaboración de la sidra. Los grupos tecnológicos se establecen en función
de la cantidad presente en el fruto de dos grupos químicos de moléculas que con-
tribuyen al flavor de la manzana, los ácidos y los polifenoles. Así, por ejemplo,
una variedad ácida se caracteriza por presentar una proporción elevada de áci-
dos orgánicos y bajo contenido en taninos, una amarga por tener una concen-
tración muy elevada de polifenoles y una baja concentración de ácidos y una
dulce por tener una baja cantidad de ácidos y polifenoles. Como se deduce de la
definición del bloque dulce, una variedad perteneciente a este grupo no tiene por
qué tener mayor cantidad de azúcares que una ácida o una amarga, ya que la per-
tenencia a él no es función del nivel de azúcares que presente el fruto. Aparte de
estos tres bloques tecnológicos principales, se pueden encontrar otros que se
definen, también, en función de las proporciones relativas que el fruto presenta
en ácidos y polifenoles. Así, por ejemplo, las variedades dulce-amargas tienen
un elevado contenido en taninos y baja proporción de ácidos, las ácido-amargas
presentan alta proporción de ácidos y una concentración intermedia de taninos y
las aciduladas tienen una proporción de ácidos comprendida entre las ácidas
y las dulces y bajo contenido en taninos.
En la tabla 1 se recogen los valores de la concentración de ácidos totales (ex-
presados como ácido sulfúrico) y taninos (expresados como ácido tánico) que
determinan los diferentes bloques tecnológicos.
En la tabla 2 se muestran algunas variedades de manzana acogidas a la DOP
“Sidra de Asturias” y su asignación a los bloques tecnológicos recogidos en la
tabla 1.
Por otra parte, con el fin de definir una mezcla de variedades apropiada para
la elaboración de la sidra, es necesario establecer la proporción de los diferentes
bloques tecnológicos. A modo orientativo, la proporción de variedades que apor-
tan acidez (ácidas, aciduladas y ácido-amargas) no debería superar el 60%, estan-
do el 40% restante integrado por variedades que aportan dulzor y amargor (dul-
ces, amargas y dulce-amargas).
40
Tabla 1.–Clasificación de las variedades de sidra en función del contenido en ácidos y taninos
(Mangas, 1992; Lea, 1995; Dapena, 1996)
Bloque tecnológico Acidez (g H2SO4/L) Taninos (g ácido tánico/L)
Amargo <3,29 >2,00

Ácido >4,80 <1,45
Dulce <3,29 <1,45
Dulce-amargo <3,29 [1,45-2,00]
Ácido-amargo >4,80 [1,45-2,00]
Acidulado [3,29-4,80] <1,45
Tabla 2.–Clasificación en bloques tecnológicos de variedades de sidra acogidas a la DOP “Sidra de Asturias”
Variedad Bloque tecnológico
Durona de Tresali Ácido

Blanquina “
Limón Montés “
Teórica “
San Roqueña “
Raxao “
Xuanina “
Fuentes “
Verdialona Dulce
Ernestina “
Regona Ácido-Amargo
Clara Amargo
Coloradona Dulce-Amargo
Carrió Acidulado
Solarina “
De la Riega “
Collaos “
Perico “
Prieta “
Perezosa “
Condiciones de higiene y sanidad de la materia prima y su efecto

sobre la calidad del mosto
Las condiciones sanitarias y de higiene de la materia prima influyen en el de-
sarrollo de microorganismos que producen toxinas y aromas desagradables en el
zumo de manzana. El fruto debe manipularse con cuidado para no dañarlo y
cuando se recolecte de manera mecánica deberá permanecer el menor tiempo
posible almacenado. Antes de la elaboración, se deberá lavar y realizar una cui-
dadosa selección del mismo, evitando la entrada en el molino de frutos podridos
o dañados.
41
La patulina es una micotoxina producida por hongos de los géneros Peni-

cillium, Aspergillus y Byssochlamys. Aunque no se ha demostrado que sea una
molécula carcinogénica, tiene efectos inmunotóxicos y neurotóxicos en anima-
les. El comité de expertos JECFA (Joint Expert Committee on Food Additives)
estableció una ingesta de patulina diaria máxima tolerable de 0,4 µg/kg pv (pv,
peso vivo), recomendándose que los productos derivados de la manzana no con-
tengan una concentración superior a 50 µg/kg (Shephard y Leggott, 2000). Sin
embargo, hay que tener en cuenta que la fermentación alcohólica destruye la
patulina, por lo que productos fermentados, como la sidra, no contienen esta
micotoxina. Su presencia en el zumo de manzana es problemática, por cuanto es
una molécula resistente a los tratamientos térmicos que se realizan para estabili-
zarlo, antes de su comercialización, tanto desde un punto de vista físico-químico
como microbiológico.
Además de esta micotoxina, se pueden detectar (concentración umbral de
reconocimiento, CUR) en el zumo de manzana un grupo de moléculas que comu-
nican sensaciones aromáticas incorrectas como, por ejemplo, aromas a “tierra”,
“moho”, “seta/champiñón” “fenólico”, “medicinal”, etc. Ello es consecuencia
del desarrollo de bacterias aerobias “termoacidofílicas”, entre las que destacan
Alicyclobacillus acidoterrestris y Streptomyces griseus griseus (Siegmund y
Pöllinger-Zierler, 2007); éstas pueden desarrollarse a bajas temperaturas (4º C) y
con limitado nivel de oxígeno. A modo de ejemplo, conviene señalar que A. aci-
doterrestris es responsable de la formación de guayacol (CUR: 2 µg/L zumo) y
de 2,6-dibromofenol (CUR: 0,085 µg/L zumo) y S. griseus griseus de la geos-
mina (CUR: 0,027 µg/L zumo), el 1-octen-3-ol (CUR: 31 µg/L zumo) y de las
metoxipiracinas (2-isobutil-3-metoxipiracina y 2-isopropil-3-metoxipiracina;
CUR: 0,0033 y 0,0006 µg/L zumo, respectivamente), entre otras moléculas
(Zierler y col., 2004; Siegmund y Pöllinger-Zierler, 2006).
Extracción
El proceso de extracción del mosto de manzana incluye tres etapas bien dife-
renciadas, la molienda, la maceración y el prensado. La maceración se produce
de manera simultánea con el prensado aunque, en ocasiones, previo al prensado,
se lleva a cabo una maceración en la que el mosto de manzana se extrae o escu-
rre por gravedad exclusivamente. La molienda de la manzana produce la pulpa o
“magaya”, la cual se somete al proceso de maceración y prensado para obtener,
por un lado, el orujo y, por otro, el mosto. La figura 2 muestra dos sistemas de
prensado utilizados en la elaboración de la sidra.
Los tipos de molinos más comunes son los de martillo y los de rejilla (ralla-
dores y de cuchillas fijas), si bien, en el caso de la elaboración de la sidra en
Asturias el más habitual es el de martillo. Éste dispone de una barra giratoria
donde están insertados diferentes martillos. El número y tamaño de éstos, así co-
mo la velocidad de giro, determinan el rendimiento del sistema (Downes, 1990).
42
(A) (B)
Figura 2.–Prensas: a) de “cajón” construida en acero inoxidable (cortesía de sidra Menéndez, Gijón) y
b) neumática (cortesía de sidra Cortina, Villaviciosa)
En este tipo de molino existe una gran variabilidad de tamaño de partícula y el

grado de trituración del fruto debe ser un compromiso entre obtener partículas de
gran tamaño, que dan poco rendimiento en mosto y partículas muy finas que difi-
cultan la transmisión de fuerza en el prensado (Bump, 1989).
El tipo de molienda utilizado determina el tamaño de partícula de la pulpa,
que deberá ser definido en función del nivel de madurez del fruto y su textura.
Así, por ejemplo, en el caso de frutos blandos se debe utilizar un molino con
pocos martillos y pequeña velocidad de giro. Los molinos de rejilla disponen de
una cámara circular donde entra el fruto y en la que existe un rotor que empuja
el fruto hacia la rejilla, que tiene un nivel de tamizado concreto (rallador), y
donde puede haber unas cuchillas fijas que dilaceran el fruto. De igual manera
que en el caso del molino de martillo, el de rejilla debe ajustarse al tipo de fruto
que se pretenda moler. Así, por ejemplo, si la manzana está blanda el tamizado
deberá ser más grueso, la velocidad de giro menor y se cambiará la profundidad
de las cuchillas para proporcionar un corte más grosero.
La maceración es una etapa opcional en la que la pulpa de manzana perma-
nece sin prensar durante un periodo de tres a 24 horas y donde el zumo de man-
zana escurre libremente a través de ésta. Es necesario controlar, en la pulpa mace-
rada, la proporción de mosto respecto a la cantidad de sólidos con el fin de que
el proceso de bombeo de la pulpa a las prensas se realice de manera satisfactoria.
Con la maceración se persigue, fundamentalmente, incrementar el rendimien-
to en mosto, que está muy condicionado por la temperatura y el estado de madu-
rez de la manzana. Así, por ejemplo, no es recomendable macerar si la manzana
está muy madura y presenta una textura suave y si la temperatura es elevada, si
bien ésta puede ser controlada en los maceradores actuales. Por el contrario, si la
manzana presenta una fuerte textura puede ser necesaria la maceración para
mejorar la salida del mosto. En todo caso, esta etapa puede facilitar la gestión del
proceso de extracción en función de los flujos de entrada de materia prima y de
la capacidad de prensado de la bodega.
43
La eficiencia de la extracción mejora notablemente con un tratamiento con

enzimas macerantes (pectinasas y otros enzimas hidrolíticos de la pared celular)
que rompen los tejidos del fruto facilitando la extracción del mosto. La hidróli-
sis de las pectinas que se ubican en la lámina media contribuye a la separación
celular (Chesson, 1980) y la rotura de las células provocada por los enzimas
macerantes favorece la salida del jugo vacuolar, incrementándose el contenido de
ácido málico y la acidez total. El aumento de la acidez se puede explicar, tam-
bién, por el mayor contenido de ácido galacturónico debido a la actividad de las
enzimas pectolíticas (Poll, 1993). Sin embargo, cuando la maceración se lleva a
cabo sin la intervención de enzimas la concentración de ácido málico y la acidez
total se reduce notablemente, lo que es achacable a la descarboxilación oxida-
tiva de este ácido, bien a través del ciclo de Krebs o del enzima málico (Poll,
1993).
A lo largo de la maceración la pulpa se oxida y la concentración de los poli-
fenoles en el mosto disminuye; a modo de ejemplo, hay que señalar que se ha
observado una reducción del 58% para las catequinas, un 44% para el ácido clo-
rogénico y un 31% para la floricina (Sluis, 2005). La disminución de la concen-
tración de polifenoles limita la formación de asociaciones entre éstos y los poli-
sacáridos, lo que favorece la acción de los enzimas hidrolíticos y, en consecuen-
cia, mejora la solubilización de la pectina y la extracción del mosto. De hecho,
el tratamiento de la pulpa de manzana con enzimas macerantes se acorta nota-
blemente en el caso de que ésta esté muy oxidada.
No obstante, una excesiva pérdida de pectina de las paredes celulares puede
ocasionar una disminución de la rigidez de éstas, dificultando, con ello, el pro-
ceso de prensado. En este sentido, conviene resaltar que los polifenoles inhiben
la ruptura de la pectina lo que hace, por ejemplo, que la pulpa de las variedades
dulce-amargas sea menos viscosa y más fácil de prensar. Por otra parte, convie-
ne señalar que la acción de los enzimas macerantes está condicionada por el pH
de la pulpa de manzana, ya que la actividad enzimática disminuye cuando la aci-
dez es más elevada.
La maceración puede condicionar la concentración de alcoholes superiores en
la sidra. Así, por ejemplo, la realización de una maceración, previa al inicio de la
fermentación, incrementa el nivel de los alcoholes isoamílico, 2-feniletanol, iso-
butanol y 1-propanol, lo cual es, probablemente, una consecuencia de la oxige-
nación de la pulpa de la manzana (Vidrih y Hribar, 1999). El tratamiento enzi-
mático de ésta condiciona la formación y distribución de los aromas C6. Así, por
ejemplo, Schreier y col. (1978) han puesto de manifiesto que la utilización de
enzimas pectolíticos en la fase de maceración de la pulpa de manzana incremen-
ta los aldehídos C6 (hexanal, E-2-hexenal) y disminuye los alcoholes C6 (1-
hexanol, Z-3-hexenol, E-2-hexenol). Sin embargo, el tratamiento de la pulpa con
celulasas aumenta la concentración de alcoholes C6. Por otro lado, la utilización
conjunta de pectinasas y celulasas provoca la hidrólisis de los ésteres de acetato
(butilo, isopentilo, pentilo, hexilo y E-2-hexenilo).
44
Los sistemas de prensado más habitualmente utilizados en la industria de la

sidra son: a) las prensas verticales de “cajón”, en madera o en acero, cuadradas
o cilíndricas, movidas por dispositivos mecánicos o hidráulicos; b) las prensas
horizontales neumáticas y c) las prensas semi-continuas automáticas horizonta-
les de pistón (Bucher-Guyer). También se emplean, en menor medida, las hidráu-
licas verticales de doble bandeja (“rack and cloth” o “pack”).
Las prensas verticales de “cajón”, que tienen una capacidad de carga media
de aproximadamente 12 t, se caracterizan por presentar una menor capacidad de
prensado (Kg/h) y mayores costes de proceso, si se comparan con otros sistemas
como las prensas neumáticas. Sin embargo, los rendimientos en mosto son algo
superiores (en el entorno del 75% para las prensas de cajón vs el 70% para las
neumáticas) y la proporción de sólidos es menor, debido a que la torta de pren-
sado tiene mayor espesor, lo que facilita la filtración del mosto que escurre a tra-
vés de ésta.
Esta capacidad de filtración y de retención de sólidos se incrementa a medi-
da que la presión aumenta y se estrechan los canales de salida del mosto. Para
alcanzar los rendimientos descritos es necesario realizar diferentes “cortes” de la
torta de prensado, lo que facilita la extracción del mosto. El número de “cortes”
a realizar está condicionado por el estado de maduración del fruto y la tempera-
tura de proceso. Si la manzana está muy madura puede ser suficiente hacer en
torno a 15-20 “cortes”, se debe disminuir el tiempo del proceso de cada “corte”
y realizar un prensado lento, es decir, que el incremento de la presión con el tiem-
po sea pequeño. Por el contrario, si se dispone de manzana con elevada textura
se puede incrementar el número de “cortes” y el tiempo del proceso de cada
“corte”, así como aumentar la variación de la presión con el tiempo. Por otra
parte, una temperatura elevada, por ejemplo, por encima de 18º C, requiere acor-
tar el tiempo de prensado, que se puede estimar como promedio en 48 horas.
Las prensas neumáticas presentan una capacidad de carga media comprendi-
da entre 8 y 16 t. Disponen de un cilindro rotatorio horizontal con una membra-
na de goma flexible en su interior, de tal forma que una vez cargada la masa de
pulpa se ejerce una presión sobre ella, por reducción del espacio que la contiene,
como consecuencia de la inyección de aire comprimido en el interior del tubo o
membrana de goma. Esta membrana puede estar ubicada en la parte central, lo
más habitual en la elaboración de la sidra, o en un lateral. Debido a la compre-
sión de la pulpa se conseguirá la extracción del mosto, que fluirá a través de las
paredes del cilindro que suelen estar formadas por una malla de acero inoxida-
ble recubierta de una tela de nylon. Su fácil automatización permite adaptar el
ciclo de prensado a las características de la materia prima. Así, el programa auto-
mático puede dirigir el prensado en función de los ciclos de caída de presión o
usar un sistema de tiempos prefijados.
A modo de ejemplo, el perfil de evolución de la presión con el tiempo puede
ser del modo siguiente: a) inicio del proceso a baja presión, por ejemplo 0,2 bares,
con varias fases de descomprensión y desmenuzado de la pulpa; b) incremento de
45
la presión desde 0,2 hasta 1,8 bares (presión máxima) empleando, también, dife-
rentes etapas de descomprensión y desmenuzado de la pulpa; y c) prensado a pre-
sión máxima, incorporando, igualmente, varias fases de descomprensión y remo-
vido de la pulpa. Normalmente, los ciclos de prensado duran de 4 a 5 horas. De la
misma forma que en el caso de las prensas de “cajón”, el programa de prensado
está condicionado por el estado de madurez del fruto. Si éste presenta una textura
débil se debe acortar el número de procesos de removido de la pulpa y alargar lige-
ramente los tiempos en las diferentes fases de prensado a presión constante.
Las prensas horizontales de pistón automáticas se encuadran dentro de las
tecnologías rápidas de prensado. De hecho, los ciclos de prensado oscilan entre
1-1,5 horas, presentando rendimientos comprendidos entre el 70 y el 75%. Estos
sistemas funcionan de manera automática, programándose los diferentes ciclos
de prensado que se componen de: a) una etapa de carga de la pulpa, b) despla-
zamiento horizontal del pistón para ejercer presión y extraer el mosto y c) des-
plazamiento del pistón en sentido inverso, con giro de la prensa, para remover y
desmenuzar la pulpa.
Los modelos existentes de prensas verticales de doble bandeja van desde un
rendimiento de 114 L/hora a diez veces más. Normalmente, trabajan en dos
ciclos de 20 a 30 min cada uno. El primero es de baja presión (34 a 48 bares) y
sirve para romper las células y extraer una parte del mosto y el segundo ciclo es
de alta presión (170 a 204 bares), lo que permite extraer el resto del líquido. Los
rendimientos, que pueden superar el 75% (Lea, 1995), pueden estar muy condi-
cionados por el nivel de maduración de la manzana, ya que si ésta está muy
madura los canales de salida del mosto pueden colapsarse en el ciclo de mayor
presión y el proceso es muy ineficiente. En estos casos, se tienen que añadir
coadyuvantes de prensado, que son materiales fibrosos que facilitan la salida del
mosto. El manejo y llenado adecuado de los paquetes de pulpa, también deno-
minados “quesos”, y el tamaño de la partícula molida, condicionan la eficiencia
del proceso de prensado. Estas prensas se utilizan en elaboraciones a pequeña
escala, ya que cuando son a gran escala el proceso de prensado es muy costoso.
El rendimiento (η) en mosto de la pulpa de manzana en el proceso de pren-
sado es función de la presión, la temperatura, el tamaño de partícula, el tiempo,
la longitud de los canales por donde el mosto fluye en la torta de prensado, la
variación de la presión con el tiempo y el grado de ruptura del material celu-
lar. Una estimación precisa de este parámetro no debe hacerse a partir del peso
del fruto y del volumen de mosto obtenido, ya que aparte de la imprecisión que
puedan tener estas variables la humedad del orujo está influida por las condicio-
nes de prensado. Beech y Carr (1977) sugieren evaluar el rendimiento en mosto
a partir de la densidad de éste y la cantidad de sólidos insolubles (si) que pre-
sentan la pulpa (p) y el orujo (o). Para ello, proponen la expresión siguiente η
(L/1.000 kg)= [1.000 * 1- (sip/sio)]/ densidad.
Los tiempos de prensado necesarios para alcanzar un determinado rendi-
miento en mosto dependen de la tecnología utilizada, ya que éstos son directa-
46
mente proporcionales al cuadrado del espesor inicial de la torta de prensado

(Beech y Carr, 1977); ello afecta, además, a la composición del mosto. Así, por
ejemplo, si se utiliza una prensa lenta la concentración de pectina aumenta mien-
tras que los polifenoles, el nitrógeno y la turbidez del mosto disminuyen (Man-
gas, 1992; Del Campo y col., 2003; González, 2004). La menor concentración de
polifenoles detectada en el mosto de manzana, cuando éste es obtenido por
medio de sistemas tradicionales de prensado (velocidad lenta de extracción), se
corresponde con una alta incorporación de oxígeno que provoca una mayor oxi-
dación de estos compuestos (Del Campo y col., 2003).
Desde el punto de vista de la composición de la sidra, se ha constatado que
cuando se utiliza un prensado rápido se incrementa la concentración de alcoho-
les superiores (amílicos e isobutanol) y acetoína y disminuye el acetato de etilo,
la acidez volátil y el metanol (Mangas y col., 1993; González, 2004), mientras
que los prensados lentos mejoran los niveles de aromas como el succinato de die-
tilo y la γ-butirolactona, entre otros (González, 2004). En este sentido, conviene
resaltar que la turbidez (mayor en los prensados rápidos) y el nivel de alcoholes
superiores tienen una correlación positiva y que la mayor concentración de meta-
nol en el prensado lento se puede explicar por la más elevada cantidad de pecti-
na que se extrae con este sistema.
Por otra parte, el incremento que se produce de los ácidos volátiles (básica-
mente ácido acético) y el acetato de etilo con el uso de las prensas lentas (Del
Campo y col., 2003), tiene que ver con la mayor concentración de microorga-
nismos (entre los que se incluyen levaduras no-Saccharomyces y bacterias lácti-
cas) detectados en esta tecnología de prensado (Cabranes y col., 1990; Mangas
y col., 1994; Del Campo y col., 2003); y, por otra parte, hay que tener en cuenta
que las levaduras no-Saccharomyces producen mayor cantidad de estos aromas
(Mangas y col., 1993; Cabranes y col., 1996, 1997 y 1998).
Interacciones físico-químicas y procesos oxidativos. La composición macro-
molecular (polifenoles, proteínas y polisacáridos), el color, el perfil aromático y
las características gustativas (amargor y astringencia) del mosto de manzana
están condicionados, no solamente por la variedad de manzana, su nivel de
maduración, el manejo y las condiciones edafo-climáticas del cultivo sino, tam-
bién, por la etapa de extracción y clarificación, en definitiva por la fase pre-fer-
mentativa. En este apartado se analizarán los diferentes procesos, tanto de carác-
ter físico-químico como bioquímico, que tienen lugar en esta etapa y que condi-
cionan o influyen en las características sensoriales del mosto y la sidra.
En la manzana, los polisacáridos, los polifenoles y las enzimas que los oxi-
dan, las polifenoloxidasas, se encuentran en compartimentos diferentes que
impiden que se produzca una interacción entre ellos. Además, en esta situación
no hay contacto con el oxígeno molecular. Sin embargo, durante la molienda y
producción de la pulpa de manzana estos componentes entran en contacto entre
sí, haciéndolo, también, con el oxígeno. Como consecuencia de ello, se ponen
en marcha una serie de procesos que condicionan la composición química y
47
propiedades sensoriales del mosto escurrido y el que finalmente se obtendrá me-

diante prensado.
En primer lugar, es bien conocido que los compuestos fenólicos están impli-
cados en interacciones físico-químicas específicas con las partes sólidas de los
frutos y, particularmente, con los materiales de la pared celular (contiene más de
un 90% de polisacáridos). Dos mecanismos están implicados en estas interac-
ciones, la adsorción de polifenoles, tanto oxidados como no oxidados, sobre los
materiales de la pared celular y la formación de enlaces covalentes entre los pro-
ductos resultantes de la oxidación de los polifenoles, las quinonas, y los políme-
ros de la pared celular.
De acuerdo con los trabajos realizados por Renard y col. (2001), Bourvellec
y col. (2004a, 2005) y Bourvellec y Renard (2005), cabe señalar que las interac-
ciones entre procianidinas y los polisacáridos de la pared celular se refuerzan con
el aumento de la fuerza iónica (lo que pone en evidencia interacciones de carác-
ter hidrofóbico), se debilitan con el incremento de la temperatura (refleja la exis-
tencia de enlaces por puente de hidrógeno) y no existe influencia del pH (las
fuerzas electrostáticas no intervienen). En consecuencia, se puede afirmar que la
adsorción está gobernada por enlaces por puente de hidrógeno e interacciones
hidrofóbicas, las cuales están favorecidas por la existencia de cavidades hidrofó-
bicas en los polímeros de la pared. Una vez establecido el lugar de nucleación o
interacción se produce una asociación de polifenoles por “apilamiento”.
La flexibilidad conformacional y el tamaño y tipo de polifenol son factores
que afectan al proceso de interacción entre los polifenoles y otras macromolécu-
las. La diferente conformación que presentan las procianidinas, en función de
que dispongan de mayor o menor porcentaje de (+)-catequina o (-)-epicatequina,
afecta a la capacidad de complejarse, incrementándose ésta con el aumento de la
proporción de (+)-catequina. Por otra parte, las interacciones se refuerzan con el
mayor grado de polimerización de la procianidina y con el aumento del porcen-
taje de ácido gálico (en el caso de la manzana no hay presencia detectada de
ácido gálico en las procianidinas), ya que, cuanto mayor sea el tamaño de la pro-
cianidina o la proporción de ácido gálico mayor será el número de grupos hidro-
xilo (con lo que se incrementan los enlaces por puente de hidrógeno) y arilo
(aumentan las interacciones hidrofóbicas).
La interacción de los polifenoles con macromoléculas, como los polisacá-
ridos, condiciona la relación existente entre procianidinas oligómeras (1-5 uni-
dades) y poliméricas (6-10 unidades) y, por ende, el balance entre amargor y
astringencia (Lea y Arnold, 1978; Lea, 1984). Como es bien sabido, la sensa-
ción de amargor se explica por las interacciones que se producen entre las mo-
léculas polares y los lípidos presentes en la membrana de las células gustativas
de la boca (Bate-Smith, 1973), por lo que el factor limitante es la solubilidad de
la molécula en la fracción lipídica. En el caso de las procianidinas, las de me-
nor tamaño son las que mejor se solubilizan y, por tanto, provocan sensaciones
amargas.
48
La astringencia, por el contrario, está fundamentada en las interacciones por

puentes de hidrógeno que se establecen entre las proteínas salivares y los grupos
hidroxilo de las procianidinas. Las más poliméricas, al tener más grupos hidro-
xilo, interaccionan más fuertemente con las proteínas provocando mayor sensa-
ción de astringencia. No obstante, las sensaciones de amargor y astringencia
pueden estar condicionadas por las interacciones de los polifenoles y otros cons-
tituyentes del mosto de manzana y la sidra. Así, por ejemplo, el etanol y los poli-
sacáridos reducen la astringencia y los azúcares el amargor (Le Quéré y col.,
2006), mientras que una disminución del pH, por adición de ácido málico, incre-
menta la sensación de astringencia, probablemente por inducir este ácido un
cambio conformacional de las proteínas salivares lo que facilita la precipitación
de éstas con los polifenoles (Kallithraka y col., 1997).
La presencia del oxígeno molecular en la etapa de extracción provoca cam-
bios muy importantes en la composición química del mosto y sus propiedades
sensoriales, en particular el aroma y el color. La acción conjunta del oxígeno y
la lipoxigenasa sobre los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana celular,
es el caso de los ácidos linoleico y linolénico, y la intervención posterior de otros
enzimas como hidroperóxido-liasas, isomerasas y alcohol deshidrogenasas, da
origen a alcoholes y aldehídos C6 y C9, como Z-3-hexenal, E-2-hexenal, hexa-
nal, Z-3-nonenal, E-2-nonenal, Z-3,Z-6-nonadienal, E-2,Z-6-nonadienal, Z-3-
hexenol, E-2-hexenol y 1-hexanol y otras moléculas como los ω-cetoácidos,
como por ejemplo el ácido 12-ceto-Z-9-dodecenoico, el 12-ceto-E-10-dodece-
noico y el 9-ceto-nonanoico (Vick y Zimmerman, 1987).
Durante el proceso de extracción del mosto de manzana se produce una pér-
dida de polifenoles (desde la manzana hasta la pulpa y el zumo) que se debe,
como se ha señalado, a las interacciones de estas moléculas con los componen-
tes de la pared celular, así como a diversos procesos bioquímicos y químicos
como, la oxidación enzimática (Nicolas y col., 1994) llevada a cabo por el enzi-
ma polifenoloxidasa (PPO) y el oxígeno (producción de quinonas), la oxidación
química realizada por las quinonas (oxidación acoplada: por ejemplo, formación
de la o-quinona de catequina a partir de la catequina y la o-quinona de un ácido
fenólico) (Cheynier y col., 1988), la interacción polifenol/quinona, dado el
carácter fuertemente electrófilo de ésta (por ejemplo, síntesis de dehidrodicate-
quinas B4 y A y otros productos de condensación; Weinges y Müller, 1972;
Cheynier y col., 1989), la comproporción (desproporción inversa) entre una qui-
nona y una hidroquinona (Singleton, 1987; Bernillon y col., 2004) con formación
de semiquinonas radicalarias y polimerización posterior de éstas, la compropor-
ción seguida de sustitución homolítica aromática y dimerización (unión O-3’B-
C-8D) por oxidación acoplada de la catequina (Guyot y col., 1996) y la forma-
ción de aductos entre quinonas y compuestos nucleofílicos, como las moléculas
nitrogenadas y azufradas (Singleton, 1987).
Por otra parte, de acuerdo con los trabajos realizados por Hubert (2008) en
variedades de manzana de sidra francesas, conviene resaltar que se extraen mejor
49
en el mosto de manzana los ácidos fenólicos (moléculas menos hidrófobas que

los flavanoles) que las catequinas y las procianidinas, especialmente las de
mayor tamaño; las procianidinas más poliméricas se fijan en mayor proporción
al orujo de la manzana. Por tanto, la proporción de flavanoles disminuye de la
manzana al mosto y la de ácidos fenólicos se incrementa. La mayor proporción
de ácidos podría justificarse por un proceso de oxidación acoplada entre la qui-
nona del ácido clorogénico y una procianidina, lo que llevaría a degradar la pro-
cianidina y a recuperar de nuevo el ácido clorogénico (Bourvellec y col., 2004b).
Así mismo, hay que tener en cuenta, además, que el ácido cafeoilquínico (clo-
rogénico) y las catequinas son mejores sustratos para las polifenoloxidasas que
las procianidinas. Otros flavonoides, como los flavonoles, no son sustratos de las
polifenoloxidasas debido al impedimento estérico que origina el azúcar enlaza-
do a la aglicona en el C3.
Todos estos procesos de oxidación y polimerización conducen a la formación
de pigmentos pardos que dan la coloración típica al mosto y a la fracción sólida
de la pulpa de la manzana (el orujo). La oxidación juega, también, un importan-
te papel en el posterior desarrollo del proceso de fermentación, por cuanto com-
pite con los microorganismos por el oxígeno molecular disponible. Así, por
ejemplo, ha sido descrito que tanto los polifenoles no oxidados (particularmente
procianidinas de elevada masa molecular) como los productos resultantes de la
oxidación de las procianidinas, catequinas y el ácido clorogénico, son capaces de
inhibir la acción de las polifenoloxidasas (Bourvellec y col., 2004b) y, por tanto,
afectar a la disponibilidad de oxígeno para los microorganismos más aerobios, es
el caso de las bacterias acéticas y determinadas levaduras no-Saccharomyces.
Clarificación pre-fermentativa: mecanismos y efecto sobre la composición

del mosto y la sidra
Como paso previo al desarrollo del proceso fermentativo puede ser necesaria
la realización de una clarificación del mosto, en el caso de que éste presente una
elevada turbidez. Es bien sabido que un exceso de turbios incrementa la veloci-
dad de fermentación y la producción de aromas indeseables, como por ejemplo
determinados compuestos azufrados (sulfuros), a la vez que se puede producir
una síntesis excesiva de alcoholes superiores.
La turbidez del mosto de manzana está constituida por partículas insolubles en
agua como fibras, celulosa, hemicelulosa, protopectina, almidón y lípidos y
macromoléculas de naturaleza coloidal como la pectina, las proteínas, la fracción
soluble de almidón, los polifenoles y sus productos de oxidación y polimerización.
Dos métodos son habitualmente usados para clarificar el mosto: a) clarificación
enzimática con posterior decantación y/o encolado (“collage”, “fining”); y b) defe-
cación enzimática. A éstos hay que añadir, también, la microfiltración tangencial.
El primer proceso (a) consiste en llevar a cabo una hidrólisis de la pectina
mediante un complejo enzimático de pectinasas que presentan diferentes activi-
50
dades: pectín metilesterasa (PME), endo-poligalacturonasa (endo-PG) y pectín

liasa (PL). La PME cataliza la hidrólisis de la pectina que se transforma en pec-
tato y metanol; la endo-PG cataliza la fragmentación y solubilización de los polí-
meros pécticos, de bajo grado de metoxilación, por ruptura de los enlaces inter-
nos del homogalacturonano (α 1,4-D-galacturónico); y la PL, a través de un
mecanismo de β-eliminación, rompe el enlace glicosídico C4 y produce un doble
enlace entre los carbonos C4 y C5 en el extremo no reductor. La PL actúa sobre
polímeros pécticos de elevado grado de metoxilación, tanto en modo “endo”
como “exo”.
Se asume que las sustancias pécticas actúan como coloides protectores de las
proteínas y otras partículas del mosto de manzana, formando asociaciones mole-
culares electronegativas al pH del mosto (3,5), donde la pectina está insolubili-
zada (ver figura 3). Las pectinasas que se añaden en el proceso de clarificación
enzimática solubilizan parcialmente las pectinas asociadas a las partículas en
suspensión, provocando que éstas se agreguen al perder una parte de la capa péc-
tica que era el factor de estabilización y quedar al descubierto la carga positiva
que determinadas proteínas presentan al pH del mosto. Las partículas con carga
pueden interaccionar mediante fuerzas electrostáticas y flocular; este proceso se
facilita al disminuir la viscosidad como consecuencia de la actividad de las enzi-
mas pectolíticas que hidrolizan la pectina solubilizada, formando oligourónicos
que presentan menor tamaño. Cuando se realiza un tratamiento enzimático y se
espera el tiempo suficiente para que las partículas sedimenten el proceso de cla-
rificación prefermentativa se denomina despectinización- decantación.
Este proceso puede ser asistido por una clarificación química (“fining”) que
consiste en añadir proteínas al mosto, generalmente gelatina. Esta proteína, al pH
Figura 3.– Mecanismo de clarificación enzimática propuesto para el mosto de manzana [Endo (1965) y
Yamasaki y col. (1967)]
51
del mosto, está cargada positivamente y puede, por tanto, interaccionar con las
partículas negativas insolubilizándolas; por otra parte, dado que es una molécu-
la rica en residuos de prolina puede también interaccionar con los polifenoles del
mosto dando lugar a la formación y sedimentación de flóculos que producen su
clarificación. En esta etapa de “fining” se puede añadir, también, bentonita. Se
trata de una arcilla que forma una dispersión coloidal con carga negativa, por lo
que interacciona con gran facilidad con las partículas proteicas cargadas positi-
vamente, formando flóculos que al sedimentar arrastran partículas en suspensión
y en dispersión coloidal, lo que incrementa la limpidez y mejora la estabilidad
del mosto.
Este tipo de clarificación está afectada por el potencial redox del mosto [que
indirectamente afecta al balance Fe (II)/Fe (III)], el pH, la temperatura y la con-
centración de cationes (sodio y calcio). La presencia de Fe (III) favorece la for-
mación de complejos electronegativos que pueden flocular con la proteína, la
concentración de cationes afecta a la estabilidad coloidal de las partículas elec-
tronegativas, un descenso de la temperatura mejora la estabilidad del complejo
proteína-polifenol y a medida que el pH aumenta, siempre y cuando se manten-
ga por debajo del punto isoeléctrico de la proteína, se favorece la floculación.
La defecación enzimática es una técnica de clarificación pre-fermentativa
muy utilizada en la elaboración de la sidra en Francia. Consiste en producir la
desmetilación de la pectina mediante una pectín metilesterasa (PME). El ácido
péctico formado se compleja con calcio, añadido como CaCl2, produciendo un
gel de pectato cálcico. Éste, atrapa las partículas en suspensión y es transporta-
do a la superficie del líquido, bien por medio del gas carbónico que comienza a
desprenderse como consecuencia del inicio del proceso fermentativo (proceso
estático) o mediante un proceso dinámico de flotación (ver figura 4), utilizando
nitrógeno para desplazar el gel a la superficie libre de líquido, donde es elimina-
do de manera continua.
Ambos procesos (estático y flotación) se basan en el mismo principio de geli-
ficación de la pectina desmetilada, pero difieren notablemente en la cinética de
formación del gel. La temperatura de la defecación enzimática debe estar bien
regulada, ya que si es muy baja la actividad de la PME disminuye notablemente
(a 7º C la PME desmetila suavemente la pectina) y si es elevada la actividad
microbiana hidroliza la pectina, impidiendo que se forme el gel de pectato cálci-
co. La temperatura de trabajo se sitúa en torno a 10-11º C. También, la concen-
tración de calcio está condicionada por la presencia de sustancias complejantes
en el mosto, es el caso de los ácidos orgánicos; éstos, al complejar los iones cal-
cio, limitan la concentración libre de este catión para enlazarse a la pectina y for-
mar el gel. Una concentración habitual de trabajo es 10 mM.
La realización de una clarificación pre-fermentativa provoca cambios en la
composición del mosto y la sidra y en el desarrollo posterior del proceso fer-
mentativo. La concentración y tamaño de los polifenoles y de los polisacáridos
está afectada por el tipo de clarificación que se lleve a cabo. Mangas-Alonso y
52
Figura 4.– Sistema de flotación para la clarificación pre-fermentativa. P: presurizador
col. (1996) han puesto de manifiesto que los mostos tratados con pectinasas y
posteriormente con bentonita presentan menor carga de proteínas y polifenoles
que los mostos control, en los que no se efectuó clarificación pre-fermentativa.
Las diferentes familias de polifenoles (flavanoles con distinto grado de poli-
merización, flavonoles, dihidrocalconas y ácidos hidroxicinámicos) están afecta-
das de modo distinto según sea la tecnología de clarificación pre-fermentativa
utilizada. A título de ejemplo, conviene destacar que la clarificación enzimática
combinada con el tratamiento con gelatina (“fining”) es el método de clarifica-
ción que disminuye en mayor proporción, tanto la concentración de flavanoles
como su grado de polimerización (Hubert y col., 2007). Sin embargo, aquellas
moléculas más susceptibles a la oxidación, como por ejemplo, los ácidos hidro-
xicinámicos y los monómeros de flavanoles [(+) catequina y (–) epicatequina]
experimentan mayores pérdidas cuando no se realiza una clarificación prefer-
mentativa o cuando se utiliza la clarificación por decantación estática, lo cual
puede estar motivado por el mayor contacto que estas moléculas presentan con
partículas en suspensión que contienen polifenoloxidasas.
En relación con la composición en polisacáridos, conviene resaltar que el
ácido galacturónico es el azúcar mayoritario de la fracción polisacarídica del
mosto de manzana sin clarificar, estando la pectina muy metilada. En estudios
realizados en mostos procedentes de variedades francesas (Hubert, 2008), cabe
resaltar la presencia en la fracción polisacarídica, entre otros azúcares, de los áci-
dos glucurónico y 4-O-metil glucurónico, que podrían formar parte de hemice-
lulosas solubilizadas. En los mostos despectinizados con complejos pectolíticos
se observa una drástica reducción del ácido galacturónico, eliminándose tam-
bién, pero en menor medida, arabinosa y galactosa que pasan a ser los azúcares
53
mayoritarios de la fracción polisacarídica de los mostos despectinizados. La ga-

lactosa es el azúcar que mejor se conserva, lo que pone en evidencia que estos
complejos pectolíticos pueden tener actividad arabinosidásica (Hubert, 2008).
Sin embargo, el tipo de clarificación empleada afecta a la mayor o menor pre-
sencia de ácido galacturónico en la fracción polisacarídica del mosto. Así, por
ejemplo, cuando se efectúa un encolado con gelatina con posterioridad a la des-
pectinización, se produce una mayor reducción de ácido galacturónico, si se
compara con una clarificación pre-fermentativa que englobe una despectiniza-
ción y una decantación. De acuerdo con el mecanismo propuesto por Endo
(1965) y Yamasaki y col. (1967) la gelatina es una proteína cargada positiva-
mente al pH del mosto, pudiendo, por ello, interaccionar electrostáticamente con
homogalacturonanos electronegativos parcialmente desmetilados por la pectin
metilesterasa presente en el complejo pectolítico.
La flotación, también, elimina una gran proporción de ácido galacturónico a
través de la reducción de la concentración de homogalacturonano, quedando en
el mosto el ramnogalacturonano I. Al ser éste un polisacárido péctico muy rami-
ficado con oligómeros neutros, permite explicar los elevados niveles de galacto-
sa y arabinosa que presentan los polisacáridos presentes en los mostos que han
sido sometidos a una flotación.
Por otra parte, con independencia de que los mostos sean o no clarificados
con anterioridad a la fermentación, esta etapa reduce el contenido de ácido galac-
turónico y su grado de metilación, lo que pone en evidencia una hidrólisis de las
pectinas por parte de los microorganismos dando lugar a oligómeros pécticos
cargados. Por otro lado, se detecta que la fracción de la sidra insoluble al alco-
hol se enriquece especialmente en galactosa y manosa. El incremento del por-
centaje de manosa responde, de acuerdo con los trabajos hechos por Hubert
(2008), a la existencia de manoproteínas procedentes de la actividad de las leva-
duras. Otros polímeros detectados en la sidra son glucuronoarabinoxilanos, con
mayor o menor proporción de arabinosa, ramnogalacturonano I y arabinogalac-
tanos proteicos tipo II.
El perfil aromático de la sidra, también, está condicionado por la tecnología
de clarificación pre-fermentativa. Así, por ejemplo, la decantación estática incre-
menta la concentración de acetato de etilo si se efectúa a una temperatura relati-
vamente baja (<12 ºC), probablemente al disolverse mayor concentración de oxí-
geno y favorecer, con ello, el desarrollo de levaduras no-Saccharomyces
(Cabranes y col., 1998). Así mismo, la utilización de la defecación enzimática
reduce el contenido de los alcoholes superiores (amílicos, isobutanol y 2-fenile-
tanol), el caprilato de etilo y el 3-metiltio-1-propanol e incrementa el de acetato
de etilo (Mangas y col., 1993; González, 2004). En este sentido, conviene resal-
tar la relación existente entre el nivel de turbidez (mayor en los mostos no clari-
ficados) y la síntesis de compuestos azufrados (mayor a más turbidez).
El contenido de nitrógeno, que es un nutriente fundamental en el desarrollo
de los microorganismos, está también afectado por el proceso de clarificación
54
pre-fermentativo utilizado, detectándose la mayor reducción cuando se utiliza la

microfiltración tangencial, si se compara con la clarificación enzimática, la flo-
tación o la decantación estática (Hubert y col., 2007). Conviene señalar que el
contenido inicial de nitrógeno del mosto afecta a la síntesis de compuestos azu-
frados y ésteres.
Por lo que respecta a la influencia de la clarificación pre-fermentativa sobre
el desarrollo de la fermentación, hay que resaltar que en los mostos clarificados
con una mezcla de pectinasas se ralentiza el proceso fermentativo, limitándose la
acumulación de los alcoholes superiores y de los ácidos acético y D (-) láctico y
la degradación de la glicerina (Mangas-Alonso y col., 1996). Esta ralentización
del proceso fermentativo, también, es observada cuando se utiliza la defecación
enzimática como método de clarificación pre-fermentativa. Así, por ejemplo,
Dueñas y col. (2002) han detectado una cinética más suave de la fermentación
alcohólica y un retraso de la fermentación maloláctica en las sidras procedentes
de mostos sometidos a defecación enzimática. La ralentización del proceso fer-
mentativo está fundamentalmente promovida por la menor concentración de
células viables de levaduras fermentativas (≤ EXP7) que se produce cuando se
efectúa la defecación enzimática (Nogueira y col., 2008). El gel de pectato cál-
cico formado en el proceso de clarificación atrapa, entre otras, partículas nitro-
genadas y levaduras que se han comenzado a desarrollar y que han consumido
una parte de los nutrientes. Por ello, el mosto clarificado tiene una menor con-
centración de nitrógeno y, por tanto, el desarrollo de las levaduras fermentativas
es menor, ralentizándose, en consecuencia, el proceso fermentativo y producien-
do sidras más aromáticas. Por otro lado, cuando se combina un sulfitado con la
defecación enzimática se obtienen sidras con menor nivel de acidez volátil.
55
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58
3. Bioquímica de los procesos de
transformación del mosto
de manzana en sidra
Introducción
Los procesos de síntesis de los componentes celulares en los seres vivos,
como por ejemplo las proteínas, los lípidos y los polisacáridos, requieren de
aporte energético; en el caso de las levaduras y bacterias, presentes durante el
proceso de elaboración de la sidra, esta energía se obtiene a partir de la degrada-
ción de los nutrientes orgánicos existentes en el mosto de manzana y la sidra.
Así, la energía producida en los procesos catabólicos (consumo de nutrientes) es
transferida a los anabólicos (procesos de síntesis). En la mayoría de los casos, la
molécula que transporta la energía es el adenosín trifosfato (ATP; la hidrólisis del
fosfato del ATP produce 7,3 Kcal/mol).
Los azúcares son los principales sustratos utilizados por los microorganismos
presentes en el mosto de manzana para su desarrollo. La ruta fundamental a par-
tir de la cual se inicia la degradación de los azúcares es la glicolisis. Este proce-
so es previo a la respiración y a la fermentación alcohólica y homoláctica, que
son rutas bioquímicas productoras de energía a través de la síntesis de ATP. Otros
procesos de degradación (oxidación) de los azúcares son la ruta de las pentosas
fosfato y la de Entner-Doudoroff. La primera tiene como funciones básicas gene-
rar el poder reductor en forma de NADPH para el desarrollo de los procesos ana-
bólicos, convertir las hexosas en pentosas (por ejemplo, formación de la ribosa)
para la síntesis de ácidos nucleicos y otras moléculas (coenzima A, FAD, NAD,
ATP...) y catabolizar las pentosas; en el caso de determinadas bacterias lácticas
(heterofermentadoras), la vía de las pentosas fosfato es el proceso fundamental
de catabolismo de los azúcares. La ruta de Entner-Doudoroff es una oxidación de
los azúcares que produce etanol; es utilizada por determinados grupos de bacte-
rias como, por ejemplo, las del género Zymomonas.
59
LEVADURAS
La pared celular: composición y funciones

La pared de la célula representa entre un 20 y un 30% de su peso seco y su
función principal es protegerla de la diferencia de presión osmótica que existe
entre el medio externo y el intracelular. Está formada mayoritariamente por poli-
sacáridos y glicoproteínas (Feuillat, 2003), siendo su composición más relevan-
te, desde un punto de vista cuantitativo, la siguiente: β-glucanos (aprox. 60%) y
manoproteínas (entre un 25 y 50%). Dentro de los β-glucanos cabe distinguir un
β-1,3 glucano, fibroso, poco ramificado y que proporciona rigidez a la pared, un
β-1,3 glucano poco ramificado y amorfo, que confiere cierta elasticidad a la
pared y sirve de anclaje para las manoproteínas y un β-1,6 glucano que es el
receptor de las toxinas proteicas (K1 y K2) excretadas por cepas K+ (productoras
del factor ‘killer’). Por otra parte, las manoproteínas juegan un papel importante
en la interacción intercelular que gobierna la floculación de las levaduras. De
hecho, ha sido bien establecido que uno de los mecanismos de floculación de las
levaduras se produce a través de interacciones de carácter específico, en las que
intervienen proteínas del grupo de las lectinas (glicoproteínas que se enlazan de
manera selectiva con carbohidratos; De Souza y col., 2003), el calcio (mantiene
activa la conformación activa de la lectina; Domingues y col., 2000) y los mana-
nos presentes en las manoproteínas de la pared celular. No obstante, este fenó-
meno de floculación puede deberse a interacciones no específicas (doble capa
eléctrica, fuerzas de van der Waals, interacciones estéricas e hidrofóbicas, puen-
tes salinos, etc.) (Dengis y col., 1995). Un ejemplo de ello son los puentes de cal-
cio que se producen entre dos células de levadura a través de los grupos fosfato
de los mananos o entre grupos carboxilo de las proteínas.
La membrana celular: composición y mecanismos de transporte

La membrana plasmática es una barrera celular relativamente impermeable a
las moléculas hidrofílicas, que dispone de proteínas especializadas para el trans-
porte selectivo de moléculas y está formada por una bicapa de lípidos polares y
proteínas (aprox. de 7,5 nm de ancho). Las principales clases de lípidos que con-
tiene la membrana de Saccharomyces cerevisiae son fosfolípidos (por ejemplo,
fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilmioinositol), esfingolípidos y
esteroles (por ejemplo, ergosterol) (Rest y col., 1995). Los lípidos estructurales
contienen ácidos grasos, entre los que destacan el oleico, esteárico, palmítico y
palmitoleico (Rest y col., 1995; Blagović y col., 2001). La composición de estos
ácidos varía en función de las condiciones del medio en el que se desarrolla la
levadura, afectando a la fluidez y permeabilidad de la membrana.
La permeabilidad depende del nivel de empaquetamiento de las cadenas de
los ácidos grasos, de tal modo que a medida que éstas son más largas y tienen
menor grado de insaturación, la fluidez disminuye al existir una estructura más
60
3. Bioquímica de los procesos de transformación del mosto de manzana en sidra
ordenada. Por el contrario, los ácidos grasos insaturados mejoran la permeabili-

dad, facilitando, con ello, la salida de etanol de la célula y haciendo que la leva-
dura sea más tolerante a éste; y, en este sentido, conviene resaltar que la síntesis
de los ácidos grasos insaturados requiere la presencia de oxígeno, lo que pone de
manifiesto la necesidad que tiene la levadura de disponer de unas condiciones
iniciales de aireación mínimas para un desarrollo normal de la fermentación
alcohólica.
Por otro lado, la relación ergosterol/fosfolípidos tiene una correspondencia
con la resistencia o susceptibilidad de la levadura a la temperatura (si la tempe-
ratura baja se reduce la permeabilidad; Kajiwara y col., 1996), de tal manera que
a medida que esta ratio es menor se incrementa la fluidez de la membrana
(Murakami y col., 1996; Valero y col., 1998) y la levadura es más resistente al
descenso de la temperatura.
Del conjunto de proteínas presentes en la membrana de S. cerevisiae (proba-
blemente más de 1.000) (Rest y col., 1995) las más importantes son las de trans-
porte, que suponen aproximadamente el 50%; de hecho, cada aminoácido tiene
una proteína de transporte y los azúcares son transportados por, al menos, 15 pro-
teínas distintas. Se distinguen varios tipos de transporte en S. cerevisiae, a saber,
transporte activo primario, difusión pasiva y facilitada y transporte activo secun-
dario.
En el transporte activo primario la energía química (en forma de ATP) se
transforma en energía electroquímica a través de la generación de un gradiente
de concentración de una molécula (iónica o neutra). Dos ejemplos son ilustrati-
vos de este tipo de transporte: a) el bombeo de protones desde el interior al exte-
rior celular, que genera un gradiente electroquímico de protones a expensas de la
hidrólisis del ATP, proceso catalizado por una H+-ATPasa del tipo P; y b) la trans-
ferencia de moléculas en contra de un gradiente electroquímico, por medio de
transportadores ABC (“ATP-Binding Cassette”), utilizando la energía de hidróli-
sis del ATP.
La difusión pasiva está gobernada por las propiedades físicas de la membra-
na y, en particular, por la composición de ácidos grasos. Las moléculas más
hidrofóbicas difunden mejor que las que tienen un cierto carácter hidrofílico
(como, por ejemplo, los polialcoholes), ya que la velocidad de difusión está
directamente afectada por el coeficiente de reparto (cociente entre la concentra-
ción del soluto en la bicapa y en el agua); otras moléculas pequeñas sin carga,
como el etanol, el oxígeno o el dióxido de carbono se transportan sin dificultad
por difusión pasiva.
La difusión facilitada se realiza por medio de las proteínas de canal y las
“Unipuerto”. Los iones no pueden atravesar por simple difusión la membrana y
para poder hacerlo se necesita la presencia de las proteínas de canal, que confor-
man un “tunel” en la bicapa que facilita el paso de los electrolitos mediante un
gradiente electroquímico. En el caso de S. cerevisiae se ha descrito un canal iónico
61
de K+ y otros canales inespecíficos. La difusión facilitada mediante proteínas

“Unipuerto”, también, se produce a favor de un gradiente de concentración y es
el proceso de transporte que S. cerevisiae utiliza para asimilar los monosacáridos
como la glucosa y la galactosa.
En el transporte secundario activo intervienen dos moléculas (incluidos
iones), una de ellas se mueve a favor de gradiente, liberándose una energía que
se emplea en la transferencia de la otra. Normalmente, la energía acumulada en
el proceso de transferencia a favor de gradiente es obtenida a partir de un trans-
porte primario activo que adquiere su energía del ATP. Si el transporte de ambas
moléculas es en el mismo sentido, entonces la transferencia la realizan proteínas
“Symport” y si es en sentido contrario, proteínas “Antiport”. Así, por ejemplo, el
transporte de disacáridos se lleva a cabo por proteínas “Symport” y algunos de
ellos, como la sacarosa, no son transportados intactos, sino que las hidrolasas
extracelulares los hidrolizan previamente.
En la figura 1 se recogen diversos ejemplos de transporte a través de la mem-
brana de la levadura: 1- transporte activo de un aminoácido y un disacárido
mediante una proteína “Symport” (S), acoplado bien a una ATPasa o a un ca-
nal iónico (C) para corregir la despolarización de la membrana mediante una
salida equivalente de K+; 2-transporte de NH4+ mediante una proteína
“Unipuerto” (U) en equilibrio de carga con una bomba de protones; 3-difusión
pasiva del etanol.
Figura 1.–Sistemas de transporte de S. cerevisiae (Rest y col., 1995). S: proteína “symport”; U: proteína
“unipuerto”; C: proteína de canal; 3: difusión pasiva
62
Glicolisis
Este proceso bioquímico transforma la glucosa en ácido pirúvico. De acuer-
do con el esquema que se recoge en la figura 2, se pueden distinguir cuatro fases:
a) fosforilación de la glucosa e isomerización para formar 1,6 fructosa-
bifosfato. Este proceso requiere el consumo de dos moléculas de ATP.
b) formación de las triosas fosfato (gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiace-
tona fosfato) por ruptura de la 1,6 fructosa-bifosfato.
c) oxidación y fosforilación del gliceraldehído-3-fosfato.
d) fosforilaciones (dos) a nivel de sustrato (1,3-bifosfoglicerato y fosfoenol-
piruvato) y síntesis de cuatro moléculas de ATP; dos serán utilizadas para
fosforilar más azúcares y las otras dos son la ganancia neta de energía del
proceso.
La glicolisis es un proceso que no solamente produce energía en forma de
ATP, sino que proporciona fuentes de carbono para la síntesis de aminoácidos
(alanina, valina, leucina, serina y moléculas aromáticas) y para las reacciones de
disimilación. Desde el punto de vista del balance de óxido-reducción, conviene
resaltar que este proceso requiere disponer de suficiente cantidad de NAD+ para
proceder a la oxidación y fosforilación del gliceraldehído-3-fosfato. La forma-
ción de NAD+ se consigue por tres vías reductoras: a) la conversión del acetal-
dehído en etanol (fermentación alcohólica realizada por las levaduras); b) la
transformación de la dihidroxiacetona fosfato en glicerina (fermentación glícero-
pirúvica realizada por levaduras); y c) la conversión del ácido pirúvico en ácido
láctico (ruta de Embden-Meyerhof llevada a cabo tanto por levaduras como por
bacterias lácticas).
Fermentación alcohólica
La fermentación alcohólica posee dos etapas más que la glicolisis (figura 3).
Por un lado, el ácido pirúvico experimenta una descarboxilación transformándo-
se en acetaldehído y, por otro, éste se reduce a etanol, lo que permite regenerar el
NAD+ necesario para proseguir con la oxidación de más azúcares a través de la
glicolisis (figura 2). La descarboxilación del ácido pirúvico está mediada por un
cofactor enzimático que es el pirofosfato de tiamina y la reducción del acetalde-
hído a etanol está catalizada por la alcohol deshidrogenasa, que contiene Zn2+ en
su centro activo. El acetaldehído puede transformarse, en parte, en acetil-coenzi-
ma A para la síntesis de lípidos y aminoácidos. Desde el punto de vista energéti-
co la fermentación alcohólica produce dos ATP netos/mol de glucosa, lo que supo-
nen 14,6 Kcal; teniendo en cuenta que la conversión de glucosa en etanol libera
40 Kcal/mol de glucosa, ello implica que 25,4 Kcal se disipan en forma de calor.
Las levaduras del género Saccharomyces son capaces de producir etanol a
partir del ácido málico, el ácido orgánico mayoritario de la manzana. La conver-
63
mal
Figura 2.–Glicolisis Figura 3.–Fermentación alcohólica
sión del ácido málico es parcial y depende del pH, de tal modo que a medida que
éste es más bajo el proceso es más activo. Sin embargo, son las levaduras del
género Schizosaccharomyces las que tienen la mayor capacidad de realizar la fer-
mentación malo-alcohólica (málico → pirúvico → acetaldehído → etanol), ya
que, disponen de un sistema activo de transporte del ácido málico a través de la
membrana celular, al contrario de lo que ocurre con las levaduras Saccharomyces
en donde este ácido se incorpora al medio celular interno por simple difusión.
Fermentación glícero-pirúvica
Se trata de una reacción colateral de la glicolisis. En la figura 4 se recoge un
esquema de este proceso. Desde el punto de vista energético (producción de
ATP) el balance es cero, ya que únicamente se producen dos ATP, una vez oxi-
dado y fosforilado el gliceraldehído-3-fosfato, que serán utilizados para fosfori-
lar los azúcares que entran en la glicolisis.
La fermentación glícero-pirúvica se produce en las primeras fases de la fer-
mentación alcohólica al no existir, probablemente, una expresión relevante de la
piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa, por lo que la regeneración
del NAD+ no puede ser hecha a través de la reducción del acetaldehído a etanol;
este proceso de regeneración es sustituido por la conversión de la dihidroxiace-
64
tona fosfato en glicerol-3-fosfato (ver figura 4). El resultado es la transformación

de los azúcares en glicerina y ácido pirúvico el cual, a su vez, da lugar a los pro-
ductos secundarios de la fermentación alcohólica (butilenglicol, ácido succíni-
co,......). De acuerdo con los trabajos realizados en sidra por Mangas (1992),
aproximadamente el 8% de los azúcares iniciales del mosto son transformados
en glicerina a través de la fermentación glícero-pirúvica. Este proceso de forma-
ción de glicerina estaría justificado, también, por la necesidad que tiene la leva-
dura de equilibrar la presión osmótica interna frente a la externa. La glicerina
protege a la célula de la levadura del estrés osmótico.
Respiración
El ácido pirúvico producido en la glicolisis tiene dos destinos importantes, ser
el sustrato para la fermentación alcohólica o ser oxidado a dióxido de carbono
por medio del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o de Krebs (respiración, figura 5).
El que se produzca un proceso fermentativo u oxidativo es función de las pro-
piedades cinéticas de la piruvato descarboxilasa (convierte el piruvato en acetal-
dehído) y la piruvato deshidrogenasa (transforma el piruvato en acetil-coenzima
A que se incorpora al ciclo de Krebs). Aunque la piruvato deshidrogenasa tiene
una alta afinidad por el ácido pirúvico, a nivel celular presenta una baja acti-
vidad. De hecho, cuando la concentración de ácido pirúvico es elevada, como
Figura 4.–Fermentación glícero-pirúvica
65
Figura 5.–Ciclo de Krebs. 1: piruvato deshidrogenasa; 2: citrato sintetasa; 3: aconitasa; 4, 5: isocitrato

deshidrogenasa; 6: α-cetoglutarato deshidrogenasa; 7: succinil CoA sintetasa; 8: succinato deshidrogenasa;
9: fumarasa; 10: malato deshidrogenasa
ocurre cuando el flujo glicolítico es alto, este ácido es fermentado y cuando su

concentración es baja se incorpora en el proceso respiratorio. Además, la gluco-
sa induce la expresión de la piruvato descarboxilasa e inhibe la piruvato deshi-
drogenasa y la acetil-coenzima A sintetasa (Dickinson y Kruckeberg, 2006) y
hay que tener en cuenta que en los mostos la concentración de glucosa es eleva-
da, por lo que el proceso favorecido es la fermentación alcohólica.
En la respiración se distinguen tres fases: a) la glicolisis, que produce ATP y
poder reductor; b) la descarboxilación oxidativa del ácido pirúvico y el ciclo de
Krebs, donde se produce el dióxido de carbono procedente del material orgáni-
co catabolizado, el poder reductor en forma de NADH y FADH2 y ATP; y c) el
transporte de electrones y la fosforilación oxidativa (síntesis de ATP).
En el ciclo de Krebs (ver figura 5) se lleva a cabo una fosforilación a nivel de
sustrato (succinil-CoA), produciéndose dos ATP adicionales a los ya obtenidos
en la glicolisis. Lo más relevante de este ciclo es la importante producción de
poder reductor (8 NADH/H+ y 2 FADH2), obtenido a partir de la oxidación del
66
ácido pirúvico, que hay que sumar al ya producido en la glicolisis (2 NADH/H+).

Finalmente, el transporte de electrones desde el NADH/H+ y FADH2 hasta el oxí-
geno produce 3 ATP/NADH, H+ y 2 ATP/FADH2. En resumen, la oxidación de
la glucosa origina 10 NADH, H+ y dos FADH2, lo que equivale a 34 ATP, que
sumados a los cuatro sintetizados en la glicolisis y el ciclo de Krebs, suma un
total de 38 ATP producidos por mol de glucosa oxidado.
El proceso respiratorio es utilizado básicamente a nivel industrial para la pro-
ducción de biomasa (levadura seca), ya que la elevada composición azucarada
del mosto de manzana impide la respiración (saturación de la capacidad respira-
toria o efecto Crabtree); por tanto, las levaduras utilizan, en las condiciones físi-
co-químicas del mosto, la fermentación alcohólica como vía para obtener ener-
gía. Por otro lado, conviene resaltar que la mejora en el desarrollo de las leva-
duras que ocasiona una aireación del mosto no se justifica por la respiración, sino
por la síntesis de los esteroles y ácidos grasos insaturados que favorece la per-
meabilidad de la membrana celular y, en consecuencia, la entrada de nutrientes
azucarados.
Por otra parte, determinados componentes del ciclo de Krebs, como el oxala-
cetato y α-cetoglutarato, pueden ser desviados para la síntesis de aminoácidos,
lo que pone de relieve que en este ciclo se integra el catabolismo de determina-
das fuentes de carbono con el anabolismo de los compuestos nitrogenados. La
salida de algunos componentes del ciclo puede comprometer su funcionamiento,
por lo que los microorganismos utilizan procesos anapleróticos como el ciclo del
glioxilato. Este ciclo, que se produce en los peroxisomas y citoplasma, es esen-
cial para el crecimiento de las levaduras cuando éstas disponen de fuentes de dos
átomos de carbono, como el etanol y el acetato. A partir de dos moléculas de ace-
til Coenzima A se sintetiza una molécula de succinato que, una vez incorporado
al ciclo de Krebs, se transforma en malato. Éste es transportado al citoplasma
donde se convierte en oxalacetato, que puede ser utilizado en la gluconeogéne-
sis para la síntesis de los carbohidratos estructurales (Barnett y Entian, 2005).
Productos secundarios de la fermentación alcohólica

Los productos secundarios de la fermentación alcohólica derivan del ácido
pirúvico. En el transcurso de la fermentación glícero-pirúvica se acumula este
ácido (ver figura 4), el cual se puede incorporar al ciclo de Krebs a través de su
conversión en oxalacetato, proceso que está catalizado por la piruvato carboxila-
sa/biotina; esta reacción no tiene lugar en la mitocondria (donde el ciclo de Krebs
interviene en la respiración) sino en el citoplasma.
Piruvato + ATP + CO2 → ADP + P + Oxalacetato
La vía oxidativa del ciclo de Krebs permite transformar el oxalacetato en
α-cetoglutarato con la formación de poder reductor en forma de NADH/H+ (ver
figura 5). Este poder reductor es utilizado para sintetizar más glicerina, lo que
67
permite formar el NAD+ necesario para oxidar los azúcares por medio de la gli-
colisis. La posterior transformación del α-cetoglutarato, de acuerdo con el
complejo enzimático del ciclo de Krebs, finaliza en el ácido succínico, ya que la
oxidación de este ácido para formar ácido fumárico requiere la presencia del
coenzima FAD, que únicamente está presente en la mitocondria (recordemos que
el ciclo de Krebs en anaerobiosis se desarrolla a nivel del citoplasma). Esto per-
mite explicar la presencia del ácido succínico como uno de los principales pro-
ductos secundarios de la fermentación alcohólica.
No obstante, algunos autores opinan que la actividad enzimática de la α-ceto-
glutarato deshidrogenasa y la succinil-CoA sintetasa, enzimas que permiten la
síntesis de ácido succínico a partir del α-cetoglutarato, es muy reducida en con-
diciones de anaerobiosis (como es el caso de la fermentación alcohólica), por lo
que arguyen que la síntesis del ácido succínico se produciría a través de la vía
reductora del ciclo de Krebs: oxalacetato → malato → fumarato → succinato.
El ácido α-cetoglutárico es otro producto secundario de la fermentación alco-
hólica que forma parte de los denominados cuerpos cetónicos y que interviene en
los procesos de transaminación que ocurren en el catabolismo de los aminoácidos.
Otro grupo importante de productos secundarios es el formado por la acetoína,
el diacetilo y el 2,3 butanodiol. La síntesis de estos compuestos se inicia con la
acción de la piruvato descarboxilasa/pirofosfato de tiamina sobre el ácido pirú-
vico. La descarboxilación de éste da origen a un producto intermedio muy reac-
tivo denominado pirofosfato de hidroxietiltiamina (también llamado acetalde-
hído activo), que al condensar con otra molécula de ácido pirúvico origina el
ácido α-acetoláctico.
En la figura 6 se recogen los procesos que permiten explicar la síntesis de la
acetoína, el diacetilo y el 2,3 butanodiol a partir de este ácido. La acetoína se
puede formar directamente a partir de la descarboxilación no oxidativa del ácido
α-acetoláctico, o bien mediante la reducción del diacetilo; éste, se sintetiza por
descarboxilación oxidativa del ácido α-acetoláctico y el 2,3 butanodiol se obtie-
ne por reducción de la acetoína en un proceso reversible. De una manera gene-
ral se puede considerar que la producción de acetoína por Saccharomyces no es
Figura 6.–Reacciones de formación de acetoína, diacetilo, 2,3 butanodiol y valina a partir del α-acetolactato.
TPP: pirofosfato de tiamina
68
elevada, al contrario de lo que ocurre con otros géneros de levaduras, como las
apiculadas.
La formación de diacetilo, de aroma a mantequilla, tiene lugar en las pri-
meras fases de la fermentación alcohólica; posteriormente, este compuesto es
reducido a acetoína y 2,3 butanodiol. La producción de estos aromas está estre-
chamente relacionada con la síntesis de aminoácidos, de hecho ha sido bien esta-
blecido que la deficiencia en valina ocasiona un incremento de la concentración
de diacetilo. El ácido α-acetoláctico es el punto de partida para la síntesis de vali-
na (ver figura 6), cuando ésta se sintetiza a partir de los azúcares. Algunos auto-
res (Nkiko y col., 2006) plantean la hipótesis de que la formación del diacetilo
sea extracelular, a través de un proceso químico de descarboxilación oxidativa
del ácido α-acetoláctico, que está favorecido por un pH bajo, el oxígeno y una
temperatura elevada. El diacetilo formado fuera de la célula sería posteriormen-
te absorbido por la levadura y reducido a acetoína y 2,3 butanodiol. Este hecho,
pone de manifiesto una posible estrategia para reducir la concentración de dia-
cetilo, que se conseguiría manteniendo el tiempo necesario las células de le-
vadura en contacto con el medio líquido para que este aroma fuese absorbido y
posteriormente reducido por la levadura.
Los ácidos láctico y acético son, también, productos secundarios de la fer-
mentación alcohólica. El ácido láctico posee dos enantiómeros, el D (-) láctico y
el L (+) láctico. Las levaduras los sintetizan a partir del ácido pirúvico mediante
la D (-) y L (+) lactato deshidrogenasa, respectivamente. Como se ha comenta-
do, este proceso permite regenerar NAD+ para que prosiga la glicolisis de los
azúcares. Sin embargo, no todo el láctico que se encuentra en la sidra proviene
del metabolismo de las levaduras. De hecho, la presencia de varios g/L de L (+)
láctico es una señal inequívoca de que este ácido se produce a través de la fer-
mentación maloláctica, realizada por las bacterias lácticas. Por otra parte, si la
concentración de D (-) láctico está por encima de 0,3 g/L, se puede sospechar que
ha sido producido por bacterias lácticas mediante el “picado láctico”.
El ácido acético es el principal ácido volátil detectado en la sidra. Se produ-
ce, fundamentalmente, a partir del metabolismo de las bacterias acéticas y lácti-
cas y levaduras no-Saccharomyces, si bien las levaduras del género Saccharo-
myces forman pequeñas cantidades en comparación con los otros grupos de
microorganismos. La acción de la acetil-CoA hidrolasa sobre el acetil-CoA
puede ser una vía de síntesis de ácido acético. Por otra parte, hay que tener en
cuenta que el acetil-CoA se forma por descarboxilación oxidativa del ácido pirú-
vico mediante la piruvato deshidrogenasa (ver figura 7), aunque esta enzima
tiene una actividad muy limitada en anaerobiosis.
Por ello, la hipótesis que actualmente se contempla para la producción de
ácido acético por levaduras es que ésta esté vinculada, en parte, a la síntesis de
los lípidos estructurales; así, este ácido se sintetizaría a partir del acetaldehído
mediante la aldehído deshidrogenasa (enzima activa durante la fermentación
alcohólica) y el acetato formado sería transformado en acetil-CoA (ver figura 7)
69
Figura 7.–Producción de ácido acético por levaduras. 1: piruvato descarboxilasa; 2: aldehído deshidrogenasa;
3: acetil Coenzima A sintetasa; 4: piruvato deshidrogenasa; 5: acetil Coenzima A hidrolasa.
a través de la acetil-CoA sintetasa, empleándose el acetil-CoA en la síntesis de

fosfolípidos y esteroles. Además, en el proceso de oxidación del acetaldehído se
produce poder reductor en forma de NADPH (ver figura 7) que es necesario en
la síntesis de lípidos.
La concentración de ácido acético, de igual modo que la glicerina, está rela-
cionada positivamente con la concentración inicial del mosto en azúcares. Por
otra parte, ha sido descrito que la producción de acidez volátil por
Saccharomyces es inversamente proporcional a la concentración de nitrógeno
asimilable, de tal forma que cuando existe una cantidad suficiente de este
nutriente se estimula la producción de poder reductor, por lo que se limitaría la
síntesis de ácido acético que tiene el mismo fin (Bely y col., 2003).
Metabolismo del nitrógeno

Las levaduras utilizan preferentemente el nitrógeno amoniacal (NH4+) exis-
tente en el mosto para la síntesis de aminoácidos y proteínas, algunas de ellas de
gran importancia en el transporte de sustratos hacia el interior celular. El amonio
se incorpora en la célula mediante un transporte activo que requiere la presencia
de glucosa.
El nitrógeno estimula la multiplicación celular y está muy implicado en la
síntesis de aromas (ésteres y alcoholes superiores). La producción de biomasa y,
por tanto, la velocidad fermentativa están influenciadas por la concentración de
nitrógeno asimilable (amonio, aminoácidos y, en menor medida, péptidos); de
hecho, las fermentaciones lentas están motivadas, por lo general, por una baja
concentración de levaduras fermentativas, si bien la temperatura de fermentación
juega, también, un papel importante. En el caso de la sidra, a diferencia de otras
bebidas alcohólicas (cerveza y vino), se detecta un menor número de levaduras
fermentativas, lo cual estaría motivado por el empobrecimiento de los mostos en
nitrógeno, además de otros factores como, por ejemplo, la presencia de levadu-
ras no-Saccharomyces que compiten por los nutrientes (Nogueira y col., 2008).
En la figura 8 se recoge la vía de fijación de amonio a partir del α-cetogluta-
rato que, como se ha comentado, es un producto secundario de la fermentación
alcohólica. La aminación del ácido α-cetoglutárico produce ácido glutámico, el
70
Figura 8.–Fijación del nitrógeno amoniacal y formación del ácido glutámico y la glutamina
Figura 9.–Desaminación de los aminoácidos por acoplamiento de una transaminación (T) y la desaminación
oxidativa (DO) del ácido glutámico (Ribéreau-Gayon y col., 2006a)
cual puede fijar más amonio y formar glutamina (ver figura 8). En caso de exis-
tir un déficit de amonio en el medio de fermentación, las levaduras lo pueden
obtener a partir de aminoácidos mediante el acoplamiento de un proceso de
transaminación y la desaminación oxidativa del ácido glutámico (figura 9).
La levadura es capaz de sintetizar aminoácidos a partir de los azúcares (ver
figura 10). Esta síntesis está controlada por la acción de transaminasas, que actú-
an sobre los ácidos cetónicos provenientes del metabolismo de los azúcares; el
amonio del glutamato se transfiere a un cetoácido y se forma el aminoácido
correspondiente mediante una transaminasa que convierte el glutamato en α-
cetoglutarato y, por el contrario, un aminoácido puede transferir el grupo amino
al ácido α-cetoglutárico formando glutamato y el cetoácido correspondiente (ver
Figura 10.–Proceso de transaminación (T) utilizado en la síntesis de aminoácidos y cetoácidos (Äyräpää, 1973)
71
figura 10). Los siguientes ejemplos de ácidos cetónicos ilustran la síntesis de

algunos aminoácidos:
1.– El oxalacetato procedente del ciclo de Krebs se convierte en ácido as-
pártico.
2.– El piruvato se transforma en alanina.
3.– El 3-fosfo-glicerato procedente de la glicolisis, previamente transformado
en 3-fosfo-hidroxipirúvico, se convierte en serina.
4.– El α-cetoisovalérico formado a partir del pirúvico, vía α-acetolactato, se
transforma en valina.
5.– El α-cetoisocaproico, que deriva del α-cetoisovalérico, vía isopropilmala-
to, se convierte en leucina.
Sin embargo, la ruta de síntesis de otros aminoácidos es algo más compleja.
Por ejemplo, la isoleucina se sintetiza a partir del ácido aspártico y la treonina
(ver figura 11). Ésta, se desamina y se transforma en 2-cetobutírico, que con-
densa con el piruvato para formar el 2-ceto-3-metil valérico. Este cetoácido
experimenta una transaminación y se convierte en isoleucina. Los aminoácidos
aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) se sintetizan a partir de molé-
culas procedentes del metabolismo de los azúcares (eritrosa 4-fosfato y fosfoe-
nolpiruvato; derivados de la ruta de las pentosas fosfato y glicolisis, respectiva-
mente), vía siquimato/corismato.
Los cetoácidos son precursores de una fracción notable del aroma de las bebi-
das fermentadas como, por ejemplo, los alcoholes. Pueden ser sintetizados, como
se ha señalado, a partir de los azúcares o bien de los aminoácidos (figura 10) que
la levadura asimila. El transporte de aminoácidos desde el exterior al interior
celular es realizado por una permeasa general (que es inhibida y reprimida por la
presencia de amonio) o por permeasas específicas (que no son inhibidas por el
amonio).
La levadura acumula, al inicio de la fermentación, los aminoácidos en la
vacuola (mediante un transporte activo antipuerto acoplado a protones) para su
posterior utilización, ya que a medida que la fermentación avanza y se forma
etanol el transporte de aminoácidos desde el exterior al interior celular se inhibe.
Esta inhibición se justifica por que el etanol aumenta la permeabilidad de la
Figura 11.–Síntesis de isoleucina a partir de la desaminación de la treonina
72
membrana, lo que facilita la entrada de protones por simple difusión. Como

consecuencia de ello, el transporte activo de los aminoácidos desde el exterior
al interior celular, acoplado a la entrada de protones (figura 1), deja de funcionar.
La reacción de Ehrlich permite explicar la transformación de un cetoácido en
un aldehído que, a su vez, en función de las condiciones del medio se puede con-
vertir en un alcohol, a través de la acción de alcohol deshidrogenasas, o en un
ácido, por medio de aldehído deshidrogenasas (ver figura 12). El NADH produ-
cido en la glicolisis debe ser de nuevo oxidado (formación de NAD+) para que el
proceso de oxidación de los azúcares pueda proseguir. La reducción de los alde-
hídos a alcoholes es la vía más favorable, desde el punto de vista energético, para
oxidar el NADH si se compara con la fermentación glícero-pirúvica (proceso que
permite, también, oxidar el NADH), (Hazelwood y col., 2008). En la tabla 1 se
recoge un listado de alcoholes formados a partir de cetoácidos que, salvo el 1-
propanol, 1-butanol y 1-pentanol, están vinculados estructuralmente a un amino-
ácido a través del mecanismo de Ehrlich. El 1-propanol deriva de la descarboxi-
lación y reducción del ácido 2-cetobutírico producido por desaminación de la tre-
onina. La descarboxilación oxidativa de este cetoácido produce propionil-coen-
zima A, que puede ser empleado en la síntesis de ácidos grasos con un número
impar de átomos de carbono (Lehtonen y Suomalainen, 1977). El ácido 2-ceto-
butírico se puede carboxilar para formar el ácido 2-cetovalérico que, a través del
mecanismo de Ehrlich, se convierte en 1-butanol. Así mismo, el ácido 2-cetova-
lérico, también, se puede carboxilar para formar el ácido 2-cetocaproico que, por
medio del mismo mecanismo, se transforma en 1-pentanol. Estos alcoholes se
sintetizan de manera más intensa cuando la fermentación se desarrolla en condi-
ciones estrictas de anaerobiosis (Mauricio y col., 1997).
Al listado de la tabla 1 habría que añadir el ácido glutámico y uno de sus
productos de transformación, la γ-butirolactona, que ha sido detectada en sidra
asturiana (Mangas y col., 1996). El ácido glutámico se desamina formando el
α-cetoglutárico que, a través del mecanismo de Ehrlich, se convierte en el ácido
4-hidroxibutírico; la lactonización de éste produce la γ-butirolactona. La relación
entre el ácido glutámico, el 4-cetobutanoato de etilo (producto intermedio de la
transformación de Ehrlich) y la producción de γ-butirolactona ha sido puesta de
manifiesto en el caso de las levaduras de flor (Saccharomyces fermentati) en
vinos (Muller y col., 1973; Freeman y col., 1977; Fagan y col., 1981; Wurz y
col., 1988).
Figura 12.–Reacción de Ehrlich: caso particular del feniletanol
73
Tabla 1.–Cetoácidos, alcoholes y aminoácidos estructuralmente relacionados
Cetoácido Alcohol Aminoácido
2-cetocaproico 1-pentanol ———

2-cetovalérico 1-butanol ———
2-cetoisovalérico isobutanol valina
2-cetoisocaproico isoamílico leucina
2-ceto-3-metil valérico 2-metilbutanol isoleucina
2-cetobutírico 1-propanol ———
fenilpirúvico feniletanol fenilalanina
p-hidroxifenilpirúvico tirosol tirosina
2-ceto-γ-(metiltio) butírico metionol metionina
indolpirúvico triptofol triptófano
Por otra parte, otras lactonas como la γ-nonalactona, también, han sido des-
critas en la sidra (Xu y col., 2007). Esta molécula aporta notas afrutadas (aroma
a coco). Su síntesis se puede explicar a partir del ácido linoleico con la siguien-
te secuencia de reacciones: 1-formación del 13-hidroperoxidolinoleico por
acción del oxígeno y la lipoxigenasa sobre el ácido linoleico, 2-reducción del
hidroperóxido y formación del 13-hidroxilinoleico, 3- β-oxidación de éste y sín-
tesis del ácido 5-hidroxidecanoico y 4- α-oxidación de este hidroxiácido y for-
mación de la γ-nonalactona (Garbe y col., 2001).
La producción de alcoholes depende de varios factores, entre los que cabe
señalar: la cepa de levadura [Torrea y col. (2003) detectaron que cepas con
mayor demanda de nitrógeno producen una ligera menor cantidad de alcoholes
superiores], la temperatura de fermentación (a mayor temperatura se estimula la
síntesis de los alcoholes superiores; Cabranes y col., 1998), el pH (a menor pH
mayor contenido de alcoholes superiores), la concentración de sólidos (la pro-
ducción de alcoholes superiores se correlaciona positivamente con el nivel de
sólidos), el nivel de aireación (moderadas aireaciones mejoran la producción de
alcoholes; Buescher y col., 2001), los ácidos grasos insaturados (su presencia
favorece la síntesis de los alcoholes superiores) y la concentración de amino-
ácidos y amonio (una disminución del contenido de nitrógeno asimilable poten-
cia la producción de los alcoholes superiores; Beltrán, 2005).
Cuando existe un déficit de nitrógeno asimilable los cetoácidos sintetizados a
partir de los azúcares se acumulan, al no existir suficiente nitrógeno α-amino
para la reacción de transaminación. El mayor stock de cetoácidos se traduce en
una producción más elevada de alcoholes superiores mediante el mecanismno de
Ehrlich. Por el contrario, cuando tenemos suficiente nitrógeno asimilable se pro-
duce una mayor síntesis de aminoácidos y se reduce el stock de cetoácidos y, por
tanto, se sintetiza una menor cantidad de alcoholes superiores. No obstante, hay
74
que señalar que la relación entre el nitrógeno asimilable y la producción de alco-

holes superiores es compleja y depende, también, de la cepa de levadura y del
intervalo de nitrógeno que se considere.
Vilanova y col. (2007) han detectado una correlación positiva entre el con-
tenido de nitrógeno asimilable y la producción de alcoholes superiores con nive-
les bajos de nitrógeno y, por el contrario, para valores de nitrógeno superiores a
200 mg/L la correlación es negativa. La activación de genes implicados en la sín-
tesis de aminoácidos (precursores de los alcoholes superiores), cuando la con-
centración de nitrógeno es baja, permitiría explicar la relación positiva observada.
La mayoría de los alcoholes superiores (amílicos, isobutanol, 1-propanol,
2-feniletanol) presentan un nivel umbral de detección superior a la concentración
que habitualmente tienen estos compuestos en la sidra, sin embargo, alguno de
ellos, como el 2-feniletanol, tienen gran relevancia a nivel sensorial (aroma a
rosa) (Le Quéré y col., 2006). Por otra parte, se considera que los alcoholes supe-
riores tienen una contribución positiva al aroma hasta 300 mg/L (Vidrih y Hribar,
1999). Por último, conviene señalar que la exportación de los alcoholes superio-
res al medio extracelular se cree que es por difusión pasiva a través de la bicapa
lipídica (Hazelwood y col., 2008), no siendo conocida la existencia de un trans-
portador para estas moléculas en S. cerevisiae.
Síntesis de ésteres
En la sidra, como en las bebidas fermentadas, en general, se pueden detectar
dos grupos importantes de ésteres: a) los ésteres de acetato y b) los ésteres etíli-
cos de los ácidos grasos de cadena media. Estas moléculas son responsables del
carácter afrutado que se puede apreciar en las bebidas fermentadas, como la
sidra. Así, por ejemplo, en este producto se han detectado, entre otros, los éste-
res siguientes (Mangas y col., 1996): acetatos de etilo (aroma a disolvente), iso-
butilo, isoamilo (aroma a plátano), hexilo y 2-feniletilo (aroma a rosas) y el
caproato (aroma a manzana/semilla de anís), caprilato (aroma a manzana agria)
y caprato de etilo (olor floral). Los acetatos de hexilo, isoamilo y 2-feniletilo y
el caprilato de etilo aportan aromas afrutados y el acetato de 2-feniletilo, además,
contribuye al aroma global con notas florales (Le Quéré y col., 2006).
Ésteres de acetato. En la figura 13 se recoge el proceso de síntesis de los éste-
res de acetato. Las moléculas que intervienen son el acetil-coenzima A y un alco-
hol. En consecuencia, la producción de los ésteres de acetato está muy vincula-
da al metabolismo de los azúcares y de los aminoácidos.
S. cerevisiae no es la única levadura responsable de la producción de los éste-
res de acetato, ya que otras levaduras no-Saccharomyces, como Hanseniaspora/
Kloeckera, Pichia o Metschnikowia, son reconocidas productoras de acetatos
(Cabranes y col., 1990; Rojas y col., 2003; Morrissey y col., 2004; Suárez y col.,
2007).
75
Figura 13.–Síntesis de los acetatos de etilo e isoamilo (Swiegers y col., 2005)
Los ésteres de acetato son formados intracelularmente y, dado que son solu-
bles en los lípidos, son excretados por difusión pasiva a través de la membrana
plasmática. Las enzimas que catalizan el proceso de síntesis de los ésteres de
acetato son la alcohol acetil transferasa I y II (AAT) que están codificadas por los
genes ATF1 y ATF2, respectivamente (Verstrepen y col., 2003). Estas enzimas
catalizan la transferencia del grupo acetilo del acetil-coenzima A al correspon-
diente alcohol. La síntesis de los ésteres depende básicamente de la concentra-
ción de los sustratos (acetil-coenzima A y el alcohol), la actividad enzimática de
las transferasas implicadas en la síntesis y las carboxiesterasas que hidrolizan los
ésteres. Por tanto, la concentración final de éstos es el resultado del balance entre
la acción de ambos enzimas.
Algunos parámetros del proceso fermentativo como la temperatura, el nivel
de oxígeno, la concentración de ácidos grasos, el nitrógeno, etc., influyen en la
disponibilidad de acetil-coenzima A y, por tanto, en la síntesis de los ésteres. Sin
embargo, la predicción de la producción de éstos a partir de los parámetros de
proceso que afectan a la concentración de acetil-coenzima A es compleja y difí-
cil. Así, por ejemplo, un desarrollo elevado de las levaduras produce un consu-
mo de acetil-coenzima A, por lo que la concentración disponible de este sustra-
to para la síntesis de los ésteres de acetato se reduce, siendo esperable, en estas
76
circustancias, que se sinteticen menos ésteres. Sin embargo, se ha observado que

tanto el nitrógeno como la glucosa estimulan la síntesis de ésteres a la vez que
favorecen el desarrollo de la flora levaduriforme.
Por otro lado, la mayor presencia de alcoholes puede ocasionar una más ele-
vada producción de ésteres, aunque se ha detectado que algunos parámetros del
proceso fermentativo que estimulan la producción de alcoholes como, por ejem-
plo, la presencia de concentraciones elevadas de oxígeno y ácidos grasos insatu-
rados, disminuyen la concentración de ésteres.
La actividad de los sistemas enzimáticos es clave para explicar la síntesis de
los ésteres de acetato. Así, por ejemplo, la mayor disponibilidad de nitrógeno
promueve la expresión de los genes ATF1 y ATF2, que codifican las transfera-
sas, lo que está de acuerdo con las experiencias realizadas por Vilanova y col.
(2007) que observaron un incremento de la concentración de ésteres (salvo para
el caso del acetato de 2-feniletilo) con la mayor disponibilidad de nitrógeno. Por
otro lado, la transcripción de estos genes (ATF1 y ATF2) está reprimida por la
presencia del oxígeno y los ácidos grasos insaturados que, como se ha señalado,
disminuyen la concentración de los ésteres de acetato. En resumen, cabe consi-
derar que la formación de estos aromas es muy dependiente de la cepa de leva-
dura, la composición del medio de fermentación y las condiciones en las que se
desarrolla el proceso fermentativo.
Ésteres etílicos de ácidos grasos. S. cerevisiae sintetiza durante la fermenta-
ción anaeróbica ácidos grasos que varían en la longitud de la cadena hidrocar-
bonada. Estas moléculas están ligadas a la biosíntesis de algunos componentes
lipídicos de la membrana celular, como los fosfolípidos y los ácidos grasos de
cadena larga, tanto saturados como insaturados (palmítico, C16:0; palmitoleico,
C16:1; esteárico, C18:0; y oleico C18:1).
Los ácidos grasos de cadena media son los principales precursores de los éste-
res etílicos producidos por Saccharomyces. Estos ácidos son liberados prematu-
ramente del complejo enzimático citoplasmático, donde son sintetizados, como
consecuencia de la inhibición que ejercen los ácidos grasos de cadena más larga,
que se acumulan a lo largo de la fermentación al existir bajos niveles de oxíge-
no, sobre la acetil-coenzima A carboxilasa (enzima que cataliza la formación del
malonil-coenzima A a partir del acetil-coenzima A y el dióxido de carbono). Esta
inhibición provoca que la síntesis de lípidos se detenga y se liberen al medio los
ácidos grasos de cadena corta y media.
Las enzimas implicadas en la síntesis de los ésteres etílicos de los ácidos gra-
sos son dos acil-coenzima A: etanol O-aciltransferasas, Eeb1 y Eht1 (están codi-
ficadas por los genes EEB1 y EHT1, respectivamente; Saerens y col., 2006,
2008a), que catalizan la transferencia del grupo acilo del ácido graso activado
con el coenzima A, presente en la ruta de la síntesis lipídica, al etanol (proceso
denominado alcoholisis). Eeb1 es la principal enzima responsable de la síntesis
de los ésteres etílicos.
77
No obstante, hay que señalar que el nivel de expresión de estos genes (EEB1
y EHT1) no es el factor limitante de la síntesis de los ésteres de etilo, a diferen-
cia de lo que ocurre con los ésteres de acetato. En este sentido, hay que tener en
cuenta que Eeb1 y Eht1 tienen, también, actividad esterásica, lo que permitiría
explicar por qué una sobreexpresión de los genes que las codifican no incrementa
de manera notable la concentración de los ésteres etílicos (Saerens y col.,
2008b). También, la síntesis de los ésteres etílicos puede realizarse por una este-
rificación directa del ácido carboxílico y el etanol mediante sintetasas/carboxi-
lesterasas. La existencia de ésteres no etílicos de ácidos grasos se justificaría,
también, por un proceso de alcoholisis.
La exportación de los ésteres etílicos al medio externo es función de la lon-
gitud de la cadena hidrocarbonada. Así, por ejemplo, mientras la transferencia
del caproato de etilo es del 100%, la del caprilato de etilo se sitúa entre el 54 y
68% y la del caprato de etilo entre el 8 y el 17% (Saerens y col., 2008a).
La síntesis de ésteres etílicos está influenciada por la concentración de ácidos
grasos. Así, por ejemplo, cuanto mayor sea la concentración de ácidos grasos
insaturados menor será la producción de ésteres de etilo (Saerens y col., 2008a),
al contrario de lo que ocurre con los ácidos grasos de cadena media que estimu-
lan su producción.
La correlación negativa observada entre los ácidos grasos insaturados y la
formación de los ésteres de etilo, puede explicarse si tenemos en cuenta que
la formación de los ácidos grasos insaturados, potenciada por la presencia de
oxígeno, no inhibe a la enzima acetil-coenzima A carboxilasa, por lo que los
ácidos grasos de cadena media no se acumulan, limitándose, por ello, la síntesis
de los ésteres correspondientes (Saerens y col., 2008b). En consecuencia, se
puede afirmar que el metabolismo de los ácidos grasos es determinante en la
síntesis de los ésteres de etilo, ya que la concentración del sustrato, los ácidos
grasos de cadena media, es el factor limitante del proceso de síntesis (Saerens y
col., 2008b).
Las condiciones de la fermentación como la presión, la aireación y la tempe-
ratura afectan a la concentración, longitud de la cadena y nivel de saturación de
los ácidos grasos y concentración de los ésteres. Así, por ejemplo, el incremento
de la presión hidrostática mejora la producción de los ésteres etílicos al disol-
verse más el dióxido de carbono (ello produce una limitación en el desarrollo
de las levaduras y se acumulan más residuos de acil-coenzima A) y la aireación
disminuye la concentración de ésteres etílicos (caproato y caprilato de etilo)
(Nykänen, 1986) al favorecerse la síntesis de lípidos estructurales (Bardi y col.,
1998). Por otro lado, el grado de insaturación de los ácidos grasos aumenta cuan-
do se trabaja en condiciones aeróbicas o semi-aeróbicas (Abbas, 2006).
La temperatura juega un importante papel en la producción de los ésteres
y los ácidos grasos. De acuerdo con Beltrán (2005) y Cabranes y col. (1998),
a menores temperaturas se produce una mayor concentración de ésteres y de
78
ácidos grasos de cadena media (C6 y C8) (Abbas, 2006). Sin embargo, a medi-
da que la temperatura baja la fluidez de la membrana disminuye, así como la
excreción de aromas, lo que debería traducirse en una mayor producción de estas
moléculas al aumentar la temperatura, tal como ha sido observado por Verstrepen
y col. (2003) y Saerens y col. (2008a) en levadura de cerveza. No obstante, hay
que tener en cuenta que la dependencia con la temperatura puede seguir un mo-
delo diferente en función del éster considerado. El descenso de la permeabilidad
con este parámetro puede compensarse con una mayor síntesis de ácidos grasos
insaturados con menor longitud de cadena hidrocarbonada, lo que daría lugar a
una estructura de la membrana menos ordenada y con mayor fluidez. Todo ello,
pone de manifiesto que la cepa de levadura es un factor determinante en la pro-
ducción de aromas.
Expresión del carácter varietal: sistemas enzimáticos de levaduras

La manzana contiene precursores no volátiles de moléculas aromáticas. La no
volatilidad es debida a que estos precursores aromáticos están conjugados con
azúcares (glicoconjugados) a través de enlaces glicosídicos. La liberación de los
aromas (aglicona) a partir de las moléculas glicoconjugadas se produce por
hidrólisis ácida y enzimática. Se cree que el mecanismo enzimático es más
importante en la liberación de aromas, ya que la hidrólisis ácida es un proceso
más lento.
Los precursores glicosídicos descritos en manzana (Schwab y Schreier, 1988,
1990) tienen como aglicona alcoholes alifáticos (1-butanol, 2-metil-1-butanol,
1-hexanol, 3-hidroxi-1-octanol, 1-octanol, octano-1,3-diol, 5(Z)-octen-1,3-diol),
alcoholes aromáticos y fenoles (eugenol, 4-vinilguayacol, 2-feniletanol, alcohol
bencílico), C13-norisoprenoides (3-hidroxi-β-damascona, vomifoliol, 3-ceto-
α-ionol) y ácidos fenólicos y alifáticos (4-hidroxi-3-metoxifenilacético, 4-hi-
droxifenilacético, 2-metilbutanoico). La parte azucarada suele consistir en un
monosacárido (por ejemplo, β-D-glucopiranosa) o disacáridos compuestos por
glucosa y otros monosacáridos como α-L-arabinofuranosa, α-L-arabinopirano-
sa, α-L-ramnopiranosa, β-D-apiofuranosa y β-D-xilopiranosa (Pogorzelski y
Wilkowska, 2007). Entre los disacáridos cabe destacar la 6-O- α-L-arabinofura-
nosil- β-D-glucopiranosa (Schwab y Schreier, 1990).
Las levaduras disponen de sistemas enzimáticos capaces de hidrolizar los
azúcares de las moléculas glicoconjugadas. Así, por ejemplo, en el caso de
Sacch. cerevisiae se ha detectado actividad glicosidásica específica (α-arabino-
furanosidasa, α-ramnosidasa, β-xilosidasa, β-apiosidasa, etc.), así como una
importante actividad β-glucosidásica (Ugliano y col., 2006). También, las leva-
duras no-Saccharomyces contribuyen a la liberación de aromas a partir de los
precursores no volátiles, habiendo sido descrita actividad β-glucosidásica en los
géneros Candida, Pichia y Hanseniaspora, entre otros (Esteve-Zarzoso y col.,
1998).
79
Metabolismo del azufre

La figura 14 recoge los procesos de formación de compuestos de azufre por
parte de las levaduras. La síntesis de los aminoácidos azufrados, cisteína y me-
tionina, se lleva a cabo a partir del azufre inorgánico, en forma de sulfato y/o sul-
fito, y de los procesos anabólicos de los azúcares que conducen a la síntesis del
ácido aspártico y la serina. El metabolismo del azufre conduce a la formación
del sulfuro de hidrógeno, que es un compuesto que presenta un olor desagrada-
ble (huevos podres) y un bajo umbral de detección (50-80 µg/L). La reducción
de sulfato a sulfuro requiere la utilización de dos moléculas de ATP y cuatro de
NADPH (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997), pudiendo incorporarse a este proceso
el sulfito añadido, por ejemplo, como sulfuroso o metabisulfito de potasio. Las
causas o factores que pueden afectar a la acumulación de sulfuro son varias:
a) presencia de azufre elemental y/o sulfuroso/metabisulfito de potasio y/o com-
puestos orgánicos azufrados; b) deficiencia en pantoténico (molécula que forma
parte del coenzima A; c) alta concentración en treonina; y d) bajo contenido en
nitrógeno.
El sulfuro de hidrógeno se combina con la O-acetil-serina y la O-acetil-homo-
serina para sintetizar cisteína y metionina, respectivamente (Jiranek y col.,
1995). En consecuencia, una limitación en el contenido de acetil-coenzima
A reduce la concentración de O-acetil-serina y O-acetil-homoserina y la posibi-
SO2 H2s
Sulfato (SO42-, exógeno)
Sulfato (SO42-, endógeno)
SO32-
S2-
Figura 14.–Producción de compuestos de azufre por la levadura (Swiegers y col., 2005)
80
lidad de combinar el sulfuro para la formación de los aminoácidos azufrados,

acumulándose, en consecuencia, sulfuro en el medio.
En este sentido, hay que resaltar que la relación existente entre el contenido en
nitrógeno y la producción de sulfuro está condicionada por el nivel existente de
ácido pantoténico. Cuando éste se encuentra en una concentración no limitante
para la levadura, se observa que a medida que aumenta la concentración de nitró-
geno asimilable disminuye la producción de sulfuro. En el caso de que la canti-
dad de pantoténico sea deficiente y se incremente la concentración de nitrógeno
asimilable se acumula más sulfuro, lo cual es explicable por la fuerte demanda de
acetil-coenzima A, provocada por el mayor desarrollo de levaduras, que reduce la
concentración de O-acetil-serina y O-acetil-homoserina (Wang y col., 2003).
Por otra parte, la treonina regula la conversión del ácido aspártico en homo-
serina, de tal modo que cuando la treonina está en altas concentraciones se inhi-
be el proceso de formación de la homoserina (Chassagnole y col., 2001) y, en
consecuencia, se limita la reacción del sulfuro con la O-acetil-homoserina. Este
control de la treonina permite explicar por qué aquellas cepas muy productoras
de 1-propanol (que se sintetiza a partir de la treonina) acumulan poco sulfuro
(Giudici y col., 1993). Por otra parte, cuando el medio está empobrecido en nitró-
geno los aminoácidos azufrados, a través de la cisteína, se degradan formando
piruvato, amonio y sulfuro.
Otros aromas producidos por levaduras

Las levaduras son capaces de degradar los ácidos fenólicos; destaca el géne-
ro Brettanomyces/Dekkera (se desarrollan con posterioridad a la fermentación
alcohólica) que, a través del sistema enzimático que se describe en la figura 15,
es capaz de transformar los ácidos p-cumárico y ferúlico en 4-etilfenol y 4-etil-
guayacol, respectivamente. Por otra parte, Saccharomyces cerevisiae, por medio
de un proceso de descarboxilación no oxidativo, convierte los ácidos fenólicos
en vinilfenoles (Swiegers y col., 2005). Los fenoles volátiles tienen un significa-
tivo impacto en el aroma, aportando notas negativas cuando están presentes en
elevadas concentraciones, en especial los etilfenoles, que se asocian a descriptores
aromáticos del tipo “medicinal”, “picante”, “humeante”, “animal”, “caballo”, etc.
Figura 15.–Biosíntesis de los etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera
81
Otros aromas que pueden ser formados por Brettanomyces/Dekkera y, tam-

bién, por bacterias lácticas, son determinados compuestos heterocíclicos de
nitrógeno que aportan notas negativas al aroma (olor a ratón con valores umbra-
les de detección en agua por debajo de 1,6 µg/L) (Costello y Henschke, 2002);
éstos, derivan de la degradación de los aminoácidos lisina y ornitina. Las sus-
tancias asociadas a este descriptor sensorial son la 2-acetiltetrahidropiridina
(ACTPY, figura 16), la etiltetrahidropiridina y la 2-acetil-1-pirrolina (ACPY,
figura 16). La detección sensorial de estos heterociclos de nitrógeno es función
del pH. En la sidra, estas moléculas están en forma iónica no detectable senso-
rialmente. Sin embargo, cuando la sidra es degustada y estos compuestos entran
en contacto con la saliva, que posee un pH más elevado, se descargan y se con-
vierten en sustancias volátiles que ya pueden ser detectadas por los sentidos (Lea
y Drilleau, 2003).
En la figura 16 se muestra un esquema de la síntesis de la 2-acetiltetrahidro-
piridina y la 2-acetil-1-pirrolina. Como se puede ver, se precisa la participación
de los aminoácidos lisina y ornitina así como de etanol/propanol (este alcohol es
necesario para la formación de la 2-propioniltetrahidropiridina) y ciertas condi-
ciones aeróbicas y en el caso de las bacterias lácticas una fuente de azúcar (fer-
mentación heteroláctica).
Figura 16.–Síntesis de heterociclos de nitrógeno por levaduras y bacterias lácticas (Costello y Henschke,
2002). ACTPY: 2-acetiltetrahidropiridina; ACPY: 2-acetil-1-pirrolina
82
Las levaduras de los géneros Candida y Pichia pueden desarrollarse en la

superficie (formación de un film) de la sidra si ésta está expuesta a la acción del
aire (caso, por ejemplo, de que el recipiente que contiene la sidra no esté total-
mente lleno). Su crecimiento, por tanto, se limita o se impide si el recipiente que
contiene la sidra no tiene cámara de aire. El metabolismo aeróbico de estos
microorganismos transforma el etanol en gas carbónico y agua (Beech y Carr,
1977; Lea, 1995), si bien, de acuerdo con Sponholz (1993) también se produce
ácido acético y sus ésteres y acetaldehído. El acetaldehído es muy reactivo y par-
ticipa en procesos de acetalización con alcoholes. Es el caso, por ejemplo, de la
formación de los dioxanos y dioxolanos, de especial relevancia aromática, que se
sintetizan a partir de la glicerina y el 2,3-butanodiol.
El indol es una molécula que aporta notas negativas (aroma fecal) cuando está
presente en la sidra en concentraciones superiores a 0,2 mg/L. No parece proba-
ble que derive de la degradación del triptófano, ya que, este aminoácido está a
nivel traza en el mosto de manzana. Por el contrario, se cree que las levaduras lo
producen cuando se sintetiza triptófano a partir de una fuente de nitrógeno inor-
gánico como, por ejemplo, el fosfato amónico. Su producción se estimula en fer-
mentaciones rápidas a elevada temperatura y cuando existe una deficiencia de
piridoxina, que es un cofactor enzimático de los procesos de transaminación (Lea
y Drilleau, 2003).
BACTERIAS
Bacterias lácticas
Metabolismo de los azúcares. Los géneros más representativos de este grupo
de microorganismos en la sidra (Cabranes, 1993) son: Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus y Oenococcus. El nombre de bacterias lácticas, también denomina-
das bacterias del ácido láctico, se debe a que estos microorganismos obtienen su
energía (ATP) a través de la fermentación de los carbohidratos, sintetizando
ácido láctico como producto mayoritario. En algunos casos se obtiene solo este
ácido (homofermentación) y en otros se produce, además, dióxido de carbono y
etanol (heterofermentación). Las bacterias lácticas se diferencian por el isómero
del ácido láctico producido, lo que está determinado por la estereoespecificidad
de la enzima lactato deshidrogenasa. Algunas producen el isómero L (+) y otras
el D (-) y, si disponen de los dos tipos de lactato deshidrogenasas, se obtendrá
una mezcla racémica.
Son microorganismos aerotolerantes anaerobios, incapaces de producir ATP
por vía respiratoria. El modelo de fermentación de los azúcares permite clasifi-
car las bacterias lácticas en dos grupos: homofermentadores (bacterias homolác-
ticas) y heterofermentadores (bacterias heterolácticas). Las bacterias lácticas
homofermentadoras degradan los azúcares a través de la ruta de Embden-
Meyerhof-Parnas (glicolisis). Una vez formado el ácido pirúvico a través de la
glicolisis (figura 2) se reduce a ácido láctico por medio de lactato deshidrogenasas,
83
al objeto de recuperar el NAD+ para continuar oxidando más azúcar. El rendi-

miento energético de este proceso es de dos moles de ATP por mol de azúcar oxi-
dado. Sin embargo, las bacterias lácticas heterofermentadoras no disponen de la
fructosa-bifosfato aldolasa (enzima que rompe la fructosa 1,6-bifosfato, ver figu-
ra 2), por lo que no pueden disimilar los azúcares a través de la glicolisis. En este
caso, estas bacterias metabolizan los azúcares mediante la ruta de las pentosas
fosfato que tiene un menor rendimiento en ATP, ya que solamente se produce un
mol de ATP por cada mol de azúcar disimilado (figura 17).
Desde el punto de vista del balance de óxido-reducción, la ruta heterofer-
mentadora está equilibrada siempre que el acetil-fosfato (Acetil P) pueda ser
reducido a etanol, lo que permite oxidar el NADPH para disponer del NADP+
necesario para la oxidación de los azúcares (figura 17). Algunas bacterias lácti-
cas son incapaces de reducir el acetil-fosfato y, de hecho, estos microorganismos
no pueden crecer en anaerobiosis estricta a partir de la presencia exclusiva de
glucosa. La existencia de oxígeno permite que estos microorganismos oxiden el
NADPH a expensas de la reducción del oxígeno molecular mediante una flavo-
proteína. También, determinadas bacterias lácticas heterofermentadoras de los
géneros Lactobacillus y Leuconostoc, incapaces de reducir el acetil-fosfato, pue-
den crecer en condiciones de anaerobiosis estricta siempre que exista otra fuen-
te de azúcar, como la fructosa. Estas bacterias disponen de la enzima manitol
deshidrogenasa que cataliza la reducción de la fructosa a manitol, lo que posibi-
lita la oxidación del NADPH.
Figura 17.–Metabolización de hexoxas por bacterias heterofermentadoras (Ribéreau-Gayon y col., 2006b)
84
Cuando las células utilizan estas vías alternativas (reducción del oxígeno y/o
de fructosa) para oxidar el NADPH, el acetil-fosfato puede ser convertido en
acetato a través de la acción de la acetato quinasa (figura 17). En estas circuns-
tancias existe una recuperación adicional de una molécula de ATP (se producen
dos moles de ATP por mol de azúcar disimilado en la heterofermentación), por
lo que los microorganismos obtienen un mayor beneficio energético. Este proce-
so da origen al fenómeno denominado “picado láctico” (producción de ácido lác-
tico y acético).
Las condiciones de aireación y la presencia de otras moléculas aceptoras de
protones (caso de la fructosa) condicionan la ratio etanol/acetato en el proceso
heterofermentativo, diminuyendo ésta a medida que la aireación es mayor.
Las pentosas (ribosa, arabinosa y xilosa) pueden ser metabolizadas tanto por
bacterias homolácticas como heterolácticas. Como se recoge en la figura 18,
estos carbohidratos son fosforilados mediante una molécula de ATP. La posterior
transformación del gliceraldehído 3-fosfato en ácido láctico mantiene el equili-
brio de óxido reducción, por lo que la reducción del acetil-fosfato a etanol no es
posible al no existir ninguna molécula de NADH en exceso que pueda ser usada
(ver figura 18). Por ello, en estas condiciones el acetil-fosfato se transforma en
acetato formando una molécula de ATP, siendo el rendimiento energético del
proceso de dos moles de ATP por mol de pentosa metabolizado. En consecuen-
cia, la degradación de las pentosas por las bacterias lácticas, tanto homo como
heterofermentadoras, conduce necesariamente a la acumulación de ácido acético.
Metabolismo de la glicerina. La degradación de la glicerina por el género
Lactobacillus ha sido descrita en sidra por Claisse y Lonvaud-Funel (2000).
Estos autores han aislado Lb. collinoides en sidras afectadas por la alteración
denominada “picado acroleínico”.
Las bacterias lácticas degradan la glicerina por la vía oxidativa, transformán-
dola en dihidroxiacetona fosfato que se incorpora a la glicolisis. Sin embargo,
Lb. collinoides utiliza una ruta alternativa (vía reductora, figura 19) acoplada
Figura 18.–Metabolismo de las pentosas por bacterias lácticas (Ribéreau-Gayon y col., 2006b)
85
Figura 19.–Degradación de la glicerina por Lb collinoides (Sauvageot y col., 2000; 2002a; 2002b). PF: pen-
tosas fosfato; 1: glicerol deshidratasa; 2: 1,3-propanodiol deshidrogenasa.
con el catabolismo de los azúcares (Sauvageot y col., 2000; 2002a; 2002b; Garai-
Ibabe y col., 2008), siendo la fructosa un factor que estimula la degradación de
la glicerina por esta vía reductora. Este proceso consta básicamente de dos eta-
pas: a) deshidratación de la glicerina para formar el 3-hidroxipropionaldehído
(3-HPA) mediante la enzima glicerol deshidratasa; y b) reducción del 3-hidroxi-
propionaldehído a 1,3-propanodiol mediante la 1,3-propanodiol deshidrogenasa.
La formación del 1,3-propanodiol permite la desintoxicación de la célula y la
formación del NAD+ necesario para continuar con la oxidación de los azúcares a
través del metabolismo heterofermentativo de las pentosas fosfato (ver figura
17). Al actuar el 3-hidroxipropionaldehído como aceptor de protones, el equili-
brio de óxido reducción se mantiene en la disimilación de los azúcares por la vía
heterofermentativa y el acetil fosfato se transforma en acético formando una
molécula adicional de ATP, de ahí la denominación de “picado”.
Por otra parte, cuando la concentración de fructosa es limitante, Lb. colli-
noides deshidrata la glicerina formando 3-HPA y éste se dismuta producien-
do 1,3-propanodiol y 3-hidroxipropiónico, proceso que está catalizado por la
1,3-propanodiol deshidrogenasa (Garai-Ibabe y col., 2008). El 3-HPA se encuen-
tra en equilibrio con un dímero cíclico y la forma hidratada formando el com-
plejo denominado reuterina (Talarico y Dobrogosz, 1989), que es un potente
agente antimicrobiano.
Por otro lado, el 3-HPA también está en equilibrio químico con la acroleína
(ver figura 19), estando el proceso dirigido hacia la formación de ésta en condi-
ciones ácidas y con aplicación de calor. Esto permite explicar la producción de
acroleína en los destilados de sidras afectadas por el “picado acroleínico”. En el
caso de que no exista oxidación de los azúcares (no se produce NADH) o bien
que el NADH se utilice para producir manitol, se puede acumular 3-HPA y, como
consecuencia de ello, se sintetiza acroleína.
La degradación de la glicerina también puede ocurrir en ausencia de una fuen-
te de azúcar y en presencia de ácido láctico. De acuerdo con los trabajos de
Claisse y Lonvaud-Funel (2000), el ácido D (-) láctico procedente de la fermen-
tación heteroláctica realizada por Lb collinoides puede ser oxidado mediante una
D-lactato deshidrogenasa a ácido pirúvico; el NAD+ necesario para esta oxida-
86
ción sería suministrado a través de un proceso acoplado con la reducción del

3-hidroxipropionaldehído a 1,3-propanodiol.
Posteriormente, el ácido pirúvico formado se transforma en acetato a través
de diferentes rutas (Sedewitz y col., 1984; Lorquet y col., 2004; Wagner y col.,
2005; Goffin y col., 2006): a) formación de acetil fosfato mediante la acción
de la piruvato oxidasa; b) síntesis de acetil-CoA mediante la piruvato formiato
liasa y/o la piruvato deshidrogenasa; y c) formación del acetil fosfato a partir del
acetil-CoA por medio de la fosfotransacetilasa (ver figura 20). El acetil fosfato
se transforma en acético, con producción de una molécula de ATP, por medio de
una acetato quinasa. El resultado global del proceso es consumo de la glicerina
y formación de 1,3- propanodiol y ácido acético.
No obstante, en sidra también se ha observado la acumulación de alcohol alí-
lico. Este alcohol puede derivar de la acroleína (Hühn et al., 1999) mediante la
acción de una deshidrogenasa. Este proceso permite regenerar NAD+ que puede
ser utilizado para oxidar más azúcares con formación de ácido acético. De ahí,
que podamos denominarlo “picado alílico”.
El control en la sidra de cepas de bacterias lácticas con capacidad de deshi-
dratar la glicerina y formar el 3-HPA, es posible llevarlo a cabo mediante una
PCR (Polymerase Chain Reaction) con la detección de un amplicón de 279 pb
(Claisse y Lonvaud-Funel, 2001).
Metabolismo del ácido málico y otros ácidos. El ácido L (-) málico se trans-
forma en L (+) láctico y dióxido de carbono por medio de la fermentación o con-
versión maloláctica (figura 21); en el caso de la sidra este proceso lo lleva a cabo,
Figura 20.–Oxidación del ácido láctico acoplada a la degradación de la glicerina con formación de acético por
bacterias lácticas. 1: lactato deshidrogenasa; 2: 1,3-propanodiol deshidrogenasa; 3: glicerol deshidratasa; 4:
piruvato oxidasa; 5: acetato quinasa; 6: piruvato formiato liasa; 7: fosfotransacetilasa; 8: piruvato deshidroge-
nasa; 9: acetaldehído, alcohol deshidrogenasa. 3-HPA: 3-hidroxipropionaldehído; P: fosfato
87
Figura 21.–Mecanismo quimiosmótico propuesto (Cox y Henick-Kling, 1995) para la síntesis de ATP duran-
te la fermentación maloláctica. U: transportador “Unipuerto”; EML: enzima maloláctica; HM-: anión malato;
HL: ácido láctico; ∆Ψ : diferencia de potencial transmembrana; H+: protón escalar citoplasmático; P: fosfato.
F0: canal iónico; F1-ATPasa: síntesis de ATP
casi en exclusividad, la especie Oenococcus oeni (sin. de Leuconoctoc oenos)

(Cabranes, 1993). Se trata de un microorganismo acidófilo que es capaz de cre-
cer a valores bajos de pH, en el entorno de 3,5 o menos y en presencia de etanol
y sulfitos (Zhang y Lovitt, 2006). La enzima maloláctica cataliza este proceso,
presentando la mayor actividad frente al L (-) málico y precisando NAD+ como
cofactor enzimático y Mn2+. Se trata de una descarboxilación directa, con for-
mación de L (+) láctico, en la que no se ha detectado ácido pirúvico como pro-
ducto intermedio del proceso.
Desde el punto de vista tecnológico hay tres métodos para desarrollar la con-
versión maloláctica: a) fermentación espontánea a partir de bacterias indígenas;
b) crecimiento celular de cultivos iniciadores con baja concentración de bac-
terias seleccionadas; y c) inducción directa con iniciadores a elevadas con-
centraciones celulares usando células libres, inmovilizadas o biorreactores de
membrana (Zhang y Lovitt, 2006).
Durante la fermentación maloláctica se produce energía en forma de ATP y,
dado que no existe fosforilación a nivel de sustrato, su síntesis se realiza a través
de la generación de una fuerza protón motriz, o gradiente electroquímico de pro-
tones (∆p), que tiene dos componentes: a) el potencial de membrana (∆Ψ ) y b)
el gradiente de pH o potencial químico de protones.
En el caso de las bacterias lácticas se han propuesto diversos mecanismos qui-
miosmóticos para explicar la generación de la fuerza protón motriz: 1- transpor-
te electrogénico de los ácidos málico y láctico mediante un “Antipuerto” (van
Maris y col, 2004); 2- transporte electrogénico del ácido málico a través de
“Unipuerto” (Salema y col., 1996); 3- eflujo electrogénico y/o electroneutro del
ácido láctico/lactato y el protón por medio de un “Symport” (Poolman y col.,
1991; Versari y col., 1999); y 4-transporte electrogénico del malato y salida del
ácido láctico por difusión pasiva (Cox y Henick-Kling, 1995). En la figura 21 se
describe un posible mecanismo quimiosmótico que permite explicar la síntesis
de ATP durante la fermentación maloláctica.
88
Como se muestra en la figura 21, el ión malato monovalente (HM-) entra en

la célula a través de un transportador electrogénico “Unipuerto”, generando una
diferencia de potencial a través de la membrana (∆Ψ ) que contribuye al incre-
mento de la fuerza protón motriz (∆p). A continuación, se produce la descarbo-
xilación del malato con consumo de un protón (H+) escalar citoplasmático. Este
proceso conlleva un incremento del pH intracelular, lo que da origen a un poten-
cial químico de protones a través de la membrana (gradiente de pH, ∆pH), que
también contribuye al aumento de ∆p. Posteriormente, tanto el dióxido de car-
bono (CO2) como el ácido láctico formado (HL) son excretados por difusión
pasiva. La fuerza protón motriz generada es utilizada por una F0-F1 ATPasa para
sintetizar ATP a partir de ADP y fosfato (P). La estequiometría de este proceso
es de tres protones transportados por el canal iónico F0 por cada molécula de ATP
sintetizada en la F1-ATPasa. En consecuencia, por cada molécula de ácido máli-
co descarboxilada se produce la tercera parte de ATP.
La fermentación maloláctica provoca una reducción de la acidez de la sidra y
una mejora de su estabilidad microbiana. Además de las implicaciones sensoria-
les que tiene el incremento de pH y la sustitución del ácido málico por láctico,
durante este proceso se generan aromas que dan una mayor complejidad y redon-
dez al producto, es el caso de los ésteres etílicos de los ácidos láctico y succíni-
co que aportan notas afrutadas.
El ácido cítrico es metabolizado por las bacterias lácticas de acuerdo con el
proceso que se describe en la figura 22, formándose láctico, acético, diacetilo,
acetoína y 2,3-butanodiol (Liu, 2002). De todos estos compuestos, hay que des-
Figura 22.–Mecanismo quimiosmótico propuesto (Cox y Henick-Kling, 1995) para la síntesis de ATP duran-
te la fermentación maloláctica. U: transportador “Unipuerto”; EML: enzima maloláctica; HM-: anión malato;
HL: ácido láctico; ∆Ψ : diferencia de potencial transmembrana; H+: protón escalar citoplasmático; P: fosfato.
F0: canal iónico; F1-ATPasa: síntesis de ATP
89
tacar el diacetilo por aportar el aroma a “mantequilla” y el ácido acético por

contribuir al “picado”. La acumulación de diacetilo puede limitarse si se produ-
ce la reducción de éste a acetoína (producto menos aromático que el diacetilo)
y a 2,3-butanodiol.
Metabolismo de los compuestos fenólicos. Los polifenoles, en función del
tipo y concentración, pueden favorecer o limitar el desarrollo de las bacterias lác-
ticas. Así, por ejemplo, los ácidos fenólicos (cafeico, p-cumárico y ferúlico) inhi-
ben el crecimiento de O. oeni a altas concentraciones y el aumento de la con-
centración de ácido gálico reduce la acumulación de ácido acético (Reguant y
col., 2000) y, en consecuencia, el “picado”. De acuerdo con los trabajos desarro-
llados por Salih y col. (2000), la inhibición provocada por los ácidos fenólicos
guarda una relación con su hidrofobicidad (orden decreciente de inhibición: ferú-
lico>p-cumárico>cafeico).
Sin embargo, cuando los ácidos fenólicos están presentes en bajas concentra-
ciones son transformados en fenoles volátiles (vinil y etilfenoles) de un modo
similar al ya descrito para algunas especies de levaduras (ver figura 15) del géne-
ro Brettanomyces/Dekkera; no obstante, en el caso de las bacterias lácticas la
producción de etilfenoles fue detectada solamente en el género Lactobacillus
(Couto y col., 2006); de hecho, se cree que Lactobacillus collinoides es capaz de
hidrogenar los ácidos hidroxicinámicos (por ejemplo, cafeico y p-cumárico)
transformándolos en hidrocinámicos o fenilpropiónicos (hidrocafeico e hidrocu-
márico). La presencia de éstos ha sido detectada en sidra asturiana y representan
más del 80% del total de los ácidos fenólicos cuantificados (Suárez y col., 2005;
Rodríguez y col., 2006). Los ácidos hidrocinámicos pueden ser descarboxilados
por estas bacterias para formar etilfenoles. Sin embargo, la capacidad que tienen
las bacterias lácticas de producir fenoles volátiles es inferior a las levaduras del
género Brettanomyces/Dekkera (Chatonnet y col., 1995) que, con carácter gene-
ral, son las responsables de proporcionar el carácter fenólico al producto final.
Producción de polisacáridos extracelulares o exopolisacáridos (EPS). Las
bacterias lácticas son capaces de producir polisacáridos (con tamaños compren-
didos entre 40 y 6.000 kDa) que provocan cambios en las propiedades reológi-
cas de los alimentos originando, en el caso de la sidra, la alteración denominada
“grasa”, “ropiness”, “oiliness” o “filado”. Estos EPS son excretados al medio
extracelular o forman una cápsula enlazada a la pared celular de modo covalen-
te, estando su producción condicionada por la concentración y fuentes de nitró-
geno y carbono, la temperatura y el pH (Dueñas y col., 2003; Velasco y col.,
2006).
La alteración de la grasa produce una sensación sensorial aceitosa que hace
inaceptable el producto desde el punto de vista comercial; no obstante, estudios
realizados utilizando el ratón como especie-modelo apuntan a que estas molécu-
las presentan propiedades inmuno-estimulantes y antitumorales, reducen el
colesterol (Boels y col., 2001) y estimulan las bifidobacterias en el tracto gas-
trointestinal. Los microorganismos responsables de esta alteración en la sidra
90
pertenecen a los géneros Pediococcus, Lactobacillus y Oenococcus. En concre-

to, las especies P. damnosus, Lactobacillus spp heterofermentativos, probable-
mente Lb. collinoides y Lb. brevis y Oenococcus oeni han sido aisladas en sidras
vascas alteradas (Dueñas y col., 1995; Dueñas-Chasco y col., 1997, 1998).
Existen dos tipos de EPS: homopolisacáridos y heteropolisacáridos. Los homo-
polisacáridos consisten en unidades repetidas de glucosa (dextranos, mutanos y/o
glucanos, en general) o fructosa. Cuando los dextranos (glucanos con uniones α-
1,6), los mutanos (glucanos con uniones α-1,3) y los fructanos/levanos (uniones
β-2,6) son sintetizados a través de glicosiltransferasas extracelulares, el azúcar
que se transfiere procede de un disacárido (por ejemplo, la sacarosa) (Boels y
col., 2001). Sin embargo, los heteropolisacáridos y algunos homopolisacáridos
se sintetizan en el interior celular a partir de los azúcares-nucleótidos (azúcares
activados).
Los heteropolisacáridos están formados por unidades de oligosacáridos rami-
ficados que contienen diferentes azúcares (de cuatro a siete) como la galactosa,
la glucosa, la ramnosa, la N-acetilglucosamina, la N-acetilgalactosamina, la
manosa, la fructosa, el ácido glucurónico y la fucosa (Yang, 2000; Boels y col.,
2001; Tieking, 2005). De acuerdo con Beech y Carr (1977), los componentes
azucarados presentes en el polisacárido aislado de sidras alteradas son la gluco-
sa, la galactosa, la arabinosa y la manosa.
No obstante, en el caso de las sidras vascas se aisló un (1,3) (1,2)-β-D-
glucano producido por P. damnosus y O. oeni cuya unidad repetitiva es un trisa-
cárido de β-D-glucopiranosa, en la que dos monosacáridos se enlazan lineal-
mente en las posiciones 1,3 y el tercero se ramifica en la posición 2 formando
una unidad de β-soforosa (Dueñas-Chasco y col., 1997; Ibarburu y col., 2007).
Este β-D-glucano se sintetiza por medio de una glicosiltransferasa que está codi-
ficada por un plásmido de aproximadamente 5.500 pb (Walling y col., 2001). La
secuenciación de este plásmido ha permitido diseñar herramientas analíticas para
el control de cepas de bacterias lácticas que producen exopolisacáridos (Walling
y col., 2005). De hecho, Garai Ibabe (2010) ha utilizado la técnica PCR para la
detección del gen gtf, que codifica la enzima glicosiltransferasa responsable de
la síntesis de (1,3) (1,2)-β-D-glucano, a través de un amplicón de 417 pb.
Por otro lado, en sidras alteradas por lactobacilos se aisló un α-D-glucano
enlazado en las posiciones 1,6 y ramificado en la posición 2 con una unidad de
α-D-glucanopiranosa mediante un enlace 2,1 (Dueñas-Chasco y col., 1998). Por
otra parte, algunas cepas de O. oeni son capaces de sintetizar heteropolisacáridos
que contienen galactosa, glucosa y ramnosa (Ibarburu y col., 2007).
La síntesis de los EPS en el interior celular se produce a partir de los azúca-
res activados por los nucleótidos UTP (uridín trifosfato), GTP (guanosín trifos-
fato) o dTTP (desoxi-timidín trifosfato). A continuación, se produce el ensamble,
mediante glicosiltransferasas, de los azúcares-nucleótidos (UDP-galactosa,
UDP-glucosa, dTDP-ramnosa, GDP-manosa, etc.) en un transportador lipídico
enlazado a la membrana citoplasmática. Una vez que el polisacárido alcanza un
91
determinado tamaño, el transportador lipídico y el polisacárido enlazado a éste

son conducidos al exterior de la membrana citoplasmática, produciéndose poste-
riormente la liberación del EPS. A continuación, el transportador lipídico es
retransportado al interior de la membrana para continuar con un nuevo proceso
de síntesis (Welman y Maddox, 2003).
Otras alteraciones causadas por las bacterias lácticas. El ácido sórbico
(2,4-hexadienoico) es un conservante que, en ocasiones, se utiliza para el control
de las levaduras en sidras dulces; no es un compuesto activo frente a bacterias
lácticas, por lo que su uso debe ir acompañado de la aplicación de sulfitos (sul-
furoso o metabisulfito potásico). De hecho, las bacterias lácticas son capaces de
degradarlo provocando la formación de un aroma a “geranio”. El primer paso
de este proceso es la reducción del ácido sórbico al correspondiente alcohol
(2,4-hexadien-1-ol); éste, posteriormente, experimenta un reordenamiento mo-
lecular (en medio ácido) que origina el 3,5-hexadien-2-ol. Finalmente, este
alcohol, en presencia de etanol, se transforma en 2-etoxi-3,5-hexadieno que tiene
un fuerte olor a “geranio”. En consecuencia, la formación de este aroma es posi-
ble únicamente en las bebidas alcohólicas.
Las bacterias lácticas son capaces de descarboxilar los aminoácidos para
formar aminas biógenas (histamina, tiramina, etc.). Éstas son responsables de
episodios de dolor de cabeza experimentados después de la ingesta de bebi-
das alcohólicas. En el caso particular de la sidra, Del Campo y col. (2000) han
demostrado que cepas de Lactobacillus spp y Oenococcus oeni presentan acti-
vidad de la histidina descarboxilasa y fueron capaces de producir histamina a
partir de histidina suplementada en un medio semisintético.
Por otro lado, Garai Ibabe (2010) detectó en sidras del País Vasco las aminas
mayoritarias putrescina (derivada de la ornitina), tiramina (derivada de la tirosi-
na) e histamina (derivada de la histidina), encontrando una relación entre la pro-
ducción de aminas biógenas, la degradación de la glicerina y la formación del
1,3-propanodiol.
Por último, cabe destacar que determinadas bacterias lácticas son capaces de
producir elevadas concentraciones de diacetilo lo que comunica a la sidra un
aroma a mantequilla y/o lactosuero. No obstante, esta molécula contribuye al fla-
vor de la sidra en concentraciones de aproximadamente 2 mg/L (Bennett, 1996).
Bacterias del género Zymomonas

Estas bacterias son un grupo de microorganismos anaerobios facultativos que
ocasionan una alteración en la sidra denominada “sickness” y/o “framboisé”
(Swings y De Ley, 1977), siendo Z. mobilis la especie responsable (Coton y col.,
2006). Se observa, fundamentalmente, en sidras dulces con un pH mayor de 3,7.
De hecho, el crecimiento de estos microorganismos está muy comprometido a un
pH inferior a 3,5. Esta alteración se identifica por el desarrollo de turbidez y de
92
Figura 23.–Ruta de Entner-Doudoroff
un fuerte aroma a “piel de banana”, “limón podrido” o “frambuesa”. Desde el

punto de vista químico, las sidras alteradas se caracterizan por poseer una eleva-
da concentración de acetaldehído (por encima de 150 mg/L, alcanzando en algu-
nos casos 1 g/L) (Coton y Coton, 2003).
El catabolismo de los azúcares, glucosa y fructosa y, en ocasiones, sacarosa,
se efectúa a través de la ruta de Entner-Doudoroff (ver figura 23), observándose
una conversión casi cuantitativa de la glucosa en etanol y dióxido de carbono.
Como se puede observar, el balance neto de energía es de 1 mol de ATP/mol de
azúcar fermentado. La síntesis de ATP se produce por medio de una fosforilación
a nivel de los sustratos: 1,3-bifosfoglicerato y fosfoenolpiruvato y existe un
equilibrio redox entre la oxidación de la glucosa-6-fosfato y el gliceraldehído-3-
fosfato y la reducción de dos moléculas de acetaldehído (ver figura 23). Por
tanto, el balance de este proceso es que un mol de azúcar fermentado produce
dos moles de etanol y dos de dióxido de carbono.
No obstante, aparte de la formación de los productos finales (etanol y gas car-
bónico) y de otros intermedios como el acetaldehído, la fermentación de los azú-
cares por parte de estas bacterias también conduce a la formación de los ácidos
láctico y acético y acetoína (Swings y De Ley, 1977).
Bacterias acéticas
Estos microorganismos causan alteraciones en la sidra al producir una exce-
siva cantidad de ácido acético, acetato de etilo y compuestos carbonílicos como
el acetaldehído y la acetoína (producto derivado del metabolismo del ácido lác-
tico). Las bacterias acéticas son aerobias y utilizan el catabolismo respiratorio
de los sustratos orgánicos para producir energía (ATP) a través de la cadena
93
respiratoria. Los electrones procedentes de la oxidación del material orgánico

(incorporados en transportadores como, FADH2, NADPH2 y NADH2) son trans-
feridos al oxígeno, produciéndose un gradiente electroquímico de protones
durante este transporte que genera una fuerza motriz que permite la fosforilación
oxidativa y la síntesis de ATP.
Las bacterias acéticas son microorganismos acidófilos (pueden crecer a un
pH<4, siendo óptimo el crecimiento entre 5 y 6) y aerobios que efectúan, ge-
neralmente, una oxidación parcial o incompleta, denominada “fermentación
oxidativa”, de determinados materiales hidrocarbonados. Cuando se oxida par-
cialmente el etanol se acumula ácido acético, siendo este proceso la base de la
elaboración del vinagre. Existen tres géneros de bacterias acéticas presentes en
la sidra, Gluconacetobacter, Gluconobacter y Acetobacter. La diferencia más
relevante entre ellos es que Gluconobacter no tiene funcional el ciclo de Krebs
y el resto sí lo tiene. Ello se traduce en que Gluconobacter no puede oxidar com-
pletamente el acetato.
Catabolismo de los azúcares. Las bacterias acéticas son capaces de oxidar
los azúcares y así, por ejemplo, la glucosa puede ser transformada en gluconato,
2-cetogluconato, 5-cetogluconato y 2,5-dicetogluconato (oxidación parcial).
Estas oxidaciones están acopladas con la reducción de FAD y la subsiguiente for-
mación de FADH2, que se incorpora a la cadena respiratoria para producir ATP.
Los cuerpos cetónicos derivados del ácido glucónico se enlazan muy favorable-
mente con los sulfitos, lo que limita la eficacia de éstos como conservantes. Las
bacterias acéticas utilizan la ruta de las pentosas fosfato para oxidar completa-
mente los azúcares.
Como es sabido, esta vía es tanto anabólica (se produce la ribosa-5P para la
síntesis de los ácidos nucleicos) como catabólica. En este caso, el ATP se produ-
ce por la vía clásica de transformación del gliceraldehído-3P en ácido pirúvico,
láctico y acético, siendo éste último oxidado completamente por especies de
Acetobacter spp (Drysdale y Fleet, 1988). La otra vía catabólica de síntesis
de ATP es a partir del NADPH producido en la oxidación de la glucosa-6P, que
se transforma en ribulosa-5P de acuerdo con el esquema que se muestra en la
figura 24. A partir de 6 moles de glucosa-6P se producen 12 moles de NADPH,
6 moles de dióxido de carbono y 5 moles de glucosa-6P; esta última se forma a
partir de diversas reacciones de transaldolización y transcetolización (figura 24).
La transferencia de 1 mol de NADPH2 (2 protones/electrones) a la cadena respi-
ratoria produce 3 ATP, por lo que, en este caso, la oxidación de 1 mol de gluco-
sa origina 36 ATP.
El catabolismo de los azúcares descrito es más importante en Gluconobacter
que en Acetobacter y, por el contrario, la formación de acético a partir de etanol
es más relevante en Acetobacter. Como consecuencia de ello, Gluconobacter
está más presente en ambientes azucarados (mostos) y Acetobacter en los alco-
hólicos (por ejemplo, la sidra); de hecho, Acetobacter tolera mejor el etanol que
Gluconobacter.
94
Figura 24.–Oxidación completa de la glucosa por bacterias acéticas a partir de la ruta de las pentosas fosfato
(Ribéreau-Gayon y col., 2006c)
Respiración del etanol. La oxidación del etanol a ácido acético es la carac-

terística más relevante de las bacterias acéticas. Dos enzimas enlazados a la
membrana citoplasmática son responsables de este proceso: la alcohol deshidro-
genasa y la aldehído deshidrogenasa. Se trata de quinoproteínas (PQQ-deshi-
drogenasas) que tienen como grupo prostético la quinona de pirrolo-quinolina
(PQQ) no enlazado covalentemente a la deshidrogenasa (Flores-Encarnación y
col., 2004). Las PQQ-deshidrogenasas participan en la oxidación del etanol
desde el exterior celular (espacio periplásmico) y se acoplan a la cadena respira-
toria para producir ATP.
El sistema de oxidación del etanol dispone de tres componentes básicos: La
alcohol deshidrogenasa (ADH III), la ubiquinona-9 (UQ9) en el caso de
Acetobacter o la ubiquinona-10 (UQ10) en Gluconobacter y una oxidasa termi-
nal que funciona como una ubiquinol oxidasa. Ésta transfiere los electrones a tra-
vés de la membrana citoplasmática, liberándose energía que se transforma en un
gradiente electroquímico de protones que es utilizado para producir ATP en una
ATP sintetasa.
95
Por otro lado, este tipo de quinoproteínas está generalmente formado por tres
subunidades: la I, de masa molecular comprendida entre 72 y 80 kDa, es una qui-
nohemoproteína que contiene una molécula de PQQ y una hemoproteína tipo C;
la II, de masa molecular estimada de 43 a 48 kDa, está formada por tres hemo-
proteínas de tipo C; y finalmente la III, cuya función se desconoce, posee una
masa molecular de 20 kDa (Du Toit y Pretorious, 2002; Gómez Manzo y col.,
2005).
La transferencia de electrones sigue la secuencia siguiente (Gómez Manzo y
col., 2005): en primer lugar, el etanol se acopla a la deshidrogenasa, transfirién-
dose dos electrones a la PQQ para formar PQQH2; a continuación, se produce la
transferencia de electrones a la hemoproteína C de la subunidad I y, posterior-
mente, éstos se transfieren a dos de las tres hemoproteínas de la subunidad II, una
de las cuales está involucrada en la reducción de la ubiquinona endógena (Q10 o
Q9). La ubiquinona es de nuevo oxidada a través de la ubiquinol oxidasa a
expensas de la reducción del oxígeno molecular a agua. En la figura 25 se reco-
ge un esquema simplificado del proceso respiratorio del etanol.
Las bacterias del género Acetobacter son capaces de oxidar el ácido acético
procedente de la oxidación del etanol a dióxido de carbono y agua a través del
ciclo de Krebs, al contrario que Gluconobacter que no puede hacer este proceso,
ya que no tienen funcionales las enzimas α-cetoglutarato deshidrogenasa y suc-
cinato deshidrogenasa (Du Toit y Pretorious, 2002). La entrada del ácido acético
en el ciclo de Krebs se lleva a cabo como acetil-CoA. La síntesis de acetil-CoA
a partir del ácido acético se puede producir de modo directo mediante la acetil-
CoA sintetasa o por medio de dos enzimas: a) la acetato quinasa, que cataliza la
síntesis de acetil fosfato a partir del acetato; y b) la fosfotransacetilasa que con-
vierte el acetil fosfato en acetil-CoA.
Las bacterias acéticas utilizan una modificación del ciclo de Krebs (ciclo del
glioxilato) para oxidar el ácido acético, al no tener la posibilidad de sintetizar a
través de los procesos anapleróticos clásicos (síntesis de oxalacetato a partir de
piruvato y/o de fosfoenolpiruvato) el oxalacetato necesario para que este ciclo
funcione con normalidad. Cuando el ciclo del glioxilato está operativo, el iso-
citrato formado en las primeras etapas del ciclo de Krebs se transforma en glio-
xilato y succinato. Posteriormente, la condensación del glioxilato y el acetil-CoA
produce ácido málico, cuya oxidación permite la síntesis de oxalacetato.
Mediante esta secuencia anaplerótica, el ciclo de Krebs funciona correctamente
en microorganismos aerobios como las bacterias acéticas.
Oxidación de otros sustratos hidrocarbonados. Acetobacter es capaz de efec-
tuar una oxidación completa (transformación en dióxido de carbono y agua) de
otros ácidos orgánicos, además del acético, como el pirúvico, cítrico, fumárico,
succínico, málico y láctico, al tener plenamente operativo el sistema multien-
zimático del ciclo de Krebs. Así, por ejemplo, la oxidación del ácido láctico se
realiza en varias etapas. En primer lugar, es transformado en ácido pirúvico por
medio de la lactato oxidasa (localizada en la membrana mitocondrial) o de la
96
Figura 25.–Respiración del etanol por A. aceti (Matsushita y col., 2005). Ox: ubiquinol oxidasa; pmf: fuerza
motriz de protones; ADH: alcohol deshidrogenasa; ALDH: aldehído deshidrogenasa.
lactato deshidrogenasa (ubicada en el citoplasma). El ácido pirúvico es converti-

do en acetaldehído mediante una descarboxilación catalizada por la piruvato des-
carboxilasa y el acetaldehído es oxidado a ácido acético mediante la aldehído
deshidrogenasa. Este ácido se acumula en el caso de Gluconobacter o se puede
oxidar a dióxido de carbono y agua en el caso de Acetobacter. Ambos géneros
pueden, también, transformar el ácido láctico en acetoína (Drysdale y Fleet,
1988) a través de la ruta del α-acetolactato.
Finalmente, hay que resaltar que las bacterias acéticas son capaces de oxidar
la glicerina transformándola en dihidroxiacetona. La enzima responsable de este
proceso es la glicerol deshidrogenasa y está ubicada en la membrana. Este pro-
ceso está inhibido por el etanol y, por ello, no es probable que se desarrolle en
productos fermentados.
97
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104
4. Microbiología de la sidra
Ana Irastorza Iribas y María Teresa Dueñas Chasco
Departamento de Química Aplicada de la Universidad del País Vasco
LEVADURAS
Introducción
Entre los factores que van a determinar las características organolépticas de
las sidras, los microorganismos tienen un papel prominente. Éstos afectarán a la
materia prima, al desarrollo de la fermentación y, en definitiva, a la calidad de la
sidra, ya que metabolizan los azúcares y otros componentes del mosto para pro-
ducir un gran número de productos finales.
La fermentación del mosto de manzana es un proceso microbiológico com-
plejo que implica la evolución secuencial de varias especies de levaduras, bacte-
rias lácticas y acéticas (Beech, 1972; Salih y col., 1988; Cabranes y col., 1990;
Dueñas y col., 1994). Entre estos microorganismos, las levaduras tienen una
influencia dominante dado que realizan la fermentación alcohólica.
Las levaduras son hongos unicelulares que, generalmente, se reproducen
vegetativamente por gemación o fisión. La mayor parte de las levaduras que par-
ticipan en procesos fermentativos pertenecen al grupo de los Ascomicetos, que
se caracterizan porque las esporas resultantes de la meiosis se encuentran conte-
nidas en una especie de saco, dentro de la célula madre (asca).
Morfología de las levaduras

Las levaduras exhiben una gran diversidad con respecto al tamaño celular y
forma. La mayor parte de los trabajos sobre morfología y biología molecular de
levaduras se han realizado con la especie Saccharomyces cerevisiae. Sus células
son generalmente elipsoidales, con tamaños comprendidos entre 5-10 µm de
longitud y de 1-7 µm de anchura.
Las células de las levaduras presentan características estructurales y funcio-
nales de las células eucariotas. Están constituidas de una pared celular rígida, que
105
Ana Irastorza Iribas, María Teresa Dueñas Chasco
les permite soportar la elevada presión osmótica extracelular, periplasma y mem-

brana plasmática, que rodea al citoplasma celular. El medio intracelular contiene
diferentes orgánulos (figura 1), cuya organización es mantenida por un citoes-
queleto. El citosol contiene numerosas enzimas, entre ellas las responsables de la
fermentación alcohólica.
Es importante destacar el papel de la vacuola, orgánulo clave implicado en el
tráfico intracelular de proteínas. Su principal actividad es la ruptura proteolítica
no específica de proteínas. Además, constituye un reservorio de aminoácidos
básicos, polifosfatos y ciertos iones metálicos y está implicada en la homeosta-
sis de las concentraciones iónicas citoplasmáticas y en la osmorregulación
(Feldmann, 2005).
Las mitocondrias de la levadura contienen su propio material genético y su
maquinaria de transcripción y traducción. Son estructuras dinámicas cuyo tama-
Figura 1.–Características estructurales de una célula de levadura: A) representación esquemática. S: vesícula

secretoria; RE: retículo endoplasmático; B) micrografía electrónica. CW: pared celular; CM: membrana celu-
lar; N: núcleo; ER: retículo endoplasmático; V: vacuola; BS: cicatriz de nacimiento
106
ño, forma y número varía ampliamente de acuerdo con el tipo de cepa, fase del
ciclo celular, concentración de glucosa, presencia de sustratos no fermentables y
disponibilidad de esteroles y ácidos grasos (Feldmann, 2005). En los mostos,
predomina la actividad fermentativa frente al metabolismo respiratorio, incluso
en condiciones de aerobiosis, debido a que la presencia de glucosa en el medio
reprime la síntesis de enzimas respiratorios (Ribéreau-Gayon y col., 2003).
El núcleo contiene el ADN genómico que, junto con histonas y proteínas no-
histónicas, se organiza formando la cromatina. Además, dispone de la maquina-
ria para la replicación del ADN, su reparación, transcripción y procesado del
ARN. Como característica distintiva del resto de eucariotas, cabe señalar que la
membrana nuclear no se desintegra durante la división celular y presenta en
polos opuestos unas estructuras, denominadas cuerpos polares del huso, que
corresponden a los centríolos de los eucariotas superiores. Éstos desempeñan un
papel fundamental en la división celular, la citocinesis y la formación de yemas
durante la gemación.
Características genéticas de las levaduras

ADN cromosómico. Las cepas de S. cerevisiae pueden ser haploides, aneu-
ploides o poliploides. Una cepa haploide contiene aproximadamente de 12-13
megabases (mb) de ADN nuclear organizado en 16 cromosomas, cuyos tamaños
varían entre 250 y 2.000 kilobases (kb). Muchas de las cepas de Saccharomyces
usadas en el laboratorio son haploides o diploides, con longitudes cromosómicas
definidas (Querol y col., 2003). Sin embargo, las cepas vínicas son predominan-
temente diploides o aneuploides y ocasionalmente poliploides (Pretorius, 2000),
exhibiendo un elevado polimorfismo en la longitud de sus cromosomas que se
aprovecha para su caracterización taxonómica. Según algunos autores, la ploidia
de las levaduras industriales puede representar una ventaja para adaptarse a con-
diciones medioambientales variables o, quizás, constituir un mecanismo para
incrementar el número de copias de genes importantes para la fermentación alco-
hólica (Querol y col., 2003).
El genoma de S. cerevisiae de una cepa haploide contiene entre 35 y 55 copias
de retrotransposones (elementos Ty). Estos elementos móviles se desplazan de
una localización genómica a otra mediante una transcriptasa reversa e intervie-
nen en translocaciones cromosómicas que contribuyen al polimorfismo cromo-
sómico (Querol y col., 2003). Además, se puede encontrar un número variable de
copias de un plásmido de 2 µm en el núcleo de la mayoría de las cepas salvajes
y en todas las cepas de laboratorio. Se trata de una molécula circular de ADN, de
función biológica desconocida.
Los genes ribosomales 26S, 18S y 5.8S se agrupan en tándem, constituyendo
una unidad de transcripción que se repite en el genoma entre 100 y 200 veces.
Presentan una organización definida (figura 2) con regiones espaciadoras inter-
nas (ITS) y externas (ETS) que se transcriben pero no son procesadas. Estas uni-
107
Figura 2.–Organización de los genes ribosomales
dades codificantes se encuentran separadas por espaciadores intergénicos (NTS).

El gen 5S no forma parte de la unidad funcional, pero se encuentra adyacente.
S. cerevisiae fue el primer organismo eucariota en ser completamente secuen-
ciado, gracias a un esfuerzo público transnacional de investigación (Goffeau y
col., 1996). El ADN es rico en guanina-citosina y está constituido por aproxima-
damente 6.000 genes codificantes de proteínas (http:// www.yeastgenome.org).
Su genoma es mucho más compacto que el de otros eucariotas, debido a que
posee pocas secuencias de ADN repetitivo y pocos intrones.
ADN mitocondrial (ADNmt). El genoma mitocondrial de S. cerevisiae está
constituido por ADN circular de entre 65 y 80 kb; es rico en adenina-timina y
presenta, también, un alto grado de polimorfismo entre cepas, característica que
se aprovecha para estudios taxonómicos. Contiene la información genética para
la síntesis de sólo algunos componentes mitocondriales. La ADN polimerasa
mitocondrial no presenta actividad exonucleasa correctora, lo que determina una
mayor tasa de mutación con respecto a la que presenta el ADN nuclear, por lo
que el ADNmt puede evolucionar muy rápidamente (Guerin, 1991). A diferencia
de otras células eucariotas, S. cerevisiae puede sobrevivir sin ADNmt (Pretorius,
2000). Ello implica la imposibilidad de sintetizar ATP por vía respiratoria, como
consecuencia de la pérdida de enzimas oxidativos. El genoma mitocondrial inter-
viene en otras funciones además de la respiración. Se ha observado que levadu-
ras con diferente ADNmt pueden diferenciarse en su metabolismo lipídico, en
sus características de floculación y en la producción de alcoholes superiores y
otros componentes que afectan a las propiedades organolépticas de las bebidas
fermentadas (Pretorius, 2000).
Elementos genéticos citosólicos. Se ha descrito en el citosol la presencia de
varios elementos genéticos extracromosomales de herencia no Mendeliana.
Entre ellos se encuentran el ARN de doble cadena (ARNds), que es responsable
del fenotipo killer en las cepas de Saccharomyces.
Actividad killer de las levaduras

La actividad killer fue descubierta inicialmente en S. cerevisiae, pero ha sido
descrita en otros géneros de levaduras como Candida, Criptococcus, Debaryomy-
ces, Kloeckera/Hanseniaspora, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Metschni-
kowia, Torulopsis, Williopsis y Zygosaccharomyces (Schmitt y Breinig, 2002).
108
Las levaduras killer segregan una toxina proteica o glicoproteica de bajo peso
molecular que mata a levaduras sensibles del mismo género o de un género rela-
cionado, siendo ellas inmunes a su propia toxina. Las levaduras pueden ser neu-
tras con respecto a una toxina killer, cuando no producen la toxina pero son
inmunes a ella.
Las toxinas de S. cerevisiae pueden ser de tres tipos: K1, K2 y K28. Las cepas
killer productoras de las toxinas K2 y K28 son las consideradas de importancia
enológica, debido a que estas toxinas presentan pH óptimos de actividad muy
bajos (pH 2,8-3,8), por lo que las condiciones ácidas de los mostos favoreceren
su actividad (Pretorius, 2000). El fenotipo killer puede ser codificado por ele-
mentos genéticos extracromosómicos, como moléculas de ARNds encapsuladas
en partículas víricas (VLPs) (Pretorius, 2000) presentes en el citoplasma. Dos
tipos de ARNds, con diferentes tamaños moleculares y funciones, son responsa-
bles del fenotipo killer en S. cerevisiae: a) el L-ARNds (4,6 kb) que codifica para
una ARN polimerasa y para la proteína mayoritaria de la cápsida de la partícula
vírica y b) el M-ARNds (1,6-1,8 kb) que codifica para la toxina y confiere inmu-
nidad (Schmitt y Breinig, 2002). Las cepas sensibles a las toxinas killer tienen
receptores específicos en la pared celular. En el caso de las toxinas K1 y K2, este
receptor ha sido identificado como un β-1,6-D-glucano, mientras que el receptor
para la K28 es una α-1,3-manoproteína de elevado peso molecular.
En cuanto a las implicaciones tecnológicas del fenómeno killer, hay que des-
tacar que no existe consenso sobre su importancia en fermentaciones espontáne-
as. En vinificación se ha indicado, en casos esporádicos, que las cepas killer pue-
den provocar fermentaciones incompletas o muy lentas (Pretorius, 2000). Sin
embargo, la repercusión del efecto killer depende de muchos factores: relación
cuantitativa entre cepas sensibles y killer, presencia de levaduras neutras y de
sustancias adsorbentes de proteínas, fase de crecimiento de las células sensibles,
tamaño del inóculo y las condiciones ambientales (pH, temperatura, cantidad de
SO2) (Pérez y col., 2001), por lo que en los últimos años se ha restado impor-
tancia al fenómeno killer. La incidencia en sidrería fue examinada por Cabranes
y col. (1997), no detectándose ninguna cepa killer. Sin embargo, recientemente,
Pando Bedriñana (2010) detectó la presencia de actividad killer en un pequeño
porcentaje de cepas S. cerevisiae aisladas en mostos de manzana en diferentes
fases de fermentación.
Reproducción y ciclo biológico de las levaduras

Multiplicación vegetativa o asexual. En condiciones nutritivas adecuadas, las
levaduras pueden reproducirse asexualmente por gemación o fisión. La gema-
ción (figura 3) constituye la forma más común de crecimiento vegetativo y
muchas levaduras presentan una gemación multipolar, incluida S. cerevisiae. En
el caso de levaduras apiculadas (Kloeckera, Hanseniaspora, Saccharomycodes)
la gemación es bipolar.
109
Separación de Célula madre

División
los cromosomas
nuclear
Citocinesis
M
Célula hija
G2
G1
Crecimiento
S Inicio

Figura 3.–Ciclo celular y
gemación en S. cerevisiae
Replicación
del ADN
Aparición
de la yema
En el proceso de gemación la yema, es decir la futura célula hija, puede for-

marse en cualquier punto de la superficie celular de la célula madre, salvo en
aquellos puntos donde ya haya ocurrido un suceso de gemación previamente
(figura 4). La gemación se inicia cuando la célula madre alcanza un tamaño celu-
lar crítico, momento que coincide con el inicio de la duplicación del ADN. A ello
le sigue un debilitamiento de la pared celular en la zona donde se formará la
yema, hacia la que se moviliza una parte del citoplasma, quedando recubierta de
nuevo material de pared celular. La quitina forma un anillo en la zona de unión
entre la célula madre y la yema emergente. Una vez que se completa la mitosis
y el núcleo y otros orgánulos han migrado hasta la yema comienza la citocinesis,
formándose un septo entre célula madre e hija. Después de la separación celular,
el anillo de quitina será retenido en la superficie celular, formando las cicatrices
de gemación y de nacimiento en las células madre e hija, respectivamente.
Reproducción sexual. Algunas levaduras poseen reproducción sexual por
conjugación, en la que se fusionan dos células de distinto signo. La célula resul-
tante es un zigoto verdadero y de él emergen esporas sexuales por reducción
meiótica.
S. cerevisiae forma tres tipos de células, las haploides a y α y las diploides
α. Las células haploides a y α tienen la capacidad de conjugarse, para dar lugar
a/α
a una célula diploide a/α (figura 5). Cada tipo celular haploide secreta un factor
de apareamiento diferente, una pequeña feromona peptídica, y expresa un recep-
tor de superficie celular que reconoce la feromona secretada por las células del
otro tipo.
Una célula diploide a/α, en condiciones nutricionales limitantes (deficiencia
de nitrógeno), experimenta un proceso de meoisis que genera cuatro ascosporas
110

Figura 4.–Células de
Saccharomyces con
cicatrices de gemación.
(Gil Ponce, 2001;
Feldmann, 2005)

Figura 5.–Representación
esquemática del ciclo
de vida de levaduras
homotálicas y heterotálicas
(Pretorius, 2000)
haploides encapsuladas dentro del asca. Cuando éstas son liberadas y las condi-
ciones son favorables, las ascosporas germinan e inician un ciclo vegetativo
haploide. Las cepas que se mantienen estables durante muchas generaciones
como haploides se denominan heterotálicas. Para volver al estado diploide nece-
sitan conjugarse con una célula de signo sexual distinto. En las cepas homotáli-
cas, sin embargo, algunas células haploides pueden cambiar de signo sexual y
conjugarse con otra célula de tipo opuesto. Se formará finalmente una célula
diploide y homocigota para todos los genes, excepto para el locus MAT (respon-
sable del fenotipo sexual a o α). Se ha indicado que la mayor parte de las leva-
duras vínicas son homotálicas (Aranda y col., 2005).
111
Aislamiento, cuantificación e identificación de levaduras

Para el aislamiento y enumeración del conjunto de las levaduras se pueden
utilizar varios medios de cultivo: agar-mosto de manzana, suplementado con
extracto de levadura (AJYE), agar-malta o YEPD-agar (extracto de levadura-
peptona-glucosa). Se deben añadir antibióticos para inhibir el crecimiento de
bacterias acéticas y lácticas. Estos medios no son selectivos y permiten el creci-
miento de todas las levaduras presentes en mostos y sidras.
Se pueden utilizar, también, medios selectivos como el agar lisina, que per-
mite cuantificar las poblaciones de levaduras no-Saccharomyces, debido a que
las cepas de Saccharomyces son incapaces de utilizar la lisina como fuente de
nitrógeno. Otro medio diferencial es el agar WLN (Wallerstein Laboratory
Nutrient), suplementado con diferentes reactivos, el cual permite el aislamiento
y la identificación presuntiva de las poblaciones de Metschnikowia pulcherrima,
Hanseniaspora/kloeckera, Brettanomyces/Dekkera y S. cerevisiae; este medio ha
sido utilizado en el control microbiológico de sidras irlandesas (Morrissey y col.,
2004). Recientemente, se han desarrollados métodos de PCR (Polymerase Chain
Reaction) a tiempo real para la cuantificación de las poblaciones totales o de
diferentes grupos de levaduras vínicas (Phister y Mills, 2003; Martorell y col.,
2005; Andorra y col., 2008).
Métodos de identificación y caracterización de levaduras. Para la clasifica-
ción taxonómica de las levaduras se han utilizado métodos basados en caracte-
rísticas fenotípicas, como la forma celular, la fermentación y asimilación de dife-
rentes azúcares, la utilización de sustancias nitrogenadas y la resistencia a la
cicloheximida, entre otras. Sin embargo, estas características pueden verse
influenciadas por las condiciones de cultivo y conducir a una identificación inco-
rrecta.
Durante los últimos 20 años se han utilizado técnicas de biología molecular
que se basan en el análisis del genoma de las levaduras. Con estos métodos de
identificación se pueden obtener resultados de forma más rápida, tienen un gran
poder discriminante y, al no depender del estado fisiológico de las levaduras,
resultan más reproducibles. Una revisión de los métodos moleculares más utili-
zados para la identificación y caracterización molecular de levaduras en alimen-
tos y bebidas puede encontrarse en Fernández-Espinar y col. (2006).
Estas técnicas moleculares pueden utilizarse para la identificación de especies
y realizar, con ello, estudios de biodiversidad en los procesos de fermentación.
También, se emplean para la diferenciación y caracterización de cepas silvestres
o comerciales de Saccharomyces con diferentes objetivos: analizar la diversidad
intraespecífica de cepas durante el proceso de fermentación, realizar un control
de calidad de levaduras comerciales o hacer un seguimiento de su implantación
en bodega, entre otras aplicaciones. A continuación, se describen algunas de las
metodologías más utilizadas para la identificación y caracterización de levaduras
en enología.
112
Métodos moleculares de identificación a nivel de especie
1) Análisis de genes ribosómicos

Los genes ribosomales 5.8S, 18S y 26S (figura 2), así como las regiones espa-
ciadoras ITS y NTS, representan poderosas herramientas para el establecimien-
to de relaciones filogenéticas y la identificación de especies, debido a la existen-
cia de regiones conservadas en las mismas, así como por su evolución concerta-
da. Esto significa que la similitud entre las unidades de transcripción repetidas es
mayor dentro de especies que entre especies diferentes, debido a modificaciones
genéticas por entrecruzamiento desigual o conversión génica (Fernández-
Espinar y col., 2006). A partir del análisis de estas regiones se han desarrollado
varios métodos para la identificación a nivel de especie:
1.1) Secuenciación de genes ribosomales.
Este método se basa en la amplificación por PCR de las secuencias nucleotí-
dicas de ciertas regiones del ADNr y la secuenciación posterior del producto de
amplificación. La secuencia obtenida para la levadura desconocida se compara
con las secuencias de ADN almacenadas en bases de datos accesibles por
Internet. Una de las regiones más utilizada es la correspondiente a los dominios
específicos de especie D1/D2 en el extremo 5´ del gen ADNr 26S (Kurtzman y
Robnett, 1988).
1.2) Amplificación y análisis de restricción de regiones ribosomales (PCR-RFLP).
La amplificación por PCR de regiones concretas del ADNr y el posterior aná-
lisis de restricción de los amplificados, es un método más transferible a la indus-
tria por ser más rápido y económico. Aunque lo habitual es utilizar como molde
para la amplificación el ADN extraído de la levadura, también se puede emplear
directamente una pequeña cantidad de colonia aislada. En este caso, se añade un
paso previo en el protocolo de amplificación (15 min, a 95º C) con el objeto de
liberar a la mezcla de reacción el ADN de la colonia (Fernández-Espinar y col.,
2006). Posteriormente, el producto de amplificación se digiere con ciertas enzi-
mas de restricción, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño que son sepa-
rados mediante electroforesis en gel de agarosa. Las levaduras en estudio se
identifican comparando los tamaños del producto de amplificación y sus frag-
mentos de restricción con los obtenidos para especies control. Esta técnica se ha
aplicado al estudio de las poblaciones de levaduras en mostos y sidras, utilizan-
do como región ribosomal a amplificar la correspondiente al gen 5.8S y las
regiones intergénicas adyacentes ITS1 e ITS2 (Morrissey y col., 2004; Coton y
col., 2006a; Suárez Valles y col., 2007a).
2) PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis).

En la actualidad, el análisis PCR-DGGE está siendo utilizado para estudios
ecológicos de comunidades microbianas. La PCR-DGGE permite la separación
de productos amplificados del mismo tamaño pero de diferentes secuencias. Los
113
productos de amplificación son sometidos a un gradiente lineal de agentes des-

naturalizantes de ADN (una mezcla de urea y formamida). Los fragmentos del
mismo tamaño, pero con secuencias distintas, se comportarán de forma diferen-
te en la electroforesis, lo que permitirá su separación. Para resolver mezclas
microbianas complejas, se deben utilizar cebadores específicos que amplifiquen
regiones de un gen que permitan la discriminación entre especies. Para la identi-
ficación de levaduras se utilizan, actualmente, los dominios D1/D2 del gen
ADNr 26S (Renouf y col., 2007).
3) PCR a tiempo real (qPCR)

A diferencia de una PCR convencional, la PCR a tiempo real se basa en la
detección y cuantificación de amplicones a medida que transcurren los ciclos de
amplificación, gracias a la señal producida por un donador fluorescente. Esta
señal aumenta en proporción directa a la cantidad del producto de la reacción y
es captada por un detector de fluorescencia acoplado al termociclador. Frente a
una PCR convencional presenta varias ventajas. Así, por ejemplo, con esta téc-
nica no sólo se identifica sino que, también, se pueden cuantificar poblaciones,
siendo el ensayo muy rápido debido a que no es necesaria la electroforesis pos-
terior. Su aplicación en enología es reciente y se ha utilizado para la identifica-
ción y cuantificación de la población de S. cerevisiae (Martorell y col., 2005), la
detección y cuantificación de la levadura alterante Dekkera bruxellensis (Phister
y Mills, 2003) o la cuantificación de las poblaciones totales de levaduras así
como de los géneros Saccharomyces y Hanseniaspora (Andorra y col., 2008).
Métodos moleculares para la diferenciación de cepas
1) Cariotipado mediante electroforesis de cromosomas en campo pulsante (PFGE)

El análisis de polimorfismos en la longitud de los cromosomas constituye una
herramienta de gran utilidad para diferenciar cepas de Saccharomyces. Mediante
la electroforesis en campo pulsante se separan los cromosomas, obteniéndose un
cariotipo característico de cada cepa. La PFGE se basa en aplicar cambios perió-
dicos de la orientación del campo eléctrico, lo que permite la separación de
moléculas de gran tamaño, como el ADN cromosómico. Esta técnica ha sido
aplicada por numerosos autores en la diferenciación de cepas vínicas de S. cere-
visiae (Fernández-Espinar y col., 2005) y en sidras francesas para la identifica-
ción de varias cepas de S. bayanus var. uvarum (Naumov y col., 2001).
2) Análisis de restricción del ADN mitocondrial (ADNmt-RFLP).

Este método se viene utilizando desde los años 80 para la diferenciación de
cepas de Saccharomyces. Posteriormente, Querol y col. (1992) perfeccionaron
esta técnica de forma que no es necesaria la purificación previa del ADNmt.
Se basa en utilizar enzimas de restricción con un elevado número de dianas
de reconocimiento en el ADN nuclear, pero no en el ADNmt. El ADN nuclear
114
experimenta una sobredigestión, rompiéndose en fragmentos de pequeño tama-

ño que no pueden detectarse en el gel. Sin embargo, se pueden visualizar clara-
mente las bandas correspondientes al ADNmt, superpuestas a la sombra de
degradación del ADN nuclear, de tal forma que se obtiene un patrón de bandas
característico para cada cepa. Posteriomente, López y col. (2001) introdujeron
ligeras variantes que permiten tener resultados en 25 h. Esta técnica es rápida,
económica y no requiere material sofisticado ni personal muy especializado. En
el campo de la enología, se ha utilizado para analizar la diversidad genética de
cepas de Saccharomyces en la fermentación espontánea de dos mostos de man-
zana en Asturias (Suárez Valles y col., 2007b).
3) Métodos basados en la PCR

3.1) Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD).
Este método está basado en el uso de cebadores no específicos, constituidos
por pocos nucleótidos (no superan los 10), que se unirán en múltiples sitios del
genoma, empleándose condiciones de amplificación relajadas (bajas temperatu-
ras de anillamiento). De este modo, se amplifican al azar fragmentos polimórfi-
cos de ADN que se visualizan por electroforesis. Esta técnica tiene el inconve-
niente de que, para asegurar su reproducibilidad, debe ser repetida varias veces
e incluso puede ser necesario el uso de varios cebadores, lo que anula su aplica-
ción rutinaria a nivel industrial (Fernández-Espinar y col., 2005).
3.2) Amplificación y caracterización de secuencias δ por PCR.
Las secuencias δ son elementos de 0,3 kb, asociadas o no a los retrotranspo-
sones Ty. La localización y número de estos elementos tiene una variabilidad
intraespecífica, que se aprovecha para caracterizar cepas de S. cerevisiae. Estas
secuencias son amplificadas por PCR mediante cebadores específicos y los pro-
ductos de amplificación se visualizan por electroforesis. Se obtienen patrones de
amplificación específicos de cada cepa o grupo de cepas. Esta técnica es econó-
mica y rápida, pero su reproducibilidad es muy dependiente de la cantidad de
ADN molde y de la temperatura de anillamiento (Fernández-Espinar y col.,
2006).
Microbiota de levaduras en mostos de manzana y sidra

En la elaboración de la sidra natural la fermentación espontánea tiene lugar
con intervención de la microbiota indígena. Este modo de elaboración todavía
está en uso en Francia, España e Irlanda (Michel y col., 1988; Dueñas y col.,
1994; Morrissey y col., 2004; Suárez Valles y col., 2007a) y durante el desarro-
llo del proceso de elaboración intervienen estirpes de levaduras procedentes de
la manzana así como del equipamiento de bodega (Beech, 1993).
La figura 6 recoge la evolución de la microbiota en la elaboración de la sidra
natural. Los niveles iniciales de levaduras en los mostos suelen ser elevados, con
115
rangos que oscilan desde 105 a

107 UFC/mL (Cabranes y col.,
1991; Dueñas y col., 1994) y
que dependen fundamentalmen-
te del estado sanitario de la man-
zana y del tipo y la duración del
prensado. Estas poblaciones ini-
ciales se incrementan durante
los primeros días de fermenta-
ción, alcanzándose habitualmen-
te poblaciones superiores a 107
UFC/mL durante la fermenta-
ción tumultuosa. Posteriormen-
te, se detecta una fase estaciona-
ria en la que estos niveles se
mantienen y cuya duración va
Figura 6.–Perfil habitual de la evolución de la microbiota
durante el proceso de elaboración de la sidra natural en a depender de varios factores, co-
Asturias y País Vasco mo el antagonismo ejercido por
las bacterias lácticas, la acumula-
ción de ácidos grasos de cadena media o el agotamiento de los esteroles celula-
res. Tras la fermentación alcohólica se observa una larga fase de declive, en la
que el número de células viables desciende progresivamente hasta alcanzar,
durante el periodo de almacenamiento, niveles de 101-103 UFC/mL. El perfil de
la fermentación variará en función del tratamiento aplicado al mosto, como la
clarificación prefermentiva (es el caso de las sidras francesas) o la adición de
dióxido de azufre.
En cuanto a la microbiota encontrada en la manzana madura, hay que desta-
car la presencia de Rhodotorula, Candida, Metschnikowia pulcherrima y
Kloeckera/Hanseniaspora. Las especies de Saccharomyces y otras levaduras
esporulantes se encuentran raramente en la manzana (Beech, 1972). El número y
diversidad de levaduras se incrementa en cada etapa de la recogida, transporte y
almacenamiento de la manzana, especialmente de K. apiculata.
Con respecto a las levaduras implicadas en la fermentación alcohólica y su
dinámica de poblaciones, se observa una gran similitud entre los procesos de fer-
mentación de sidras y vinos (Morrissey y col., 2004). Durante las etapas inicia-
les de la fermentación alcohólica se desarrollan principalmente especies no-
Saccharomyces, siendo mayoritarias las levaduras apiculadas del tipo
Hanseniaspora/Kloeckera, que se caracterizan por un bajo poder fermentativo y
poca tolerancia al etanol. Posteriormente, durante la fase más activa de la fer-
mentación, se imponen las levaduras del género Saccharomyces que tienen, en
general, una gran capacidad fermentativa (Cabranes y col., 1990; Le Quéré y
Drilleau, 1993; Dueñas y col., 1994; Suárez Valles y col., 2007a). En sidra irlan-
desa se ha descrito un predominio de cepas de Brettanomyces/Dekkera en la fase
de maduración (Morrissey y col., 2004).
116
La diversidad de la microbiota acompañante (figura 7) de-pende de factores

como la localización geográfica, las variedades de manzana y su estado sanitario
o la tecnología de elaboración (tipo de prensado, temperatura de fermentación).
En los mostos se aislan, también, levaduras de metabolismo oxidativo o ligera-
mente fermentativo como M. pulcherrima, diversas especies del género Pichia
(P. fermentans, P. guilliermondii, P. anomala), Candida (C. stellata, C. tropicalis),
Rhodotorula, Lachancea cidri o Saccharomycodes ludwigii, entre otras (Dueñas
y col., 1994; Coton y col., 2006a;
Suárez Valles y col., 2007a).
Con respecto a las levaduras
del género Saccharomyces, con-
viene destacar que se identifica-
ron diferentes variedades de S.
cerevisiae (bayanus y uvarum)
mediante métodos clásicos de
caracterización fenotípica. En
estudios recientes y teniendo en
cuenta la taxonomía molecular,
hay que resaltar que los aislados
pertenecientes a Saccharomyces
se han identificando como S. ce-
revisiae y S. bayanus (Morrissey
y col., 2004; Coton y col., 2006a;
Suárez valles y col., 2007a). En Figura 7.–Morfología de algunas especies de levaduras
las sidras asturianas se ha des- presentes en la elaboración de la sidra
crito la evolución de las especies
de Saccharomyces durante la fermentación, predominando S. bayanus en etapas
tempranas de este proceso, mientras que S. cerevisiae es la especie más abundante
al final de ésta (Suárez Valles y col., 2007a). En la tabla 1 se muestra la diversi-
dad de especies encontradas en las sidras de diferentes zonas de producción.
Por otra parte y al igual que en la elaboración de vinos, se ha puesto recien-
temente de manifiesto que durante la fermentación alcohólica de la sidra se suce-
den diferentes cepas de S. bayanus o S. cerevisiae (Suárez Valles y col., 2007b),
siendo, además, el número de éstas superior al que habitualmente se encuentra
en vinificación. Ello es indicativo del alto grado de polimorfismo dentro de las
poblaciones de Saccharomyces que fermentan los mostos de manzana. Esta
mayor diversidad intraespecífica ha sido explicada como consecuencia de que no
se inoculan los mostos de manzana con levaduras secas activas. Su uso podría
provocar que la levadura comercial colonice el lagar, reduciendo así la diversi-
dad de cepas de Saccharomyces. Por otra parte, la existencia de cepas con feno-
tipo killer reduce la variabilidad de las poblaciones naturales, pero en Asturias
este tipo de levaduras no es frecuente. Algunas de las cepas fueron encontradas
en años sucesivos de estudio, lo que sugiere un “efecto bodega”, es decir, la
retención de cepas específicas en el lagar de año en año.
117
Tabla 1.–Microbiota de levaduras en mostos de manzana y sidras
Tipo de Método de
Origen Diversidad de la microbiota* Referencia
estudio identificación
Asturias Dinámica H. valbyensis P. guilliermondii PCR-RFLP Suárez

poblacional H. uvarum S. bayanus (5.8S-ITS) Valles y
según prensa H. osmophila S. cerevisiae col., 2007a
tradicional o M. pulcherrima
pneumática
Asturias Caracterización Gran diversidad intraespecífica de las cepas de ADNmt-RFLP Suárez

de cepas de Saccharomyces. Valles y
S. bayanus y col., 2007b
S. cerevisiae
Francia Identificación S. bayanus P. misumaiensis PCR-RFLP Coton y

de cepas en S. cerevisiae P. nakasei (5.8S-ITS) col., 2006a
sidras no L. cidri C. stellata
pasteurizadas y D. anomala C. tropicalis
mostos H. valbyensis C. oleophila
H. uvarum C. sake
M. pulcherrima K. marxianus
P. delftensis
Irlanda Microbiota S. cerevisiae P. anomala PCR-RFLP Morrissey y

asociada a la B. anomala P. guilliermondii (5.8S-ITS) col., 2004
sidrería y H. uvarum K. marxianus
evolución de las M. pulcherrima Sacch. ludwigii
poblaciones P. fermentans D. polymorphus
predominantes
País Vasco Dinámica K. apiculata H. valbyensis Caracterización Dueñas y

poblacional S. cerevisiae C. pulcherrima fernotípica col., 1994
Z. cidri P. membranaefaciens
Z. Florentinus C. Vini
R. Rubra
T. delbrueckii
Asturias Dinámica K. apiculata C. variovaarai Caracterización Cabranes y

poblacional S. cerevisiae C. vini fernotípica col., 1990
según diferentes Pichia ohmeri B. naardenensis
tecnologías de S. kluyveri P. membranaefaciens
elaboración C. stellata
* Las especies indicadas en negrita constituyen la micribota predominante.
Tradicionalmente, las especies S. cerevisiae y S. bayanus, dentro del denomi-

nado complejo Saccharomyces sensu stricto, son consideradas como las más
importantes del proceso fermentativo. Se han encontrado, también, especies
híbridas resultantes del cruce entre especies diferentes de Saccharomyces (S.
cerevisiae x S. bayanus; S. bayanus x S. uvarum). La presencia de híbridos inte-
respecíficos ha sido, también, puesta de manifiesto en las sidras. Así, se ha des-
crito una cepa híbrida CID1, aislada de sidra francesa, siendo sus cepas parenta-
les S. kudriavzevii, S. cerevisiae y S. uvarum (Groth y col., 1999).
118
Factores que afectan al crecimiento de las levaduras

Son numerosos los factores que pueden incidir sobre el número y diversidad
de levaduras presentes en los mostos de manzana y la sidra. Entre éstos se
encuentran: las variedades de manzana, su estado sanitario y el proceso pre-
fermentativo (factores que influyen en la composición del mosto), la tecnología
de fermentación y la interacción entre diferentes especies de levaduras o entre
levaduras y bacterias. La influencia de estos factores en sidrería ha sido poco
estudiada; a continuación, se indican algunos de los factores examinados.
Composición de los mostos. La composición química de los mostos afecta a
la velocidad de la fermentación alcohólica. Entre las variables que influyen sobre
el crecimiento de las levaduras se encuentran: la concentración de azúcares, las
sustancias nitrogenadas y vitaminas, el contenido de oxígeno disuelto y la pre-
sencia de residuos de pesticidas, entre otras.
Se ha indicado que concentraciones muy elevadas de azúcares, del orden de
250-300 g/L, resultan inhibitorias, por estrés osmótico, para el crecimiento de las
levaduras (Aranda y col., 2005). Sin embargo, estas concentraciones de azúcares
no son encontradas en los mostos de manzana. De mayor importancia en sidre-
ría será, sin duda, el contenido en nitrógeno, que resulta necesario para el creci-
miento de las levaduras. Éstas asimilan el catión amonio de las sales amoniaca-
les y lo utilizan para la síntesis de aminoácidos. También, pueden metabolizar los
aminoácidos libres, presentes en los mostos de manzana o aquéllos liberados de
péptidos y proteínas, ya que algunas cepas de especies no-Saccharomyces secre-
tan proteasas (Schuller y Casal, 2005). Con respecto a las vitaminas, hay que
destacar que estas moléculas actúan como factores de crecimiento de las levadu-
ras (Ribéreau-Gayon y col., 2003). En general, éstas pueden sintetizar sus pro-
pias vitaminas, aunque su presencia en los mostos de manzana estimulará, sin
duda, su crecimiento.
La producción de etanol por S. cerevisiae es uno de los principales factores
que incide sobre el crecimiento de especies no-Saccharomyces durante la fer-
mentación. Generalmente, las especies de Hanseniaspora/Kloeckera, Candida,
Metschnikowia y Pichia, encontradas en el mosto de manzana, no toleran con-
centraciones de etanol elevadas (5-7%) y, por ello, sus poblaciones disminuyen
o desaparecen durante la fermentación alcohólica. Sin embargo, se ha compro-
bado que la sensibilidad al etanol disminuye con la temperatura y, por ello, la
contribución de estas especies será mayor cuando la temperatura de fermenta-
ción es inferior a 15-20º C (Fleet, 2003).
Otros compuestos producidos por la actividad de las levaduras durante la
fermentación alcohólica son los ácidos grasos de cadena corta y media (áci-
dos hexanoico, octanoico y decanoico), que pueden resultar inhibitorios para
S. cerevisiae y probablemente para otras especies, dependiendo de su concen-
tración.
119
, S. cerevisiae (cultivo puro); K. apiculata (cultivo puro);

, S. cerevisiae (cultivo mixto); K. apiculata (cultivo mixto).
Figura 8.–Dinámica de las poblaciones de K. apiculata y S. cerevisiae a 10 y 25º C
Tecnología de elaboración
Temperatura. La temperatura es uno de los principales factores que afectan a
la velocidad de la fermentación alcohólica, existiendo una relación directa entre
ambos. S. cerevisiae tiene una temperatura óptima de crecimiento próxima a 30º
C, pero se adapta a un rango amplio de temperaturas. La temperatura máxima
que puede soportar está próxima a los 40º C, detectándose pérdida de viabilidad
cuando se alcanza esta temperatura.
Por otra parte, la temperatura de fermentación puede condicionar la dinámi-
ca de las poblaciones de levaduras. Se considera, en general, que las temperatu-
ras bajas (por debajo de 20º C) aumentan substancialmente la contribución de
levaduras no-Saccharomyces. Este comportamiento ha sido también observado
en experiencias realizadas con cepas de K. apiculata y S. cerevisiae, inoculadas
en mostos de manzana (Cabranes y col., 1996; Bilbao y col., 1997). En la figu-
ra 8 se muestran las diferencias de comportamiento de K. apiculata a distintas
temperaturas. La prolongada supervivencia de esta especie se explica por su
mayor tolerancia al etanol a bajas temperaturas.
Prensado de la manzana. El tipo de prensa puede influir en los recuentos tota-
les de levaduras y en la diversidad de especies presentes en los mostos. Suárez y
col. (2007a) han encontrado que en los mostos obtenidos mediante prensa neu-
mática dominan especies de levaduras no-Saccharomyces (Hanseniaspora y M.
pulcherrima), mientras que en los producidos con prensa tradicional se aislan,
también, cepas de Sacharomyces junto con no-Saccharomyces.
Clarificación de los mostos. La despectinización de los mostos promueve una
ralentización de la fermentación alcohólica, que se justifica por el empobre-
cimiento en compuestos nitrogenados. Así, el tratamiento despectinizante con
pectinmetilesterasas constituye un método de clarificación prefermentativa, que
120
se emplea en Francia con la finalidad de reducir las poblaciones de levaduras y

ralentizar la velocidad de la fermentación alcohólica (Nogueira y col., 2008).
Sulfitado. El sulfitado ejerce una acción diferencial sobre las poblaciones de
levaduras, si bien esta actividad va a depender de la concentración empleada, del
pH del mosto y de la presencia de compuestos que se unen al SO2. Se considera,
en general, que las poblaciones de levaduras no-Saccharomyces son más sensi-
bles a la acción inhibitoria de este compuesto y esta característica se ha puesto
en evidencia, también, en ensayos realizados con mostos de manzana (Cabranes
y col., 1997; Dueñas y col., 2002).
BACTERIAS LÁCTICAS
Introducción
Las bacterias presentes en los mostos de manzana y la sidra son acidófilas,
capaces de crecer en el ambiente ácido de la sidra, con valores de pH que osci-
lan entre 3,3 y 4,0. Además, deben de tolerar la presencia etanol y altas concen-
traciones de azúcar. Estas condiciones permiten el crecimiento de bacterias lác-
ticas, acéticas y Zymomonas (Beech y Carr, 1977).
Bajo el nombre de bacterias lácticas (LAB) se engloba un conjunto de micro-
organismos de una gran diversidad tanto morfológica como fisiológica. Son bac-
terias Gram-positivas, en forma de cocos, bacilos o coco-bacilos, inmóviles, no
esporuladas, anaerobias aerotolerantes, catalasa negativas y desprovistas de cito-
cromos. En consecuencia, presentan un metabolismo estrictamente fermentativo,
sintetizando ácido láctico como principal producto de la fermentación de los car-
bohidratos (Axelsson, 2004). Son microorganismos nutricionalmente exigentes
por lo que requieren una gran cantidad de factores nutritivos, como aminoácidos,
bases nitrogenadas y vitaminas.
La importancia de las bacterias lácticas en la elaboración de la sidra y otras
bebidas alcohólicas es doble, por una parte, ejercen un efecto beneficioso pues-
to que son las responsables de la fermentación maloláctica (Cabranes y col.,
1991; Dueñas y col., 1994) y, por otro lado, pueden tener consecuencias negati-
vas debido a su capacidad para ocasionar alteraciones que disminuyen la calidad
de la bebida, tales como la acetificación (Dueñas y col., 1994) y la producción
de amargor (Garai-Ibabe y col., 2008), aminas biógenas y exopolisacáridos
(Dueñas y col., 1995).
En la elaboración de la sidra natural la fermentación maloláctica (FML) se
lleva a cabo con la microbiota indígena, aunque en los últimos años se han rea-
lizado diversas experiencias con el fin de desarrollar cultivos iniciadores malo-
lácticos, constituidos fundamentalmente por cepas de Oenococcus oeni. Esta tec-
nología permite controlar y seleccionar la cepa responsable de la FML y reducir
el riesgo de alteración por bacterias lácticas. Para inducir esta transformación en
121
los mostos de manzana, se han descrito diferentes sistemas que utilizan: células
libres e inmovilizadas o biorreactores de membrana. Se ha estudiado, también, el
momento más conveniente para la inoculación de la bacteria maloláctica, simul-
táneamente con la adición de la levadura S. cerevisiae o después de la fermenta-
ción alcohólica (Cabranes y col., 1998; Herrero y col., 1999; Zhang y Lovitt,
2006).
Las principales características que nos permiten diferenciar las bacterias lác-
ticas de las acéticas se describen en la tabla 2.
Tabla 2.–Diferenciación entre bacterias acéticas y lácticas
Bacterias acéticas Bacterias lácticas
Tinción Gram Negativa Positiva

Prueba de catalasa Positiva Negativa
Motilidad Móvil o inmóvil Inmóvil
Requerimiento de oxígeno Aerobios obligados Aerobios o anaerobios
Producción de acético a partir de etanol Sí No
Metabolismo de azúcares Ruta de las pentosas fosfato Homo o heterofermentativo
Contenido Guanina+Citosina (mol%) >50 <50
Aislamiento, cuantificación e identificación

Para el aislamiento y cuantificación de las bacterias lácticas de los mostos de
manzana y la sidra, se realiza una siembra en superficie sobre placas de agar
MRS (Man, Rogosa y Sharpe) con un 20% de jugo de tomate o en agar mosto de
manzana suplementado con extracto de levadura (AJYC). El crecimiento de
mohos y levaduras es inhibido por la adición al medio de cultivo de un 1% (v/v)
de una solución de pimaricina al 0,5% (v/v). Las placas son incubadas a 28º C
durante 7-10 días en anaerobiosis o en atmósfera enriquecida en CO2. Después
del aislamiento y purificación de las cepas aisladas, éstas se consideran bacterias
lácticas si son Gram-positivas y catalasa negativas.
La cuantificación de los microorganismos mediante recuento en placa, a pesar
de ser un método económico, tiene el inconveniente de ser muy laborioso y lento,
ya que se necesitan varios días para la aparición de las colonias. En los últimos
años, se han desarrollado técnicas independientes de cultivo que permiten la
identificación y cuantificación directa de microorganismos, sin necesidad del
cultivo en placa. También, es posible diferenciar entre: microorganismos culti-
vables, viables pero no cultivables (VBNC, mantienen su actividad metabólica
pero no pueden reproducirse y formar colonias) y no viables. Para la cuantifica-
ción directa de bacterias lácticas totales (viables y no viables), se pueden utilizar
técnicas de tinción fluorescente como la epifluorescencia directa (Millet y
122
Lonvaud-Funel, 2000) y la citometría de flujo (Herrero y col., 2006). Asimismo,

se ha desarrollado un método de PCR a tiempo real que utiliza cebadores espe-
cíficos basados en el gen ADNr 16S (Neeley y col., 2005).
En cuanto a la identificación de las bacterias lácticas, hay que señalar que,
en la actualidad, se lleva a cabo por métodos clásicos, basados en sus caracte-
rísticas fenotípicas y por técnicas de biología molecular, habiéndose aislado en
mostos de manzana y sidra bacterias lácticas pertenecientes a los géneros Lacto-
bacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus.
Métodos basados en características fenotípicas. Los métodos clásicos inclu-
yen, en primer lugar, la observación microscópica de la morfología celular de las
bacterias y la producción de gas a partir de la fermentación de la glucosa (carác-
ter homo o heterofermentativo). Los géneros Leuconostoc/Oenococcus presen-
tan una morfología celular en forma de coco-bacilos o cocos dispuestos en pares
o cadenas y producen CO2 a partir de la glucosa (heterofermentativos). El géne-
ro Pediococcus está constituido por cocos dispuestos en tétradas o parejas que no
producen gas (homofermentativos) y las bacterias del género Lactobacillus son
bacilos que pueden o no producir gas a partir de la glucosa (figura 9).
Además, se realizan las siguientes pruebas: producción de amonio a partir de
arginina, determinación de la naturaleza del isómero del ácido láctico obtenido a
partir de la glucosa y del patrón de fermentación de los carbohidratos y diversas
pruebas fisiológicas (crecimiento a diferentes pHs y temperaturas, tolerancia al
etanol). Estos métodos convencionales siguen siendo útiles y se usan de forma
rutinaria, aunque en determinados casos dan resultados poco reproducibles y
ambiguos.
Por otra parte, conviene destacar que han sido desarrollados otros métodos
fenotípicos para la identificación de bacterias lácticas, que analizan componen-
tes celulares como los ácidos grasos totales y las proteínas. La comparación de
los perfiles proteicos obtenidos por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-
Polyacrilamide Gel Electrophoresis) ha sido utilizada para identificar LAB ais-
ladas de vinos portugueses (Couto y Hogg, 1994).
Métodos basados en características genotípicas. En los últimos años, se han
desarrollado una gran variedad de técnicas de caracterización genotípica que tie-
nen ciertas limitaciones, ya que son más costosas y requieren del equipamiento
(A) (B)

Figura 9.–Micrografía
electrónica de barrido de
Lactobacillus diolivorans (A)
y Pediococcus parvulus (B).
123
apropiado. A continuación, se indican las técnicas moleculares más utilizadas

para la identificación de bacterias lácticas en sidra y vino.
Secuenciación de genes ribosomales. Se secuencian regiones de los genes
ADNr 16S o 23S y son comparadas con las secuencias de ADN almacenadas en
las bases de datos accesibles por Internet. Mediante esta técnica, se han identifi-
cado diversas cepas de LAB productoras de exopolisacáridos e implicadas en el
ahilado (“filado”) de la sidra (Werning y col., 2006; Ibarburu y col., 2007).
Hibridación de ADN mediante sondas específicas. La sonda constituida por
el ADN de especies de referencia, marcado química o radiactivamente, se hibri-
da con el ADN de la bacteria en estudio. Esta técnica permite la identificación de
las especies que se encuentran habitualmente en la sidra y el vino, aunque no
sirve para la discriminación de aquéllas estrechamente relacionadas de lactoba-
cilos heterofermentativos, como Lactobacillus brevis y Lactobacillus hilgardii
(Claisse y Lonvaud-Funel, 2001).
Hibridación Fluorescente In Situ (FISH). Esta técnica permite la identifica-
ción y cuantificación directa de diferentes especies por microscopia de fluores-
cencia, con la ventaja de no necesitar cultivo previo de la bacteria. Se basa en el
uso de sondas específicas de ADN marcadas con un fluorocromo y homólogas al
ADNr 16S de las especies de bacterias lácticas normalmente encontradas en
vinos y sidras (Blasco y col., 2003).
PCR-Análisis de restricción (PCR-RFLP). Se han desarrollado varios méto-
dos que analizan los patrones de restricción de los productos de amplificación
que resultan de una PCR selectiva, dirigida al ADNr 16S, denominada 16S-
ARDRA (Rodas y col., 2003) o bien a una región del gen rpoB que codifica la
subunidad β de la ARN polimerasa (Claisse y col., 2007).
PCR-Electroforesis desnaturalizante en geles de gradiente (PCR-DGGE).
Esta metodología ha sido recientemente aplicada a la identificación de LAB. En
este caso, se analizan los fragmentos amplificados del gen ADNr 16S o de una
región del gen rpoB. Esta técnica permite estudiar la dinámica de las poblacio-
nes durante el proceso de elaboración (López y col., 2003) y ha sido también uti-
lizada para identificar las especies implicadas en la alteración del amargor de la
sidra, Lactobacillus collinoides y L. diolivorans (Garai-Ibabe y col., 2008).
PCR con cebadores específicos. Se pueden detectar especies concretas me-
diante el uso de cebadores específicos, como por ejemplo los dirigidos a la enzi-
ma maloláctica de O. oeni (Zapparoli y col., 1998). Además, esta especie se
puede cuantificar mediante PCR cuantitativa a tiempo real (Pinzani y col., 2004).
Esta metodología se puede utilizar, también, para la identificación simultánea de
diferentes especies de Pediococcus en una PCR múltiple, que emplea varias pare-
jas de cebadores dirigidos al gen ADNr 23S (Pfannebeckera y Fröhlich, 2008).
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Mientras las metodologías
anteriores se utilizan fundamentalmente en la identificación de especies, esta
124
técnica se ha aplicado para la diferenciación de cepas de lactobacilos (Rodas y

col., 2005; Rodríguez y col., 2007) y de O. oeni (Reguant y Bordons, 2003).
Especies presentes en la sidra y evolución durante el proceso de elaboración

La evolución de la población láctica durante el proceso de elaboración es, en
general, similar para la sidra natural del País Vasco y Asturias (Salih y col, 1990;
Cabranes y col., 1991; Dueñas y col., 1994). Los niveles de LAB de los mostos
están influidos fundamentalmente por la tecnología de prensado y el estado sani-
tario de la manzana, que a su vez vendrá determinado por el sistema de recogi-
da y cuidado durante el transporte y almacenamiento (Doores, 1983). En los
mostos es habitual la presencia de cantidades elevadas de LAB, del orden de
105-107 UFC/mL (figura 6) e incluso, en algunos casos, se ha detectado que esta
población es superior a la de levaduras. Durante la fermentación alcohólica se
produce, generalmente, un aumento de las LAB, detectándose niveles del orden de
107-108 UFC/mL al final de la misma. En este caso, no se ha observado la fase
de regresión de la población láctica que ha sido detectada en sidras francesas
(Salih y col., 1988) e inglesas (Beech, 1972) y que se atribuye a la intensa com-
petencia con las levaduras, a la sensibilidad al SO2 y al etanol. La ausencia de
esta fase de regresión se puede explicar por la falta de control del crecimiento
bacteriano mediante sulfitado y a que el efecto antagonista de las levaduras
puede no ser suficiente para limitar el desarrollo bacteriano (Dueñas y col.,
1994).
La presencia de estas elevadas poblaciones determina un rápido desarrollo de
la fermentación maloláctica que, habitualmente, discurre de forma paralela a la
fermentación alcohólica. Generalmente, los recuentos de LAB se mantienen
durante el periodo de maduración de la sidra y, dado que no se realiza una esta-
bilización microbiológica previa al embotellado, la sidra en botella presenta
niveles elevados de esta microbiota.
Este perfil puede variar debido al efecto de diferentes factores que influyen
en la supervivencia y crecimiento de la población láctica: composición química
de los mostos, técnicas de elaboración y las interacciones con otros microorga-
nismos (Wibowo y col., 1985). Entre ellos, el pH de los mostos tiene una gran
influencia sobre la viabilidad y metabolismo de las LAB y constituye un factor
que condiciona la distribución de las especies. Así, se aisla O. oeni en mayor pro-
porción en mostos con pHs bajos (próximos a 3,5) (Dueñas y col., 1994). Sin
embargo, a pHs superiores predominan las especies del género Lactobacillus.
Con respecto a la tecnología, es bien conocido que el dióxido de azufre inhi-
be el crecimiento de las LAB y su adición puede retrasar el desarrollo de la fer-
mentación maloláctica. La clarificación prefermentativa puede eliminar una
importante proporción de LAB, sobre todo si este tratamiento es muy intenso. En
las sidras, se ha puesto en evidencia que la despectinización con pectinmetiles-
terasas provoca un retraso en la fermentación maloláctica. Si este tratamiento se
125
combina con la adición de sulfuroso, la FML resulta completamente inhibi-

da, debido a que las poblaciones de LAB se mantienen muy bajas, por debajo de
104 UFC/mL (Dueñas y col., 2002).
Con respecto a la evolución cualitativa de especies de LAB, hay que señalar
que en sidras francesas (Salih y col., 1988) fueron aisladas diversas especies. En
los mostos se detectó la presencia de Leuc. oenos (actualmente Oenococcus
oeni), Leuc. mesenteroides y Pediococcus spp. y en la fermentación alcohólica
se aisló, además, L. brevis. En tres de los cuatro mostos estudiados, Leuc. oenos
predominó al final de la fermentación alcohólica y maloláctica, así como duran-
te el periodo de maduración de la sidra.
En la sidra natural del País Vasco y Asturias la población láctica predomi-
nante es heterofermentativa (tabla 3) y está constituida, fundamentalmente, por
las especies Lactobacillus brevis y Oenococcus oeni. Estas especies fueron ais-
ladas en todas las etapas del proceso de elaboración: mosto, fermentación alco-
hólica, maduración y sidra embotellada. O. oeni aparece como la especie más
abundante, al igual que en otras zonas de producción sidrera (Salih y col., 1988;
Salih y col., 1990; Laplace y col., 1998).
Además, se han aislado otros lactobacilos heterofermentativos implicados en
diversas alteraciones de la sidra. Así, en sidras alteradas con el amargor se detec-
tan cepas pertenecientes a las especies L. diolivorans y L. collinoides (Claisse y
Lonvaud-Funel, 2001; Garai-Ibabe y col., 2008). Por otra parte, en sidras ahila-
das del País Vasco se han encontrado cepas de L. diolivorans, L. collinoides y L.
suebicus (Werning y col., 2006). Al igual que en las sidras inglesas (Beech y
Carr, 1977), las especies homofermentativas constituyen una población bastante
minoritaria y están representadas por L. mali y L. plantarum. Se aislan princi-
Tabla 3.–Bacterias lácticas presentes en mostos de manzana y sidra
Género Metabolismo de azúcares Especie
Lactobacillus Homofermentativo L. mali

Heterofermentativo facultativo L. plantarum
L. brevis
Heterofermentativo L. collinoides
L. suebicus
L. diolivorans
L. hilgardii
Pediococcus Homofermentativo P. parvulus

P. damnosus
Oenococcus Heterofermentativo O. oeni
Leuconostoc Heterofermentativo Leuc. mesenteroides
126
palmente en el mosto y en las primeras etapas de la fermentación alcohólica. Las

especies del género Pediococcus, también homofermentativas, han sido rara-
mente encontradas (Salih y col., 1988, 1990; Dueñas y col., 1994) y en las sidras
vascas se han asociado con la aparición del ahilado (Fernández y col., 1996).
BACTERIAS ACÉTICAS
Introducción. La microbiota acética está constituida por un grupo de bacte-
rias acidófilas muy ubicuas en la naturaleza y que se adaptan bien a diferentes
ambientes ricos en azúcar y etanol. Las bacterias acéticas se clasifican como
organismos aerobios obligados con metabolismo respiratorio, siendo el oxígeno
el aceptor terminal de electrones. Sin embargo, pueden sobrevivir o incluso cre-
cer en condiciones de anaerobiosis o semi-aerobiosis, debido a que pueden usar
otros aceptores de electrones, como las quinonas (Bartowsky y Henschke, 2008).
Las bacterias acéticas son Gram-negativas o Gram-variables, catalasa positi-
vas y oxidasa negativas. Pueden ser móviles con flagelos polares o peritricos o
inmóviles. No forman endosporas y en cuanto a su morfología pueden ser elip-
soidales o bacilares, encontrándose aisladas, en parejas o formando cadenas.
Pueden utilizar como fuentes energéticas sustratos presentes en los mostos de
manzana o en las sidras, como glucosa, etanol, lactato o glicerol. Debido a que
muchos de estos componentes no son completamente oxidados en CO2 y H2O, se
acumulan en el medio diferentes metabolitos, especialmente ácido acético, ace-
taldehído y acetato de etilo. Ello supone un detrimento de la calidad de la sidra,
por lo que su crecimiento debe ser evitado mediante prácticas que limiten la airea-
ción de la sidra (llenado completo de las barricas o protección de la bebida con
un gas inerte).
Taxonomía, aislamiento e identificación

La taxonomía de las bacterias acéticas es compleja y ha sido revisada en los
últimos años (Yamada y Yukphan, 2008). En la actualidad, se clasifican en la
familia Acetobacteraceae y se reconocen diez géneros. Las bacterias acéticas
aisladas de la sidra fueron asignadas a los géneros Acetobacter y Gluconobacter,
teniendo en cuenta los criterios morfológicos, bioquímicos y fisiológicos (Salih
y Suárez-Díaz, 1990; Fernández y col., 1994). La principal diferencia entre estos
dos géneros es que Acetobacter es capaz de oxidar completamente el etanol hasta
CO2 y agua y, por el contrario, Gluconobacter no puede hacerlo.
El género Acetobacter fue dividido en 1984 en dos subgéneros, Acetobacter
y Gluconacetobacter, siendo este último elevado a nivel de género en 1998.
El género Gluconacetobacter se diferencia de Acetobacter, desde el punto de
vista bioquímico, por presentar la ubiquinona-10 (Q-10) frente a la ubiquinona-
9 (Q-9) que dispone Acetobacter. Por ello, las especies Acetobacter hansenii y
127
A. liquefaciens, aisladas en sidras del País Vasco y de Asturias, deberían ser rea-
signadas, actualmente, como Gluconacetobacter hansenii y Gluconacetobacter
liquefaciens (Yamada y Yukphan, 2008).
Métodos de aislamiento. Para el aislamiento y recuento de bacterias acéticas
del mosto de manzana y la sidra se utiliza, generalmente, el medio agar-mosto de
manzana suplementado con extracto de levadura (Carr y Passmore, 1979) y,
también, el medio agar diferencial Wallerstein (WL). Para inhibir el crecimiento
de levaduras y mohos se añade un 1% (v/v) de una solución de pimaricina al
0,5% y para inhibir las bacterias lácticas un 1% de penicilina G (250.000 U.I.).
Las placas se incuban a 25-28º C durante 4-8 días en condiciones de aerobiosis.
La población acética puede entrar en el estado de viable pero no cultivable al
ser sometida a determinados tipos de estrés y, por tanto, puede ser subestimada
debido a la incapacidad de crecer en los medios de cultivo. Para la cuantificación
de bacterias acéticas totales (viables y no viables) directamente del vino, se han
aplicado técnicas de tinción fluorescente como la epifluorescencia directa (Millet
y Lonvaud-Funel, 2000). Se ha desarrollado, también, un método de PCR a tiem-
po real que utiliza cebadores específicos basados en el gen ADNr 16S (González
y col., 2006b). Este método se ha aplicado para evaluar el efecto sobre la pobla-
ción acética de las prácticas enológicas más habituales, adición de SO2 e inocu-
lación de levaduras (Andorra y col., 2008).
Identificación y tipificación de bacterias acéticas. Las bacterias acéticas de la
sidra, al igual que otros microorganismos, han sido identificadas, hasta hace unos
años, a nivel de género y especie sobre la base de criterios morfológicos, fisio-
lógicos y bioquímicos (Salih y Suárez-Díaz, 1990; Fernández y col., 1994) En la
actualidad, estas características fenotípicas son complementadas o reemplazadas
por técnicas moleculares. Para la identificación a nivel de especie se puede rea-
lizar el análisis de la secuencia del gen ribosomal 16S (González y col., 2005).
Como alternativa más rápida y económica se ha utilizado, también, la técnica
PCR-RFLP del ADNr 16S (Ruiz y col., 2000) o de la región intergénica ITS
entre los genes ribosomales 16S y 23S (González y col., 2006a).
El análisis a nivel de cepa, al igual que para el tipado de levaduras o bacterias
lácticas, se puede realizar según una metodología RAPD (Bartowsky y col.,
2003). Otra alternativa consiste en el uso de PCR-ERIC (Enterobacterial
Repetitive Intergenic Consensus) y PCR-REP (Repetitive Extragenic
Palindrom). Estas técnicas se basan en la amplificación del ADN genómico com-
prendido entre secuencias repetitivas que se encuentran dispersas por el genoma
bacteriano (González y col., 2005).
Desarrollo de bacterias acéticas en el proceso de elaboración de la sidra

Las bacterias acéticas se han encontrado en la manzana de sidra, tanto en la
piel como en la pulpa y su cantidad viene determinada, al igual que el resto de
la microbiota, por el estado sanitario de la fruta, que está afectado por la recogida
128
de la manzana, el transporte al lagar y la duración del periodo de almace-

namiento. Otra fuente de contaminación procede de la maquinaria de la bodega
(trituradora y prensa), por lo que se recomienda una rigurosa limpieza de ésta. El
principal problema ocasionado por estas bacterias en los mostos es la formación
de compuestos cetónicos a partir de los azúcares, que tienen la capacidad de unir-
se al dióxido de azufre, disminuyendo así la concentración del SO2 libre y
haciendo menos efectivo el sulfitado (Whiting, 1973).
Se ha estudiado la evolución de las bacterias acéticas durante la elaboración
de la sidra natural del País Vasco. Los niveles encontrados en los mostos son ele-
vados y oscilan entre 104 y 106 UFC/mL. Estos microorganismos no proliferan
durante la fermentación alcohólica, pero pueden sobrevivir en las condiciones
de microaerofilia y empobrecimiento de nutrientes que se producen en esta
etapa. Generalmente, se observa una disminución progresiva de su concentración
durante la fermentación, encontrándose al final de ésta niveles del orden de
102 y 103 UFC/mL (figura 6) y detectándose un descenso de esta microbiota
durante la maduración de la sidra. No obstante, se pueden producir proliferaciones
indeseables si por cualquier circunstancia tiene lugar una aireación de la sidra.
En cuanto a la evolución de las distintas especies, se han encontrado resul-
tados similares en estudios realizados en sidra natural de Asturias y del País
Vasco (Salih y Suárez-Díaz, 1990; Fernández y col., 1994). Las elevadas concen-
traciones de azúcares de los mostos de manzana favorecen el predominio de
Gluconobacter oxydans en la etapa pre-fermentativa y al comienzo de la fer-
mentación alcohólica. Esta especie va disminuyendo a medida que transcurre la
fermentación debido a su intolerancia al etanol y, paralelamente, aumenta
la población de Acetobacter, detectándose únicamente este género durante el
periodo de almacenamiento de la sidra. G. oxydans metaboliza las pequeñas
cantidades de etanol producidas por las levaduras durante las primeras etapas
de la fermentación convirtiéndolo en ácido acético. Con respecto al género
Acetobacter, hay que resaltar que en sidras del País Vasco se aisló con mayor
frecuencia la especie A. aceti, seguida de A. hansenii (actualmente Gluconace-
tobacter hansenii) y A. pasterianus, encontrándose todas ellas en proporción
similar (Fernandez y col., 1994). En sidras asturianas se encontró, sin embargo,
un claro predominio de la especie A. aceti y en mucha menor proporción
A. liquefaciens (actualmente Gluconacetobacter liquefaciens) y A. pasteurianus
(Salih y Suárez-Díaz, 1990).
BACTERIAS DEL GÉNERO ZYMOMONAS

Zymomonas mobilis es una bacteria Gram negativa de forma bacilar que se
presenta aislada o asociada en pares. Es anaerobia facultativa, catalasa positiva y
oxidasa negativa. Se puede aislar de varias bebidas alcohólicas y en sidras oca-
siona la alteración denominada “framboisé” (Beech y Carr, 1977). Esta altera-
ción ha sido descrita en sidras inglesas y francesas, afectando con mayor inci-
dencia a pequeños productores en el caso de las sidras francesas. Se ha indicado,
129
también, que el desarrollo de esta alteración se ve favorecido por temperaturas

elevadas y fermentaciones ralentizadas.
En la actualidad se consideran dentro de Z. mobilis tres subsespecies: Z.
mobilis subsp. mobilis, Z. mobilis subsp. pomacea y Z. mobilis subsp. francen-
sis. La diferenciación de estas subespecies se basa en pruebas fenotípicas (creci-
miento en presencia de 100 g/L de sacarosa, 0,2 % de sales biliares y 0,5 % de
NaCl, a 36° C), el estudio de sus perfiles proteicos unidimensionales mediante
SDS-PAGE, la caracterización genética mediante las técnicas 16S-ARDRA y
RAPD y la secuenciación del gen ADNr 16S y de un fragmento correspondien-
te a la región espaciadora intergénica entre los genes 16S y 23S (Coton y col.,
2006b).
130
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135
5. La evaluación sensorial
Departamento de Biotecnología y Ciencia de los Alimentos. Universidad de Burgos
Introducción
La evolución de la especie humana y la supervivencia de la misma han esta-
do íntimamente vinculadas a la evaluación sensorial de nuestro entorno, ya que
en el reino animal los sentidos modulan las respuestas de aceptación y acerca-
miento o de rechazo, repulsa y alejamiento.
La aceptación de los alimentos depende claramente de las sensaciones que
éstos producen y, en general, aquello que no genera sensaciones positivas no se
acepta. Es evidente que la primera función de un alimento es proporcionar las
sustancias necesarias para subsistir. Sin embargo, en las sociedades con las nece-
sidades nutricionales cubiertas pocos son los consumidores que ingieren un ali-
mento pensando en subsistir. La mayoría de la población come por apetencia,
escogiendo lo que le gusta, atrae y agrada, es decir, selecciona lo que le satisfa-
ce. Esto lleva implícito un proceso de evaluación sensorial y el hecho de que la
respuesta pueda ser positiva o negativa hace que la evaluación sensorial y, por
ende, los parámetros sensoriales sean de extrema importancia para la calidad de
los alimentos. Por ello, en las últimas décadas cada vez es mayor la preocupa-
ción por una evaluación adecuada de las propiedades sensoriales de los alimentos.
Parece evidente que la calidad sensorial es primordial para todos los produc-
tos con marcada componente hedónica, entre los que destacan los alimentos y las
bebidas (alcohólicas o no) que en gran medida se ingieren por placer. Por otra
parte, los productos alimentarios acogidos a algún tipo de marca de calidad o de
origen, como pueden ser la DOP (denominación de origen protegida), la IGP
(indicación geográfica protegida), o la ETG (especialidad tradicional garantiza-
da), deben cumplir con unos requisitos sensoriales bien definidos y, de no hacer-
lo, no pueden acogerse o salir al mercado con la certificación deseada.
Dado que la valoración sensorial de los alimentos tiene una fuerte compo-
nente hedónica y ésta es subjetiva, la adecuada evaluación sensorial de los ali-
mentos no es una tarea fácil. Además, debe distinguirse claramente lo que es una
137
evaluación analítica de las propiedades sensoriales de los alimentos, acción que

sólo puede llevarse a cabo con jueces entrenados a través del Análisis Sensorial
de los Alimentos (ASA), de la evaluación afectiva o de agrado, ya sea a nivel de
aceptación o de preferencia, que se realiza habitualmente con los consumidores
potenciales del producto. Asimismo, debe diferenciarse lo que es una sesión de
cata reglada o realizada bajo las condiciones establecidas en el ASA, de lo que
es una jornada de degustación en el sentido popular.
En este capítulo se presentan, de forma resumida, las bases de la percepción
sensorial y del análisis sensorial. Además, se analizan las propiedades sensoria-
les que definen la calidad sensorial de las sidras.
LA PERCEPCIÓN SENSORIAL
La percepción sensorial se produce cuando el cerebro procesa la información
recibida desde los receptores sensoriales, los cuales lanzan la correspondiente
señal tras haber sido impresionados por los estímulos. La percepción implica un
proceso de reconocimiento de las señales percibidas por comparación con otras
sensaciones grabadas previamente en la memoria sensorial, por tanto es un pro-
ceso comparativo que facilita la educación y el entrenamiento sensorial.
Los estímulos capaces de producir percepción sensorial son físicos, como la
energía radiante, las ondas de diversas longitudes, la densidad, la temperatura y
la estructura o son de naturaleza química (moléculas diversas). Así, dos de los
sentidos son químicos, el gusto y el olfato, ya que responden esencialmente a
estímulos químicos y los otros tres, la vista, el oído y el tacto, son físicos. En
general, salvo el sentido del tacto, que es difuso, los demás se localizan en una
determinada zona del cuerpo, generalmente en un único órgano y evalúan, salvo
los receptores del gusto, un sólo tipo de propiedad (Tabla 1).
Las sensaciones se reconocen de modo secuencial e incluso puede que la
transmisión de la señal sea también secuencial, según se va produciendo la inter-
acción estímulo-receptor.
Es relativamente fácil establecer un orden lógico de cómo se producirán las
distintas sensaciones. Las primeras impresiones, en condiciones normales del
individuo y del medio, son siempre las visuales que comienzan a evaluarse, ya
sea consciente o inconscientemente, en el momento en que el producto se visua-
liza. Posteriormente, lo más habitual es que se produzca una primera fase de la
sensación olfativa, se perciben los olores. En casos excepcionales, como en el
descorche de una botella, la sensación olfativa puede ser precedida de la auditiva.
Tras la captación de los primeros olores suelen llegar las primeras impresiones
de la textura, que se producen de forma directa cuando los dedos tocan el pro-
ducto o indirectamente si se usan utensilios como los cubiertos; éstas son las sen-
saciones táctiles-dactilares. En el caso de los alimentos líquidos las sensaciones
138
Tabla 1.–Relación entre estímulos, órganos, receptores y sensaciones o propiedades sensoriales
Estímulo Sentido Órgano/receptor Sensaciones/Propiedades
Visuales
Energía/ Vista Ojo/ Apariencia/Aspecto
luz Retina Color, brillo, burbujas,
turbidez, etc.
Auditivas
Ondas Oído Oído/ Grado de crujiente, chispeante,
audibles Aparato auditivo efervescencia, etc.
Olfativas
Sustancia Olfato Nariz/ Olor
química Epitelio Nasal Aroma
Gustativas
FLAVOR
Sustancia Gusto Aparato Buco-nasal- Sápidas
química digestivo/ Papilas Trigeminales: pungencia, dolor,
gustativas picante, astringencia, etc.
Táctiles
Estructura Tacto Piel/ Textura: dureza, masticabilidad,
Dedos y elasticidad, arenosidad, etc.
Boca Cinestésicas: (*)
(*) Sensaciones vinculadas a los movimientos producidos durante la masticación y la deglución.
táctiles, generalmente, no se detectan hasta que el producto está en la boca. En

la fase bucal se producen más o menos simultáneamente sensaciones gustativas
(sápidas, trigeminales y cinestésicas), olfativas (aromas) y táctiles (textura). De
nuevo, en casos especiales, estas sensaciones pueden ir acompañadas de las audi-
tivas que se producen al morder o masticar los alimentos.
La percepción visual
El ojo es el órgano receptor de la sensación visual y el conjunto de sensaciones
visuales que produce un cuerpo se conoce con el nombre de apariencia o aspecto.
El 80% de la información que recibimos llega por vía visual y, aproximadamente,
el 40% de ella es cromática. Esto explica, al menos en parte, la repercusión que
tiene la apariencia en la percepción, así como su interacción en la evaluación de
otras propiedades del alimento. Además, es la razón por la que el color es la carac-
terística de la apariencia más importante para la calidad de los productos.
El origen de la percepción óptica o visual está en la capacidad que tiene todo
cuerpo iluminado de reflejar energía electromagnética (luz), ya que es precisa-
139
mente la luz reflejada la que penetra en el ojo a través de la pupila y proyecta la

imagen de los objetos sobre la retina. La impresión de la luz sobre las sustancias
presentes en la retina produce distintas reacciones químicas que se transforman
en una señal eléctrica que se transmite por el nervio óptico hasta el cerebro,
donde se interpreta y traduce como la imagen del objeto. La primera fase hace
referencia al proceso físico de ver, mientras que la segunda se aproxima más al
hecho de mirar; el ojo ve y el cerebro mira, ya que al reconocer, valorar e inter-
pretar la percepción asociada al objeto visto está evaluando la apariencia.
La excitabilidad de la retina depende de la luz recibida, esencialmente de la
longitud de onda, la intensidad y la duración del estímulo. Además, la respuesta
final depende de la sensibilidad de los dos tipos de células receptoras presentes
en la retina, los bastones y los conos. Los primeros son los más sensibles y son
los responsables de la detección de las formas y el tamaño de los objetos (visión
en blanco y negro), mientras que los segundos son responsables de la percepción
del color y de los detalles finos y, al ser menos sensibles, necesitan mayor canti-
dad de estímulo (más fuerte o intenso) para emitir la señal. Por ello, los colores
y los detalles finos de las formas son los primeros que se pierden en condiciones
de baja luminosidad. Ambos tipos de células son sensibles a las radiaciones con
longitud de onda comprendida entre 400 y 700 nm, por lo que esta región del
espectro se denomina zona visible.
Es importante no olvidar que la sensación visual se graba como una sensación
pictórica, incluyendo la impresión cromática y la lumínica y, por tanto, dada la
dependencia de la sensación cromática de la luz, la apariencia del producto será
muy distinta en función de la iluminación recibida. Por ello, se hace necesaria
una adecuada iluminación para reconocer y aceptar las sensaciones visuales reci-
bidas. El control de este factor será esencial para una correcta evaluación de las
propiedades sensoriales de los alimentos.
La apariencia engloba varias características asociadas al color, el tamaño y la
forma, además de las de superficie en cuerpos sólidos o de transparencia y
limpieza en líquidos. El color es el resultado de la recepción de la luz, de una
determinada longitud de onda, reflejada por un objeto. Así, dependiendo de la
capacidad de absorber o reflejar la radiación recibida, los cuerpos presentan una
coloración o producen una sensación cromática u otra. Los cuerpos blancos son
los que reflejan todas las radiaciones del visible, no absorben ninguna de ellas.
Hay que recordar que el blanco no es un color real si no la suma de todos los
colores. Por el contrario, los cuerpos negros son los que absorben todas las radia-
ciones del visible, no reflejando ninguna de ellas. Los cuerpos grises son los que
absorben o reflejan por igual todas las longitudes de onda del visible, siendo más
oscuros cuanto mayor es el porcentaje de las radiaciones que absorben. Por últi-
mo, los cuerpos de un color definido son los que reflejan solamente o mayorita-
riamente una zona concreta del visible, absorbiendo las demás (figura 1).
Al color se asocian parámetros como el tono o combinación tricromática o
longitud de onda predominante de la luz reflejada; la intensidad o cantidad glo-
140
Figura 1.–Espectros de reflexión de cuerpos de distintos colores
bal de color; el brillo, que es la relación entre la luz incidente y la reflejada y que
depende de la intensidad lumínica recibida; y la luminosidad, que es el porcen-
taje de luz reflejada por lo que no depende de la intensidad de la luz recibida.
El color no es la única propiedad de la apariencia importante para la calidad
sensorial de los alimentos. De hecho, en el caso de productos líquidos, aquellas
propiedades que tienen que ver con la limpidez, como la transparencia y turbi-
dez, pueden ser tan importantes o más que el color. Las propiedades vinculadas
a la limpidez están relacionadas entre sí. La transparencia se refiere a la resis-
tencia de un cuerpo a ser atravesado por la luz, mientras que la turbidez se debe
a la difusión de la luz en el seno del cuerpo. Por tanto, un cuerpo turbio será poco
transparente, porque la difusión de luz en su seno reduce la cantidad de luz que
lo atraviesa.
Es importante tener en cuenta que en el caso de ciertos productos específicos
como la cerveza, los vinos espumosos o gasificados y las sidras, algunas otras
cualidades de la apariencia también son importantes para su calidad. Es el caso
de los parámetros relacionados con el aspecto de la espuma, la efervescencia, la
lágrima, etc.
La percepción auditiva
El oído es el órgano receptor de la sensación auditiva. Los sonidos son reco-
gidos en el pabellón auricular, se transmiten por el oído medio e impresionan el
oído interior, desde donde la información se envía al cerebro a través de unas
30.000 terminaciones nerviosas. El estímulo son las ondas producidas por el mo-
vimiento, la vibración, etc., que generan una perturbación que se difunde como
una onda longitudinal de determinadas características que la hacen audible, la
onda sonora.
141
El oído es un sentido muy sensible, la audición es factible prácticamente

desde los cero decibelios y se hace molesta si la intensidad supera los 120.
Además, abarca un amplio espectro de sonidos de frecuencias comprendidas
entre 16 y 20.000 Hz.
Los sonidos, de modo similar a los colores, se caracterizan y asocian a pará-
metros como la intensidad o energía que emite la onda, el tono o la frecuencia de
ésta y el timbre o conjunto de frecuencias e intensidades que produce un cuerpo
al moverse o vibrar.
El oído, como el resto de los sentidos, es educable. Contribuye al reconoci-
miento y la evaluación de la calidad sensorial y está especialmente asociado a la
apreciación de las propiedades de la textura.
La percepción olfativa
El receptor de las sensaciones olfativas, el epitelio olfativo, se sitúa en la parte
superior posterior de la nariz (figura 2). Es una zona húmeda y bien protegida
debido a su alta sensibilidad. El
olfato es el sentido más sensible,
llega a detectar sustancias en
concentraciones realmente bajas,
sirvan de ejemplo los valores
umbral en el aire de la vainillina,
2 x 10–10 mg/L o el mercaptano,
4 x 10–8 mg/L. Se estima que sólo
el 4% de los volátiles que nos
rodean llegan al receptor, evi-
tando así la sobre información ol-
fativa que podría causar daños
Figura 2.–Sistema olfativo y estructura del epitelio olfativo cerebrales.
La sensación olfativa se produce cuando el estímulo, el compuesto volátil,
interacciona con los receptores situados en los cilios de las células del epitelio
olfativo, provocando la señal eléctrica que es transmitida por los nervios hasta el
cerebro donde se descodifica e interpreta. En principio, toda sustancia capaz de
ser olida puede ocasionar sensación olfativa. Se trata de moléculas volátiles, rela-
tivamente pequeñas, con un peso molecular menor de 300 Da, aunque de natu-
raleza y volatilidad muy variables. El potencial odorable de una sustancia depen-
de de numerosos factores, tanto intrínsecos como extrínsecos a la propia molé-
cula y no es fácil establecer correlaciones fijas entre estructuras químicas y un
olor determinado aunque, con muchas excepciones, si se pueden establecer gru-
pos de sustancias con características odorables comunes.
Durante años se pensó que existían olores básicos cuyas mezclas originaban
el resto de olores, hoy se sabe que esta teoría no es correcta. Se han detectado
142
y aislado al menos 1.000 receptores distintos, específicos y no específicos.

También, se conoce que la respuesta del olfato es múltiple y rara vez se percibe
un olor puro, siendo habitual que lo que llegue al epitelio sea una fragancia o
conjunto de odorantes cuya impresión se graba como si fuera una sensación sim-
ple, aunque realmente es múltiple.
La sensación olfativa se produce, habitualmente, en dos fases que determinan
sus dos componentes (olor y aroma). El olor es la primera componente de la sen-
sación olfativa y puede ser definido como la percepción de las sustancias voláti-
les liberadas de los alimentos y que llegan hasta el epitelio olfativo a través de
las fosas nasales. El aroma, es la segunda componente de la sensación olfativa
y se debe a la percepción de las sustancias olorosas o aromáticas que se liberan
desde el alimento después de poner éste en la boca. Dichas sustancias se volati-
lizan o disuelven en la mucosa del paladar y la faringe, llegando por vía retrona-
sal a los sensores del olfato (el epitelio olfativo).
La evaluación de la calidad sensorial de los alimentos suele implicar tanto la
valoración del olor como del aroma. Además, interesa tanto la intensidad o
potencia como la persistencia de los componentes típicos y beneficiosos, así
como de los atípicos y negativos que son el origen de los defectos olfativos.
La percepción gustativa
Los receptores del gusto son las papilas gustativas (figura 3), que son estruc-
turas en forma de bulbo abiertas en su parte superior, el poro gustativo, lo que
favorece la interacción con el estímulo. La existencia de puntos de anclaje espe-
cíficos o la modificación de la permeabilidad de la membrana celular o de la
estructura de alguno de sus constituyentes (figura 3), son los principales oríge-
nes de la señal eléctrica que, una vez descodificada en el cerebro, será interpre-
tada y reconocida.
El mecanismo de detección del sabor dulce y amargo tiene como primera
etapa la unión de la molécula que estimula a un receptor de membrana. Como
consecuencia de ello se produce un cambio en la proteína G que está unida a
Figura 3.–Estructura de un botón gustativo (Fisher y Scott, 2000) y mecanismos de recepción de sabores
(Laing y Jinks, 1996).
143
dicho receptor, lo que provoca una cascada de reacciones bioquímicas [síntesis

de adenosín monofosfato cíclico (cAMP) o inositol trifosfato] que conduce tanto
a la apertura de los canales de calcio y sodio (permitiendo la entrada de estos
iones al interior celular) como al bloqueo del canal de potasio (impidiendo la
salida de este catión al exterior celular). Con ello, se consigue la despolarización
de la célula y la transmisión del impulso nervioso (Walters, 1996).
Un proceso similar se da en el caso de los estímulos odoríferos (Bell, 1996).
Los sabores producidos por sustancias de carácter iónico (el ácido y salado) se
perciben como consecuencia de la alteración del estado eléctrico de la membrana
de la célula receptora. En el caso del sabor salado, el mecanismo de despolariza-
ción celular es el paso de iones sodio hacia el interior de la célula. Las sustancias
ácidas despolarizan la célula bloqueando los protones los canales iónicos, como
el de potasio (la salida de este catión se utiliza para hiperpolarizar la célula), y
promoviendo la apertura de los canales de sodio (Laing y Jinks, 1996; Kinnamon
y Margolskee, 1996; Herness y Gilbertson, 1999; Pocock y Richards, 2005).
Las células gustativas se distribuyen por toda la superficie bucal e incluso por
la garganta y faringe, aunque en el ser adulto se concentran mayoritariamente en
la lengua, al perderse paulatinamente las de los carrillos, el paladar, etc. Estos
receptores son sensibles a los sabores, pero también a otros estímulos como la
temperatura, la presión, el potencial redox, el dolor, etc., existiendo canales de
transmisión de cada tipo de sensación. Según lo expuesto, los principales estí-
mulos del sentido del gusto son sustancias químicas, aunque éste también es
impresionable por estímulos físicos. La sensibilidad gustativa es directamente
proporcional a la densidad de botones gustativos, factor que presenta una eleva-
da variación entre individuos.
La cavidad bucal es una zona húmeda continuamente bañada por la saliva,
que facilita la limpieza de los botones gustativos dejándolos listos para nuevas
percepciones y contribuyendo a la selección de los estímulos. El hombre es poco
sensible a la sensación sápida, que se produce de forma progresiva, si exceptua-
mos el sabor ácido que, en general, suele percibirse de forma inmediata.
El estímulo de esta sensación es toda sustancia capaz de ser “gustada”, por lo
que las sustancias deben presentar cierta solubilidad en agua (la saliva). Sin
embargo, las sustancias hidrófobas también producen sensación sápida, proba-
blemente porque son transportadas por proteínas específicas.
La teoría de los sabores básicos: ácido, amargo, dulce y salado es bastante
antigua (fue enunciada por Aristóteles) y no fue modificada hasta finales del
siglo pasado cuando se reconoció oficialmente un quinto sabor básico, el
“Umami”. Hoy en día, sigue la pugna o la discusión de si otras sensaciones sápi-
das como el metálico y alcalino son o no otros sabores básicos.
La sensación ácida, o el sabor ácido, se debe esencialmente a los protones
(H+) que interaccionan con receptores específicos (figura 3). Una alta concentra-
ción de protones produce una sensación similar a una descarga eléctrica y de ahí
144
la inmediatez en el reconocimiento de este sabor. El ácido cítrico suele tomarse

como sustancia patrón de referencia. Debe tenerse en cuenta que los ácidos orgá-
nicos se perciben como más intensos que los inorgánicos a igual pH y que la pre-
sencia de ciertos iones puede modificar la percepción ácida.
La sensación amarga, o el sabor amargo, se produce por sustancias capaces
de interaccionar con constituyentes de la membrana de las células receptoras.
Hasta hace relativamente poco tiempo se asociaba a la alteración de los fosfolí-
pidos de la membrana. Sin embargo, a principios de este siglo se identificaron las
primeras proteínas receptoras y, por tanto, hoy sabemos que existen receptores
proteicos específicos de este sabor (figura 3). Son numerosas y muy diversas las
sustancias que producen sensación amarga, así lo hacen muchos alcaloides, cier-
tos fenoles, sales biliares y de calcio, etc. La mayoría son sustancias orgánicas y
muchas son hidrófobas. La cafeína y la quinina son los patrones habituales.
La sensación dulce, o el sabor dulce, se reconoce como el más placentero.
Son relativamente pocos los estímulos dulces, es decir, el número de sustancias
que producen esta sensación es bastante reducido en comparación con otros
sabores. La mayoría de los estimulantes dulces son moléculas orgánicas que dis-
ponen, generalmente, de algún grupo funcional tipo alcohol, aldehído o amino,
siendo, por lo general, más dulces cuantos más grupos alcohol posean; por eso,
los azúcares y los polialcoholes son los máximos representantes de las sustancias
dulces, siendo la referencia habitual la sacarosa.
Debe señalarse que pequeñas modificaciones en la estructura química produ-
cen grandes cambios en la sensación dulce. Esto explica el alto poder edulco-
rante de algunas moléculas como la sucramina (sal amónica de la sacarina) que
es mucho más potente que la sacarina sódica. Sin embargo, también se ha detec-
tado que diversos isómeros de un mismo producto pueden presentar sensación
dulce distinta e incluso sensaciones sápidas contrarias, como ocurre con los este-
reoisómeros del aspartamo y la sacarina, que uno es dulce y el otro amargo.
Como ya se ha comentado, la percepción dulce está mediada por receptores
proteicos específicos que interaccionan por puentes de hidrógeno con el estímu-
lo. En este caso, parece que la sensación está ligada al bloqueo de la salida de
iones potasio más que a la entrada de iones calcio, como ocurre en el caso de la
percepción del sabor amargo (figura 3).
La percepción salina, o el sabor salado, se correlaciona con la presencia de
electrolitos en el medio, sobre todo sales inorgánicas. Los halogenuros y, espe-
cialmente, los cloruros producen una fuerte sensación salina; otros aniones como
los sulfatos y nitratos contribuyen a esta sensación pero con menor intensidad y
pureza. Respecto a los cationes, los más importantes son los monovalentes, sobre
todo el sodio y litio. Otros, como el potasio y amonio y los cationes divalentes,
contribuyen a la sensación salina pero presentan fondos amargos. El cloruro
sódico (la sal) es el patrón habitual y se considera que es la única sustancia con
capacidad de producir la sensación salada pura.
145
La percepción salina está directamente relacionada con la entrada de iones a

través del canal sodio/potasio (figura 3) que se modifica en función de las con-
centraciones de iones presentes en el medio externo de la célula receptora.
El sabor “Umami” es bien conocido por la población oriental, especialmente
por la japonesa, pero resulta difícil de asimilar para muchos occidentales. Este
hecho pone claramente de manifiesto la incidencia de los hábitos alimenticios y
culturales en el desarrollo de la memoria sensorial y, por tanto, en la capacidad
para reconocer e identificar las sensaciones recibidas. Con el objetivo de facili-
tar su reconocimiento algunos autores lo han traducido como sabroso o carnoso,
pero estas traducciones no han alcanzado gran aceptación, prefiriéndose adaptar
la terminología nipona.
En 1909, el profesor Ikeda identificó este sabor en al sopa de algas y aisló el
componente que lo originaba, el glutamato monosódico, que es la sustancia de
referencia universal (Kawamura y Kare, 1987).
La percepción del sabor “Umami” está mediada por un receptor proteico
específico que fue localizado en las papilas gustativas a finales de los 90 (Nelson
y col., 2002). El receptor (mGLuR4) es capaz de reconocer el glutamato a las
concentraciones que se requiere para ser considerado como un sabor.
Interacción y relaciones entre la percepción olfativa y la gustativa

Es bien sabido que los receptores y las vías de transmisión de las percepcio-
nes vinculadas al olfato y al gusto son distintos. Sin embargo, es igualmente bien
conocido que, habitualmente, la interpretación y reconocimiento de las sensa-
ciones olfativas y gustativas que produce un alimento llevan a una respuesta con-
junta. Así, la población no entrenada en el análisis sensorial, cuando trata de defi-
nir el gusto de un alimento, aplica términos que engloban tanto sensaciones gus-
tativas como olfativas. Por ejemplo, cuando se dice que un yogur sabe a fresa, se
están englobando las sensaciones sápidas (dulce y ácido, principalmente) y las
olfativas (aroma a fresa).
Por otra parte, existe una clara incidencia de la percepción olfativa sobre la
sápida, que es todavía más intensa que la interacción visual ya comentada. Así,
si no olemos no somos capaces de saborear, no reconocemos sabores o nos cues-
ta mucho hacerlo. Se ha estimado que con la nariz tapada, es decir, bloqueando
la estimulación del receptor olfativo, se produce una pérdida del 80% de la per-
cepción gustativa. Por el contrario, el estímulo olfativo esperado aumenta la per-
cepción sápida y al revés. Además, debe considerarse que muchas de las sustan-
cias sápidas son odorables y viceversa. Por todo ello, ambas sensaciones se gra-
ban conjuntamente en nuestra memoria sensorial y forman un patrón de recono-
cimiento conjunto.
Por último, hay que señalar que tanto el gusto como el olfato son sentidos quí-
micos que tienen una fuerte componente hedónica y de evocación, así durante la
146
evolución humana han preservado la existencia de la especie a través de los

mecanismos de aceptación de los alimentos energéticos (dulces y de olores agra-
dables) y de rechazo de los tóxicos (ácidos, amargos, pútridos). Además, su capa-
cidad para discernir cualitativamente (bueno, malo, agradable, nauseabundo,
etc.) los hace imprescindibles para la evaluación de la calidad del alimento.
De modo similar a lo que ocurre con el término “Umami”, en castellano no
existe un vocablo específico para definir los patrones de respuesta conjunta de
las sensaciones gustativa y olfativa, sin embargo existe un término anglo-sajón
que se adoptó y que ha alcanzado el reconocimiento oficial, el flavor. Ahora
bien, debe quedar claro que el flavor abarca más sensaciones que las gusto-olfa-
tivas, extendiéndose a todo el conjunto de sensaciones buco-nasales que se reci-
ben al introducir un alimento en la boca. Por tanto, se asocia también a las sen-
saciones táctiles, térmicas, de dolor, etc., que se producen tanto en la boca como
en la nariz, e incluso se extiende hasta las que alcanzan los lagrimales oculares
por la vía retronasal. Así, la norma UNE 87001:1994 define el flavor como el
“conjunto complejo de las propiedades olfativas y gustativas que se perciben
durante la degustación y que puede estar influido por las propiedades táctiles,
térmicas, dolorosas e incluso por efectos cinestésicos”.
La percepción táctil
En general, se refiere a la percepción de las propiedades superficiales de un
objeto por los receptores táctiles. Los líquidos, al carecer de superficies, presen-
tan un “tacto” singular que se percibe al ingerirlos o al sumergirnos en ellos.
Los receptores son las terminaciones nerviosas cutáneas que se extienden a lo
largo de todo el cuerpo (figura 4). Son receptores sensibles al tacto, la presión,
la temperatura, el dolor, etc. La percepción táctil
está asociada al movimiento y los receptores se
estimulan al desplazarse por las superficies que se
evalúan. La información hacia el cerebro no viaja
por un nervio bien definido, lo que explica las sen-
saciones denominadas como “tacto fantasma”.
El sentido del tacto es difuso, sin emisiones, ni
sensaciones básicas, ni regulable. Está poco evolu-
cionado y es poco preciso, pero es esencial para el
equilibrio emocional. Las zonas más sensibles son
los labios, las yemas de los dedos y las mucosas. Figura 4.–Terminaciones nerviosas
cutáneas del tacto
Los alimentos, cuando son masticados, se rom-
pen multiplicando su superficie específica y, además, son movidos por la boca
aumentando las posibilidades de impactar con los receptores táctiles bucales. El
aumento de superficie depende de su estructura, que determina sus característi-
cas mecánicas y geométricas.
147
La sensación bucal se puede descomponer en tres componentes: la textura,

vinculada a la presión; la trigeminal (sensación de dolor, astringencia, pungen-
cia, picante, frío, etc.); y la cinestésica (retroalimentación procedente de los mús-
culos masticatorios durante la masticación) (Fisher y Scott, 2000).
La textura es una característica sensorial esencial para la calidad de los ali-
mentos. Se ha definido como un conjunto de propiedades de carácter multi-
dimensional y complejo. Así, Szczesniak (1963) la definió como “la manifes-
tación sensorial y funcional de las propiedades estructurales y mecánicas de los
alimentos detectadas a través de los sentidos de la vista, oído y tacto, junto con
las propiedades cinestésicas”. La “British Standard Institution” la define como:
“el atributo de una sustancia que es el resultado de una combinación de propie-
dades físicas (tamaño, forma, número, naturaleza y conformación de los ele-
mentos estructurales constituyentes) y que es percibida por los sentidos del tacto
(incluyendo la sensación bucal), vista y oído”. Más recientemente, se ha defi-
nido como “el conjunto de propiedades mecánicas, geométricas y de superficie
de un producto, perceptibles por los mecano-receptores, los receptores táctiles y,
en ciertos casos, por los visuales y auditivos”, de acuerdo con la norma ISO
5492:1992.
Han sido varios los intentos de agrupar o clasificar las múltiples propiedades
que se engloban bajo el término textura. De ellos, quizás siga siendo el enuncia-
do por Szczesniak (1963) el más aceptado. Esta autora estableció la siguiente
clasificación: 1-características mecánicas: relacionadas con la reacción del ali-
mento ante la aplicación de una fuerza. Engloba las características primarias:
dureza, cohesividad, viscosidad, elasticidad y adhesividad y las secundarias: fra-
gilidad, gomosidad y masticabilidad; 2-características geométricas: vinculadas
al tamaño, forma y orientación de los elementos estructurales de un alimento; y
3-características de composición: humedad y grasa, ambas relacionadas con la
jugosidad, untuosidad, etc.
Como ya se comentó, las primeras informaciones de la textura llegan por el
sentido de la vista que nos informa de la homogeneidad, rugosidad, sequedad,
etc. Cuando tocamos el alimento, ya sea con la mano o con los útiles usuales
(cuchara, cuchillo, tenedor,...), recibimos más información sobre la textura debi-
do a los receptores dactilares. Por último, al introducir el alimento en la boca
(tacto bucal) es cuando completamos toda la información, que puede verse com-
plementada por el sentido del oído cuando se muerde un alimento crujiente o se
parte un vegetal jugoso. Por todo ello, la evaluación de la textura es un proceso
continuo que comienza incluso antes del primer mordisco y termina después de
la deglución.
Las sensaciones trigeminales están vinculadas al “dolor” que produce un
alimento en la cavidad bucal aunque, también, están implicados los receptores
nasales y ópticos; por ello, se las denomina sensaciones irritantes. Son variadas
y de intensidades diversas y destacan las siguientes:
148
a) La astringencia o sensación de sequedad y aspereza que se produce en la

cavidad bucal por la desnaturalización de las proteínas de la saliva y de las
glándulas salivales. Los responsables principales son los taninos presentes
en los alimentos de origen vegetal. No debe confundirse ni con amargo ni
con ácido. El té, los membrillos, la piel de las nueces, algunos vinos, etc.,
son alimentos astringentes.
b) Las sensaciones de “pungencia” son los “pinchacitos”, el hormigueo o cos-
quilleo vinculado a la efervescencia y el picor provocado por moléculas
irritantes. Se detecta en la boca (chile), pero también en la nariz (pimien-
ta, carbónico) y en los ojos, especialmente en el lacrimal.
c) Las sensaciones térmicas: el frío o calor (ardiente) que producen algunos
componentes de los alimentos como el mentol, el alcohol, etc.
Se conoce poco de los mecanismos de activación de los irritantes y, por tanto,

de cómo se producen o regulan estas sensaciones. Se cree que interaccionan con
las terminaciones nerviosas libres de los epitelios de la boca y la nariz, en las que
alteran la membrana modificando la conductancia del ión calcio.
Se han descrito varios grupos de irritantes: los que interaccionan con grupos
nucleófilos, los que rompen puentes disulfuro y los alcoholes aromáticos y alifá-
ticos de cadena corta, además de algunos ésteres, ácidos y monoterpenos.
Los umbrales de detección de la mayoría de los irritantes son muy variables
entre personas, contribuyendo a ello los hábitos de consumo. En general, a con-
centraciones elevadas producen un efecto de anestesia, por saturación, y pueden
llegar a provocar daños irreversibles.
LA EVALUACIÓN SENSORIAL REGLADA: EL ANÁLISIS SENSORIAL
Introducción
La norma internacional ISO 5492:1992 y la correspondiente española UNE
87001:1994, definen el análisis sensorial como “el examen de las propiedades
organolépticas de un producto realizable con los sentidos”. Ésta es una defi-
nición sencilla, en perfecta armonía con las definiciones del análisis sensorial de
los alimentos que se han venido usando desde los años 70.
Algunas definiciones del análisis sensorial de alimentos, postuladas más
recientemente, contemplan numerosos referentes a los distintos elementos o facto-
res que están involucrados en el desarrollo adecuado de esta técnica analítica.
Sirva, a modo de ejemplo, la definición de Ureña Peralta y col. (1999) “el análisis
sensorial de los alimentos es el método experimental mediante el cual los jueces
perciben y califican, caracterizando y/o mesurando, las propiedades sensoriales
de muestras adecuadamente presentadas, bajo condiciones ambientales preesta-
blecidas y bajo un patrón de evaluación acorde al posterior análisis estadístico”.
149
Metodología del análisis sensorial

La validez de los datos obtenidos tras un análisis sensorial dependerá de
cómo se haya llevado a cabo éste, de tal modo que sólo será fiable aquél que se
realice bajo una metodología adecuada y definida.
Actualmente, es bastante amplia la bibliografía disponible sobre análisis sen-
sorial, su desarrollo y aplicaciones, siendo muy numerosos los tratados que se
centran en el análisis sensorial de los alimentos. Además, existen normas inter-
nacionales (ISO) y nacionales (UNE) que lo regulan y sirven de guía para su
correcta aplicación. Al respecto, a continuación se indican algunas de las normas
nacionales (UNE) que son adaptaciones de las normas internacionales ISO res-
pectivas y que están vinculadas con el adecuado desarrollo de los análisis senso-
riales (la información que se cita está actualizada con la base de datos NOR-
WEB, febrero de 2010). La guía general de la Metodología del Análisis Sensorial
se dicta en la norma UNE-ISO 6658:2008 que corresponde a la ISO de igual
número y fecha de 2005. El vocabulario propio de este método analítico se reco-
ge en la norma UNE 87001:1994, correspondiente a la ISO 5492:1992. Todo lo
relativo al personal de los laboratorios de evaluación sensorial queda definido en
dos guías generales editadas en las normas UNE-ISO 13300-1:2007 y UNE-ISO
13300-2:2008, correspondientes con la ISO de igual número y de fecha 2006.
La metodología del análisis sensorial es relativamente sencilla y responde a
las cinco fases tradicionales del desarrollo de cualquier otro experimento analí-
tico que se realice con rigor científico, que son: planteamiento, planificación,
realización, análisis de los datos y establecimiento de conclusiones finales.
El planteamiento implica fijar el objetivo del análisis, es decir definir lo que
se espera obtener, el tipo de información, así como la reflexión sobre el uso que
se le dará a ésta, cotejando si es adecuada para el fin perseguido.
En principio, se pueden definir dos tipos de objetivos, uno analítico, que es el
mayoritario y otro hedónico, centrado en la evaluación y valoración del nivel de
agrado, aceptación y/o preferencia. El objetivo analítico, a su vez, se subdivide
en otros dos, discriminar y describir. Discriminar, como su nombre indica, es
establecer diferencias entre las muestras, quedándose en la evaluación de su exis-
tencia (pruebas de diferencias) o profundizando en el sentido de la diferencia
(ordenación) e incluso llegando hasta la cuantificación de la diferencia (uso de
escalas). Con la descripción de las características sensoriales de un producto se
persigue la evaluación de su calidad, diferenciación y caracterización.
Debe tenerse en cuenta que si bien fijar el objetivo es la tarea principal de esta
fase, no es la única. Establecido el objetivo, se deben considerar las acciones
directamente vinculadas a la consecución del mismo y recoger cuanta informa-
ción sea pertinente. Es imprescindible considerar las propiedades sensoriales que
será necesario evaluar, el tipo y características de las muestras, el número, las
cantidades disponibles, los tiempos de caducidad y el consumo preferente (muy
importante en el caso de alimentos perecederos y casi siempre cambiantes en el
150
tiempo), el tiempo disponible para dar una respuesta, etc. Además, se deberá con-
siderar el tipo de jueces necesario, su número, disponibilidad, etc. Por tanto,
teniendo en cuenta la definición de Ureña Peralta y col. (1999), desde el inicio
debe estar claro el patrón de evaluación, los parámetros a evaluar, o sea, las pro-
piedades sensoriales, el tipo de información deseada, ya sea calificar, caracteri-
zar o diferenciar y la naturaleza de las muestras, ya que éstas siempre deberán
estar adecuadamente presentadas.
No se debe olvidar recabar información de estudios previos y analizar sus
resultados y estrategias de planificación y desarrollo. Además, es conveniente
informarse sobre ingredientes, interacciones entre componentes, evoluciones
esperadas, usos frecuentes, modos de consumo, vías de distribución y cuanto
pueda afectar al producto.
La planificación es la fase en la que se establece y concreta las condiciones
en que se llevará a cabo el análisis sensorial. El tipo de prueba y de jueces, la pre-
sentación de las muestras y el tratamiento estadístico que se vaya a elegir depen-
derá de los objetivos del análisis, los tipos de muestras y la información recopi-
lada previa. Es decir, en esta fase se establece el diseño del experimento que
engloba los planes o la secuencia de etapas para organizar, llevar a cabo y anali-
zar los resultados de un experimento, persiguiendo conseguir la máxima infor-
mación con el menor número de datos y eliminar o minimizar el efecto de los
factores externos sobre los resultados.
El diseño experimental, en función de la metodología estadística predetermi-
nada, establece el número de respuestas necesarias y, por tanto, el de sesiones y
muestras por sesión, repeticiones de las sesiones, orden de realización, etc., con-
siderando, también, el número y tipo de jueces necesarios y los disponibles. Cada
clase de prueba necesita un tipo concreto de jueces y un número variable de res-
puestas (análisis) en función del juez que desarrolle la prueba. Además, el dise-
ño experimental debe tener en cuenta algunas consideraciones de interés rela-
cionadas con la respuesta sensorial. Así, por ejemplo, debe considerarse la fati-
ga y la adaptación, que dependen no sólo del grado de entrenamiento del catador
sino, también, y casi principalmente, de las características del producto a evaluar.
Alimentos con estímulos muy potentes fatigan más rápidamente, lo que reduce
el número de muestras que pueden ser evaluadas en cada sesión y eliminan o
reducen la posibilidad de hacer varias series en una sesión. Por otra parte, debe
considerarse que la repetición de las pruebas con las mismas muestras puede pro-
ducir adaptación y, por tanto, respuestas falsas. Por estas mismas razones, si se
opta por pruebas con muestras control, se debe asumir que esto reduce el núme-
ro de muestras problema a evaluar.
La realización del análisis sensorial es, por lo general, la fase siguiente donde
se desarrollan las actividades planificadas. Las pautas de actuación vendrán defi-
nidas por el diseño del experimento y, en esta etapa, hay que prestar especial aten-
ción al control de las condiciones de realización establecidas y a todos aquellos
parámetros que puedan afectarlas. Por tanto, en esta fase se controlan los aspec-
151
tos ambientales que, en general, se refieren al local donde se realiza el análisis y

lo que los jueces precisan, prestando especialmente interés a las fichas de cata y
a los aspectos prácticos relacionados, esencialmente, con la forma de presentación
de las muestras y con el control de los jueces. En caso de que el nivel de entrena-
miento de éstos no coincida con el grado necesario para el desarrollo de un deter-
minado tipo de análisis, la fase de realización deberá empezar por la selección y
entrenamiento de los jueces hasta el nivel necesario. Es habitual que, incluso dis-
poniendo de jueces entrenados, la fase de realización conlleve alguna sesión de
evaluación o control de los jueces e incluso nuevas sesiones de entrenamiento.
Lo más habitual es que el análisis sensorial de alimentos se lleve a cabo en
locales especiales, la denominada sala de cata (figura 5). Ésta debe cumplir una
serie de requisitos bien definidos en las normas reguladoras (UNE 87004:1979).
El adecuado desarrollo de este análisis hace necesario que cada catador o juez dé
una respuesta individual e independiente, por ello, se aíslan unos de otros y se
trabaja en cabinas de cata individuales que están diseñadas para reducir e inclu-
so impedir totalmente la posibilidad de que los catadores se comuniquen entre sí,
pero que deben ser espaciosas y confortables. Las dimensiones mínimas de las
cabinas, los elementos imprescindibles (trampilla de entrada de muestras, pilas,
tipo de luz, etc.) o convenientes (juegos de luces, elementos calefactores, etc.)
quedan especificados también en las guías. Además, y para controlar la influen-
cia del ambiente sobre la percepción sensorial, la normativa establece incluso los
colores y los materiales que pueden usarse en su construcción, el tipo de luz y
los iluminantes, la climatización, la ventilación, la insonorización, etc.
Figura 5.–Cabina para el Análisis Sensorial de Alimentos
152
Adyacente a la sala de cata suele situarse la cocina o zona de preparación de

las muestras; debe estar bien aislada y separada de la sala de cata para evitar con-
tactos con los estímulos antes de comenzar con el análisis.
A veces, se desarrollan sesiones especiales para la evaluación visual de la pre-
sentación comercial de las muestras, el comentario de los resultados, el inter-
cambio de ideas y su discusión con el fin de alcanzar consensos entre los ca-
tadores (catas de armonización). En estas sesiones es necesario que los jueces
trabajen en conjunto. Se realizan en locales distintos a la sala cata, tales como
salas de reunión, locales para la inspección visual, etc.
Los aspectos prácticos relativos a las muestras son esenciales para un ade-
cuado desarrollo del análisis sensorial. En primer lugar, como en el resto de los
análisis, las muestras han de ser representativas del producto a evaluar y, para
determinar la muestra objeto de estudio, conviene aplicar las normas generales
de muestreo. Deben presentarse lo más homogéneas posible, es esencial asegu-
rar la uniformidad entre las submuestras que se entregan a los catadores y se debe
evitar cualquier diferencia perturbadora de la respuesta, como la forma de la pre-
sentación, la cantidad de muestra, el recipiente usado, etc. Se debe enmascarar,
siempre que no sea objeto de evaluación, cualquier perturbación que pueda
influir la respuesta, como el color (aplicación de luces de colores), la turbidez
(uso de vasos y copas opacas), etc. Las muestras se evaluarán en las condiciones
habituales de consumo (fría/caliente, cruda/cocinada, etc.) o en las preestableci-
das que se consideren más adecuadas. Éstas deberán estar bien definidas, ser
concretas y siempre iguales para todos los catadores y sesiones. Las muestras se
servirán codificadas y se presentarán de acuerdo con el diseño del experimento
o la norma que regule la prueba y, en caso de un número elevado de jueces, se
presentarán al azar. Respecto a los códigos conviene resaltar que, para evitar aso-
ciaciones inconscientes que condicionen las respuestas, deben usarse referencias
de tres dígitos que pueden ser numéricos o alfa-numéricos distribuidos aleato-
riamente entre las muestras.
Los utensilios, platos, vasos, cubiertos, etc. que se emplean, generalmente,
son de un sólo uso y deben ser de calidad alimentaria. Los colores de éstos no
deben interferir en la evaluación, por lo que los más usados son blancos. Si se
emplean materiales reutilizables deben lavarse convenientemente para evitar
toda interferencia de muestras anteriores. Se prestará especial atención a la eli-
minación total del detergente y se usarán, en la medida de lo posible, jabones de
olor neutro. Obviamente, cuando existan recipientes normalizados o las normas
indiquen el uso de un determinado material, habrá que utilizarlos. Algunos uten-
silios normalizados son la copa para la degustación de vino y la copa para la cata
de aceite de oliva, regulados en las normas UNE 87022:1992, que se correspon-
de con la ISO 3591:1977, y UNE-ISO 16657:2007, correspondiente a la ISO de
igual número y fecha de 2006, respectivamente.
Es importante evitar cualquier contaminación de la muestra, por lo que pue-
den utilizarse materiales plásticos diversos (de uso alimentario y sin olor) para
153
cubrir las muestras mientras se sirven u observan. También, es necesario consi-

derar y tener a disposición los útiles que permitan, en su caso, calentar/enfriar la
muestra y mantener la temperatura habitual de consumo. Se pueden instalar cale-
factores en las cabinas, usar recipientes metálicos, etc.
Respecto a los parámetros informativos, hay que señalar que algunas normas
y normativas vigentes (pliegos de las denominaciones de origen, por ejemplo)
determinan las fichas de cata que deben emplearse en el desarrollo de pruebas
concretas o, al menos, dan las pautas de cómo deben ser esas fichas.
La ficha de cata es el formulario de respuestas, es decir, el documento donde
el juez debe emitir su juicio sobre el producto a evaluar sensorialmente. Además
de las preguntas que se formulan en la ficha, ésta lleva información adicional
sobre qué hacer y cómo hacerlo: se indican las pautas de ingesta, el orden de
cata, los tiempos de espera entre muestras, si está permitida la recata o no de las
muestras, etc. Las últimas instrucciones suelen ser relativas a cómo se debe ano-
tar la respuesta en la ficha.
Es importante resaltar que, cuando no se utilizan fichas estandarizadas, es ne-
cesario que éstas se confeccionen de tal modo que la información le llegue al
juez de forma ordenada y clara, sin dar lugar a dudas o interpretaciones ambi-
guas, de tal modo que si el director del panel no estuviera presente el catador
pueda realizar la prueba sin ningún problema, siguiendo las instrucciones reco-
gidas en la ficha de cata. Las preguntas deben ser, en general, concisas y cerradas.
Habitualmente, la sesión de análisis sensorial comienza por una información
oral sobre lo que se va a realizar, que suele estar recogida en la ficha de cata.
Antes de que el juez comience su análisis debe comprobar que tiene a su alcan-
ce todo lo que necesita para llevarlo a cabo y para anotar su valoración. También
debe comprobar, antes de abandonar el local, que ha registrado los datos sobre el
cuestionario y que lo ha hecho del modo adecuado. Es importante, también, que
el jefe de cata compruebe este hecho y que intente recabar información, en la
medida de lo posible, del interés de los catadores en continuar participando en
las sesiones de cata y mantenerles motivados. A este respecto, debe considerarse
que sesiones de catas demasiado largas o frecuentes aburren, dan malos resulta-
dos y conducen al abandono del panel.
Otro aspecto práctico importante que debe considerarse para una adecuada
realización de las pruebas de análisis sensorial es la hora de la cata; se deben evi-
tar los momentos del día de hambre y saciedad, ya que ambos influyen en las res-
puestas de los jueces. Es conveniente que el análisis se lleve a cabo alejado de
las franjas horarias de las comidas principales del día, siendo recomendable que
los jueces se abstengan de fumar y de consumir cualquier cosa, excepto agua, al
menos una hora antes de la cata. Se ha comprobado que la máxima agudeza sen-
sorial se tiene a media mañana.
Por otra parte, y para mantener un ambiente libre de interferencias, es apro-
piado que los jueces se abstengan de usar cosméticos u otros productos de olor
154
intenso los días de la cata y que se cambien de ropa, si fuera necesario, antes
de acudir a la sesión de análisis sensorial. Asimismo, cuando los jueces están
resfriados, ansiosos, estresados, malhumorados, etc., es mejor que no acudan a
las catas.
Una vez desarrollada la prueba, la etapa siguiente y final es la recopilación de
resultados, el análisis de los datos y el establecimiento de las conclusiones fina-
les. Los datos que se obtienen del análisis sensorial deben ser tratados para poder
establecer unas conclusiones finales. El análisis estadístico que se aplica está
asociado al diseño experimental seleccionado en función de los objetivos, las
muestras, etc.
Tipos de pruebas sensoriales

La clasificación de las pruebas sensoriales no es estricta y claramente defini-
da; existen pequeñas variaciones según los autores u obras que se consulte. En
esta ocasión se ha optado por la clasificación más acorde a los objetivos que
persigue el análisis sensorial. Así, se establecen dos grupos principales, el de las
pruebas analíticas que se dividen en discriminatorias y descriptivas y el de
las pruebas afectivas o hedónicas.
Dentro de las pruebas discriminatorias cabe señalar, en primer lugar, las
pruebas de diferencias que tienen por finalidad la detección de diferencias entre
dos muestras. Estas pruebas trabajan o evalúan una única propiedad de los pro-
ductos. La propiedad sobre la que se investiga la diferencia puede ser una carac-
terística sensorial particular o el conjunto de ellas, como la valoración global de
las sensaciones bucales, el color, el aroma, etc.
Son varias las pruebas que pertenecen a este grupo, en su mayoría regla-
das por normas internacionales y nacionales: prueba de comparación por pa-
rejas (UNE-EN ISO 5495:2009, correspondiente a ISO 5495:2005 e ISO
5495:2005/cor 1:2006); prueba A/noA (UNE 87016:1986); prueba duo-trío
(UNE 87010:1993, correspondiente a ISO 10399:1991); prueba triangular
(UNE-EN ISO 4120:2008, correspondiente a ISO 4120:2004); prueba cuadran-
gular y prueba dos en cinco. De ellas, probablemente la triangular, seguida de la
pareada, son las que más se han aplicado y aplican en la industria alimentaria.
En segundo lugar y dentro de las pruebas discriminatorias, hay que destacar
las de ordenación o de categorías (UNE 87023:1995 y UNE 87023:1995
Erratum: 2005). Se caracterizan por distribuir las muestras en grupos o categorías
previamente establecidas. La distribución se hace en función de un determinado
parámetro sensorial, lo que lleva implícito determinar un orden de la diferencia
y, por tanto, indicar el sentido de la misma. Al igual que en las pruebas de di-
ferencias, los jueces ordenan en función de un único atributo o bien de la sen-
sación global. Se distinguen dos tipos: las de clasificación simple, que sólo
usan categorías nominales y las de clasificación con ayuda de escala, que usan
155
categorías que constituyen una escala de intervalos, ordinal semántica o numé-

rica (puntuaciones). Estas pruebas trabajan con más de dos muestras, lo reco-
mendable es de tres a nueve dependiendo de sus características. Las pruebas que
usan escalas (UNE-ISO 4121:2006, correspondiente con ISO 4121:2003) eva-
lúan puntuando o calificando; por tanto, permiten no sólo saber el sentido de la
diferencia sino que también la cuantifican. Por otro lado, conveniente tener en
cuenta la norma UNE 87030:2002 que regula el método de estimación de la mag-
nitud. El número de muestras y/o atributos evaluados por sesión depende de la
naturaleza de la muestra y está limitado por la fatiga de los jueces. El tipo de
escala a utilizar quedará bien definida desde el inicio (planificación) y condicio-
na el tipo de prueba.
Las clases de escalas que suelen emplearse son de intervalo, proporcionales y
ordinales o de calidades. Las primeras son aquéllas en las que los tramos se esco-
gen de manera que a intervalos iguales corresponden diferencias de percepción
iguales (por ejemplo, escalas de temperatura), mientras que en las escalas pro-
porcionales los intervalos (valores) se establecen de tal modo que a cocientes
iguales de los valores corresponden cocientes iguales de percepción. Ambos
tipos de escalas son difíciles de elaborar, por eso, en la práctica, las de intervalo
se definen con sustancias de referencia de concentraciones distintas, dando pun-
tuaciones (escala numérica) o a través de un conjunto de expresiones definidas
(escala semántica o nominal). Por otra parte, la escala puede tener definido cada
punto (escala estructurada), sólo alguno (escala incompleta) o únicamente los
extremos (escala no estructurada) (figura 6). Las escalas ordinales son aquellas
en las que el orden de los valores asignados se corresponde con el orden de inten-
sidad percibido para la propiedad evaluada. En estas escalas no se puede asumir
que la diferencia entre dos valores refleje la diferencia entre intensidades perci-
bidas, ni que la proporción entre dos valores recoja la proporción entre las inten-
sidades percibidas.
Figura 6.–Tipos de escalas más usadas en análisis sensorial
156
Las escalas proporcionales suelen necesitar el uso de muestras de referencia,

respecto a las cuales se valoran las muestras problema. Las ordinales están cons-
tituidas por números enteros, cada uno de ellos corresponde a una clase y los
tramos superiores de la escala designan la mayor calidad o intensidad. La ampli-
tud de la escala es variable, depende del objetivo del análisis sensorial y debe
fijarse previamente. Las habituales son de tres a nueve puntos según se desee
afinar en las categorías. Usualmente combinan escala numérica con categorías
semánticas o nominales. Un ejemplo es la escala de dureza Mohs, en la que cada
punto de dureza está definido por un valor y una sustancia patrón: el valor 1
corresponde al talco y el 10 al diamante. No es fácil encontrar los patrones y tér-
minos apropiados para construir escalas aplicables a las propiedades sensoriales.
Además, en este tipo de escalas, como ya se ha dicho, los datos no representan
situaciones globales, es decir, el valor 4 no implica el doble de intensidad que el
2, ni diferencias numéricas iguales entre pares de muestras distintas implican
igual diferencia de sensación. Por todo ello, se usan menos que las de intervalo
en el análisis sensorial cuantitativo, sin embargo se emplean para calificar por
calidades y preferencias.
Las pruebas descriptivas, como su nombre indica, son las que sirven para
seleccionar los atributos que describen y caracterizan un producto, centrándose
en los más importantes para la calidad y teniendo en cuenta, también, los posi-
bles defectos que pueda presentar el producto. Estas pruebas deben ser desarro-
lladas preferiblemente por expertos. Dentro de este grupo están: la prueba des-
criptiva simple y la descriptiva cuantitativa o perfil sensorial.
La prueba descriptiva simple es una descripción cualitativa de los atributos
individuales que inciden en la calidad global del producto, por tanto se aplica,
principalmente, para describir e identificar los atributos más importantes de éste.
Esta prueba se recomienda, también, para entrenar y describir diferencias pre-
viamente detectadas. Al final de la prueba, por consenso entre los jueces, quedan
seleccionados y definidos los parámetros más importantes y también el orden en
que éstos deben ser evaluados.
Estas pruebas son la base de las pruebas descriptivas cuantitativas o perfiles
sensoriales, que se definen como las pruebas de evaluación reproducible de las
propiedades organolépticas de un producto, usando términos seleccionados de un
glosario previamente establecido mediante pruebas descriptivas simples. Los
atributos seleccionados se evalúan aplicando escalas de intensidad, obteniéndo-
se, con ello, el perfil sensorial del producto (ver norma UNE 87027:1998).
Las pruebas descriptivas cuantitativas pueden aplicarse al conjunto de atri-
butos del perfil simple o a un grupo de ellos, como en el caso del perfil olfato-
gustativo o el de textura. El desarrollo de estos perfiles está reglado, siendo las
normas que los regulan la UNE 87017:1992, equivalente a la ISO 6564:1985 y
la UNE 87025:1996, equivalente a la ISO 1036:1994, respectivamente.
Las pruebas afectivas o hedónicas son las que determinan el agrado de los
consumidores, generalmente, a través de pruebas de aceptación o de prefe-
157
rencia. Se desarrollan aplicando modalidades de las pruebas de diferencias y de

categorías u ordenación.
La aceptación es un hecho no comparativo, cada producto se acepta o recha-
za o se puntúa de forma independiente de los demás y se pueden otorgar pun-
tuaciones iguales. Sin embargo, la preferencia implica comparación y ordenación
por grados de satisfacción que son los que marcan la preferencia. Ello conlleva
otorgar puntuaciones distintas y ordenadas. Además, la preferencia se lleva a
cabo siempre entre dos o más productos mientras que la aceptación puede ser
evaluada sobre un único producto.
Las pruebas afectivas se utilizan en el estudio de mercados y en el desarrollo
de nuevos productos. Estas pruebas deben realizarlas un elevado número de con-
sumidores, recomendándose un mínimo de 100 aunque algunos autores indican
un mínimo de 500.
Jueces
Hay básicamente dos tipos de jueces, los legos o no entrenados y los entre-
nados. Los primeros, en general, son seleccionados por ser consumidores poten-
ciales del producto estudiado. Se debe consultar un grupo numeroso y no tienen
que realizar el análisis en la sala de cata, aunque es conveniente. En cualquier
caso, las condiciones del desarrollo del análisis deben estar controladas y seguir-
se las normas básicas de presentación de las muestras.
Los estudios con consumidores son habitualmente costosos, lo que hace que
se tiendan a sustituir por estudios con empleados de la empresa; sin embargo,
éstos no son adecuados para todos los estudios y, por ejemplo, nunca debieran
ser usados para el desarrollo de nuevos productos.
Los jueces entrenados son personas que han pasado por una fase intensa de
entrenamiento, en la que han educado sus sentidos y han desarrollado adecuadas
aptitudes y capacidades sensoriales. Se distinguen tres tipos: a) catadores: jue-
ces seleccionados y entrenados, b) expertos o jueces expertos, aquéllos que
han demostrado agudeza en trabajos de panel y buena memoria a largo plazo y
c) jueces expertos especializados, aquéllos que tienen un conocimiento adicio-
nal y especial en un campo particular.
La selección y formación de un panel de jueces entrenados está regulado en
las normas (UNE 87024-1:1995, correspondiente a la ISO 8586-1:1993; y UNE-
EN ISO 8586-2:2009, correspondiente a la ISO de igual número y fecha de
2008). En general, la selección y formación de jueces entrenados conlleva las
etapas siguientes: preselección, selección, entrenamiento y comprobación. En la
preselección, realizada mediante entrevistas, se tiende a primar el interés perso-
nal, la motivación y el tiempo disponible sobre las habilidades sensoriales. La
selección se orienta a comprobar la normalidad fisiológica de los candidatos y
a evaluar las habilidades sensoriales, diferenciadoras, descriptivas, etc. Por su
158
parte, los objetivos del entrenamiento son desarrollar y mejorar la habilidad in-
dividual para reconocer, identificar y cuantificar los atributos sensoriales, así
como familiarizarse con la metodología del análisis sensorial, realizando pruebas
distintas, usando un vocabulario adecuado, aprendiendo el uso de escalas, etc.
Además, en la fase de entrenamiento se pretende desarrollar, fomentar y mejorar
la sensibilidad y la memoria frente a los distintos atributos.
El periodo de entrenamiento es variable, dependiendo de los catadores y
del nivel de confianza que se quiera alcanzar, por lo que es necesario disponer
de suficiente cantidad de muestras homogéneas, alimentos de referencia, etc.
Además, supone un continuo contacto con cada catador, que permite evaluar sus
aptitudes sociales y de comunicación con el resto de catadores.
La comprobación es una actividad periódica y necesaria para garantizar la fia-
bilidad de los resultados. El análisis estadístico de la variabilidad de opinión de
cada catador nos informa sobre su habilidad y consistencia y el estudio de la
variabilidad de las calificaciones medias del equipo nos informa sobre el funcio-
namiento del mismo.
La selección final de los integrantes del panel de catadores dependerá de los
resultados alcanzados en relación con los porcentajes de aciertos o respuestas
correctas en el reconocimiento de sensaciones, pruebas de diferencias, uso de las
escalas, etc. Los niveles exigibles dependen del intervalo de confianza fijado.
Además, es importante que los catadores sean consistentes y regulares en las
respuestas correctas.
Se recomienda que el número de jueces seleccionados sea superior al desea-
do o necesario para las pruebas a realizar, con el fin de tener cubierto el absen-
tismo. Por otra parte, conviene señalar que para disponer de paneles de expertos
y de expertos especializados se requieren entrenamientos más prolongados,
intensos y complejos, que pueden durar años. Además, es importante que los
expertos ejerciten diariamente sus habilidades sensoriales.
LA EVALUACIÓN SENSORIAL DE LA SIDRA
Generalidades
La evaluación de la calidad sensorial de una bebida alcohólica, como la sidra,
suele llevarse a cabo aplicando pruebas descriptivas cuantitativas, en las que los
parámetros más importantes para la calidad son evaluados con escalas de inter-
valo o bien se aplican fichas definidas por comités de cata o especialistas de las
empresas del sector, instituciones y organismos oficiales, etc. Estas fichas pue-
den considerarse un tipo especial de perfiles sensoriales.
Dado que existen diversos tipos de sidras con características físico-químicas
muy distintas, es lógico que los parámetros de calidad que se valoran en cada una
de ellas difieran adaptándose a su tipología. Además, debe tenerse en cuenta que
159
las características sensoriales típicas de cada producto suelen denominarse con

vocablos específicos, muchas veces derivados de términos o modismos típicos de
las zonas de producción. Esto hace necesario familiarizarse con el vocabulario
usualmente empleado para cada tipo de bebida a analizar. Por ello, la adecuada eva-
luación sensorial de la sidra sólo podrá conseguirse si los catadores conocen per-
fectamente los significados de los términos usados para describir sus características.
Es muy importante corroborar y comprobar la asimilación de los términos en
el contexto de la bebida evaluada, sobre todo en el caso de aquellos catadores
familiarizados con el análisis sensorial de otras bebidas alcohólicas, como cavas
o cervezas. Sirva de ejemplo el concepto de “calidad de la espuma” que es total-
mente diferente si se asocia a cervezas, a vinos espumosos o a sidras.
Terminología del análisis sensorial descriptivo de las sidras

Los términos usados en la descripción y valoración de las sidras engloban
vocablos comunes a otras bebidas y productos alimenticios como el color, la tur-
bidez, la acidez, el equilibrio, etc. y otros más específicos y característicos. Es
bien conocido que la sidra natural difiere de otras sidras en sus características
sensoriales y, por tanto, para la descripción de cada una de ellas se usarán pará-
metros y vocablos específicos distintos. Por otra parte, además de la variación
propia de los idiomas, el uso de vocablos populares, característicos de zonas
determinadas, trae consigo otra posible fuente de variación a la hora de denomi-
nar las propiedades que se quieren evaluar.
La zona de mayor producción de sidra en España es Asturias (82%) y, por
ello, se tomarán como vocablos base los habitualmente empleados en este terri-
torio, introduciéndose otros términos específicos propios de otras regiones pro-
ductoras que se han encontrado en diversas fuentes de información.
Varios años de trabajo conjunto entre investigadores del Servicio Regional de
Investigación y Desarrollo Agroalimentario (SERIDA) de Asturias, lagareros y
técnicos del sector empresarial permitieron determinar los parámetros primor-
diales para la evaluación sensorial de la sidra natural. Entre ellos, destacan varios
vocablos que se consideran característicos de este producto (Picinelli, 1999):
Espalme: Es la desaparición rápida y completa de la espuma superficial gene-
rada en el vaso al escanciar la sidra. Lo esperado en una sidra de calidad es que
la espuma superficial se forme pero desaparezca rápida y completamente y, en
este caso, se dice que la sidra espalma (figura 7).

Figura 7.–Espalme de
la sidra. Diferentes fases
del proceso de espalme
(por cortesía de
José María Osoro)
160
Aguante: Es la persistencia de la emulsión de burbujas

formada al escanciar la sidra. Esta emulsión inicialmente
ocupa toda la masa del líquido y, posteriormente, va des-
apareciendo desde el fondo del vaso hacia la superficie.
Una sidra de calidad presenta buen aguante o desaparición
lenta desde el fondo del vaso de la emulsión de burbujas
(figura 8).
Gas: Es un atributo de apreciación difícil y se evalúa
atendiendo a la espuma que se genera al escanciar y al
aguante (Txinparta en eusquera).
Pegue: Es la película de espuma que se pega de modo Figura 8.–Aguante de
consistente a las paredes del vaso cuando se bebe la sidra. la sidra (por cortesía de
Una sidra de calidad debe dejar adherida a la pared del vaso José María Osoro)
una película consistente de finas burbujas (figura 9).
Otros términos peculiares que son empleados por los
consumidores y lagareros y que han sido trasladados como
vocablos para definir algunas características peculiares y
algunos defectos son:
Espoleta: Sidra con mucho gas que se desprende en gran
cantidad al escanciarse, por tanto, espalma intensamente
haciendo ruido e incluso puede producir que el tapón se
desprenda enérgicamente con un ruido característico (Brisk
cider). Figura 9.–Pegue de la
sidra (por cortesía de
Espumona: Sidra que produce un pegue de película frag- José María Osoro)
mentada, de burbujas no finas y poco consistente (figura 10).
Mugor: Sidra que presenta olor a moho (Underwood/
Sous-bois).
Tastu o tasto: Sidra que presenta sabor extraño, no espe-
rable en una sidra sana y se define como “sabor sucio”. Esta
sensación es comparable con los gustos a sucio, humedad o
cartón definidos para otras bebidas alcohólicas como vinos
o cervezas (Cardboard). En el caso de la sidra, conviene
resaltar que este defecto permanece generalmente escondi-
do en la nariz, detectándose sólo por vía retronasal una vez
que el producto está en la boca.
Figura 10.–Sidra con
Verdín: Sidra con acidez marcada (Sharp/ Vert). “espumona”
Dulcín: Sidra que, al contener azúcares residuales, ofrece cierto sabor dulce.
También, se le dice “sidra fémina” y amante. Este término puede considerarse
equivalente al término “abocado” usado para algunos vinos. Si el grado de dulzor
es tal que se percibe nítidamente se denomina llandío y si es marcado, llambiona.
161
Dura: Sidra con acidez volátil elevada, puede estar turbia en exceso. El tér-
mino “Dura” también se dice cuando la sidra es muy seca (Dry cider). A estas
sidras, también, se las denomina “fecha” o “machu”, aunque no queda claro si es
por la acidez volátil o por el grado alcohólico y la carencia de dulzor.
Agüina, sidrina o blanda: Sidra con poco alcohol y sin cuerpo (Thin cider,
wearish/wersh).
Turrín: Sidra con sabor a quemado u oxidada.
Ñisu: Sidra que presenta defectos de aroma y sabor a ciruelas.
Piescu: Sidra que presenta defectos de aroma y sabor a melocotón.
Sapu: Sidra con importantes defectos de aroma y sabor a podredumbre. Suele
deberse al uso de manzanas con defectos sanitarios marcados, probablemente
recogidas del suelo y sin selección adecuada (Goût de fruit).
Puxarra: Sidra con grandes defectos que no se puede beber.
En las sidrerías y entre la gente del sector sidrero son frecuentes también otros
términos como:
Palu: Conjunto de cualidades organolépticas (color, aroma, sabor, etc.) que
definen a una sidra.
Bon vasu, abre bien, pega bien, tiene alma o fai estrella: Se aplica a las sidras
que espalman y presentan suficiente gas carbónico, denotando “vida” al romper
en el vaso.
En el caso de la sidra espumosa, de modo análogo a los vinos espumosos, los
parámetros más característicos son:
Espuma: conjunto de burbujas adheridas entre sí que se forma al verter la
sidra sobre la copa y que se extienden o no por ella.
Rosarios y corona: los rosarios son los grupos de burbujas de desprendi-
miento continuado desde los puntos de nucleación en el fondo de la copa y la
corona es el círculo que forman las burbujas en la superficie de la sidra y que es
apreciable una vez reducida la espuma inicial.
Otros términos utilizados para definir las propiedades sensoriales de las sidras
o sus defectos son comunes a los empleados para otras bebidas alcohólicas
como, cuerpo, astringencia o sequedad, ahilado o “filado”, enfermedad del
amargo, apagada o muerta, turbia, sucia (olor a sulfídrico o huevos podridos),
aguada, picado láctico, etc.
Metodología del análisis descriptivo de la sidra natural

Probablemente, el tipo de análisis más empleado en la evaluación de las bebi-
das alcohólicas sean las pruebas descriptivas, que son aquéllas diseñadas para
evaluar el conjunto de propiedades que mejor permiten definir la calidad de un
162
producto y diferenciarlo de otros similares. Estas pruebas deben realizarse por

catadores expertos, sobre todo si son descriptivas cuantitativas.
Es muy escasa la bibliografía y las fuentes de información donde se pue-
dan consultar los perfiles sensoriales que se usan habitualmente para evaluar las
sidras. Sin embargo, teniendo en cuenta los criterios generalmente aplicados a
productos alimenticios, es evidente que el perfil sensorial de evaluación de la
sidra debe abarcar parámetros sensoriales que se valoran en las tres fases princi-
pales: visual, olfativa y gustativa, pudiéndose completar la evaluación con una
valoración global final. Además, de la información disponible se desprende que
las pruebas descriptivas que se están aplicando en la evaluación de sidras se han
desarrollado de forma similar a las utilizadas en otras bebidas alcohólicas.
Los perfiles simples y la selección de los parámetros de interés suelen ser
definidos por paneles formados por personas familiarizadas con el producto,
como lagareros, técnicos, restauradores, sumilleres, etc. Ésta no es una labor sen-
cilla, ya que al final debe llegarse a una situación de consenso, no sólo para ele-
gir los parámetros sino, también, para definir el significado y la interpretación de
cada uno de ellos, además de ponerse de acuerdo en el modo y orden de evalua-
ción. A modo de ejemplo, conviene resaltar que en el caso de la evaluación del
olor se debe acordar si se hará a vaso parado o con agitación; y en la valoración
del gusto si se hará con ingesta o no (expulsando el producto).
Los paneles de catadores o de jueces deben ser entrenados en el uso de las
escalas con las que se evaluarán cada uno de los parámetros del perfil sensorial,
una vez establecidos los perfiles simples. Ésta es una de las fases más difíciles
en la que se invierte más tiempo y esfuerzo. Suele ser habitual tener que enfren-
tarse a la reticencia de los jueces más entrenados y/o expertos a ser evaluados y
reeducados, en su caso. Es necesario buscar estrategias que permitan hacer
entender la importancia del consenso y, para alcanzar éste, se llevan a cabo las
denominadas catas de armonización. En estas sesiones lo que se pretende es ven-
cer la problemática derivada de que la mayoría de los jueces expertos no se han
educado siguiendo metodologías de entrenamiento similares, han desarrollado
sus habilidades sensoriales empíricamente y han establecido escalas de valora-
ción propias, no consensuadas con los demás expertos.
La armonización no es especialmente relevante cuando se realizan valoracio-
nes cualitativas (apto/no apto; típico/no típico; bueno/malo); sin embargo, se
hace imprescindible en las pruebas descriptivas cuantitativas, ya que la falta de
armonización puede provocar graves desencuentros en las valoraciones, obte-
niéndose puntuaciones dispares, con una variabilidad intrínseca elevada, no
aptas desde el punto de vista de la significación estadística de los resultados. Por
ello, se debe convencer a los jueces de la necesidad de educarse en el uso de
escalas comunes y vencer su reticencia, haciéndoles entender que eso no impli-
ca que sus escalas no sean válidas y que podrán seguir usándolas en el desarro-
llo de otras pruebas, concursos, informes, etc., en los que actúen individualmen-
te y no como miembros de un panel unificado.
163
Una vez que se comprueba que el panel de jueces evalúa dentro de los rangos
de confianza establecidos, se está en condiciones de llevar a cabo, de modo ade-
cuado y acorde a la norma, el análisis sensorial descriptivo cuantitativo.
El análisis de los perfiles empleados por diversos organismos, asociaciones
de elaboradores y consumidores, enólogos y restauradores, permite concluir que
todos ellos son cualitativamente similares, presentando tan sólo algunas diferen-
cias respecto al número de parámetros evaluados, así como en el tipo de escalas.
En la figura 11 se muestra el perfil utilizado en el SERIDA. Lo más habitual es
que en la fase visual se evalúen sólo los parámetros del comportamiento en vaso,
en la olfativa la franqueza (limpieza o ausencia de olores extraños), la frescura y
la intensidad de olor a sidra y en la fase gustativa la intensidad de sabor a sidra,
la franqueza, la frescura, el ácido, el amargo y la sequedad o la astringencia,
dejando abierta la posibilidad de indicar defectos de cualquier tipo (visuales,
olfativos o gustativos). En general, todos los perfiles incluyen una valoración
global final.
En el caso de los análisis clasificatorios en concursos y valoraciones de gru-
pos expertos los perfiles aún pueden ser mucho más sencillos, reduciéndose a un
análisis cualitativo de la presencia o ausencia de defectos y de la tipicidad o
incluso una valoración final de apta/no apta, justificada por la ausencia/presen-
cia de defectos (figura 12). En estos casos, las catas son comentadas y los comen-
tarios descriptivos son anotados en los espacios diseñados para ello (tabla 2).
Aunque lo más habitual es usar escalas de intervalo numéricas, de valores
enteros, a veces se diseñan y se emplean escalas de simbologías, ya sea con sím-
bolos internacionales y universales, como estrellas, o con símbolos más propios o
vinculados a la sidra, como por ejemplo manzanas (figura 13). Estas escalas, sue-
len permitir diferenciaciones más detalladas al permitir valorar con fracciones.
Para llevar a cabo, adecuadamente, el análisis sensorial de la sidra se deben
controlar y cuidar muchos factores, entre los que se encuentra la fatiga de los
catadores. Así, por ejemplo, no se recomienda que en una misma sesión se eva-
lúe un número elevado de sidras (no más de seis) dada la gran cantidad de pará-
metros a analizar en el caso de los perfiles sensoriales completos. Respecto a las
muestras, se debe determinar la temperatura de servicio y los márgenes permiti-
dos. En general, se establece como temperatura óptima 14º C + 1º C. Las sidras,
antes de ser servidas, se atemperarán y se mantendrán a esa temperatura durante
toda la sesión de cata.
Por otra parte, dada la peculiaridad del producto, en parte debida al anhídri-
do carbónico endógeno que hace que sólo muestre sus características más apre-
ciables tras escanciarse, se hace necesario fijar un protocolo de servicio. Las
muestras se presentarán debidamente codificadas y en orden aleatorio a cada
catador y se debe disponer de escanciador/es cualificados, recomendándose que
en cada sesión actúe el mismo para evitar la posible influencia del modo de
escanciar. Una alternativa son los escanciadores mecánicos; los modelos exis-
164
FICHA DE PRUEBA SENSORIAL DESCRIPTIVA

DE SIDRA NATURAL
Figura 11.–Perfil sensorial para sidras naturales (Pando Bedriñana, 2010)
165
Figura 12.–Fichas de calificación de sidras usadas en el SERIDA
tentes reproducen bien el escanciado tradicional y presentan la ventaja de que los

servicios presentan poca variabilidad. Se fijará la cantidad de sidra a servir y se
usarán los vasos de sidra tradicionales (figura 9).
Con la salvedad de los catavinos y las copas de cata de aceite, no existen otros
utensilios de cata normalizados. El objetivo de normalizar los recipientes es evi-
tar interferencias en la valoración y estandarizar los procesos de evaluación, para
que los diversos paneles trabajen con las menores fuentes de variación. La nor-
malización del catavinos no fue tarea fácil y hoy en día sigue siendo bastante dis-
cutida su validez universal entre los expertos del mundo del vino, quizás por ello
no se han normalizado otros recipientes. Este hecho deja cierta libertad o margen
de decisión respecto a qué útiles se deben emplear para la evaluación de pro-
ductos que no sean ni vinos ni aceites. En el caso de la sidra natural se reco-
mienda el uso del vaso tradicional de consumo, que se caracteriza por ser de cris-
tal incoloro, fino, amplio y cilíndrico.
166
Tabla 2.–Ejemplos de comentarios descriptivos de las sidras evaluadas
Sidra 354 Sidra de color dorado brillante con tonos verdes y muy limpia.
Vaso correcto con excelente espalme y buen aguante, deja pegue uniforme pero con
poca persistencia.
Olor franco y de buena intensidad, enseña aromas frutales y frescos que en segunda
olfacción tiene leves notas acéticas que no empañan.
Sabor con una intensidad aceptable y equilibrado, entra en boca con frescura y notas
ácidas para dar paso a amargos finales que dejan un retrogusto de secante
Sidra 819 Sidra de color dorado claro limpio con abundantes tonos verdes.
El vaso, de gran categoría, muestra un espalme excelente, gran aguante y un pegue
fino, uniforme y largo en el tiempo.
Olor con excelente intensidad, fresco y limpio, totalmente afrutado, recuerda a
manzana recién cortada y en su punto de madurez.
Sabor muy agradable, con amplia entrada en boca, tiene muy compensados los
ácidos y amargos, dejando un final agradable amargo con secante suave y
persistente que invita a seguir bebiendo.
Sidra redonda.
Figura 13.–Muestra de escalas de intervalo estructuradas simbólicas usadas para valorar la calidad global de
los parámetros indicados
Dada la importancia que tiene la evaluación del comportamiento de la sidra

en el vaso, es imprescindible fijar el tiempo máximo que debe transcurrir entre
el escanciado y la valoración, siendo recomendable que la sidra se escancie
delante del juez que recibirá el vaso inmediatamente.
Cuando se opte por la valoración del color y la turbidez se establecerá, tam-
bién, el momento de su evaluación, siendo recomendable hacerla una vez que
finalice la valoración del aguante. En general, la sidra natural de calidad debe
presentar colores de baja intensidad y respecto a su turbidez hay que tener en
cuenta que ésta hace referencia a la presencia de partículas irregulares de tama-
ño considerable en suspensión.
En relación con la evaluación olfativa, conviene señalar que es recomendable
hacer una valoración a vaso parado, sin agitación, una vez concluida la evalua-
ción del aguante; posteriormente, se efectúa una segunda olfacción tras una lige-
ra agitación. En todas las fuentes consultadas se ha observado que es habitual la
valoración de la intensidad del olor típico a “sidra”, aunque la “tipicidad” es una
característica compleja de definir. Por tanto, este parámetro olfativo, así como el
sabor típico a “sidra”, son dos casos en los que el consenso del panel es vital para
llegar a una correcta evaluación y validar la ficha de cata y el método. Por otra
167
parte, aunque no siempre aparece en los perfiles sensoriales revisados, con cier-
ta frecuencia se incluye la valoración del olor a borras, referido al olor residual
a levadura o lías.
En ningún caso se ha encontrado referencia expresa a si el análisis descripti-
vo de la sidra natural se realiza con ingesta o no de la misma. Sólo se ha detec-
tado cierta información indirecta, ya que, en algún caso, se recomienda comer
algo de pan entre la cata de sidras, lo que suele hacerse en evaluaciones con
ingesta. La sidra, salvo excepción de aquéllas que presentan excesiva acidez, no
es un producto de características agresivas que hagan desaconsejable la ingesta.
Además, la evaluación de la persistencia y el retrogusto es mucho más fácil si se
ingiere el producto.
De los cinco sabores básicos reconocidos, en la sidra es importante la eva-
luación del dulce y esencialmente la del ácido y el amargo, que deben distin-
guirse de la astringencia. Por otra parte, el amargo típico de ciertas variedades de
manzanas sidreras no debe confundirse con el que produce la alteración del
amargor, intenso y agresivo, que es acompañado, generalmente, de otros defec-
tos olfativos o de estructura como es el caso de las modificaciones de la densi-
dad y el cuerpo. No es deseable una persistencia intensa, siendo bien valorada
una sensación final de frescura y justa astringencia.
Metodología del análisis descriptivo de la sidra

Todo lo descrito para la sidra natural es válido para la sidra con las salveda-
des derivadas de sus peculiaridades sensoriales, especialmente las que se valoran
en la fase visual.
En este tipo de sidras la evaluación del aguante y el pegue no procede y, por
el contrario, cobran especial importancia otros parámetros como la limpidez o la
transparencia y el brillo, a la vez que se deben valorar nuevas características
como los rosarios, la corona y la espuma.
La espuma debe formarse en abundancia y llenando la copa y debe reducirse
en el mismo tiempo en que se ha formado. Se dice que es abundante si llena toda
la copa y persiste un tiempo superior al de su formación; se considera normal
cuando llena toda la copa y se reduce con la misma velocidad con que se ha for-
mado; y se dice que es escasa cuando la espuma formada prácticamente no llena
la copa y desaparece en pocos segundos.
Los rosarios deben ser abundantes en número, continuos y de burbujas finas.
Al desaparecer la espuma queda un círculo de burbujas en la superficie del lí-
quido. Este círculo puede ser completo, ocupando toda la superficie, entonces
se dice que es total. Pero, también, puede ocurrir que sólo queden burbujas
cubriendo una parte del mismo, entonces se habla de encajes o puede ser que las
burbujas se dispongan formando una circunferencia anexa a las paredes de la co-
pa, que puede ser completa o parcial, entonces se define como corona (figura 14).
168
Distribución burbujas en la superficie
Total

Figura 14.–Formación de
diferentes tipos de agrupaciones
de burbujas en la superficie de
Encajes la sidra espumosa
Rosarios
Corona
Además, el círculo total, los encajes o la corona, pueden estar formados por dos o
tres capas de burbujas superpuestas, en este caso se habla de formaciones densas
o por una única capa de burbujas, entonces se definen como formaciones finas.
En la fase olfativa cobra especial importancia la valoración de las notas fru-
tales y florales, seguidas de las especiadas; y en la fase bucal es interesante eva-
luar la pungencia (capacidad de pungir) vinculada a la efervescencia y a la cali-
dad de las burbujas.
La realización del análisis descriptivo
de estas sidras implica, igualmente, usar
los utensilios más adecuados, en este caso
lo más apropiado y habitual es usar copas
típicas de vinos espumosos, estrechas y
largas (figura 15). Los catavinos normali-
zados son una alternativa, pero se usan
con poca frecuencia.
La temperatura de servicio será en tor-
no a 10-12º C. Es igualmente recomenda- Figura 15.–Copas utilizadas en la cata de sidras
ble establecer un protocolo de tiempos
máximos entre el servicio y la entrega al catador, así como el tiempo de apertu-
ra de la botella que se usará para servir a los distintos jueces; también, conviene
determinar cómo se van a mantener las botellas hasta que sean catadas.
Otras pruebas sensoriales

Si bien los análisis descriptivos son los mayoritarios, las pruebas discrimina-
torias y/o hedónicas también pueden ser de interés en determinados momentos.
Las hedónicas se aplican, esencialmente, para estudios de mercado en los que
interesa evaluar cuál es el grado de aceptación o preferencia de una determinada
169
sidra frente a otras. Tienen interés para valorar el posicionamiento de una sidra
frente a la competencia y se hacen imprescindibles para lanzar al mercado, con
cierta certeza de éxito, un nuevo producto como, por ejemplo, la sidra de nueva
expresión. Los que deben desarrollar estas pruebas son consumidores y es dese-
able que sean grupos estadísticamente representativos de los potenciales consu-
midores o de los grupos de población con intención de compra de ese tipo de
sidra. Tal y como corresponde al número de muestras a evaluar se aplicará una
prueba pareada, si se desea comparar dos muestras y pruebas de ordenación si
son más de dos.
Las pruebas discriminatorias se aplican, también, dentro de las empresas con
diferentes fines como, por ejemplo, para evaluar el efecto de la aplicación de
nuevas tecnologías, procesos, coadyuvantes, materiales, materias primas, etc.,
sobre la calidad y características de las sidras obtenidas. En estos casos las prue-
bas deben ser hechas por catadores o jueces expertos, en un número mínimo
basado en los intervalos de confianza deseados. De nuevo, en función del núme-
ro de sidras a evaluar se usarán pruebas de diferencias (dos sidras) o de ordena-
ción (más de dos).
Componentes de la sidra más vinculados a sus características sensoriales

Son muchos los componentes de la sidra que están vinculados a sus propieda-
des sensoriales. Es indudable que uno de los responsables principales de las pro-
piedades específicas de las sidras es el anhídrido carbónico. Este gas está relacio-
nado con la mayoría de los parámetros que se valoran en la fase visual (espalme,
espuma, rosarios, aguante, gas, etc.) así como con la capacidad de pungir. Además,
contribuye a la sensación de frescor y también modula la acidez y la astringencia.
En el caso de productos muy carbonatados debe cuidarse su efecto sobre la valo-
ración olfativa, porque la pungencia nasal puede disminuir esta sensación.
La turbidez fina, propia de las sidras naturales, se debe esencialmente a macro
componentes de naturaleza coloidal, como polifenoles, pectinas y otros polisa-
cáridos, proteínas y péptidos, que se encuentran libres o condensados. Además,
la turbidez se produce por la presencia en suspensión de pequeños fragmentos de
células vegetales y de levaduras, agregados bacterianos, etc. Por otra parte, cier-
tas sales orgánicas como los oxalatos e inorgánicas como los fosfatos y sulfatos,
también, pueden contribuir a la turbidez. Desde el punto de vista de la calidad,
la turbidez es negativa si es grosera, deja poso o si son visibles partículas de gran
tamaño.
Muchas de las sustancias responsables de la turbidez afectan a la calidad de
la espuma, al espalme y al aguante. Así, por ejemplo, los polisacáridos de natu-
raleza ácida ejercen una acción negativa sobre las propiedades espumantes de las
sidras (Mangas y col., 1999), mientras que los contenidos de proteínas y poli-
fenoles totales se han asociado positivamente con la espumosidad de las sidras
(Picinelli y col., 2005).
170
El color de la sidra, que debe ser claro, se debe a la presencia de pigmentos

presentes en las manzanas, clorofilas, carotenoides y compuestos fenólicos. Es-
tos últimos, en su mayoría, son incoloros pero se oxidan fácilmente dando tonos
amarillos, dorados, marrones, etc., según avanza el grado de oxidación (Bajaj y
col., 1997). En casos excepcionales, cada vez menos frecuentes debido al uso
extendido del acero inoxidable, las sidras pueden presentar colores verdosos
intensos por formación de complejos metálicos de hierro y/o cobre.
Los olores y aromas característicos de las sidras se deben esencialmente a las
transformaciones producidas durante las fermentaciones, son los aromas fer-
mentativos, siendo minoritarios los pre-fermentativos. Los aromas frutales se
deben esencialmente a la presencia de acetatos (por ejemplo, acetatos de isoami-
lo y hexilo) y los florales se asocian a otros volátiles como el 2-feniletanol o el
acetato de 2-feniletilo (Le Quéré y col., 2006).
El aroma típico a “sidra” ha sido vinculado a diferentes compuestos, entre los
que se encuentra el hemiacetal 1-etoxi-5-octen-1-ol (Lea, 1995) y los 1,3-dioxanos
derivados de la acetalización de diversos alcoholes como el octano-1,3-diol, el
5-octen-1,3-diol o la glicerina (Williams y col., 1983; Dietrich y col., 1997; Kavva-
dias y col., 1999). Los dioles citados, junto con el octano-1,3,7-triol, son típicos de
la manzana y están tanto en forma libre como glicosilada en el fruto (Beuerle y col.,
1996), transformándose en acetales en el transcurso de la fermentación.
La presencia de aldehídos procedentes del fruto y del metabolismo de las le-
vaduras, como el acetaldehído, el propanal, el butanal, el 2-metilpropanal, el he-
xanal, el 3-metilbutanal y el 2-metilbutanal, así como de polialcoholes, da lugar
a la formación de una gran diversidad de estructuras químicas que contribuyen
al aroma de la sidra, como es el caso de los 1,3-dioxanos y de los 1,3-dioxolanos,
responsables de los denominados aromas “verdes”.
Los sabores característicos de la sidra son el ácido y el amargo, que deben
estar en justo equilibrio entre sí y con las demás sensaciones bucales. La impor-
tancia de estos dos sabores se pone de manifiesto, por ejemplo, en el hecho de
que las sidras francesas e inglesas se han clasificado tradicionalmente en grupos
dependiendo de su acidez total, asociada al sabor ácido y por el contenido de
taninos, asociado al amargo, sin tener en cuenta la concentración de azúcares.
Así, sidras con poca acidez (<4,5 g/L) y pocos taninos (<2 g/L) son clasificadas
como dulces (Lea, 1990). Los rangos de dulzor de las sidras son muy variables,
existiendo sidras secas o “brut”, semidulces y dulces. En el caso de las sidras
naturales los rangos de dulzor son menores y en general son secas.
Los máximos responsables de las sensaciones ácidas son los ácidos málico,
quínico, láctico, dihidrosiquímico, citramálico y succínico, que estarán en mayor
o menor cantidad dependiendo del desarrollo de la fermentación alcohólica y
maloláctica. A mayor cantidad de ácido málico más agresiva e intensa es la sen-
sación de acidez, mientras que su conversión a ácido láctico suaviza y redondea
la sensación ácida. La acidez de ciertas sidras también se debe a la presencia del
ácido acético en cantidades por encima de su umbral de percepción. Se cree que
171
este ácido da “carácter” e imprime personalidad a la sidra natural, siendo habi-

tual su presencia en cantidades superiores a las habituales e incluso a las desea-
bles en otras bebidas alcohólicas como vinos y cervezas.
Hoy es bien conocido que los máximos responsables del amargor de las sidras
son las proantocianidinas, compuestos que también lo son de la astringencia.
El nivel de amargor y astringencia varía según el grado y tipo de polimerización
y difiere entre monómeros y sus derivados (Noble, 2002). La influencia de la
isomería es muy importante; se ha descrito que la catequina (cat) es más tánica
que la epicatequina (epi) y que el dímero C4-C8, cat-cat, es menos astringente que
el C4-C6, cat-cat, o que el C6-C8, cat-epi. En general, el nivel de astringencia
aumenta con el grado de polimerización, si bien a partir de un determinado peso
molecular disminuye, ya sea por pérdida de solubilidad de los polímeros o por
impedimentos estéricos para reaccionar con las proteínas. Se ha descrito que la
capacidad de las proantocianidinas para interaccionar con las proteínas salivares,
ricas en prolina, aumenta con el grado de polimerización hasta, al menos, 4.500
Da, mientras que su capacidad de reacción con α-amilasas y seroalbúmina bovi-
na (BSA) aumenta hasta 3.400 Da y luego decrece.
El amargor se comporta de modo contrario a la astringencia; en general, los
monómeros son más amargos que astringentes y los trímeros y tetrámeros al
revés. De nuevo, el tipo de unión afecta de modo distinto, uniones C4-C6 produ-
cen compuestos más amargos que las C4-C8 y, también, se ha observado el efec-
to de la isomería, habiéndose descrito que la epicatequina es significativamente
más amarga que la catequina y, por ello, muestra mayor persistencia.
Por otra parte, debe considerarse que la condensación de los “taninos” (pro-
antocianidinas) con otros polímeros, especialmente de naturaleza glucídica, tam-
bién modifica su astringencia y amargor y, en general, suaviza ambas sensacio-
nes. Además, tanto el amargo como la sensación de astringencia dependen de la
presencia de otras sustancias con efecto sinérgico o antagónico.
Es bien sabido que el sabor dulce enmascara tanto el sabor ácido como el
amargo, lo que puede ser debido a la competencia de los estímulos por los recep-
tores o a los cambios en el flujo electrolítico intracelular. La incidencia del alcohol,
que aumenta la sensación dulce, no parece tener un efecto ni sinérgico ni antagó-
nico importante en cuanto a la intensidad del amargo, sin embargo, se ha descri-
to que el alcohol intensifica la duración y persistencia de esta sensación y reduce
la astringencia. El efecto de los ácidos es contradictorio, en algunos casos no se
encuentran diferencias y, en otros, se detecta la existencia de un efecto sinérgico
dependiente del ácido. No obstante, el pH del medio afecta a la percepción de la
astringencia, que se intensifica a pH más ácido. Por otra parte, a temperaturas
más bajas la percepción de la astringencia disminuye, pero con un efecto menos
significativo que el que produce la modificación del pH. Por último, los azúcares
y polisacáridos suavizan la sensación de astringencia, sin embargo, parece que la
disminución de la percepción de la astringencia se debe al cambio de la viscosi-
dad del medio que producen estas sustancias y no al aumento del dulzor.
172
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174
6. Clarificación y estabilización de la sidra
Fenómenos coloidales
Las dispersiones coloidales se caracterizan por estar formadas por partículas
con un tamaño comprendido entre 10 nm y 10 µm. Poseen propiedades eléctri-
cas y ópticas (las más pequeñas presentan efecto Tyndall y las de tamaño medio
provocan opalescencia). En las bebidas alcohólicas, como la sidra, las dispersio-
nes coloidales incluyen partículas de sólidos, macromoléculas y agregados mole-
culares (micelas) que están formados por una asociación de moléculas unidas por
fuerzas de baja intensidad, como las interacciones hidrofóbicas, los puentes de
hidrógeno o las fuerzas atractivas de van der Waals.
Con carácter general, se asume que la estabilidad de las dispersiones coloi-
dales está basada en las propiedades eléctricas de las partículas que las forman,
si bien los coloides hidrofílicos disponen de una capa de hidratación que comu-
nica una estabilidad adicional a la originada por las cargas eléctricas. Por otra
parte, conviene señalar que determinados coloides, denominados protectores,
cubren la superficie de las partículas coloidales, comunicándoles mayor estabili-
dad a través de impedimentos estéricos y repulsiones electrostáticas.
La carga eléctrica presente en las partículas coloidales es consecuencia de
procesos de ionización, es el caso de las dispersiones coloidales formadas por
macromoléculas, o de adsorción de carga en la superficie de la partícula coloi-
dal. De acuerdo con el modelo de Stern, cada partícula presenta una doble capa
eléctrica formada por iones de signo contrario que se estructura en dos zonas (ver
figura 1), la capa de Stern (formada por iones de signo contrario a la carga de la
partícula y que están rígidamente unidos a su superficie) y la capa de difusión,
en la que los iones positivos y negativos presentan mayor movilidad; el conjun-
to de ambas capas forma la doble capa eléctrica.
La función que relaciona el valor del potencial eléctrico generado por la par-
tícula coloidal y la distancia es de carácter exponencial (ver figura 1); se distin-
guen diferentes potenciales, a saber: a) potencial de superficie; b) potencial de
175
Stern; y el potencial zeta (ξ= 4πδe/ε; δ:

espesor de la doble capa; e: carga por uni-
dad de superficie; ε: constante dieléctrica).
El potencial de superficie es el valor que
presenta éste en la superficie de la partícula,
el potencial de Stern es el que existe en la
capa de Stern y el potencial zeta (ξ) es el
valor del potencial en la zona límite del pla-
no de deslizamiento, dentro de la capa difu-
sa, donde todas las cargas que están dentro
de este límite se mueven con la partícula.
Este potencial es, en buena parte, responsa-
ble de la movilidad y estabilidad de la partí-
cula coloidal, de hecho, se considera que las
partículas coloidales son estables para valo-
res del potencial ξ mayores de 30 mV y
menores de -30 mV.
La teoría DLVO (llamada así por Derja-
Figura 1.–Potencial y distribución de cargas
en una partícula cargada en disoluciónguin, Landau, Verwey y Overbeek) permite
explicar la estabilidad de los sistemas co-
loidales sobre la base del balance entre las fuerzas atractivas de van der Waals
(Ea= -Ar/12D; A: constante de Hamaker; r: radio de la partícula; D: distancia
entre partículas) y las repulsivas electrostáticas (Er= cte. r2 ξ2 e –D/δ/R; R: distan-
cia entre los centros de las partículas). Las fuerzas atractivas (Ea) cobran impor-
tancia cuando tenemos partículas de gran tamaño muy próximas (elevados valo-
res de r/D, por ejemplo, partículas de 100 nm separadas menos de 5 nm) y las
repulsivas (Er) son directamente proporcionales al tamaño de la partícula (r), a
su potencial eléctrico (ξ) y al espesor de la capa de difusión (δ), e inversamente
proporcionales a la distancia que las separa (D, R). Las fuerzas repulsivas están
también afectadas por la fuerza iónica (I) existente en el medio, ya que a medi-
da que I aumenta el espesor de la
doble capa disminuye y la repul-
sión es menor. La curva de ener-
gía neta de interacción (Ea + Er),
de acuerdo con la teoría DLVO,
se recoge en la figura 2.
Como se puede observar
en esta figura, en un intervalo de
distancia entre partículas la ener-
gía neta es positiva, existiendo,
por ello, una barrera de energía
que las partículas deben superar
para poder aproximarse lo sufi-
Figura 2.–Curva de energía de acuerdo con la teoría DLVO ciente para que se produzca una
176
agregación irreversible (coagulación). La altura de esta barrera indica cómo de

estable es el sistema. Para aglomerar dos partículas, deben tener suficiente ener-
gía cinética (relacionada con el movimiento Browniano) para poder superar
dicha barrera. Si ésta desaparece, entonces la interacción neta es totalmente
atractiva y, consecuentemente, las partículas se aglomeran. Cuando esto ocurre
se produce una trampa de energía donde el sistema coloidal está gobernado úni-
camente por fuerzas atractivas, produciéndose la coagulación.
Este fenómeno irreversible se lleva a cabo en el mínimo primario de la curva
de energía neta de interacción; sin embargo, a una mayor distancia entre las par-
tículas y cuando éstas tienen más tamaño (aprox. 250 nm), existe un mínimo
secundario en la curva de energía donde se produce el fenómeno de floculación,
que es una agregación reversible. Por tanto, en el entorno de los mínimos existe
una atracción que es fuerte en el mínimo primario y débil en el secundario y
fuera de estos entornos las partículas se repelen.
Las dispersiones coloidales formadas por macromoléculas juegan un impor-
tante papel en los procesos de clarificación, particularmente, cuando se utilizan
proteínas (“fining”) y taninos. Así, por ejemplo, cuando una proteína es añadida
a la sidra (por ejemplo, gelatina) se dispersa en partículas coloidales hidrofílicas
con carga positiva. La presencia de taninos provoca la formación de un coloide
hidrófobo negativo en el que se ha producido la desnaturalización de la proteína,
como consecuencia de la formación del complejo tanino-proteína. Al existir
iones (cationes) en la sidra se produce la “descarga” de las partículas coloidales
hidrófobas electronegativas o, dicho de otro modo, la barrera energética (factor
de estabilización) disminuye, pudiendo ser ésta superada por la energía térmica
que presentan las partículas, lo que provoca su floculación. Actualmente, se
admite que los polifenoles (taninos) se agrupan mediante fuerzas hidrofóbicas
para formar partículas coloidales las cuales, a través de interacciones de baja
intensidad, se asocian y floculan con macromoléculas coloidales proteicas.
Este proceso provoca la separación de las partículas en suspensión y coloida-
les produciendo, en consecuencia, la clarificación y estabilización de la sidra.
Por otra parte, la presencia de polisacáridos puede inhibir la interacción entre el
coloide tánico y el proteico debido a la interacción que se produce entre los tani-
nos y los polisacáridos, lo que aporta estabilidad a las partículas coloidales.
Determinados polisacáridos y manoproteínas pueden actuar como coloides
protectores, de tal forma que una dispersión coloidal inestable se estabiliza en
presencia de éstos, es el caso, por ejemplo, de la goma arábiga. Su efecto pro-
tector se debe a que se adsorbe sobre la partícula coloidal. La estabilidad de la
dispersión coloidal se asegura cuando la superficie de cada partícula está ínte-
gramente cubierta por el coloide protector. Sin embargo, si la concentración de
éste no es lo suficientemente elevada puede actuar como puente entre dos partí-
culas coloidales, lo que provoca su floculación y, por el contrario, si la concen-
tración del coloide protector es muy superior a la necesaria para cubrir la super-
ficie de las partículas coloidales, se produce una desestabilización del sistema
177
coloidal al ejercer, el coloide protector, una presión osmótica que hace que las
partículas coloidales se aproximen, aglomeren y floculen.
Clarificación y estabilización: uso de proteínas

Estos procesos tienen por objeto eliminar la turbidez de la sidra y conseguir
un nivel de estabilización que impida que ésta se enturbie de nuevo y se produz-
can sedimentos en la botella que limiten su calidad. Hay dos procedimientos clá-
sicos de clarificación y estabilización, la sedimentación y el tratamiento con pro-
teínas (“fining”).
La fuerza (f) que posibilita la sedimentación de las partículas se relacio-
na con la gravedad (g), el volumen de la partícula (V) y la diferencia de densi-
dad entre la partícula (dp) y el líquido (dl) a través de la siguiente expresión:
f= V (dp - dl)*g. Por otro lado, la velocidad (v) de sedimentación de las partícu-
las está controlada por la ley de Stokes [v= 2r2 (dp-dl) g/9η], donde r es el radio
de la partícula y η es la viscosidad. Como se puede deducir, la velocidad de sedi-
mentación aumenta con el tamaño y densidad de la partícula y con la disminu-
ción de la densidad y viscosidad de la sidra. No obstante, la carga de las partícu-
las juega un importante papel en la sedimentación y, por consiguiente, el pH, al
condicionar su carga, también afecta a este proceso. Otras variables como la tem-
peratura, la presión y el tipo de depósito también influyen en la sedimentación.
Así, por ejemplo, los depósitos de madera pequeños favorecen la clarificación;
por el contrario, los recipientes de acero inoxidable pueden tener carga eléctrica
en las soldaduras y limitar la clarificación.
Una vez conseguida la sedimentación de las partículas se procede al trasiego.
En esta operación se incorporan cantidades variables de oxígeno que pueden
limitar el desarrollo de determinadas bacterias lácticas, como las que provocan
el “filado”, si bien la presencia de oxígeno, azúcares y bacterias lácticas hetero-
fermentativas favorece la producción de acidez volátil. También, la presencia de
oxígeno eleva el potencial redox, limitando, con ello, la presencia de compues-
tos de azufre que producen aromas a reducido; éste es el caso de los tioles, cuyo
potencial redox (tiol/disulfuro) es muy bajo (entre -270 y -220 mV), o el del sul-
furo de hidrógeno (H2S) que presenta el olor típico a “huevos podres”. El nivel
de oxigenación en el trasiego está condicionado por la técnica utilizada. Así, por
ejemplo, cuando se persigue un trasiego en ausencia de aire la sidra debe entrar
en el depósito por la boca inferior de éste, si, por el contrario, se pretende trase-
gar con cierta aireación, la entrada debe realizarse por la parte superior y si el
objetivo es trasegar con máxima aireación se puede distribuir el líquido a través
de un embudo colocado en la parte superior del tonel.
La clarificación por la técnica “fining” supone la adición de una proteína a la
sidra como, por ejemplo, la gelatina, la albúmina de huevo o la caseína. Este pro-
ceso forma partículas que, al insolubilizarse, arrastran a otras existentes en la
sidra provocando su clarificación y estabilización. El mecanismo de clarificación
se esquematiza en la figura 3.
178
Figura 3.–Mecanismo propuesto de clarificación mediante proteínas (Ribéreau-Gayon y col., 2006a)
Cuando la proteína se encuentra en disolución acuosa es un coloide hidrófilo

electronegativo y, como se ha indicado, al incorporarse a la sidra (pH entre 3,5 y
3,8) se convierte en un coloide hidrófilo electropositivo. Las partículas electro-
negativas que provocan turbidez se asocian con las proteínas, produciéndose una
descarga de ambas partículas y formando flóculos que sedimentan en el fondo
del tonel, lo que provoca la clarificación de la sidra. También, como se ha seña-
lado, la asociación de los polifenoles (taninos) presentes en la sidra, o añadidos,
con las proteínas produce partículas coloidales hidrófobas electronegativas (ver
figura 3) que, en presencia de cationes, como el calcio, floculan y clarifican la
sidra.
El proceso de descarga que se produce durante la clarificación puede ser
monitorizado midiendo el potencial de capilaridad (Vs; potencial de “strea-
ming”), que es aquél que se establece cuando un líquido se mueve en la doble
capa eléctrica, estando directamente relacionado con el potencial zeta de la
partícula. Antes de clarificar se parte de un potencial Vs negativo, motivado por
la presencia de partículas electronegativas (turbios y polifenoles) y, a medida
que se añade la proteína (con carga positiva) el Vs aumenta, alcanzando un va-
lor igual cero en el punto de neutralización. Posteriormente, se vuelve positivo
179
cuando se produce un exceso de proteína. La clarificación está afectada por el

pH, el O2, la temperatura y las concentraciones y tipos de polifenoles y proteí-
nas. Así, por ejemplo, la disminución de la temperatura potencia la formación de
flóculos, lo que pone en evidencia la existencia de interacciones por puentes de
hidrógeno, y la presencia de oxígeno y la menor acidez favorecen la floculación,
ya que el oxígeno incrementa la concentración de cationes como el hierro (III)
(que forman complejos férricos que precipitan proteínas, ver figura 3) y a medi-
da que el pH aumenta nos acercamos al punto isoeléctrico de la proteína, por lo
que se minimizan las repulsiones electrostáticas entre proteínas y se favorece la
precipitación de los complejos proteína-polifenol.
Estos complejos se forman y estabilizan a través de enlaces por puentes
de hidrógeno (entre el grupo carbonilo del enlace peptídico y el hidroxilo del
polifenol) e interacciones hidrofóbicas entre zonas apolares de las proteínas y
los polifenoles, es el caso, por ejemplo, de las interacciones que se producen
entre los anillos aromáticos de los polifenoles y el de pirrolidina de la prolina.
La presencia de este aminoácido en las proteínas dificulta la formación de la
estructura secundaria en hélice y su compactación estructural, lo que favorece
las interacciones por puente de hidrógeno entre el grupo carbonilo de la prolina,
especialmente activo al estar próximo a una amina secundaria y los grupos hidro-
xilo de los polifenoles; de hecho, la mayor afinidad entre proteínas y polifenoles
se produce cuando las proteínas contienen alta concentración de prolina.
Este tipo de interacciones entre proteínas y polifenoles pueden ser de carác-
ter no covalente, lo que hace que la precipitación de los agregados moleculares
sea reversible; sin embargo, cuando la interacción proteína-polifenol tiene carác-
ter covalente, por ejemplo a través de una quinona, como consecuencia de la oxi-
dación del polifenol, la precipitación es irreversible. Por otra parte, de acuerdo
con el mecanismo (ver figura 4) propuesto por Siebert y col. (1996), la forma-
ción de partículas proteína-polifenol de mayor tamaño se produce cuando el
número de moléculas de polifenol es igual al número de lugares de recepción
existentes en la proteína para los polifenoles. Cuando la concentración de poli-
fenoles es superior a la de proteínas, los lugares de enlace de las proteínas esta-
rán ocupados por éstos, existiendo menor probabilidad de unir las asociaciones
proteína–polifenol, lo que limita la formación de una red de partículas de gran
tamaño. Cuando el contenido de polifenoles es menor que el de proteínas, que-
darán libres lugares de enlace para los polifenoles lo que igualmente limita la
unión de las asociaciones proteína-polifenol, por lo que se formarán partículas de
menor tamaño.
Los productos que habitualmente se utilizan en la clarificación de la sidra con
proteínas son la gelatina y la caseína. Además, se emplea el tanino enológico y
otros productos de carácter inorgánico, como la bentonita.
Desde el punto de vista enológico la gelatina se puede clasificar del modo
siguiente: a) gelatina soluble en caliente con alta masa molecular (>EXP5) y ele-
vada carga eléctrica; b) gelatina líquida de masa molecular intermedia (<EXP5)
180
Figura 4.–Mecanismo de interacción propuesto entre proteínas y polifenoles (Siebert y col., 1996)
y con débil carga eléctrica; y c) gelatina soluble en frío, con muy baja carga eléc-
trica y con una masa molecular inferior a EXP5. A medida que la gelatina pre-
senta más carga tiene mayor actividad frente a los taninos. Por ello, cuando la
sidra tiene poco cuerpo es conveniente utilizar gelatinas con baja o media carga,
ya que éstas se asociarán solamente con aquellas moléculas tánicas muy carga-
das, no interaccionando con el resto. La dosis habitual de gelatina está compren-
dida entre 3 y 7 g/hL. No obstante, hay que tener en cuenta que un exceso de esta
proteína puede ocasionar “sobreencolado”. Este proceso provoca una desestabi-
lización coloidal que origina la formación de turbios y sedimentos. Para evitar el
“sobreencolado” es necesario disponer de suficiente cantidad de taninos que se
combinen con las proteínas añadidas. Así, por ejemplo, utilizando concentracio-
nes de hasta 10 g/hL de tanino enológico se previene este problema.
La caseína es una heteroproteína globular que contiene fósforo. En disolución
acuosa es un coloide hidrófilo con un punto isoeléctrico (pI) de 4,6. Se caracteri-
za porque su coagulación y precipitación se produce como consecuencia del pH
ácido existente en la sidra. Por encima de su pI, las micelas de caseinato formadas
por las diferentes caseínas (αs1, αs2, β, y κ) están estabilizadas mediante repulsión
eléctrica negativa (ξ= -20 mV a pH 6,7) (Phadungath, 2005), que está producida
por los grupos fosfato y carboxilo de los ácidos glutámico y aspártico presentes en
la caseína κ. Cuando el pH baja la carga se neutraliza y la proteína coagula. Esta
propiedad de coagular en medio ácido provoca que el uso de la caseína no pro-
duzca “sobreencolado”, a diferencia de lo que ocurre con la gelatina. La dosis nor-
mal está comprendida entre 10 y 20 g/hL. Su manipulación es más compleja, ya
que hay que garantizar una correcta distribución de la caseína por toda la sidra
antes de que comience la coagulación de ésta, lo que ocurre muy rápidamente.
181
La bentonita es un silicato de aluminio hidratado (Al2O3, 4SiO2, nH2O) que

en disolución acuosa se presenta como una dispersión coloidal hidrófoba con una
fuerte carga negativa y una gran superficie específica de adsorción (5 m2/g), lo
que le confiere un potente poder adsorbente de partículas electropositivas, como
las proteínas presentes en la sidra en los procesos de clarificación mediante
“fining”. Se trata de un coloide poco selectivo con las proteínas, es decir, se une
a ellas con independencia de su tamaño, punto isoeléctrico o de que estén libres
o asociadas con polifenoles. Así, por ejemplo, es capaz de separar de igual mane-
ra proteínas ricas en prolina, que causan turbidez, como aquéllas vinculadas a la
formación de la espuma, a diferencia de lo que ocurre con el gel de sílice que es
muy selectivo con las proteínas ricas en prolina (Siebert y Lynn, 1997).
La bentonita es un producto de clarificación muy utilizado para garantizar la
no existencia de “sobreencolado”. Contiene iones intercambiables como magne-
sio, calcio y sodio que afectan de manera muy significativa a sus propiedades
físico-químicas, siendo la bentonita sódica y cálcica la más utilizada en la clari-
ficación de la sidra. Las bentonitas presentan un retículo cristalino con amplios
espacios laminares, 100 Å para la bentonita sódica y 10 Å para la cálcica, que
permiten la absorción de agua de hasta 12 veces su volumen. El mayor espacia-
miento entre láminas que tiene la bentonita sódica se traduce en que ésta presenta
mayor capacidad de hinchamiento en agua y de adsorción de proteínas. La dosis
necesaria es muy variable, entre 50 y 300 g/hL de acuerdo con Oreglia (1978).
Clarificación y estabilización por filtración

Filtración frontal (“deadend”). La filtración estándar, denominada frontal o
transversal, se caracteriza porque el líquido circula perpendicularmente a la super-
ficie filtrante, a diferencia de la filtración tangencial (“cross flow”) donde el líqui-
do se mueve en el sentido tangencial al medio filtrante. Por otra parte, el meca-
nismo por el cual las partículas son retenidas en la barrera de filtración determina
si se trata de una filtración en superficie, es el caso de una membrana con un diá-
metro de poro más pequeño que las partículas presentes en el líquido; o una fil-
tración en profundidad (“depth”), donde las partículas son retenidas, fundamen-
talmente, en el interior del medio filtrante por adsorción y en función de su tamaño.
Los mecanismos de adsorción se describen de acuerdo con la teoría DLVO,
que combina las fuerzas intermoleculares de van der Waals (atractivas de corto
alcance: de interacción dipolar por orientación, inducción y dispersión; y de
repulsión de Born, de muy corto alcance) y aquéllas debidas a la doble capa eléc-
trica. En general las fuerzas de van der Waals son de tipo atractivo y las de doble
capa son repulsivas, aunque éstas últimas pueden ser, también, de carácter atrac-
tivo. Cuando las fuerzas entre la partícula y la superficie del medio filtrante son
netamente repulsivas, la partícula únicamente será capturada en la matriz del fil-
tro por su tamaño. Sin embargo, si las fuerzas netas son atractivas, la partícula
puede ser retenida, además, por atracción electrostática.
182
Las leyes que gobiernan la filtración (Ribéreau-Gayon y col., 2006b) se pue-

den clasificar, en función del tipo de colmatación del filtro, del modo siguiente:
A) con oclusión o taponamiento repentino o gradual de los poros sin acumu-
lación de materiales en la superficie del filtro; y B) con acumulación de las
partículas en la superficie del filtro, formando una torta o capa de filtración.
A partir de estas leyes se pueden conocer parámetros de interés del proceso de
filtración como, por ejemplo, el volumen máximo que se puede filtrar.
A1. Filtración con rápida obstrucción de los poros. En esta situación, la ecua-
ción que relaciona el caudal (Q) y el volumen filtrado (V) en un instante deter-
minado de tiempo (t) es la siguiente:
Q=dV/dt= -K1* V + Q0, siendo K1 una constante y Q0 el caudal
al comienzo del proceso
Como se puede observar, el caudal disminuye a medida que el volumen fil-
trado aumenta, determinándose el volumen máximo a filtrar (VM) cuando el cau-
dal es cero, por lo que VM= Q0/K1. A partir del registro del tiempo de proceso y
los volúmenes filtrados se puede calcular K1 mediante la expresión:
t= 1/K1* ln {1/[Q0-K1* V]}
A2. Filtración con una paulatina obstrucción de los poros. La ecuación que
relaciona el volumen filtrado (V) con el tiempo (t) de proceso es la siguiente:
t/V= t* K2 + 1/Q0, o bien 1/V= K2 + 1/t* Q0; siendo K2 una constante
Si se registra t/V frente a t se puede estimar la constante K2 (pendiente de la
recta) y Q0, ya que 1/Q0 es la ordenada en el origen. En este caso, el volumen
máximo a filtrar (VM) se puede calcular a partir de dicha ecuación cuando el
tiempo tiende a ∞. En esta situación, el término 1/t* Q0 tiende a cero y VM=1/ K2.
B. Filtración con acumulación de materiales en la superficie del medio fil-
trante. En este caso, la ecuación que relaciona el volumen filtrado (V) con el
tiempo (t) de proceso es la siguiente:
t/V= V* K3 + 1/Q0, siendo K3 una constante
Esta situación es la que se presenta en una filtración por tierras de diatomeas.
En este proceso se añade, de manera continua, medio filtrante (las tierras) que se
adhiere al soporte metálico del filtro. El valor de Q0 es muy alto debido a la alta
permeabilidad y baja resistencia que tiene el soporte al paso del líquido. En con-
secuencia, 1/Q0 puede despreciarse y la ecuación se transforma en:
t/V= V* K3
Si se expresa esta ecuación en forma logarítmica, entonces log V=0,5* log
t + K4. Una vez que se registran los datos de volumen filtrado y tiempo de pro-
ceso se obtiene una línea recta sobre la que se puede estimar el volumen que se
puede filtrar en un tiempo determinado.
183
Como se ha señalado, la retención de partículas en el medio filtrante se lleva

a cabo por adsorción y en función de su tamaño. Cuando las partículas presentes
en el líquido son rígidas y mayores que los poros y los canales de filtración, éstas
se acumularán en la superficie del filtro provocando una disminución lineal del
flujo de filtración con el tiempo. Si, por el contrario, estas partículas son defor-
mables por presión taponarán rápidamente los poros y el flujo de filtración dis-
minuirá rápidamente con el tiempo de acuerdo con un modelo exponencial.
En el caso de que las partículas penetren en los canales del medio de filtra-
ción, son también retenidas por adsorción (aparte de por su tamaño) y la dismi-
nución del flujo de filtración con el tiempo de proceso se ajusta al modelo des-
crito en la figura 5. Finalmente, si las partículas penetran en la matriz del filtro y
se fijan a ésta únicamente por adsorción, el flujo se mantendrá independiente del
tiempo de proceso; sin embargo, en esta situación, cuando exista una saturación
de partículas adsorbidas en el medio filtrante, el filtro no podrá fijar más par-
tículas y la turbidez del filtrado aumentará.
Los parámetros que controlan la eficiencia de un proceso de filtración son,
entre otros, la porosidad, la distribución del tamaño del poro, el espesor y asi-
metría del medio filtrante y las características físicas de la torta. La porosidad es
la relación entre el volumen de huecos que tiene el medio filtrante y el volumen
total de éste. La permeabilidad está directamente relacionada con la velocidad de
filtración y es inversamente proporcional al área y a la caída de presión a lo largo
del filtro. El mayor o menor grado de permeabilidad condiciona la velocidad de
filtración; se expresa en unidades de Darcy, correspondiendo 1 Darcy a la per-
meabilidad de un medio filtrante de 1 cm de espesor y 1 cm2 de área que permi-
te el paso de un líquido, con una viscosidad de 1 cp, a un caudal de 1 mL/s bajo
una presión de 1 bar. Las permeabilidades varían desde 0,017 Darcy en los fil-
tros esterilizantes hasta 7 Darcy, propias de medios de filtrantes con altas velo-
cidades de filtración.
También, el tamaño de poro es un parámetro muy utilizado para definir las
propiedades de un medio filtrante. Podemos tener desde filtros, como algunas
membranas, que tienen un valor
absoluto de corte (“cutoff”; ex-
presado en µm) que nos indica
por encima de qué tamaño de par-
tícula ésta quedará retenida en la
superficie y aquéllos donde se
define un tamaño nominal de
poro, que nos informa del tamaño
de partícula que puede ser reteni-
da, no existiendo una garantía
Figura 5.–Evolución del volumen (V) de filtrado con el
absoluta de retención al presentar
tiempo (t) de proceso en la filtración en profundidad el filtro una distribución hetero-
(Ribéreau-Gayon y col., 2006b). Q0 = caudal inicial génea del tamaño de los poros.
184
Los medios filtrantes clásicos son la celulosa y las tierras de diatomeas y, para
el caso de las membranas, los ésteres de celulosa, poliamida, polipropileno, poli-
sulfona, etc., disponiendo, además, de membranas inorgánicas manufacturadas
en óxidos de aluminio, titanio y circonio.
Los filtros de celulosa, en módulos lenticulares o en placas, consisten en
fibras de celulosa que pueden incorporar tierras de diatomeas, perlita o resinas
catiónicas. Se caracterizan por el “cutoff” nominal y filtran tanto por tamaño
como por adsorción. Al tener un potencial electrocinético positivo retienen por
adsorción las partículas electronegativas. Cabe distinguir, en función de la capa-
cidad de retención de las partículas, dos tipos de filtros: esterilizantes y clarifi-
cantes. Los primeros presentan una menor permeabilidad y son más susceptibles
a la colmatación, por lo que los flujos de filtración y los volúmenes que se pue-
den filtrar son menores. Así, por ejemplo, mientras en los filtros esterilizantes se
pueden alcanzar densidades de flujo de 500 L/m2 h, en los clarificantes se puede
llegar a 900 L/m2 h. Ello conlleva que el nivel de turbidez (NTU) y el número de
células de microorganismos viables presentes en el líquido filtrado sea menor
cuando se emplean filtros esterilizantes.
La filtración por celulosa es un proceso que responde al modelo de filtración
con paulatina obstrucción de los poros (modelo A2). Una vez conocida K2, a
través de la representación gráfica de t/V frente a t, se puede determinar el vo-
lumen que se puede filtrar en un determinado ciclo de proceso, por ejemplo
durante ocho horas. Si, además, se conoce el área de filtración se puede estimar
la densidad de flujo de filtración media (L/m2 h) y compararla con los valores
recomendados por el fabricante. De este modo, se podrá evaluar si la sidra a
filtrar reúne las condiciones adecuadas para que sea sometida a un filtrado, cla-
rificante o esterilizante, con un coste de proceso razonable. Por otra parte, con-
viene vigilar la caída de presión a través del filtro para asegurar su efectividad,
no debiendo exceder la presión diferencial generada de los valores recomenda-
dos por el fabricante.
Las tierras de diatomeas han sido muy utilizadas debido a su superficie espe-
cífica de adsorción, 20-25 m2/g; existen diferentes tipos en función del tamaño
de partícula, desde las más finas (< 1 Darcy) que efectúan una adecuada clarifi-
cación hasta las de mayor tamaño (> 2 Darcy) que se utilizan para la filtración
de desbaste, previa a la filtración clarificante. Como se ha indicado, la expre-
sión que regula la filtración por tierras es: log V= 1/2 log t + Cte, por lo que a tra-
vés de una representación gráfica se puede estimar el volumen filtrado (V) en un
tiempo de proceso (t). Para realizar la filtración se incorpora al soporte metálico
una tierra de permeabilidad alta (denominada pre-capa) y, una vez estabilizada
ésta, se procede a la filtración de la sidra con acreción de tierra de baja permea-
bilidad, con el fin de proceder a su clarificación. Este proceso de acreción incre-
menta la eficacia de la filtración.
Las membranas son barreras filtrantes que retienen sólidos en su superficie
sobre la base del tamaño de corte absoluto que presenten. Separan partículas
185
finas, coloides y microorganismos en un intervalo aproximado de diámetro de

poro de 0,05 a 5 µm (microfiltración). Por tanto, mediante esta técnica se consi-
gue clarificar la sidra y, en función del corte, se puede realizar, además, una esta-
bilización microbiológica. Estos sistemas se colmatan con mucha rapidez, por lo
que es recomendable trabajar con un prefiltro, que generalmente trabaja en pro-
fundidad (“depth”), ensamblado en serie con la membrana. Es recomendable uti-
lizar prefiltros con permeabilidades inferiores a 1 Darcy, con el fin de poder man-
tener razonables densidades de flujo de filtración en la membrana (400 L/m2 h).
Antes de proceder a la filtración por membrana, se debe evaluar el índice de col-
matación (FI=t400-2* t200) y el volumen máximo a filtrar (VM= ti-tj/[ti/Vi –tj/Vj]);
i y j son dos tiempos de proceso y t400 y t200 son los tiempos necesarios para
microfiltrar 400 y 200 mL de sidra, respectivamente, a una presión de 2 bares a
través de una membrana de 0,65 µm de tamaño de poro y 3,9 cm2 de área. Las
referencias disponibles para los vinos es que se trabaje con FI<30. Se recomien-
da utilizar bajas presiones diferenciales para evitar una rápida colmatación de la
membrana.
Microfiltración tangencial. La microfiltración frontal trabaja con un flujo de
filtración perpendicular a la membrana. Ello conlleva una rápida acumulación de
partículas sobre ésta, lo que origina la colmatación del filtro, la rápida disminu-
ción de la densidad de flujo (kg/m2 h), la pérdida de eficacia del proceso y el
incremento de su coste. Para evitar estos problemas se desarrolló el flujo tan-
gencial, que como su propio nombre indica supone trabajar con un flujo de ali-
mentación paralelo a la membrana de separación. Mediante esta configuración
(ver figura 6), la sidra no precisa de ningún tratamiento clarificante previo a la
microfiltración, incrementándose notablemente el volumen de filtrado antes de
que el flujo de permeado disminuya a valores incompatibles con un proceso efi-
ciente. El mantenimiento de adecuadas densidades de flujo de permeado duran-
te un mayor tiempo es consecuencia del efecto que produce el flujo tangencial,
que reduce la colmatación y origina un flujo cuasi-estacionario (ver figura 7).
Gradiente de velocidades
δ Capa de polarización
Torta
Membrana
Figura 6.–Diagrama de flujo de un proceso de filtración tangencial
186
Zona de filtración cuasi-estacionaria
Espesor de la torta
de filtración
Flujo
t
Figura 7.–Evolución en el tiempo del flujo de permeado y de la colmatación de la membrana en la filtración
tangencial
La velocidad de filtración (vF) puede ser estimada a partir del modelo de po-
larización por concentración. En él se establece que, en el equilibrio, el flujo
convectivo de soluto (hacia la membrana) es igual al de difusión (desde la
membrana); éste se produce como consecuencia de la formación de una capa de
polarización de espesor δ donde se concentra el soluto. La velocidad de filtra-
ción, en estas condiciones, se determina a partir del coeficiente de transferencia
de materia D/δ, siendo D el coeficiente de difusión molecular del soluto, y de las
concentraciones de soluto en el permeado (CP), alimentación (CF) y en la super-
ficie (CM) de la torta de filtración, a través de la expresión siguiente:
vF= D/δδ * ln {CM-CP/CF-CP}
Como se puede deducir, la velocidad de filtración es proporcional al coe-
ficiente de transferencia de materia, disminuye con el incremento de la con-
centración de soluto en el permeado y en la alimentación y aumenta con el
incremento de la concentración de soluto en la superficie de la torta de filtración.
La capa de polarización dificulta la filtración, ya que a medida que su espesor (δ)
aumenta el coeficiente de transferencia de masa (D/δ) disminuye.
La acumulación de materiales en la membrana depende de las fuerzas hi-
drodinámicas en su zona más próxima. El gradiente de velocidad (γº) que se
establece en un flujo tangencial laminar a lo largo de la membrana origina una
fuerza de elevación (FL) que actúa sobre la partícula para separarla de la torta de
filtración; esta fuerza es proporcional a la fuerza de cizalla (τ, fuerza por unidad
de superficie que está directamente relacionada con el gradiente de velocidad) y
al tamaño de la partícula. Frente a esta fuerza, se oponen las fuerzas de interac-
ción interpartícula y la de arrastre del permeado (FD), que es proporcional al
tamaño de la partícula y a la velocidad de filtración (Ripperger y Altmann, 2002;
Kang y col., 2004), provocando que las partículas se ubiquen en la superficie de
la membrana. Para elevadas velocidades de permeación la fuerza de arrastre es
superior a la de elevación en un amplio intervalo de tamaño de partícula (hasta 2
187
µm), lo que significa que, en estas condiciones, únicamente las partículas de gran
tamaño (>2 µm) (que presentan una mayor fuerza de elevación) no se deposita-
rían en la membrana.
Cuando se trabaja con velocidades de filtración bajas, básicamente se acu-
mulan en la membrana las partículas más pequeñas (por debajo de 0,5 µm)
(Ripperger y Altmann, 2002) que son las que experimentan la menor fuerza de
elevación. El tamaño de la partícula también condiciona el proceso que gobier-
na la filtración. Así, por ejemplo, por encima de 1 µm los efectos hidrodinámi-
cos permiten explicar satisfactoriamente la velocidad de filtración en el estado
estacionario, mientras que para partículas más pequeñas es necesario tener en
cuenta la difusión de la partícula, la concentración por polarización y las inter-
acciones interpartícula (electrostáticas, fuerzas de van der Waals, efectos estéri-
cos) (Kim y col., 2006).
Al inicio de la operación de filtración, el flujo de permeado depende básica-
mente de la presión a través de la membrana (PTM) y de la resistencia que ofre-
ce la propia membrana al paso del líquido. Posteriormente, el flujo convectivo
del filtrado provoca la acumulación de materiales en la membrana, produciendo
un incremento del espesor de ésta que disminuye el flujo de permeado. Cuando
la velocidad de filtración se reduce se depositan preferentemente las partículas
de menor tamaño que, al hacerlo en las capas superiores de la torta de filtración,
provocan un incremento significativo de su resistencia; como consecuencia de
ello, el flujo disminuye hasta valores que hacen el proceso de filtración inefi-
ciente.
El depósito de partículas sobre la membrana y el paso de macromoléculas a
través de los poros de ésta produce una colmatación que se estructura del modo
siguiente: 1-depósito de partículas en la torta de filtración (como, por ejemplo,
levaduras); 2-bloqueo de los poros de la membrana por partículas discretas; y
3-adsorción de macromoléculas en la superficie de la membrana y en el interior
de los poros (Gan y col., 2001). La colmatación interna de los poros ha sido iden-
tificada como el factor determinante de la disminución del flujo durante el pro-
ceso de filtración.
Para conseguir reducir la pérdida de eficiencia de la filtración, debido al
fenómeno de colmatación, se han planteado diversas estrategias (Gan, 2001; Gan
y col., 2001; Ahmad y col., 2004): a) técnicas hidrodinámicas; b) “backflus-
hing”; y c) membrana invertida.
Las técnicas hidrodinámicas están basadas en el aumento del flujo turbulento
y de la fuerza de cizalla (con el aumento de ésta se incrementa la fuerza de flo-
tación sobre la partícula). El incremento de la turbulencia se establece mediante
un flujo pulsante que aumenta el número de Reynolds, siendo éste proporcional
a la velocidad del pico del flujo oscilatorio; también, la turbulencia puede
aumentar si se impone en el interior del canal del filtro un flujo helicoidal. Los
experimentos llevados a cabo por Gan (2001) en cerveza ponen de manifiesto
188
que el flujo pulsante es poco eficaz para la separación de las partículas de la torta
de filtración, mejorando ligeramente la eficacia del proceso con la introducción
de un flujo helicoidal. Sin embargo, en este caso, la superposición de ambas
técnicas no produce un incremento del flujo de permeado hacia valores que ha-
gan el proceso económicamente rentable.
Otra tecnología muy utilizada es el “backflushing”. Consiste en introducir en
sentido contrario al movimiento del permeado un gas en combinación con el pro-
pio permeado. Se debe optimizar la presión inversa que se aplica (intensidad del
pulso), la duración del pulso y su frecuencia. Gan y col. (2001) han concluido
que el “backflushing” es más efectivo que las técnicas hidrodinámicas para con-
seguir la descolmatación de la membrana. La frecuencia e intensidad del pulso
son las variables más determinantes de la eficiencia de la técnica de “backflus-
hing” (Gan, 2001).
Por otra parte, la inversión de la entrada del flujo de alimentación a la mem-
brana (membrana invertida) ha dado buenos resultados en la clarificación de cer-
veza por microfiltración, en particular cuando se combina esta técnica con el
“backflushing” (Gan, 2001). La inversión del flujo se puede realizar en las mem-
branas cerámicas. Éstas están constituidas por una primera capa, que es el ele-
mento de filtración que determina el tamaño nominal de poro y que define la ca-
pacidad de separación de la membrana. A continuación, está el soporte que es un
elemento que contiene una distribución de poros irregular y de mayor tamaño y
que confiere la resistencia mecánica a la membrana. En consecuencia, la inversión
del flujo de permeación permite que se depositen en la superficie de la membrana
las partículas de mayor tamaño, reteniéndose las más pequeñas en su interior.
El mayor tamaño de las partículas retenidas en la superficie de la membrana
incrementa la permeabilidad de la torta de filtración y disminuye su resistencia.
Ello unido a la aplicación de “backflushing”, que facilita la descolmatación de
los poros más pequeños del interior, produce una mejora del flujo de permeado
durante el ciclo de filtración. Así, por ejemplo, utilizando la membrana invertida
con “backflushing” se incrementa notablemente el flujo de permeado, respecto a
la microfiltración tangencial convencional, de acuerdo con los experimentos rea-
lizados por Gan (2001) en cerveza.
Actualmente, se dispone de una nueva generación de membranas con tecno-
logía “isoflux” (Atkinson, 2005), que permite mantener los flujos de permeado
durante un mayor tiempo de proceso. En las membranas clásicas, el espesor y la
porosidad son constantes a lo largo de la membrana y la presión PTM es varia-
ble, siendo mayor al principio que al final de la membrana; ello provoca que el
flujo disminuya a lo largo de ésta, produciéndose una mayor polarización a la
entrada. Esta heterogeneidad origina una variación en la calidad de las diferen-
tes fracciones de filtrado y acorta los ciclos de filtración.
Las nuevas membranas se diferencian de las clásicas en que el espesor, tanto
del soporte como de la propia membrana, y/o la porosidad son variables (el espe-
189
sor disminuye y la porosidad aumenta a lo largo de la longitud de la membrana).

El diseño “isoflux” garantiza que el flujo de permeado sea constante en toda la
membrana, al modularse la resistencia a la filtración (mayor al principio y menor
al final de la membrana) con el gradiente negativo de la PTM. El flujo constan-
te que se obtiene con esta nueva tecnología es mayor que el flujo promedio que
se consigue con las membranas clásicas.
Uso del sulfuroso y de los ácidos ascórbico y sórbico

El anhídrido sulfuroso (SO2) es una sustancia con propiedades antisépti-
cas (inhibe el desarrollo de microorganismos, más en el caso de bacterias que
levaduras), antioxidantes (en presencia del oxígeno y catalizadores se transforma
en SO3) y antioxidásicas (inhibe los enzimas oxidantes) que se utiliza en la ela-
boración y conservación de bebidas alcohólicas, como el vino o la sidra, desde
hace mucho tiempo. La incorporación de anhídrido sulfuroso a la sidra se puede
hacer mediante la combustión del azufre (S + O2 ↔ SO2) o la adición de meta-
bisulfito potásico (K2S2O5 + H2O ↔ 2 K+ + 2 HSO3-) o bisulfito potásico
(KHSO3 ↔ K+ + HSO3-). La concentración de SO2, con independencia de la mo-
lécula incorporada a la sidra, está gobernada por el pH (ver figura 8) y por la
naturaleza y concentración de las sustancias capaces de enlazarse con el sulfuro-
so, formando lo que se denomina el “sulfuroso combinado”.
Figura 8.–Porcentaje de las diferentes formas libres del sulfuroso en función del pH (Zamora Marín, 2005)
190
La dependencia de la concentración de las diferentes formas de sulfuroso

libre (SO2, HSO3-, y SO32-) con el pH se establece sobre la base de los equilibrios
siguientes:
SO2 + H2O ↔ HSO3- + H+ (pK1 =1,81) HSO3-↔ SO32- + H+ (pK2 =6,91)
Como se puede observar en la figura 8, la molécula mayoritaria al pH de la
sidra (3,5-4,0) es el bisulfito (HSO3-). La concentración de sulfuroso molecu-
lar (SO2) se puede estimar a partir de la siguiente expresión: [sulfuroso
libre]/10(pH-1,81). Esta forma molecular del sulfuroso es la que realmente tiene una
verdadera actividad antimicrobiana, siendo eficaz, con carácter general, para
concentraciones superiores a 0,5 mg/L.
En la figura 9 se recoge la relación existente entre la concentración del sul-
furoso libre y total y el pH para alcanzar una concentración de sulfuroso mole-
cular de 1 mg/L. La concentración de sulfuroso molecular también está afecta-
da por la fuerza iónica del medio, aunque en menor grado que lo hace el pH.
Así, la constante de disociación (K’1) del sulfuroso está afectada por la fuerza
iónica de acuerdo con la expresión: pK’1 = pK1 – [A I1/2 /1 + B I1/2], siendo K1
la constante de disociación cuando la fuerza iónica es cero. De esta expresión
cabe deducir que si la fuerza iónica aumenta pK’1 disminuye y, por tanto, tam-
bién lo hará la concentración de sulfuroso molecular. La temperatura y el con-
tenido de alcohol también afectan a la concentración de sulfuroso molecular.
Así, por ejemplo, el aumento del grado alcohólico y la temperatura incremen-
tan su concentración.
SO2 libre (mg L-1)
Figura 9.–Relación entre la concentración de sulfuroso libre y total y el pH de la sidra para alcanzar una con-
centración de sulfuroso molecular de 1 mg/L, de acuerdo con Jarvis y Lea (2000)
191
La concentración total de sulfuroso es, por tanto, la suma de las formas libres
más el sulfuroso combinado. Una distribución porcentual típica en la sidra entre
las formas libres del sulfuroso y las combinadas se muestra en la figura 10.
Las moléculas que se combinan con el sulfuroso lo hacen a través de un grupo
carbonilo. El proceso en virtud del cual se combina el sulfuroso con una molé-
cula (aldehído o cetona) es el siguiente:
R-CO-H + HSO3- ↔ R-CHOH-SO3- K= [R-CO-H] * [HSO3-] / [R-CHOH-SO3-]
R-CO-R’ + HSO3- ↔ R-COHR’-SO3- K= [R-CO-R’] * [HSO3-] / [R-COHR’-SO3-]
Estos equilibrios de combinación están gobernados por una constante de
equilibrio (K) que es característica de cada sustancia. A medida que K disminu-
ye el grado de combinación con el sulfuroso aumenta. Así, por ejemplo, mientras
para el acetaldehído K= 0,0024 x 10-3 M, para la xilosona (producto resultante de
la degradación del ácido ascórbico) K= 0,15 x 10-3 M y para el ácido galacturó-
nico K= 20 x 10-3 M. Por tanto, el acetaldehído es una molécula con una gran
capacidad de combinación, a diferencia del ácido galacturónico, que es de las
menores. Estas diferentes capacidades de combinación del sulfuroso afectan a su
disponibilidad en la forma libre. Así, por ejemplo, si la concentración de sulfu-
roso disminuye, como consecuencia de su reacción con el oxígeno, se podrá libe-
rar más sulfuroso a partir de las formas combinadas, si exceptuamos aquél que
está unido al acetaldehído, ya que esta forma combinada es muy estable por pre-
sentar una K muy pequeña.
Las diferentes moléculas de sulfuroso presentes en la sidra (molecular, bisul-
fito y combinado) tienen diferentes propiedades antisépticas, antioxidantes y
antioxidásicas. Así, por ejemplo, mientras el sulfuroso molecular tiene buenas
propiedades fungicidas (destruye la población de levaduras) y bactericidas, la
actividad es más baja para el bisulfito (es fungiestático e inhibe la multiplicación
celular) y el sulfuroso combinado únicamente presenta una cierta actividad bac-
tericida. No obstante, hay que tener en cuenta que la actividad fungicida del sul-
12%
Enlazado a otros
12%
Enlazado al ácido
galacturónico 38%
HSO3-
9%
40%
Enlazado al
Libre
piruvato
2%
SO2
27%
Enlazado al acetaldehído
Figura 10.–Distribución porcentual típica entre las formas libres y combinadas del sulfuroso en la sidra (Jarvis
y Lea, 2000)
192
furoso molecular se produce a pH bajo y elevadas concentraciones, mientras que

a pH alto y bajas concentraciones la actividad es fungiestática. En lo referente a
su capacidad antioxidante y antioxidásica, únicamente la forma molecular y el
bisulfito presentan actividad.
La combinación del sulfuroso con el oxígeno molecular es lenta, de hecho
pueden emplearse varios días en consumir la concentración de saturación del
oxígeno (en torno a 8 mg/L) y requiere catalizadores metálicos como el cobre o
el hierro. Su efecto más relevante sería el antioxidásico, a través del bloqueo de
la acción de enzimas oxidantes.
El ácido ascórbico es un agente reductor que se utiliza en concentraciones que
varían entre 50 y 100 mg/L. En la figura 11 se muestra la reacción de óxido-
reducción de este ácido y del producto resultante de su oxidación, el ácido dehi-
droascórbico. Se trata de un proceso en teoría reversible pero que, en la práctica,
no lo es debido a la inestabilidad del ácido dehidroascórbico que es hidrolizado
y convertido en el ácido 2,3-dicetogulónico. Éste, a través de un proceso de des-
carboxilación, se transforma en xilosona que es un cuerpo cetónico fácilmente
combinable con el sulfuroso.
Figura 11.–Oxidación del L-ascorbato con formación de un radical libre y del ácido dehidroascórbico y del
producto de su hidrólisis, el ácido 2,3-dicetogulónico.
La oxidación del ácido ascórbico se acopla a procesos de reducción de otros

componentes de la sidra, como el hierro (III) que se transforma en hierro (II). Sin
embargo, cuando la oxidación del ácido ascórbico se produce en presencia del
oxígeno, éste se reduce a peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es un
potente oxidante que puede alterar notablemente el aroma de la sidra. Al contra-
rio de lo que ocurre con la oxidación del sulfuroso por el oxígeno molecular, la
oxidación del ácido ascórbico es muy rápida. Este proceso, por tanto, permite
una rápida disminución del oxígeno disuelto.
La adición de ácido ascórbico debe ir acompañada de anhídrido sulfuroso,
con el fin de evitar los procesos oxidativos provocados por el peróxido de hidró-
geno [el sulfuroso añadido se combina con el peróxido de hidrógeno formando
ácido sulfúrico (SO2 + H2O2 ↔ H2SO4)] o bien que los microorganismos anae-
robios puedan desarrollarse más fácilmente en las nuevas condiciones de bajo
potencial redox que se producen al consumirse el oxígeno. En definitiva, cabe
considerar que el ácido ascórbico es un efectivo antioxidante que previene de
manera inmediata los problemas causados por una súbita incorporación de oxí-
geno, como por ejemplo durante el embotellado, mientras que el sulfuroso actúa
193
a más largo plazo. El ácido ascórbico protege, también, frente a las oxidaciones
de carácter enzimático, pero a diferencia del mecanismo de acción del sulfuroso
(inactivación enzimática) el ácido ascórbico actúa compitiendo de manera muy
rápida por el oxígeno, impidiendo que los sistemas enzimáticos puedan actuar.
El ácido sórbico presenta una acción microbiana complementaria con el sul-
furoso, siendo el isómero trans, trans el utilizado en la industria alimentaria.
Mientras el sulfuroso es muy eficaz frente a bacterias, el ácido sórbico lo es fren-
te a levaduras; de hecho, las bacterias lácticas en un medio ácido son capaces de
degradar el ácido sórbico transformándolo en un alcohol secundario que, combi-
nado con el etanol, produce un compuesto con fuerte olor a geranio (valor
umbral de detección 1µg/L). Por ello, la adición de ácido sórbico debe ir nece-
sariamente acompañada de sulfuroso en concentraciones de aproximadamente
30 mg/L de sulfuroso libre. Se trata de una molécula muy efectiva frente a leva-
duras a concentraciones de 200 mg/L, si bien hay que tener en cuenta que esta
dosis puede disminuir si el grado alcohólico es elevado y el pH bajo y, en todo
caso, está condicionada por el tipo y concentración de levaduras. En consecuen-
cia, este antiséptico está recomendado en los casos en que la sidra es embotella-
da con azúcares residuales que pueden ser fermentables por las levaduras.
194
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195
7. Tecnología de la producción de sidra.
Equipamiento industrial
Mónica Herrero Vázquez, Álvaro Gonzalo Vergara y Luis A. García Díaz
Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Oviedo
Introducción
Asturias es la Comunidad Autónoma que mantiene el título de potencia sidre-
ra nacional. La producción con origen en este territorio ronda los 60 millones de
litros al año (González Torre y col., 2002), lo que constituye más del 80 por cien-
to de la producción nacional, dada su producción relativa. De ese volumen, unos
35 millones corresponden a sidra natural. De acuerdo con estas cifras y el volu-
men de negocio (unos 80 millones de euros al año) la industria de elaboración de
la sidra se sitúa en tercer lugar dentro del sector agroalimentario asturiano, tan
sólo superada por la industria láctea y la cárnica (González Torre y col., 2002).
Durante las últimas tres décadas se han producido numerosos y beneficiosos
cambios en el proceso de elaboración de la sidra. Ésta, anteriormente considera-
da como una actividad secundaria dentro de la casería asturiana, ha pasado a con-
solidarse como una actividad industrial del sector agroalimentario de gran impor-
tancia, constituyéndose como uno de los motores principales para el desarrollo
del medio rural de Asturias. Este sector posee, en la actualidad, más de 1.500
explotaciones y unas 100 empresas elaboradoras de sidra natural (García Álva-
rez, 2005). Los lagares emplean de forma directa a unas 400 personas y, en la
mayor parte de los casos, se trata de empresas pequeñas de carácter familiar.
Expertos del sector cifran en unas 6.000 las sidrerías existentes en Asturias, que
comercializan entre el 85% y el 90% de la producción anual de sidra natural astu-
riana. No obstante, también se distribuye a través de otros canales y en zonas
geográficas diversas. En la última década ha crecido el interés por el consumo de
la sidra natural en un ámbito distinto al tradicional. Así, son diversos los elabo-
radores de sidra que cubren con su red comercial y de distribución la totalidad
del territorio nacional, la mayoría de los países de la Unión Europea, Estados
Unidos, Centroamérica y el área del Caribe y toda Sudamérica. Esto denota que
es un mercado en expansión y que, por ello, se deben dedicar esfuerzos al de-
sarrollo de mejores técnicas de elaboración y a fomentar la calidad de las pro-
ducciones.
197
Mónica Herrero Vázquez, Álvaro Gonzalo Vergara, Luis A. García Díaz
En este capítulo se hará referencia a la tecnología y equipamiento industrial

utilizados, tanto en la producción de sidra natural como de sidra gasificada y de
segunda fermentación.
SIDRA NATURAL
Es la bebida resultante de la fermentación alcohólica total o parcial de
la manzana fresca o de su mosto, elaborada siguiendo las prácticas tradiciona-
les, sin adición de azúcares, que contiene anhídrido carbónico de origen exclu-
sivamente endógeno. Su graduación alcohólica adquirida mínima será de 5%
en volumen. Se caracteriza sensorialmente por un sabor y aroma franco y equi-
librado y unas propiedades de espuma, derivadas del gas carbónico endógeno,
que se definen básicamente a partir de los atributos “espalme”, “aguante” y
“pegue”.
La sidra natural se elabora a partir de variedades de manzana de sidra dentro
de los siguientes bloques tecnológicos: dulce, ácido, amargo, ácido-amargo,
dulce-amargo y acidulado (ver capítulo 2). Las fases de elaboración incluyen, de
forma genérica, el lavado y molienda de las manzanas, la obtención del mosto
por prensado, la fermentación de éste, los trasiegos, las clarificaciones y filtra-
ciones y el embotellado. En la figura 1 se presenta el diagrama de flujo detalla-
do de este proceso.
Extracción del mosto de manzana

Tradicionalmente, en la elaboración de sidra natural asturiana se han emplea-
do sistemas de extracción lenta. Están basados en la molienda del fruto con moli-
nos de troceado de martillo o de cuchillas con rodillo y prensado en prensas de
cajón mecánicas o hidráulicas discontinuas, que se caracterizan por utilizar un
tiempo de prensado prolongado (2-4 días). Durante este tiempo se llevan a cabo
diversos cortes de la pulpa de prensado, con el objeto de facilitar la extracción
del mosto (maceración en la propia prensa) e incrementar el rendimiento de esta
etapa (en el entorno del 75%, ver capítulo 2).
Sin embargo, en la actualidad, se utilizan con mayor frecuencia los sistemas
de extracción rápidos.
Las ventajas e inconvenientes que presentan ambos tipos de sistemas son:
Sistema de extracción lento:

Ventajas:
– rendimiento de extracción del mosto elevado (~75 %).
– obtención de mosto de bajo contenido en sólidos, con menor cantidad de
polifenoles y mayor concentración de pectina.
198
7. Tecnología de la producción de sidra. Equipamiento industrial
Figura 1.–Diagrama de flujo del proceso de elaboración de sidra natural
Inconvenientes:
– elevados tiempos de extracción (2-4 días).
– necesidad de más mano de obra.
– mayor acumulación de ácido acético y acetato de etilo (si se encuentran por
encima de los valores establecidos se consideran componentes organolép-
ticos no deseables) así como de glicerina (Gonzalo Vergara, 2000).
199
Sistema rápido de extracción:

Ventajas:
– tiempos cortos de prensado: elevada capacidad de transformación en el
tiempo.
– notable ahorro en la mano de obra (elevado automatismo).
– menor incidencia de las alteraciones producidas por los microorganismos
(como el picado láctico y acético) y mejor control de la etapa fermentativa.
Inconvenientes:
– rendimiento de prensado algo menor, especialmente en el caso de las pren-
sas neumáticas (70-75%).
– mayor contenido de sólidos en suspensión en el mosto (se puede subsanar
mediante una clarificación pre-fermentativa).
– mayor coste de inmovilizado.
– obtención de mosto deficiente en determinados componentes, como las sus-
tancias pécticas y los componentes aromáticos varietales. Esto puede mejo-
rarse realizando una etapa de maceración intermedia entre el triturado de la
manzana y el prensado de la pulpa.
En la actualidad, ambos tipos de sistemas conviven en los lagares de sidra
natural, lo que permite limitar los costes de producción y mejorar la capacidad
de procesado en determinados momentos de la campaña. En una planta industrial
se emplea preferentemente un sistema de extracción rápido, ya que permite un
ahorro en los costes de producción, lo que posibilita una rápida amortización de
la inversión en inmovilizado realizada, y tiene una capacidad elevada de trans-
formación del fruto. De esta forma se limita el
tiempo de esta etapa y se consigue un mayor con-
trol del proceso, no sólo en la transformación del
fruto sino también en la etapa fermentativa.
Recepción y lavado del fruto. Se deben asegu-

rar unas condiciones sanitarias e higiénicas ópti-
mas de la manzana. Cuando ésta se recibe en el
lagar se clasifica de acuerdo con el grupo tecnoló-
gico al que pertenezca con el fin de realizar la
mezcla adecuada, descartando materia prima en
malas condiciones. La manzana se recoge en una
tolva de recepción y, a continuación, se conduce
mediante corriente de agua hasta la zona de trans-
Figura 2.–Columna de lavado de la formación del fruto, consiguiendo así no sólo su
manzana (por cortesía de transporte sino el lavado del mismo (en la figura 2
Valle, Ballina y Fernández, S.A.) se muestra una columna de lavado). La tolva tiene
200
generalmente geometría triangular, con una inclinación adecuada y dispone de

una cinta transportadora superior que facilita las labores de recepción del fruto.
Triturado de la manzana. Características de la trituradora. El fruto está
constituido por la piel, la pulpa, las semillas y el tallo interior. El triturado su-
pone la fragmentación mecánica del mismo, produciendo la rotura de los teji-
dos celulares y la liberación del mosto contenido en las vacuolas de las células
que componen la pulpa del fruto. El mosto obtenido en esta etapa suele deno-
minarse mosto flor o primer mosto. En el caso de utilizar un sistema rápido de
extracción, se requiere disponer de una trituradora que permita mayar el fruto a
la velocidad y condiciones adecuadas.
La trituradora elegida debe proporcionar un tamaño de pulpa adecuado. Las
partículas grandes confieren una gran dificultad en la posterior extracción del
mosto y generan una maceración incompleta. Los tamaños demasiado pequeños
pueden provocar la trituración de las pepitas, pasando al mosto sustancias inde-
seables. Por lo general se estima que el tamaño adecuado ronda los 2 cm (Madrid
y col., 1994), si bien hay que tener en cuenta que el tamaño óptimo es inversa-
mente proporcional al grado de dureza que pre-
sente el fruto (ver capítulo 2).
La trituradora habitual es de rodillos de alto
rendimiento, alimentada a través de una tolva su-
perior (figura 3). Se puede estimar que un rendi-
miento apropiado está en el entorno de 30.000 kg/h.
Maceración. Características de los macerado-
res. La maceración es la extracción de las partes o
elementos solubles de una sustancia, mantenién-
dola durante algún tiempo sumergida en un líqui-
do. En enología, la técnica de maceración se refie-
re a la extracción de los distintos elementos de las
partes sólidas del fruto por contacto con diferentes
medios. En función del tipo de medio la macera- Figura 3.–Trituradora (por cortesía
ción se divide en: de Valle, Ballina y Fernández, S.A.)
a) Maceración en medio hidroazucarado: basada en la extracción de com-

puestos deseables de las sustancias sólidas del fruto por contacto con el
mosto ya extraído.
b) Maceración en medio hidroalcohólico: basada en la extracción de com-
puestos presentes en las sustancias sólidas del fruto por contacto con el
caldo de cultivo durante el proceso fermentativo. De esta forma el alcohol
actuará como elemento extractor de forma principal.
c) Maceración en medio gaseoso o maceración carbónica: se trata de un
proceso realizado en atmósfera de anhídrido carbónico, ocurriendo de for-
ma simultánea una fermentación intracelular y una extracción de sustan-
cias desde la piel a la pulpa del fruto.
201
En el caso de la manzana la maceración se desarrolla en medio hidroazuca-

rado por contacto de la pulpa de manzana con el mosto flor, ambos procedentes
de la operación de triturado. Esta etapa influye en las características organolép-
ticas del producto final, ya que se consiguen extraer otros componentes que du-
rante la etapa de prensado no son extraídos en concentraciones adecuadas y que
condicionan la evolución del resto del proceso y las características finales del
producto, como son las pectinas.
Los parámetros fundamentales que definen una maceración adecuada son la
temperatura y el tiempo. La temperatura deberá ser como máximo de 10º C, sien-
do el intervalo óptimo entre 7-8º C, ya que en este rango se consigue reducir
apreciablemente la solubilidad de los polifenoles y la actividad de las polifeno-
loxidasas sin que se limite la solubilidad y difusión de los compuestos aromáti-
cos en el medio azucarado. En estas condiciones, se logra un mayor control de la
microbiota natural y se reduce el nivel de proteínas, facilitando la posterior cla-
rificación del mosto. El tiempo de maceración debe estar correctamente ajustado
para controlar el nivel de oxidación de los polifenoles, que tiene una influencia
importante en la intensidad del color del producto.
Se recomienda un macerador cilín-
drico tipo horizontal giratorio de acero
inoxidable AISI 316. El macerador ro-
ta alrededor de su eje con objeto de fa-
cilitar el contacto líquido-sólido en su
interior, aunque la velocidad de giro
ha de controlarse para evitar una in-
corporación excesiva de oxígeno en el
mosto (figura 4). El control de la tem-
peratura de maceración se realiza a
través de un intercambiador de calor
de placas que regula la temperatura del
Figura 4.–Macerador mosto flor que permanece en contacto
(por cortesía de Valle, Ballina y Fernández, S.A.) con la pulpa.
Finalizada la etapa de maceración, el mosto flor es conducido hasta un de-
pósito cerrado y aislado térmicamente. El objetivo es mantenerlo a una tempe-
ratura relativamente baja y evitar en lo posible el contacto con el aire, hasta que
se mezcle con el mosto de prensa. De esta forma se pretende reducir la posibi-
lidad de que se desarrolle la microbiota natural del mosto, en especial la zimo-
lógica.
Prensado de la pulpa (ver capítulo 2). Características de las prensas. El
prensado es una operación mecánica que permite la extracción del mosto que
todavía permanece en la pulpa (figura 5). Como se comentó previamente, exis-
ten sistemas lentos de extracción en los que se emplean prensas de cajón me-
cánicas o hidráulicas. En lo relativo a los sistemas rápidos de prensado, cabe
distinguir los siguientes:
202
Figura 5.–Prensas horizontales de pistón automáticas (por cortesía de Valle, Ballina y Fernández, S.A.)
– Prensas discontinuas hidráulicas: verticales u horizontales. Basan el prensa-

do en la aplicación de una fuerza de presión sobre la masa ejercida por un
dispositivo hidráulico. En el caso de las primeras no es posible su automa-
tización, al contrario de lo que ocurre con las segundas, pero, en este caso,
se produce una importante aireación que no es deseable si se trata de evitar
alteraciones causadas por microorganismos y oxidaciones no deseables.
– Prensas discontinuas neumáticas. Son prensas horizontales que extraen el
mosto de prensado ejerciendo una fuerza de presión sobre la masa, por
inflamiento de una membrana de goma interna, que comprime a la pulpa en
el interior de la prensa. Pueden alcanzar presiones entre cinco y seis atmós-
feras, aunque lo habitual es no sobrepasar las dos atmósferas. Los tiempos
de prensado suelen ser menores que en el caso de las prensas discontinuas
hidráulicas y tienen un rendimiento en torno al 70-75%. Son muy versá-
tiles, pudiendo prensar todo tipo de pastas, incluyendo las borras proce-
dentes de la fermentación. Como inconveniente añadido, cabe señalar la
necesidad de disponer de un compresor como fuente de aire comprimido.
– Prensas continuas de tornillo. Permiten un tratamiento continuo de la pulpa
por incorporación de ésta sobre un tornillo sinfín que presiona la masa sobre
una compuerta móvil, disponiendo de varias salidas para el mosto. A pesar
203
de que permite su uso en continuo, sólo se emplea en la elaboración de

zumos de manzana. Se hace necesario añadir coadyuvantes de prensado
que faciliten la salida del mosto a la vez que limiten la turbidez del mismo.
Por esto se rechaza utilizar este tipo de prensas en la elaboración de la
sidra.
– Prensas continuas de bandas: efectúan el prensado por compresión de la
masa entre dos telas sinfín movidas por cilindros perforados, a través de los
cuales fluye el mosto extraído. Presentan como ventajas su gran capacidad
horaria de tratamiento (8.000 kg/h) y el automatismo. Sin embargo, pro-
ducen mostos con elevado contenido en sólidos en suspensión, por lo que
tampoco son empleadas para elaborar sidra. Generalmente, se utilizan en la
elaboración de mostos, tratando la pulpa con enzimas pectolíticas a una
temperatura próxima a los 48º C.
El sistema de extracción rápido más adecuado para la elaboración de la sidra
es el prensado neumático. A pesar de que no presenta una capacidad de trata-
miento tan elevado como las prensas continuas, se consigue reducir el contenido
en sólidos en suspensión y se evita el contacto de la masa con el aire, lo que faci-
lita el control de las oxidaciones y la extracción de cantidades excesivas de sus-
tancias astringentes de sabor desagradable. Unido a su elevado automatismo,
permite obtener un mosto de elevada calidad.
El mosto extraído de la prensa se denomina mosto de prensa. Finalizada la
etapa de prensado, se conducirá este mosto hasta el depósito cerrado que con-
tiene el mosto flor con el fin de proceder, a continuación y si se considera
conveniente, a la clarificación pre-fermentativa. Con esto se consigue la homo-
geneización del volumen total del mosto obtenido en cada carga. El diseño geo-
métrico de este depósito de homogeneización será un cilindro cerrado fabricado
en acero inoxidable AISI 316. Este depósito deberá estar revestido con algún ais-
lante térmico (por ejemplo, lana roca) para evitar, en la medida de lo posible, el
calentamiento del mosto por transmisión de calor con el medio ambiente, de tal
forma que se garantice que la temperatura del mosto esté en el entorno de 10 a
12º C.
Clarificación pre-fermentativa
En la elaboración tradicional, utilizando prensas lentas, esta etapa no se
realiza. Sin embargo, con la introducción de sistemas rápidos de prensado, en
ocasiones, puede ser necesaria a fin de limitar las partículas en suspensión y la
turbidez en el mosto, al tratarse de un sistema coloidal compuesto por partículas
en disolución verdadera, dispersión coloidal y suspensión.
Las ventajas que aporta la etapa de clarificación pre-fermentativa (ver ca-
pítulo 2) son las siguientes:
– Reduce los sólidos en suspensión.
204
– Favorece la estabilidad microbiológica del mosto y, por tanto, de la sidra.

Este proceso permite, además, un desarrollo más lento de la etapa fermen-
tativa que se traduce en una mayor calidad del producto final.
– Limita el enturbiamiento de la sidra y facilita la clarificación y estabiliza-
ción previa al embotellado. Este paso es importante si se pretende utilizar
filtración por membranas, pues evita la rápida colmatación de éstas.
Dependiendo del tipo de técnica que se utilice, puede ser necesario aplicar
medidas para evitar que el mosto empiece a fermentar durante esta etapa. Así,
justo después del prensado, se puede agregar SO2 o mantener el mosto bajo refri-
geración (Troost, 1985).
Las técnicas de clarificación pre-fermentativa se pueden clasificar en:
a) Físicas:
– Desfangado por sedimentación-decantación (conlleva tiempos más largos).
– Filtración a vacío (poco recomendable, necesita coadyuvantes y pre-filtra-
ción para reducir los materiales en suspensión).
– Centrifugación.
b) Bioquímicas y químicas:
– Defecación enzimática: consiste en la adición de una enzima (pectinmeti-
lesterasa, PME), que desmetila los ácidos pectínicos transformándolos en
ácido péctico, y una sal de calcio (CaCl2.2H2O). Como consecuencia se for-
ma un gel de pectato cálcico que asciende a la superficie empujado por el
CO2. A continuación, se realiza un trasiego después de la formación del gel.
La eficacia de este proceso está influenciada por la acidez y la temperatura.
– Clarificación enzimática convencional: se basa en la degradación de la pec-
tina mediante un complejo enzimático pectolítico (pectinesterasa, poliga-
lacturonasa y pectinliasa). Se suelen añadir compuestos químicos cla-
rificantes (gelatina, bentonita o albúmina) para facilitar la floculación y
precipitación de los flóculos que arrastran otras partículas coloidales y en
suspensión.
c) Combinación de las técnicas anteriores.
Del conjunto de técnicas descritas cabe destacar la centrifugación, que pre-
senta las siguientes ventajas:
– las centrífugas ocupan muy poco espacio en planta.
– menor coste de mano de obra en comparación con otras técnicas alternativas.
– fácil limpieza (in situ).
– obtención de fangos más compactos, lo que se traduce, a su vez, en una fácil
manipulación de los mismos y mínimas pérdidas de mosto.
205
– reducción drástica del tiempo de contacto entre el mosto y los fangos, limi-
tando la transmisión de olores y sabores indeseables.
– obtención de caldos de fermentación más afrutados y aromáticos.
– en caso de sulfitar el mosto permite reducir mucho la dosis, ya que el tiempo
del proceso se acorta enormemente respecto al desfangado por decantación.
La mejora en el diseño de los equipos de centrifugación ha permitido evitar
la aireación indeseable del mosto, con la comercialización de centrífugas hermé-
ticas o hidroherméticas que aseguran la ausencia de aire durante el proceso
(Madrid y col., 1994). Además, la aparición de centrífugas autolimpiables sol-
ventó el problema de la alta frecuencia de limpieza del equipo. Los modernos
diseños son capaces de generar caudales horarios de hasta 60.000 L. El mayor
inconveniente que presenta la centrifugación es que, debido a la diferencia de
tamaño entre las levaduras y las bacterias, puede alterarse el equilibrio poblacio-
nal de los microorganismos, ya que sedimentan a tiempos distintos.
Sin embargo, previa a la etapa de centrifugación, es recomendable realizar
una etapa de clarificación enzimática convencional, en la que, mediante la adi-
ción de un complejo enzimático comercial, se promueva la formación de flócu-
los que posteriormente se eliminarán en la centrífuga, sin necesidad de que éstos
precipiten. Esta fase de clarificación enzimática se realizará en una sola etapa,
prescindiendo de la adición de agentes clarificantes.
Características del tanque de tratamiento enzimático. La actividad del com-
plejo enzimático dependerá de la temperatura, cantidad de enzima, tiempo de
contacto y características del mosto. Su efectividad viene definida en función del
tiempo requerido para la formación del flóculo. Como ejemplo, una concentra-
ción de enzimas pectolíticos y gelatina para llevar a cabo la clarificación del
zumo de manzana puede ser 0,025% (p/p) y 0,005% (p/p), respectivamente
(Kilara y Van Buren, 1989). El tiempo estimado para clarificar enzimáticamente
un mosto de pH 3,5 y a una temperatura de 10º C es de, al menos, 200 min (tiem-
po de residencia de este proceso). La disolución clarificante (por ejemplo, de 50
a 100 g de gelatina por litro) se inyecta por medio de una bomba dosificadora a
la tubería de la canalización del mosto hasta el tanque (por ejemplo, a una dosis
de 1 ml de disolución de clarificante por cada litro de mosto a tratar) (Blouin y
Peynaud, 2006).
Realizada la etapa enzimática, el mosto se someterá a una clarificación por
sedimentación centrífuga. La centrifugación deberá reducir drásticamente los
flóculos formados en la etapa anterior. En la sedimentación centrífuga, una par-
tícula se separa del líquido si dispone de suficiente tiempo para alcanzar la pared
del recipiente separador.
Características de la centrífuga. Entre los distintos tipos de centrífugas se-
dimentadoras que existen, se propone una centrífuga de discos, ampliamente
utilizada en el campo de la enología. La disposición de discos cónicos en el
206
recipiente de la centrífuga consigue disminuir la distancia de sedimentación, que

en el sentido radial es de 1-2 mm entre dos discos consecutivos.
La centrífuga debe ser autolimpiable, evitando así la necesidad de interrum-
pir la operación para la extracción de sólidos. El principio de funcionamiento se
basa en la apertura de ranuras periféricas cuando el nivel de acumulación de sóli-
dos depositados en los conos periféricos es elevado. El cierre hermético inme-
diato en las ranuras evita el escape de líquidos contenidos en el tambor. El siste-
ma de descargas será por autodisparos, con eliminación de los sólidos mediante
una bomba centrípeta, en el momento en que el espacio existente entre la pared
del tambor y el disco superior se satura de sólidos, lo que provoca una variación
de presión en una cámara colocada encima de la bomba.
La centrífuga debe equiparse con cierre hidrohermético en la descarga del
líquido clarificado, evitando completamente la aireación del mosto. También,
dispondrá de bastidor con paneles dobles que ayuden a reducir el ruido y por
donde pueda circular refrigerante para el enfriamiento del mosto. Esta última
característica permite asegurar la conservación del mosto a lo largo de la clarifi-
cación a una temperatura adecuada (10-12º C), evitando alcanzar temperaturas
no deseables.
Fermentación
El mosto inicial, obtenido tras las operaciones anteriores, tiene una densidad
entre 1.040-1.060 g/L. La manipulación del mosto previa a la fermentación
incluye la mezcla de mostos de diferente origen y, en ocasiones, el sulfitado (Lea
y Piggott, 1995). Los dos procesos microbiológicos principales en la fermenta-
ción de la sidra son la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica.
Fermentación primaria o tumultuosa. Características del fermentador. A la
primera fase del proceso de fermentación de la sidra se le suele denominar fer-
mentación primaria o tumultuosa. Se caracteriza porque la llevan a cabo levadu-
ras de la especie Saccharomyces cerevisiae, que transforman los azúcares del
mosto en etanol y CO2 mediante el proceso microbiológico de la fermentación
alcohólica. El CO2 producido arrastra materiales en suspensión y forma gran can-
tidad de espuma. Posteriormente, la velocidad del consumo de azúcares y libe-
ración del CO2 se ralentiza hasta llegar al final del proceso (de la Roza, 1999).
Se utilizan fermentadores cilíndricos con cabezas toriesféricas, fabricados
íntegramente en acero inoxidable AISI 316 y espesor de chapa de 3 mm. La se-
lección del acero inoxidable, frente a otros materiales, se debe a sus indudables
ventajas entre las que destacan:
– hermetismo total (no existen pérdidas por mermas) y control de presión
interna.
– pared inalterable.
207
– fácil limpieza (permite el uso de sistemas in situ).

– admite sistema de refrigeración (elevada transmisión térmica).
– fácil desplazamiento.
Los accesorios más importantes de cada fermentador son:
– dos bocas, una superior, normalmente de forma circular y 400 mm de diá-
metro y una inferior ovalada o elíptica de dimensiones variables, entre 305
x 430 y 400 x 500 mm.
– dos válvulas, una para el vaciado total del depósito y otra para la salida de
líquido claro con diámetro nominal de 80 mm.
– grifo sacamuestras.
– apertura superior circular con cierre hermético, con el objeto de impedir la
entrada de oxígeno y minimizar las pérdidas de CO2. Control de la presión
interna (válvula de venteo).
– asiento sobre patas.
– elementos de control, refrigeración y limpieza.
Los volúmenes utilizados varían normalmente desde unos 10.000 a 30.000 L
y representan el 80% del total, ya que se debe estimar un 20% del volumen para
la fase gas, formada principalmente por el CO2 desprendido. Este gas es más
denso que el aire, por lo que éste es desplazado del espacio de cabeza. Por otro
lado, la válvula de venteo impide que el aire entre en el depósito y minimiza las
pérdidas de CO2 solubilizado. Se considera una relación adecuada de altura/diá-
metro del fermentador igual a 3. Teniendo en cuenta la capacidad máxima de
producción de la planta, se debe calcular el número de fermentadores necesarios.
La fermentación primaria puede durar en torno a un mes, como término medio.
El tipo de agitación del fermentador es autoinducida por el desprendimiento
del CO2. La liberación de este gas hace que la mezcla sea homogénea durante
gran parte de la fermentación. Esta agitación es tan vigorosa que el caldo ofrece
un aspecto visual semejante al de un líquido en ebullición.
La fermentación alcohólica requiere un control de temperatura mediante la
implantación de un encamisado externo. El intervalo de temperaturas óptimo
para el desarrollo de la microbiota zimológica está comprendido entre 12 y 18º
C, de tal forma que se evita la producción de compuestos secundarios no desea-
bles y las alteraciones bacterianas, favoreciendo la acumulación de compuestos
organolépticos deseables.
Teniendo en cuenta la temperatura del mosto en las fases previas a la fer-
mentación (alrededor de 10º C) y que ésta aumenta aproximadamente 2º C de-
bido al tránsito del mosto por las conducciones, la temperatura de éste, al inicio
de la fermentación, será inferior a 15º C, por lo que no será necesario su enfria-
208
miento previo. Hay que señalar que, en caso de que el mosto estuviese a una tem-
peratura superior al intervalo adecuado para la fermentación, sería necesario
enfriarlo hasta el nivel inferior de la franja de temperatura de fermentación ele-
gida para, de este modo, poder controlar la temperatura en las condiciones
exotérmicas de la fermentación. De lo contrario, los riesgos de falta de control
térmico pueden ser muy altos, pudiendo necesitar un sobredimensionado en la
instalación de refrigeración.
El sistema de encamisado utiliza como refrigerante una mezcla de agua y pro-
pilenglicol. El cálculo de los tubos que conforman el encamisado se hace para el
momento de máxima generación de calor en la fermentación. De esta forma se
satisface la demanda máxima de refrigeración.
Maduración o fermentación maloláctica. Características del fermentador.
Terminada la fermentación alcohólica, la sidra suele trasvasarse a otro fermenta-
dor donde tendrá lugar la fase de maduración. De esta forma, se separa la sidra
clara y limpia de las borras generadas (y también el sombrero superficial). Esta
operación se denomina trasiego y su finalidad es:
– eliminar las borras depositadas en el fondo del fermentador para evitar
enturbiar la sidra y que aparezcan olores y sabores desagradables.
– reducir la carga microbiana. Los microorganismos arrastrados al fondo por
sedimentaciones y floculaciones son separados de la sidra, lo que evita su
proliferación en etapas posteriores del proceso (por ejemplo, en la botella).
– evitar alteraciones indeseables causadas por microorganismos, capaces de
metabolizar compuestos que darían lugar a productos secundarios respon-
sables de características organolépticas inaceptables para la sidra.
– realizar mezclas entre caldos contenidos en distintos fermentadores, permi-
tiendo que la sidra de la bodega sea lo más homogénea posible.
Al realizar el trasiego se debe evitar la aireación de la sidra, para impedir el
desarrollo de bacterias que producen acético en concentraciones indeseables.
También, la no aireación es esencial para evitar procesos de oxidación y altera-
ciones del color y minimizar las pérdidas de CO2 endógeno. Tradicionalmente,
para asegurar el éxito de esta operación, aparentemente sencilla pero importante
para lograr la estabilidad de la sidra, se eligen días fríos, sin tormentas y con altas
presiones.
El proceso más importante durante la fase de maduración es la fermentación
maloláctica (FML), que consiste en la transformación del ácido málico en ácido
láctico, con desprendimiento de CO2, por acción de un grupo de bacterias lácti-
cas que poseen la enzima maloláctica. Las bacterias responsables de esta trans-
formación pertenecen, en su mayoría, a los géneros Oenococcus, Leuconostoc,
Pediococcus y Lactobacillus. La FML reduce la acidez de la sidra pero, además,
mejora las características sensoriales y favorece la estabilidad microbiológica del
producto final. La sidra, sin embargo, es un medio desfavorable para el creci-
209
miento de las bacterias lácticas que poseen actividad maloláctica. El crecimien-

to de las levaduras durante la fermentación alcohólica agota muchos nutrientes
necesarios para el desarrollo de estas bacterias, muy exigentes en sus requeri-
mientos nutritivos. Las levaduras también producen otros compuestos inhibito-
rios para las bacterias lácticas, como el etanol y los ácidos grasos. Otros factores
químicos (SO2, compuestos fenólicos y pH) y físicos (bajas temperaturas) tam-
bién resultan perjudiciales para el desarrollo de estas bacterias.
El mosto natural (es decir, que no proviene de concentrado) generalmente
contiene una población inicial de bacterias malolácticas de, al menos, 103 a 104
unidades formadoras de colonias (UFC)/mL que, en determinadas circunstancias
(como, por ejemplo, si se aplica un sulfitado), no se multiplica y permanece poco
activa durante la fermentación tumultuosa. Después de la fase de latencia (coin-
cidiendo con la etapa de proliferación de las levaduras), cuya duración depende
de las propiedades del medio, las bacterias malolácticas que sobreviven empie-
zan a multiplicarse para llevar a cabo la FML. Este proceso tiene lugar cuando
la población de bacterias malolácticas alcanza un número suficiente (al menos
106 UFC/mL), siendo posible que no llegue a desarrollarse al no existir el núme-
ro necesario de bacterias. El tiempo que se precisa para una transformación
maloláctica completa varía normalmente de semanas a meses, según las caracte-
rísticas físico-químicas del medio y la cantidad de ácido a transformar. En oca-
siones, tras el inicio, la fermentación puede pararse bruscamente y continuar de
nuevo pasados varios días o semanas. También, es posible el caso de FML
incompletas, en las que la cantidad de ácido málico residual es superior a 0,2-0,5
g/L.
El tipo de fermentador utilizado en esta etapa tendrá unas características simi-
lares al fermentador empleado en la etapa previa, salvo que en este caso se utili-
zan fermentadores que alberguen un volumen mayor de caldo (50.000 L). Esto
favorecerá la homogeneización entre sidras de diferentes fermentadores en eta-
pas anteriores. Se mantiene, como la más idónea, una relación altura/volumen
igual a 3.
De igual modo, teniendo en cuenta la capacidad máxima de producción de la
planta, se calculará el número de fermentadores necesarios. Podemos suponer un
desfase en la evolución temporal de los fermentadores entre el trasiego de un fer-
mentador y otro, que sea suficiente para adecuar el fermentador ya usado para su
reutilización. Pero si la rutina de la bodega lo requiere, se deberán adquirir mayor
número de fermentadores para estas tareas.
Acabado final. Una vez clarificada la sidra por trasiego y superados los con-
troles de calidad, se procede a su embotellado y etiquetado para su posterior
comercialización.
Anejos al equipo de embotellado, se dispondrá de un sistema de lavado y
etiquetado de botellas. La lavadora elegida deberá ser capaz de eliminar las eti-
quetas de aquellas botellas que fueran retornables. El tapón de corcho es un
210
elemento básico para conservar adecuadamente la sidra en la botella. Es impres-

cindible que éste sea de alta calidad y se debe controlar su altura en el interior de
la botella.
SIDRA GASIFICADA
Introducción
El proceso de elaboración de la sidra gasificada presenta algunas diferencias
con el de la sidra natural, ya que determinadas prácticas como la carbonatación,
el edulcoramiento o la adición de agua no están permitidas legalmente en la ela-
boración de la sidra natural y sí lo están, en cambio, en el caso de la sidra gasi-
ficada. Su sabor puede ser seco, semiseco o dulce y las propiedades espumantes
tienen que ver con la persistencia de rosarios, burbujas y coronas finas. En la
figura 6 se muestra el diagrama de flujo del proceso.
Tratamientos pre-fermentativos. Extracción del mosto por difusión y

licuefacción. Concentración del mosto
El proceso comienza por la recolección de la manzana en su momento ópti-
mo de madurez y, una vez lavada y eliminados los frutos dañados, se procede a
la extracción del mosto.
La difusión en caliente y la licuefacción son sistemas alternativos al prensa-
do en la obtención del mosto concentrado de manzana. La difusión es aplicada
como una ósmosis a través de las paredes celulares a una temperatura de trabajo
que ronda los 80º C y se consigue al poner en contacto los frutos cortados y el
agua de condensación procedente de los condensadores. Por su parte, la licue-
facción consiste en la hidrólisis a 50º C de la pared celular vegetal por medio de
enzimas que consiguen romper la célula y liberar su contenido vacuolar y cito-
plasmático. La extracción del mosto se finaliza mediante decantadores centrífu-
gos, obteniéndose, por una parte, el mosto de manzana, que pasará a la etapa de
concentración y, por otra, los orujos.
La mayor parte del mosto, así obtenido, es concentrado del orden de unas
nueve veces (como máximo) por calentamiento a baja presión, transformándolo
en un medio de alta concentración en azúcares, del orden de 71 a 72 °Brix (con-
tenido aprox. en azúcares expresado en g/100g). En estas condiciones, no hay
desarrollo de microorganismos debido a la elevada presión osmótica y a la baja
actividad de agua. Con esta operación se consigue eliminar la estacionalidad a
que está sujeto el proceso de elaboración de la sidra (en caso de que se emplee
mosto natural), ya que el mosto concentrado es relativamente estable a bajas
temperaturas y no comenzará a fermentar hasta que no se realice una dilución
adecuada, alcanzándose una actividad de agua compatible con el crecimiento de
los microorganismos. La operación de concentración, también, permite tener
211
plantas de obtención de zumo bastante alejadas de las industrias fermentadoras,

ya que la etapa de concentración permite reducir de manera significativa el volu-
men a transportar, con el consiguiente ahorro en el transporte de la materia prima.
Cuando se considere necesario proceder a la elaboración de la sidra, será pre-
ciso diluir el concentrado de manzana. Para ello, se utiliza agua tratada de gran
Figura 6.– Diagrama de flujo del proceso de elaboración de la sidra gasificada
212
calidad y se añade en proporción tal que la densidad del mosto esté en el entor-
no de 1.050 a 1.080 g/L, de tal forma que las levaduras fermentativas puedan
desarrollar su actividad. Resulta habitual, en este tipo de sidras, la inoculación de
una levadura del género Saccharomyces (S. cerevisiae) que será la encargada de
transformar los azúcares del mosto en etanol y CO2, como productos principales.
Cuando la densidad del medio se encuentra en torno a 1.000 g/L la fermentación
alcohólica se puede dar por finalizada, siendo entonces cuando se realiza una cla-
rificación de la sidra mediante la adición de agentes precipitantes: enzimas pec-
tolíticas, bentonita (de las más utilizadas), gelatina, albúmina, caseína, gel de
sílice, etc.
Mediante una centrifugación posterior el líquido claro, así obtenido, se pasa
a tanques donde tiene lugar el proceso de maduración, de duración variable, ya
que en este proceso se desarrolla espontáneamente la FML (sin inoculación con-
trolada de la bacteria láctica adecuada). Como ya se indicó, la fermentación
maloláctica mejora substancialmente las características organolépticas del pro-
ducto final, aumentando su estabilidad y disminuyendo su acidez. Una vez que
la etapa de maduración y de clarificación ha concluido, tiene lugar la etapa de
acabado del producto.
Clarificación pos-fermentativa.
Características del equipo de filtración tangencial
La sidra fermentada (d≤1.000 g/L) presenta una turbidez que se debe elimi-
nar con el fin de conseguir una mayor estabilización físico-química y microbio-
lógica del producto para su adecuada comercialización (ver capítulo 6). La fase
de clarificación de la sidra procedente de la fermentación es fundamental a la
hora de elaborar sidra gasificada o sidra de “nueva expresión”. Sin embargo, en
el caso de la sidra natural, el proceso de estabilización se restringe básicamente
a la sedimentación natural y al trasiego. A continuación, se indican algunos pro-
cesos de clarificación utilizados en la estabilización de la sidra, de los que cabe
destacar la filtración:
– Adición de clarificantes y posterior centrifugación.
– Filtración por tierras de diatomeas:
a) filtro de tierras de diatomeas con placas dispuestas horizontalmente.
b) filtro de tierras de diatomeas con placas dispuestas verticalmente.
c) filtro de varillas o bujías.
– Filtración por placas (filtrantes de fibra de celulosa).
– Combinación de las técnicas anteriores.
– Filtración por membranas:
a) filtración frontal o vertical.
b) filtración tangencial.
213
La filtración por membranas se basa en al separación de uno o varios com-

ponentes de una fase fluida por paso a través de una barrera selectiva (la mem-
brana) basada en el tamaño de poro, que restringirá el paso a aquellas moléculas
y/o microorganismos con un tamaño superior al mismo. En función de la direc-
ción del flujo de alimentación, con respecto a la membrana, la filtración puede
ser: frontal (la alimentación fluye en dirección perpendicular a la sección lon-
gitudinal de la membrana) o tangencial (la alimentación fluye en dirección pa-
ralela a la sección longitudinal de la membrana, dando lugar a dos corrientes:
permeado y retenido).
La filtración tangencial es, sin duda, una de las técnicas más eficientes para
la estabilización de bebidas. Permite obtener un producto final con unas cualida-
des organolépticas óptimas, reduciendo, además, los costes y tiempos de proce-
so. Las principales ventajas que ratifican la elección de esta técnica respecto a las
tradicionales son:
– operacionales: tiempo reducido a una sola etapa; fácil automatización y
control del proceso; larga duración de las membranas, en particular las
de origen inorgánico; se trata de unidades compactas que ocupan poco
sitio; son versátiles, pudiendo adaptarse la membrana al tipo de separación
a realizar.
– calidad del producto: obtención de una sidra más homogénea, con una esta-
bilización físico-química, microbiológica y características organolépticas
óptimas.
– económicas: menor inversión en el inmovilizado y en costes de operación;
rápida recuperación del capital invertido.
Además, se consigue minimizar las pérdidas de CO2 endógeno en la sidra por
control de la temperatura y presión en las líneas de alimentación y permeado
(mediante tanques de alimentación y permeado presurizados). También, permite
la estabilización de productos en cualquier fase del proceso fermentativo. Se
puede destacar, por ejemplo, la elaboración de sidra parcialmente dulce.
Para estabilizar la sidra se puede utilizar un sistema de microfiltración tan-
gencial (esto es, se emplean membranas con un tamaño de poro dentro del rango
de 0,05-10 mm, con presiones transmembrana de 0,5-3 bares).
El tipo de membrana elegido es de naturaleza inorgánica. Las razones se
basan en las siguientes características:
– son inertes frente a la mayoría de los disolventes utilizados.
– soportan grandes intervalos de temperatura, presión y pH.
– poseen una elevada vida útil, en ocasiones entre 10 y 14 años. A pesar de su
mayor coste, se rentabilizan a medio y largo plazo.
– permiten técnicas de retrolavado.
214
Las características principales de la membrana inorgánica de elección son:

– material: α-alúmina.
– tamaño de poro: 0,22 mm.
– tipo de módulo: tubular
– nº de elementos/módulo: 60.
– nº de canales/elemento: 37.
– geometría del soporte de los canales: hexagonal.
– diámetro del canal: 3 mm.
– longitud: 1,02 m.
Cada elemento ofrece 0,36 m2 y, consecuentemente, cada módulo tiene una
superficie de 21,6 m2. La temperatura límite del proceso de filtración tangencial
será de 15º C. Para ello, se dispondrá de cambiadores de calor de placas para el
enfriamiento de la sidra y del retenido.
Dilución y adición del licor de expedición

Durante este proceso de acabado se deben mantener condiciones de esterili-
dad. Una vez estabilizada la sidra se ajusta tanto su contenido en azúcar como de
alcohol (hasta 4-4,5% (v/v)). Para ello, la sidra se diluye con agua tratada (libre
de turbidez, sabores y olores que alteren la calidad de la sidra y estéril) y se añade
el denominado licor de expedición. Se trata de una disolución azucarada consti-
tuida por un azúcar soluble (glucosa, sacarosa) o incluso concentrado de manzana.
El tanque de dilución está fabricado en acero inoxidable AISI 316 con chapa
de 3 mm de espesor (figura 7). Su diseño geométrico es cilíndrico con cabezas
toriesféricas y relación altura/diámetro igual a 2. Además, durante esta etapa se
corrigen los posibles defectos de acidez y se pueden añadir estabilizantes como
el ácido ascórbico y los sulfitos.
Carbonatado
La sidra es carbonatada hasta alcanzar una concentración de 8 g/L de anhí-
drido carbónico. Para conseguir una adecuada absorción del gas, la sidra debe ser
refrigerada previamente. El equipo de carbonatar debe conseguir un contacto
gas-líquido adecuado, hasta su saturación. En la práctica, la operación debe rea-
lizarse mediante equipos de carbonatado que contengan:
– bujías porosas, o
– columnas.
Estos equipos deben estar fabricados en acero inoxidable AISI 316. En los de
columnas, se logra la obtención de burbujas de menor tamaño y mayor duración
215
(perlage) mediante la pulverización de la sidra a presión a través de una ducha o

difusor situada en la parte superior. La introducción del CO2 mediante un inyec-
tor permite mantener una presión interna acorde con la temperatura de trabajo,
consiguiéndose una rápida saturación del líquido (elevada interfase de contacto
líquido-gas). En el depósito de carbonatado se distinguen tres capas:
– superior, compuesta por aire y gas.
– intermedia, en la que se produce el contacto de las gotas de sidra produci-
das por el difusor con la atmósfera de CO2. El inyector del gas se sitúa en
esta capa por debajo del difusor del líquido.
– inferior, donde aparece la bebida saturada de CO2.
Mediante una bomba a sobrepresión, colocada en al parte inferior del depósi-
to, se envía la bebida hasta una embotelladora isobarométrica. Como la tempe-
ratura de trabajo es de 3º C, la presión interna deberá ser de 2,7 atmósferas para
que, en el equilibrio, la concentración de CO2 disuelto sea de 8 g/L.
Embotellado y etiquetado
Una vez que la sidra está estabilizada y carbonatada y se le ha añadido el licor
de expedición, se procede al embotellado a presión constante mediante una em-
botelladora isobarométrica de elevado rendimiento. Previamente al embotellado
la sidra se enfría hasta 3º C, lo que permite reducir la presión necesaria para con-
servarla saturada de CO2 (así, por ejemplo, para una concentración de CO2 de 4,7
g/L y una temperatura de 3º C, la presión de
equilibrio necesaria es de 1,6 atmósferas).
Como se ha comentado, el equipo de
llenado debe ser isobarométrico a contra-
presión, con el fin de evitar la pérdida de
CO2. El mecanismo de llenado es el si-
guiente: el cuello de la botella se ajusta
de forma hermética a la máquina median-
te una junta o ensambladura, consiguien-
do que la atmósfera de la botella quede
unida al reservorio de alimentación, por
lo que la presión es la misma en todo el
circuito (Troost, 1985). Para evitar la
pérdida de gas en la botella, la presión
por encima del líquido debe ser superior
a la del gas disuelto. Se deberá calcular la
capacidad de llenado de la embotelladora
teniendo en cuenta el rendimiento del tren
Figura 7.–Tanques para el acabado de embotellado y la capacidad de la bote-
(por cortesía de Valle, Ballina y Fernández, S.A.) lla utilizada (habitualmente de 0,75 L).
216
La flexibilidad de este tipo de embotelladoras permite embotellar tanto sidra

natural como gasificada, ya que por un lado, se puede fijar la presión necesaria,
por inyección de gas inerte previo al embotellado, según el producto embotellar
y, por otro, los actuales trenes de embotellado pueden incorporar distintos tipos
de taponadoras, etiquetadoras y encajonadoras de botellas.
SIDRA DE SEGUNDA FERMENTACIÓN

El Consejo Regulador de la DOP “Sidra de Asturias” prohíbe determinadas
prácticas para este tipo de sidra:
a) el aumento artificial de la graduación alcohólica natural.
b) la corrección y/o adición de productos no autorizados.
c) añadir agua en cualquier fase de la elaboración.
d) la adición de vino, fermentados de frutas y/o de alcohol de cualquier pro-
cedencia.
e) el empleo de edulcorantes artificiales y dextrinas.
f) la utilización de materias colorantes distintas del caramelo de azúcar.
g) el uso de ésteres, aromas y sustancias similares de cualquier clase o pro-
cedencia.
h) la pasterización.
i) la adición de anhídrido carbónico exógeno.
El incremento endógeno del gas carbónico de la sidra se lleva a cabo median-
te el proceso denominado toma de espuma, que es una segunda fermentación
alcohólica en recipiente cerrado. La elaboración de la sidra base (producto de
partida para la segunda fermentación alcohólica) se hace siguiendo las técnicas
habituales descritas. La sidra de segunda fermentación puede obtenerse por los
métodos que se indican a continuación.
Método Champenoise
En este método la toma de espuma se realiza en botella cerrada herméti-
camente (ver capítulo 8) (como en el caso de la elaboración de algunos tipos
de cerveza). Para reactivar la fermentación en la botella, se le añade azúcar y
levaduras específicas (deben poseer características diferentes a las de la fermen-
tación primaria y adaptarse a las peculiaridades del proceso). El CO2 generado
en la fermentación se disuelve en el líquido al estar cerrada la botella. Hay que
dosificar bien la cantidad de azúcar, ya que si se hace incorrectamente pue-
de reventar la botella. Ésta se mantiene en posición horizontal durante un perio-
do de tiempo que puede ser de varios meses, durante el cual se lleva a cabo el
217
proceso de maduración sobre las lías

de fermentación (envejecimiento, ver
capítulo 8). Para eliminar los sedimen-
tos de la fermentación y que el líquido
quede completamente claro, se colo-
can las botellas con el cuello hacia
abajo y en un ángulo de unos 45 gra-
dos en los pupitres (figura 8). Durante
varias semanas se gira cada botella
un cuarto de vuelta un par de veces al
día, de manera que los sedimentos se
vayan acumulando en el cuello de la
botella, junto al tapón. Para eliminar
los sedimentos, se congela el cuello de
la botella, se descorcha y el gas expul-
sa la franja congelada (donde se en-
cuentran los sedimentos de levadura).
Después, se llena la botella con el licor
de expedición que le confiere el dul-
Figura 8.–Pupitres. Sidra de segunda fermentación,
zor deseado (brut, semiseco, etc.) y se
método Champenoise (por cortesía de Valle, Ballina vuelve a tapar con un tapón y anilla
y Fernández, S.A.) especiales.
Método Champenoise-milispark
Éste es un proceso con las mismas fases y condiciones que el método
Champenoise, pero con variaciones considerables en las operaciones de removi-
do y degüelle. Después de la primera fermentación (elaboración de la sidra base),
el azúcar se introduce en las botellas, pero las levaduras que ocasionan la segun-
da fermentación en botella van contenidas en el interior de un cartucho que, a la
vez, va unido al tapón. Los microorganimos permanecen alojados en este dispo-
sitivo durante todo el proceso, ya que el cartucho contiene en su interior una serie
de membranas y filtros permeables a la sidra e impermeables a las células y sus
restos; de esta forma, el líquido circula a su través sin enturbiarse. Llegada la
operación del degüelle, el tapón saltará con los restos de levaduras en su interior
y el líquido permanecerá limpio.
Método de la cuba cerrada, granvás o gran envase

Otras denominaciones son, según el país productor: granvàs, grand vas, char-
mat, cuvée close. Este método, que tiene su origen en la segunda mitad del siglo
XIX y que ha sido varias veces modificado y perfeccionado por técnicos italia-
nos, fue puesto a punto en 1907 por un ingeniero francés, Jean-Eugène Charmat.
El procedimiento es como sigue: se deposita la sidra base en un tanque sellado,
218
donde se mantiene a 20º C de 12 a 16 horas. Seguidamente, se pasa a otro tan-

que donde se le añade el azúcar y la levadura y se deja fermentar de 10 a 15 días.
Después, se trasvasa a otro tanque donde se clarifica por refrigeración (2º C) y,
finalmente, se filtra a contrapresión y se embotella.
El charmat, con sus grandes tanques presurizados e interconectados que retie-
nen la presión en todo el proceso, implica técnicas de producción más rápidas y
económicas que el método tradicional, lo que permite elaborar espumosos de
precio inferior (Daban, 2005). Pueden poseer una cierta calidad, aunque una vez
servidos pierden rápidamente la espuma y no son tan valorados como los tradi-
cionales. Los espumosos producidos en cuba cerrada suelen estar pensados para
consumir jóvenes. En cambio, la sidra de segunda fermentación, obtenida por el
método tradicional en botella, tiene un afrutado más sutil debido a la interacción
con las lías en fermentación.
Método continuo
La elaboración de sidra base se hace siguiendo las técnicas habituales. La fer-
mentación secundaria, en este caso, es un proceso lento y continuo. Después de
la adición de azúcares y levaduras, la sidra circula por una serie de tanques de
fermentación, con anillas o piezas de roble sobre las que se absorben las levadu-
ras. En la salida de los depósitos de fermentación, la sidra contiene sólo una
pequeña cantidad de levaduras muertas y ya es efervescente y, por tanto, espu-
mosa. A continuación, se procede al enfriamiento y estabilización del CO2.
Finalmente, la sidra se almacena en un tanque y se embotella a contrapresión. El
taponado y anillado se hace en la salida del filtro.
PERSPECTIVAS
Para finalizar, cabe destacar que la reciente implantación de avances tecnoló-
gicos en el sector, como la aplicación de la tecnología del frío y la utilización de
biorreactores de acero inoxidable, ha conseguido claramente mejorar la calidad
del producto final. De igual modo, la incorporación de la tecnología de mem-
branas (como, por ejemplo, la microfiltración tangencial o la ósmosis inversa)
ha permitido el desarrollo de nuevos productos emergentes como la sidra sin
alcohol y la denominada sidra de “nueva expresión”. El desarrollo tecnológico
mejorará la competitividad del sector sidrero con relación a otros sectores de las
bebidas alcohólicas fermentadas, como la cerveza o el vino. La continuidad en
los avances en el campo científico, tecnológico y la innovación posibilitará una
mejora de la competencia en los actuales mercados.
219
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Troost, G. 1985. Técnica de la vinificación. En “Tecnología del Vino”, Ed. Omega, S.A.,
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220
8. Sidras espumosas
Introducción
La sidra espumosa se caracteriza por presentar abundante espuma en el
momento de ser servida y consumida. Ello es consecuencia de que la fermenta-
ción alcohólica se desarrolla en un ambiente cerrado, provocando el fenómeno
denominado “toma de espuma”. Cuando esta espuma se genera por incorpora-
ción a la sidra de gas carbónico exógeno, estamos hablando de sidras artificial-
mente carbonatadas.
La toma de espuma puede llevarse a cabo en una o en dos fermentaciones.
Cuando se realiza en una sola fermentación el producto resultante deriva de la
fermentación total o parcial de los azúcares presentes inicialmente en el mosto,
desarrollándose una parte de este proceso fermentativo en un ambiente cerrado,
bien en botella o en depósito presurizado. Si se realiza en dos fermentaciones, la
primera de ellas se efectúa a presión atmosférica en el tanque de fermentación y
la segunda (re-fermentación de la sidra base) se desarrolla en un ambiente cerra-
do, bien en botella o en depósito presurizado.
Sidras de doble fermentación

Método “Champenoise”. La elaboración de la sidra se lleva a cabo a través
de dos fermentaciones alcohólicas (figura 1). La primera de ellas dará lugar a la
sidra base, que se obtiene por fermentación total del mosto de manzana a presión
atmosférica. La segunda fermentación se realiza en botella, donde tiene lugar la
toma de espuma una vez añadido a la sidra base el denominado licor de “tirage”.
Las etapas del proceso “Champenoise” son las siguientes: a) preparación de la
sidra base; b) adición del licor de “tirage”; c) fermentación en botella (normal-
mente de 0,75 o 1,5 L de capacidad) y toma de espuma; d) envejecimiento sobre
las lías de fermentación (botella en posición horizontal); e) transferencia de las
lías de fermentación desde el fondo al cuello de la botella, mediante removido y
221
giro de ésta hasta posición vertical con el cuello hacia abajo (posición “en
punta”); f) degüelle (eliminación de las lías de fermentación sedimentadas en el
cuello de la botella); y g) adición del licor de expedición y corchado.
a) Preparación de la sidra base. La elaboración de la sidra base sigue el mismo
protocolo que en el caso de la sidra natural, recomendándose que la concen-
tración de azúcares residuales de la sidra base no exceda de 5 g/L. Hay que ha-
cer especial énfasis en el proceso de maduración de la sidra, que se desarrolla
una vez finalizada la fermentación alcohólica y es consecuencia de la actividad
de un grupo complejo de microorganismos, a saber, levaduras y bacterias lác-
ticas y acéticas (Swaffield y Scott, 1995). Este proceso depende de complejas
interacciones entre factores químicos, físicos y microbiológicos, existiendo una
fuerte relación entre el tipo de recipiente donde la sidra madura, particularmente
Figura 1.– Esquema del proceso de elaboración de la sidra espumosa por el método “Champenoise”
222
8. Sidras espumosas
si se trata de un tonel de madera, y el perfil microbiológico que presenta dicho

envase. Así, por ejemplo, levaduras y bacterias lácticas penetran con mucha faci-
lidad en la estructura porosa de la madera (Swaffield y Scott, 1995).
Por otra parte, es reconocido que el desarrollo de la fase de maduración mejo-
ra la calidad de la sidra, por cuanto ésta adquiere mayor suavidad y cuerpo. Uno
de los procesos que más afectan al desarrollo del flavor en la sidra es la fermen-
tación maloláctica.
Esta transformación del ácido málico en láctico supone una disminución de
la acidez, una mejora de la estabilidad bacteriana y una potenciación del aroma,
incrementándose la redondez del producto y su complejidad aromática; esta evo-
lución del aroma está relacionada con el metabolismo de los carbohidratos, áci-
dos orgánicos y polifenoles. Así, por ejemplo, los ácidos quínico y siquímico se
convierten en dihidrosiquímico, lo que provoca la oxidación de otras moléculas
como el ácido láctico y la fructosa que se transforman en ácido acético. Éste es
uno de los indicadores más relevantes del proceso de maduración de la sidra.
También, los compuestos fenólicos, es el caso del ácido clorogénico y los flava-
noles, evolucionan durante la maduración de la sidra. Así, por ejemplo, Picinelli
y col. (2000) han detectado una disminución del ácido clorogénico y de los fla-
van-3-ol y un incremento del ácido cafeico durante la maduración de la sidra,
pudiendo justificarse estos cambios por los procesos de polimerización que
experimentan las procianidinas y por la acción de las bacterias lácticas sobre los
ácidos fenólicos. Todo ello, sin menos cabo de que se produzca la autolisis de las
células lo que añadiría más complejidad aromática al producto.
El tiempo de maduración es muy variable y depende de las características físi-
co-químicas y microbiológicas de la sidra, su potencial redox y la temperatura de
almacenamiento, pudiendo variar entre uno y cuatro meses aunque puede alar-
garse más tiempo (Swaffield y Scott, 1995; Johansen, 2000). Una vez madurada,
la sidra base debe experimentar un proceso de clarificación que normalmente
consiste en una microfiltración tangencial. Las experiencias realizadas en vinos
base ponen de manifiesto que esta etapa influye en las propiedades espumantes
de los vinos espumosos. Así, de acuerdo con Viaux y col. (1994), la realización
de una microfiltración muy cerrada, por ejemplo 0,2 µm, deteriora la calidad de
la espuma.
b) Licor de “tirage”. El objeto de añadir este licor es disponer de las condi-
ciones adecuadas en la sidra base para desarrollar el proceso de toma de espuma
(segunda fermentación en botella) y alcanzar una presión de gas carbónico en bo-
tella de 5 a 6 atmósferas en el intervalo de temperatura, 10-12º C. Teóricamente,
la fermentación de 20 g/L de sacarosa genera una presión de 5 atmósferas a 10º
C (el promedio, por tanto, será de 4 g/L de azúcar necesario para generar una
atmósfera) y 1,3 % (v/v alcohol). Acompañando a la fuente de azúcar hay que
añadir un iniciador (estárter) para llevar a cabo la segunda fermentación; éste
consiste en levaduras secas activas (cada gramo contiene de 20 a 30 EXP9 célu-
las vivas) del género Saccharomyces.
223
Se utilizan, habitualmente, cepas seleccionadas de S. cerevisiae que deben

presentar los atributos siguientes: tolerancia a la presión, al alcohol, los sulfitos
y a las bajas temperaturas, ser poco productoras de sulfitos y sulfuros, tener alta
capacidad fermentativa, disponer de elevada capacidad de floculación o agluti-
nación, no ser productoras de aromas indeseables, presentar un efecto positivo
sobre la carbonatación, no tener mucha adherencia sobre la pared de la botella e
inactivarse rápidamente una vez concluida la fermentación.
En este sentido, hay que resaltar los trabajos llevados a cabo por Suárez Valles
y col. (2008) y Pando Bedriñana (2010) sobre selección de levaduras para la
elaboración de sidras espumosas. Estos autores han seleccionado cinco cepas
floculantes de S. cerevisae que no solamente cumplen los requisitos tecnológicos
anteriormente señalados sino que, también, son capaces de llevar a cabo una
correcta toma de espuma y elaborar una sidra espumosa de calidad, de acuerdo
con la metodología sensorial descrita por Picinelli Lobo y col. (2005).
La concentración inicial recomendada del iniciador debe estar comprendida
entre 1,5 y 2 EXP6 células/mL. Por debajo de 1,5 EXP6 la fermentación puede
ralentizarse demasiado y las levaduras pueden adherirse más al vidrio y por enci-
ma de 2 EXP6 el proceso fermentativo puede ir demasiado rápido, lo que pro-
vocaría la aparición de aromas indeseables. Para facilitar el proceso de sedimen-
tación de las células, una vez que se ha producido la toma de espuma, se incor-
pora bentonita en el licor de “tirage” en una proporción de 3 g/hL. Sin embargo,
hay que tener en cuenta que las proteínas están afectadas por la adición de ben-
tonita y éstas, junto con polisacáridos y lípidos, juegan un papel importante en la
calidad de la espuma, en lo relativo a la espumabilidad y la retención y tamaño
de la burbuja. Ello es una consecuencia de que el dióxido de carbono disuelto se
encuentra, además de libre, ligado por fuerzas electrostáticas a estas moléculas.
En este sentido, se ha sugerido que las burbujas disponen de carga eléctrica nega-
tiva, por lo que serían atraídas por proteínas cargadas positivamente. Por otro
lado, hay que destacar que, en ocasiones, también se añade tanino que puede
tener un efecto positivo sobre la calidad de la espuma y ácido cítrico para facili-
tar la inversión de la sacarosa en glucosa y fructosa.
Una metodología habitual para preparar el licor de “tirage” es como sigue: se
parte de 500 mL de sidra base estéril diluida con agua estéril hasta alcanzar 3,5%
de alcohol. A esta mezcla se le añade azúcar en un 5% y entre 1 y 2 gramos de
levadura seca activa y se incuba a 25º C. Una vez que se ha consumido la mitad
del azúcar añadido, se transfiere este inóculo a 1,5 litros de sidra base que con-
tendrá un 5% de azúcar. Cuando se ha consumido el 50% del azúcar del inócu-
lo, se añade un 10% de éste a un volumen determinado de sidra base, que con-
tiene un 5% de azúcar. Este proceso requerirá diversos pases, teniendo en cuen-
ta que debemos añadir al volumen final de sidra base a tratar un 5% de inóculo.
Estas etapas deben realizarse a la temperatura del proceso de toma de espuma.
c) Toma de espuma. El desarrollo de la segunda fermentación en botella,
como consecuencia de haber añadido el licor de “tirage”, origina la toma de
224
8. Sidras espumosas
espuma, proceso que es controlado mediante un “afrómetro” (manómetro) fijado

a la botella. Una vez añadido el licor las botellas, son cerradas herméticamente
mediante un dedal u obturador (“bidule”) de polietileno que se incorpora dentro
del gollete de la botella y se adapta a un tapón corona (normalmente de acero
inoxidable). Las botellas se almacenan en posición horizontal en contenedores
especiales con capacidad para 500 o 600 unidades (rimas), con el fin de garan-
tizar la máxima superficie de intercambio entre las lías de fermentación y la sidra
y evitar la entrada de aire.
La toma de espuma puede durar de uno a dos meses y se desarrolla a una tem-
peratura de bodega de 11 a 12º C con el fin de que exista un lento, pero progre-
sivo, incremento de la presión de gas carbónico para mejorar la calidad de la
espuma y la desgasificación de la sidra en el momento de ser servida. No obs-
tante, la velocidad fermentativa está también condicionada por el estárter uti-
lizado, su concentración inicial, el contenido en nutrientes (a veces se añade
tiamina o sales amoniacales), sulfitos y polifenoles, el grado alcohólico, la pre-
sión de carbónico y el pH.
La temperatura de fermentación condiciona la calidad de las burbujas for-
madas. Así, se cree que si se fermenta a una temperatura baja se mejora la pro-
ducción de lípidos, lo cual favorece la retención de las burbujas. A medida que
la toma de espuma se produce la concentración de gas carbónico aumenta, lo
que provoca una cierta inhibición del proceso fermentativo y su ralentización.
Esta inhibición puede limitarse si se añaden en el licor de “tirage” nutrientes; así,
por ejemplo, las sales de amonio favorecen la producción de ésteres y limitan la
de alcoholes superiores y sulfitos. No obstante, con el fin de contrarrestar el efec-
to de la inhibición de la actividad de las levaduras, es más efectivo aumentar la
cantidad inicial de inóculo y adaptar el estárter al tipo de sidra base que se vaya
a utilizar.
d) Envejecimiento. Finalizada la fermentación en la botella comienza el pro-
ceso de envejecimiento sobre las lías que se depositan en el fondo. Se trata de
una etapa fundamental en la elaboración de sidras espumosas de calidad. Un ade-
cuado envejecimiento sobre las lías de fermentación comunica redondez, cuerpo
y complejidad aromática a la bebida espumosa, a la vez que afecta a la calidad
de la burbuja. Durante este proceso las levaduras mueren y se produce poste-
riormente (entre tres y nueve meses después del “tirage”) su autolisis, que con-
lleva la liberación al medio exterior de la célula de moléculas del citoplasma (por
ejemplo, péptidos, ácidos grasos, nucleótidos, aminoácidos, etc.) y de la pared
celular (por ejemplo, manoproteínas); también, la autofagia (proceso que se acti-
va por la deficiencia de nutrientes y que consiste en la formación de autofagoso-
mas que transportan estructuras celulares hacia la vacuola donde se degradan)
puede jugar un notable papel en la liberación de sustancias al medio extracelular.
Desde un punto de vista bioquímico, la autolisis consta de las fases siguien-
tes (Charpentier y Feuillat, 1993): a) desorganización de los sistemas de mem-
brana de la célula con liberación de enzimas hidrolíticos (por ejemplo, proteasas
225
vacuolares); b) activación de éstos; c) degradación enzimática de macromolécu-

las intracelulares e incremento de los productos de degradación; d) aumento de
la porosidad celular con liberación al exterior de los productos derivados de la
autolisis; y e) degradación adicional de las moléculas en el medio externo.
La mayor influencia de la autolisis sobre las propiedades sensoriales (aroma
y flavor) y espumosas tiene que ver con los productos resultantes de la autode-
gradación enzimática de los constituyentes celulares. Así, por ejemplo, la endo-
proteasa (proteasa A) presente en la levadura Saccharomyces cerevisiae libera,
en primer lugar, péptidos que posteriormente son hidrolizados en fragmentos
más pequeños y aminoácidos. La pared celular (formada por glucanos y mano-
proteínas, fundamentalmente) es degradada por sus propios enzimas (endo y exo
β-(1,3) glucanasas) produciendo oligosacáridos que contienen enlaces glicosídi-
cos β-(1,3) y polisacáridos constituidos por manoproteínas (relación: 2/8, gluco-
sa/manosa).
La desestabilización posterior de la pared celular produce manoproteínas de
alto peso molecular con un bajo porcentaje de glucosa (disminuye la ratio
glucosa/manosa) (Moreno-Arribas y Polo, 2005). Finalmente, las exo β-(1,3)
glucanasas solubilizadas en el medio externo producen manoproteínas. La acción
de las α-manosidasas y proteasas provoca la hidrólisis de las manoproteínas,
liberando peptidomananos de menor tamaño. La presencia de todos estos pro-
ductos de hidrólisis mejora la calidad de la espuma y la sensación táctil en la boca.
También, las nucleasas hidrolizan el ADN y ARN produciendo nucleósidos,
mononucleótidos y polinucleótidos que se comportan como agentes de flavor, es
el caso, por ejemplo, de los nucleótidos: adenosina 5’-monofosfato (5’-AMP) y
guanosina 5’-monofosfato (5’-GMP).
La liberación de péptidos y aminoácidos al medio líquido se utiliza como
indicador del proceso de autolisis y, por ello, se cree que aquellas proteasas con
actividad en medio ácido, como la proteasa A de S. cerevisiae (se estima que esta
enzima puede ser la causante de hasta el 80% del nitrógeno liberado en la auto-
lisis), son responsables de la liberación de estos materiales nitrogenados.
El perfil observado en la concentración de aminoácidos a lo largo de la ela-
boración de la bebida espumosa (figura 2) se corresponde con una absorción ini-
cial de estos componentes por la levadura durante la segunda fermentación, para
luego ser excretados de manera pasiva una vez que ésta finaliza, hecho que no
debe ser confundido con el fenómeno de autolisis. La absorción/excreción de
aminoácidos está condicionada por la existencia de una fuente de amonio en el
licor de “tirage”. Así, por ejemplo, la presencia de amonio limita la absorción y
favorece la excreción de aminoácidos. Una vez excretados, su concentración per-
manece constante durante un tiempo (fase de activación que precede a la autoli-
sis) hasta que comienza el proceso de autolisis de las células, que provoca un
nuevo incremento de la concentración de aminoácidos como consecuencia de la
acción de las proteasas sobre péptidos y proteínas.
226
8. Sidras espumosas
Figura 2.– Evolución de los aminoácidos y células viables de levadura a lo largo del proceso de elaboración
de la sidra espumosa (Suárez Valles y col., 2005). Σ AA: total aminoácidos en mg/L (−); ufc: unidad formado-
ra de colonias (—-); TE: toma de espuma; C: crianza;
No obstante, el aumento de la concentración de aminoácidos es limitado por

cuanto, por un lado, la proteasa A es de tipo endo, es decir, produce péptidos fun-
damentalmente y, por otro, los aminoácidos liberados pueden ser transformados
por descarboxilación y desaminación.
Algunos de esos péptidos aportan sabores dulces y amargos, a la vez que esta-
bilizan la espuma. Por lo que se refiere a los aminoácidos liberados al medio
extracelular y de acuerdo con los estudios realizados por Suárez Valles y col.
(2005) en sidras espumosas, conviene destacar que los aminoácidos relacionados
con el envejecimiento son la serina, glicina, alanina, valina, ornitina, leucina y
lisina, mientras que el tipo de cepa de levadura utilizada en el proceso de toma
de espuma afectaría a las concentraciones de asparagina y ácido aspártico.
Por otro lado, según Alexandre y Guilloux-Benatier (2006) la presencia de
treonina y serina en las bebidas espumosas, sometidas a envejecimiento sobre
lías, se justificaría porque estos aminoácidos participan en los enlaces glicosí-
dicos existentes entre proteínas y mananos de la pared celular de la levadura. La
degradación de los aminoácidos enriquece el aroma así, por ejemplo, la treonina
se puede transformar por desaminación en α-cetobutirato y éste, en presencia
de acetaldehído y a través de dos etapas de deshidratación y lactonización, se
convierte en 4,5 dimetil-3-hidroxi-2(5H)-furanona, que tiene un fuerte impacto
aromático a nuez verde. Por otra parte, la degradación de los lípidos, que son
constituyentes de la membrana celular, conduce a la liberación de ácidos grasos
que, a su vez, están implicados en la formación de ésteres (los ésteres etílicos
aportan notas frutales y mejoran la calidad de la espuma), aldehídos y otros aromas.
227
Otros compuestos volátiles producidos durante el envejecimiento son los

alcoholes superiores, aromáticos y terpénicos, aldehídos, ésteres, como el succi-
nato de dietilo, C13 norisoprenoides, compuestos azufrados como el sulfuro de
hidrógeno, mercaptanos, disulfuros, etc. En este sentido, conviene resaltar el
trabajo realizado por Rodríguez Madrera y col. (2008) sobre la influencia del
cultivo iniciador y el envejecimiento de sidras espumosas sobre la composición
aromática. Se constata que la maduración sobre las lías es un factor determinan-
te en el perfil aromático de las sidras espumosas, detectándose un aumento de los
alcoholes superiores, el acetato de etilo, el lactato de etilo y el octanoato de etilo
con el tiempo de contacto de la sidra con las lías.
La velocidad con la que se produce la autolisis de las levaduras es función de
la temperatura, el pH, la concentración de etanol y el tipo de cepa. En las condi-
ciones de la sidra espumosa (pH entre 3 y 4; temperatura<15º C; y 7% de etanol)
este proceso es lento, ya que las condiciones ideales son pH 5 y 45º C (Alexandre
y Guilloux-Benatier, 2006). No obstante, hay que tener en cuenta que un enve-
jecimiento a temperaturas elevadas trae consigo una pérdida en la calidad de la
burbuja y de los atributos sensoriales.
El envejecimiento debe realizarse con la botella en posición horizontal pa-
ra facilitar los procesos de transferencia desde las células a la sidra y a una
temperatura comprendida entre 11 y 12º C, con el fin de favorecer la persisten-
cia y finura de las burbujas en el momento de ser descorchada la sidra; su dura-
ción no debe ser inferior a un periodo comprendido entre nueve y 12 meses, a la
luz de los estudios efectuados en cavas y champanes. También, es recomen-
dable que las botellas estén protegidas de la luz, ya que ésta puede fotodegra-
dar aminoácidos azufrados produciendo tioles (metanotiol, dimetildisulfuro)
que comunican aromas tipificados como “reducidos”. Este proceso puede limi-
tarse si se usan botellas con baja transmisión de longitudes de onda inferiores a
450 nm.
e) Removido de las lías. Terminado el periodo de crianza o de envejecimien-
to sobre las lías de fermentación, lo que supone que la sidra ya adquirió las pro-
piedades sensoriales adecuadas, es necesario proceder a la eliminación de las
lías. Esta operación tiene por objeto desplazar los sedimentos de la fermentación
desde el fondo de la botella hasta el cuello/gollete de ésta. Una vez lograda la
posición invertida de la botella (“en punta”), se procederá a la siguiente etapa
que es el degüelle. El removido puede llevarse a cabo manualmente una vez
colocadas las botellas en los “pupitres”. Éstas son giradas diariamente 1/8 de
vuelta sobre su eje a la vez que se desplazan desde una posición inicial de 30º
hasta el final de removido (posición de 60º) efectuándose, simultáneamente, un
movimiento oscilatorio. Cuando se realizan tres giros completos de las botellas
(aprox. 24 días) los sedimentos se acumulan en el cuello/gollete, disponiendo la
sidra de un nivel de turbidez lo suficientemente bajo (por ejemplo, inferior a 0,7
NTU). Esta operación de removido puede ser efectuada por un experto con un
rendimiento de 25.000 botellas removidas/día.
228
8. Sidras espumosas
También, el proceso de removido puede hacerse a través de sistemas como el

“giropalet” (figura 3) que pueden ser mecanizados y programados para mejorar
la eficiencia de la operación, teniendo
una capacidad de almacenamiento de
varios cientos de botellas (de 500 a
600). La duración del proceso de re-
movido es variable, de tres semanas a
un mes, en caso de hacerse de manera
manual o una semana si se mecaniza.
Los sedimentos de la fermentación
están formados por diversas capas:
material orgánico procedente de la si-
dra, levaduras y los coadyuvantes de
clarificación añadidos en el licor de “ti-
rage”. Las partículas más pesadas son
fácilmente transferibles al cuello de la
Figura 3.–GIRO-PALET (cortesía de Decavi, S.A.) botella al contrario que las más lige-
ras, lo que supone una dificultad para
ejecutar este proceso con eficacia. En este sentido, hay que destacar que la homo-
geneidad del sedimento se mejora con un contacto más prolongado de las lías de
fermentación con la sidra. El proceso de transferencia está afectado también por
otros factores, entre los que cabe señalar el tipo de levadura, el volumen del
inóculo, la velocidad de fermentación, los coadyuvantes utilizados, el sistema de
removido empleado, la temperatura (se recomienda trabajar en torno a 18º C), la
existencia de corrientes de aire (hay que evitarlas para que no se produzcan
movimientos convectivos en el líquido que dependen de los cambios de tempe-
ratura de la pared de vidrio de la botella), etc.
Otro modo de afrontar de manera eficiente el proceso de separación de las lías
de fermentación es mediante el empleo de biocatalizadores inmovilizados, que
se configuran como un conjunto formado por las células de los microorganismos
y el soporte de inmovilización. Con esta tecnología la fase de removido en “pupi-
tre” desaparece, ya que resulta muy sencillo eliminar de la botella las levaduras,
lo que disminuye los costes del proceso en un 80%.
Diversas tecnologías están disponibles para la inmovilización de microorga-
nismos como, por ejemplo, la adsorción en la superficie de un soporte (cerámi-
co, fibra de vidrio, silicatos, etc.), la incorporación de éstos en un gel (por ejem-
plo, alginato cálcico, agarosa, poliacrilamida, carragenato, etc.) y la retención en
una membrana (Martynenko y Gracheva, 2003). Dos de ellas están bien adapta-
das al método “Champenoise” (Hidalgo, 2003): a) perlas de alginato; y b) mem-
brana semipermeable.
Los geles de alginato son pequeñas esferas (perlas) de 5 mm de diámetro,
donde las levaduras activas son atrapadas a través de una densa red en el interior
del gel que es transparente a la entrada de nutrientes y a la salida de los productos
229
resultantes de la actividad de los microorganismos. Generalmente, las perlas de

alginato presentan dos recubrimientos de seguridad (uno con levaduras muertas
y otro de alginato) para evitar la salida de biomasa al exterior de la cápsula; de
hecho, el ambiente agresivo de la bebida espumosa deteriora la estructura del gel,
posibilitando la salida de células al exterior y enturbiando el líquido. El número
de “perlas”/botella varía entre 200 y 400, admitiendo que el inóculo de estárter
está en el entorno de EXP6 células/mL. Este procedimiento de inmovilización
provoca que las levaduras sean más tolerantes al anhídrido sulfuroso, a la pre-
sencia de polifenoles, a los bajos pH y altas temperaturas (Yajima y Yokotsuka,
2001); de hecho, la pared celular de las levaduras inmovilizadas es más espesa.
Por otra parte, ha sido descrito que la actividad respiratoria y fermentativa es más
elevada en levaduras inmovilizadas que en células libres, estando más limitada
su capacidad de proliferación dentro de la red del gel.
En el proceso de toma de espuma y envejecimiento sobre lías las células
inmovilizadas mueren primero que las libres, lo que pone en evidencia que el uso
de biocatalizadores puede liberar mayor cantidad de aminoácidos, al comenzar
antes el proceso de autolisis (Martynenko y Gracheva, 2003). De acuerdo con los
estudios realizados por Yokotsuka y col. (1997), la inmovilización de levaduras
produce bebidas espumosas con un nivel de calidad sensorial similar que cuan-
do se utilizan células libres.
Martynenko y col. (2004) han propuesto el uso de criogeles de polivinil alcohol
para inmovilizar levaduras en la toma de espuma del método “Champenoise”,
debido a su biocompatibilidad, falta de toxicidad, elevada resistencia a factores
químicos y microbiológicos, accesibilidad y bajo coste. A este biocatalizador se
le añaden autorreguladores, es el caso del factor d1 [2-(4-hidroxifenil)-etanol],
que inhiben los sistemas enzimáticos relacionados con el crecimiento y prolife-
ración celular, en el caso de S. cerevisiae, sin afectar a aquéllos vinculados con
el metabolismo energético, lo que previene la liberación de las células atrapadas
en la red del gel.
El sistema de fijación a través de membrana consiste en alojar los microor-
ganismos dentro de un sistema de doble membrana de 0,65 µm, una de carácter
hidrófilo y otra hidrófoba. El soporte hidrófilo permite la entrada de la sidra al
interior donde están las levaduras y el hidrófobo posibilita la salida del gas car-
bónico no disuelto (burbujas) producido en la segunda fermentación alcohólica.
Con esta tecnología la toma de espuma se ralentiza respecto al método conven-
cional con células libres; y, de hecho, la multiplicación celular está afectada por
la presencia de gas carbónico, por lo que es recomendable que en el interior de
la membrana se introduzca una población de levaduras activas en el entorno de
EXP9 células/mL.
El movimiento de los sustratos de fermentación, desde el seno del líquido
hasta la membrana fijada en el cuello de la botella, se establece sobre la base de
las corrientes de convección que se producen como consecuencia del calenta-
miento local de líquido, motivado por la fermentación alcohólica que es un pro-
230
8. Sidras espumosas
ceso exergónico (25,4 Kcal/mol). Con las células inmovilizadas mediante mem-
brana, la posición de la botella conviene que esté “en punta”.
f) Degüelle. Este proceso se lleva a cabo para eliminar los sedimentos acu-
mulados en el cuello de la botella. Previamente, el producto se enfría a 4-10º C
y, a continuación, el cuello de la botella es introducido en una disolución de clo-
ruro de calcio o de glicol a -15º C, lo que permite que se congele el sedimento y
una pequeña proporción de líquido. Se debe tener precaución en no congelar
demasiado líquido lo que acarrearía dificultades en el degüelle. La presión que
existe en el interior de la botella permite expulsar el sedimento congelado cuan-
do ésta se destapona. En esta etapa, se debe evaluar el nivel de clarificación del
líquido y si existen aromas que deprecien la calidad del producto. Normalmente,
se pierden aproximadamente 0,6 atmósferas de presión de gas carbónico y un 2%
de volumen durante este proceso. El degüelle manual tiene un rendimiento de
1.500-2.000 botellas/persona*día y si es automático 2.700 botellas/hora.
g) Licor de expedición. La expulsión de las lías de fermentación en la opera-
ción de degüelle origina una merma de volumen. Con el fin de recuperar dicho
volumen se añade el licor de expedición. La adición de éste altera la composi-
ción de la sidra espumosa y cada bodega o firma comercial utiliza una fórmula
concreta. El principal componente del licor de expedición es el azúcar, que per-
mite edulcorar el producto, equilibrar la acidez, enmascarar la astringencia y el
amargor y modificar ligeramente el flavor. La concentración de azúcar (normal-
mente sacarosa) añadido define el tipo de bebida espumosa así, por ejemplo,
entre 0 y 15 g/L se define la categoría “Brut”, distinguiéndose las subcategorías
“Extra Brut”, con menos de 6 g/L y “Brut Nature”, con menos de 3 g/L; entre 12
y 20 g/L la clase “Extra Seco”; entre 17 y 35 g/L “Seco”; entre 33 y 50 g/L
“Semiseco”; y por encima de 50 g/L “Dulce”.
El licor de expedición puede contener, además de azúcar, un corrector de la
acidez, por ejemplo ácido cítrico, dióxido de azufre (≈ 40 mg/L) y ácido ascór-
bico (≈ 60 mg/L), con el fin de eliminar el oxígeno disuelto incorporado duran-
te el proceso de degüelle, ya que durante esta etapa el potencial redox puede
incrementarse en 150 mV. La acción antioxidante del ácido ascórbico comple-
menta la del dióxido de azufre, de tal modo que la concentración de sulfitos
puede reducirse si añadimos este ácido. Así, de ese modo, podemos limitar la
percepción sensorial del sulfuroso que está potenciada por el anhídrido carbónico.
También, puede ser incorporada una pequeña cantidad de aguardiente de sidra
(por debajo del 3%) envejecido con el fin de, por un lado, incrementar ligera-
mente el grado alcohólico de la sidra espumosa y, por otro, aumentar la comple-
jidad aromática de ésta. En todo caso, esta adición no debe inhibir los aromas
propios de la sidra y la manzana y aquéllos producidos durante el proceso de
envejecimiento sobre las lías.
Método “Charmat” (cuba cerrada). La tecnología “Champenoise” es utili-
zada en la producción de bebidas espumosas de elevada calidad, lo cual está
231
asociado a periodos de envejecimiento prolongados. Este tipo de maduración no

es rentable para otros productos que, teniendo una calidad aceptable, se aleja de
la excelencia de los primeros. En estos casos, el método “Charmat” es el que
habitualmente se emplea (ver capítulo 7). Se distinguen los elementos siguien-
tes: 1- depósito con el iniciador para la segunda fermentación; 2- tanque con el
licor de “tirage”; 3-recipiente para la toma de espuma o autoclave; 4-depósito de
refrigeración; 5-tanque de embotellado; 6-tanque de dióxido de carbono para lle-
nado isobarométrico; 7-grupo de frío; 8-filtro isobárico; y 9-llenadora isobárica.
La sidra base es trasegada al depósito donde se efectuará la toma de espuma.
A este tanque se incorporará, desde los recipientes que contienen el licor de
“tirage” y el iniciador, la cantidad requerida de azúcar, levadura y coadyuvantes.
Este depósito hermético deberá tener un sistema de control de la temperatura y
soportar la presión que se requiere en la elaboración de la sidra espumosa.
Cuando se alcanzan aproximadamente 5 bares de presión la sidra espumosa es
transferida al tanque de refrigeración con el fin de proceder a su estabilización.
En el método Charmat no se produce una adecuada crianza sobre las lías de fer-
mentación; no obstante, la salida de los materiales intracelulares se puede favo-
recer por medio de la agitación de la sidra espumosa con sus lías. Una vez esta-
bilizado el producto por frío se procede a su filtración y trasiego al depósito de
embotellado, el cual está conectado con la línea de alta presión de carbónico que
garantiza la no desgasificación de la sidra. Por último, se realizará un llenado iso-
barométrico.
Sidras de una sola fermentación

Toma de espuma en botella. Estas sidras espumosas consiguen adquirir una
determinada presión de gas carbónico (toma de espuma) mediante un solo proce-
so fermentativo, el cual finaliza en un recipiente cerrado, en este caso, en la bote-
lla. Por tanto, en este procedimiento no se añade el licor de “tirage” y los azúcares
que se transforman son los que inicialmente presenta el mosto de manzana.
La fermentación alcohólica tiene lugar en dos fases; en una primera etapa, el
proceso se produce a presión atmosférica en el depósito y en una segunda fase la
fermentación se desarrolla en la botella, que es donde se genera la toma de espu-
ma y la presión de gas carbónico. La concentración de azúcares residual, una vez
finalizado el proceso fermentativo en la botella, es variable, lo que se traduce en
la elaboración de sidras con diferente grado de dulzor que normalmente se inclu-
yen en la categoría Brut, esto es, con una concentración de azúcar por debajo de
15 g/L.
La primera fase del proceso de elaboración es similar al que se utiliza en la
sidra natural. Se recomienda emplear una mezcla de manzana de sidra del tipo
acidulado con cierto grado de amargor, con el objeto de facilitar el control de
las diferentes poblaciones de microorganismos presentes en el mosto, levaduras
de primera fase y fermentativas y bacterias lácticas y acéticas. A continuación, se
232
8. Sidras espumosas
lava el fruto y se extrae el mosto mediante molinos y prensas convencionales

(neumáticas, de cajón, etc.). Después, el mosto es clarificado mediante tecnolo-
gías clásicas como el “collage” o la defecación enzimática (Mangas y col., 1993)
o procedimientos físicos como la filtración tangencial o la centrifugación. En
caso de utilizar técnicas físicas de clarificación es conveniente emplear un estár-
ter para desarrollar la fermentación alcohólica.
Una vez iniciada la fermentación y cuando la fase tumultuosa está en pleno
desarrollo (aprox., entre 20 y 25 días) se filtra el mosto-sidra. Para ello, se pue-
den utilizar filtros de fondo con un tamaño nominal de poro de 0,5 µm.
Dependiendo del nivel de azúcar que se desee obtener en el producto final, se
elige el momento de efectuar una segunda filtración, algo más cerrada de poro,
para luego proceder al embotellado de la sidra. Lo habitual es efectuar la segun-
da filtración cuando el nivel de azúcar está por debajo de los 20 g/L (aprox. con
una densidad de 1.010 g/L). En esta situación, si todo el azúcar fermentase en la
botella, se obtendría una presión de gas carbónico de aproximadamente 4,7 bares
a 10º C. Sin embargo, dado que la concentración de levaduras será baja una vez
efectuado el filtrado y como no se añade el licor de “tirage”, lo normal es obte-
ner una presión de gas carbónico inferior.
Así, por ejemplo, con un descenso de cinco puntos de densidad en la botella,
lo que supone aproximadamente un consumo de 10 g/L de azúcar y admitiendo
un rendimiento del 100% de la fermentación alcohólica, la presión alcanzada en
botella sería de 2,36 atm (constante de Henry a 10º C, 2,07 g/L CO2/atm). Las
sidras espumosas obtenidas en estas condiciones difieren de las elaboradas por el
método “Champenoise” en dos aspectos fundamentales: a) el grado alcohólico
adquirido es inferior, incluso éste es menor que el de la sidra natural; y b) la pre-
sión alcanzada en botella es más baja. También, conviene señalar que, depen-
diendo del tiempo de permanencia de la sidra en la botella, se puede desarrollar
un cierto grado de autolisis que afectará al aroma de la sidra.
233
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234
9. Físico-Química de la espuma.
Propiedades espumantes
Introducción
La espuma es una dispersión coloidal de un gas en un líquido. Es un sistema
termodinámicamente inestable que, sin embargo, puede presentar una estabilidad
cinética. En el caso de las bebidas efervescentes, como la sidra, la fase dispersa
es el gas carbónico que se encuentra envuelto en un film líquido formando la
burbuja. La espuma es una de las principales características de este tipo de bebi-
das (sidra natural y sidra), ya que es el primer atributo sensorial que el consu-
midor percibe. Así, por ejemplo, en el caso de la sidra natural se aprecian, en el
momento de ser servida (escanciada) en el vaso, la espumosidad (cantidad
de espuma generada), el espalme (relacionado con la estabilidad de la espuma),
el aguante (permanencia de las burbujas por debajo de la superficie libre del
líquido) o el pegue (relacionado con la adherencia de la espuma al vaso).
En el caso de la sidra espumosa, de acuerdo con los trabajos de Picinelli y col.
(2005), se valoran la espuma inicial, la persistencia de la espuma en la superfi-
cie del líquido, el número de centros de nucleación (zonas de formación de bur-
bujas en el seno del líquido), el tamaño de la burbuja y las características del
collar de burbujas formado en la superficie del líquido.
La espuma que se percibe en una bebida efervescente es el resultado de un
conjunto complejo de procesos de formación y ruptura que tiene que ver funda-
mentalmente con las propiedades físicas de la dispersión coloidal (tensión super-
ficial, densidad, viscosidad, espesor del film, temperatura, presión, solubilidad,
coeficiente de difusión del gas, etc.) y la composición química (contenido en pro-
teínas, polisacáridos, polifenoles, ácidos grasos, etc.).
Física de la espuma
Cuando se forma la espuma el área del líquido donde el gas está disperso se
incrementa de manera muy significativa, oponiéndose a la tensión superficial
235
que tiende a minimizar la energía. En las bebidas alcohólicas el etanol es capaz

de disminuir la tensión superficial del agua pura (73 mN/m, σo) hasta valores
comprendidos entre 40 y 50 mN/m (σ) y los tensoactivos incorporados a la pared
de la burbuja provocan una disminución local, aún mayor, de la tensión superfi-
cial; este descenso de la tensión superficial se denomina presión de superficie
(∏= σo-σ). Los tensoactivos tienen propiedades anfifílicas, esto es, una parte
hidrofílica que se orientará hacia el medio acuoso y otra hidrofóbica que lo hará
hacia el interior de la burbuja. Además, ésta adoptará la forma esférica para mini-
mizar el área de la superficie del líquido.
La estabilización de las burbujas también se favorece si se incrementa la rigi-
dez del film que la envuelve (por ejemplo, a través de interacciones moleculares
de los componentes del film), se limita la evaporación y se incrementa la visco-
sidad del líquido (Bamforth, 1985). Desde el punto de vista físico, hay varios
procesos que están implicados en la generación y estabilización/desestabiliza-
ción de la espuma: la formación de burbujas, el drenaje, la maduración de
Ostwald y la coalescencia.
Formación de burbujas. Este proceso es uno de los mecanismos de pérdida o
escape de gas carbónico cuando una bebida efervescente, herméticamente cerra-
da, es abierta. Como ya se ha comentado, la burbuja es una estructura física
donde el gas carbónico está encerrado en un film líquido. La ley que gobierna la
cantidad de CO2 disuelto en un líquido es la ley de Henry [c= KH * P (CO2)],
donde c es la concentración en g/L de gas disuelto, KH es la constante de Henry
(g/L x atm-1) y P (CO2) es la presión (atm) parcial de gas carbónico en la fase
vapor. La constante de Henry depende de la temperatura, de tal manera que a
medida que ésta disminuye KH aumenta, con lo que la solubilidad del gas, para
una presión determinada, se incrementa.
El gas carbónico se disuelve en dos etapas, la primera conlleva la formación
del anión bicarbonato (pKa= 6,37) y en la segunda se forma el anión carbonato
(pKa= 10,25); teniendo en cuenta el pH de la sidra, en torno a 3,7, se puede con-
siderar que prácticamente todo el gas disuelto lo está en forma molecular (CO2),
existiendo una baja concentración de carbonato y bicarbonato.
Cuando la botella de sidra es abierta se produce una fuerte disminución de la
P (CO2), ya que la presión parcial de este gas en la atmósfera es de aproximada-
mente 3 x 10-4 atm; en consecuencia, y de acuerdo con la Ley de Henry, casi
todas las moléculas disueltas de CO2 en la sidra deben escapar, produciéndose
una fuerte descarga de gas a través de las burbujas. En este punto, es importante
definir la sobresaturación de gas carbónico (S), que se relaciona con las concen-
traciones de gas disuelto a una presión parcial P (Cp) y a una presión de 1 atm
(Co) mediante la expresión, S= (Cp/Co) - 1. A título de ejemplo, si consideramos
que la presión de carbónico en una botella de sidra espumosa es de 6 atm, enton-
ces S tomará el valor de 5, ya que existe una relación de proporcionalidad entre
la concentración y la presión del gas de acuerdo con la ley de Henry. Siempre
que S>0 se producirá la desgasificación.
236
9. Físico-Química de la espuma. Propiedades espumantes
La formación de las burbujas (nucleación) es de carácter heterogéneo (inter-

viene una interfase sólida, microcavidades), ya que la nucleación homogénea
precisa valores de S>1.000. La burbuja de radio R se desprenderá de una mi-
crocavidad de radio r siempre y cuando la fuerza del empuje (4/3 πR3ρg) supere
la fuerza capilar (2πrσ), donde σ es la tensión superficial, ρ es la densidad y g la
gravedad.
El tamaño de una burbuja (R), en el momento de su formación, se describe
mediante la expresión siguiente: R= (3rσ/2ρg)1/3, donde r es el radio de la micro-
cavidad. Éste es el factor que más afecta al tamaño de la burbuja, de tal modo
que a medida que la microcavidad es más pequeña menor será el tamaño de la
burbuja formada.
Por otra parte, estas microcavidades de gas tienen que tener un tamaño supe-
rior a un radio crítico de nucleación (rc), que se relaciona con el grado de sobre-
saturación (S) y la tensión superficial del líquido mediante la expresión rc≈ 2σ/S
* Po, donde Po es 1 atm. Así, por ejemplo, en vinos espumosos el radio crítico ten-
dría un valor de aproximadamente 0,2 µm, teniendo en cuenta una sobresatura-
ción de 5 y una tensión superficial de 50 mN/m. En consecuencia, el tamaño ini-
cial de la burbuja para una microcavidad de 0,2 µm y para un líquido de 50
mN/m de tensión superficial y 1.000 kg/m3 de densidad sería de 0,1 mm.
Es importante resaltar que el radio crítico depende del grado de sobresatura-
ción (S) del gas carbónico, el cual se modifica una vez que la botella es abierta.
Dado que a partir de ese momento S comienza a disminuir el radio crítico aumen-
ta progresivamente, limitándose y cesando, finalmente, la producción de burbujas.
De acuerdo con el trabajo desarrollado por Liger-Belair (2005), las irregulari-
dades del recipiente de vidrio, donde se sirve la bebida efervescente, no tienen el
tamaño suficiente como para que en ellas se pueda desarrollar el proceso de nucle-
ación, teniendo en cuenta el bajo nivel de sobresaturación que presentan estas bebi-
das (S≤5). Según este autor, las fibras huecas de celulosa son las microcavidades
donde se produce la nucleación. El gas carbónico difunde hacia ellas, provocando
un crecimiento de la burbuja que se separa de la fibra una vez que el empuje supe-
ra las fuerzas capilares que la retienen. La frecuencia de producción de burbujas es
una función del tamaño y forma de la microcavidad así como del nivel de sobre-
saturación del líquido (las frecuencias son más altas en bebidas espumosas, como
el “champagne”, que en la cerveza). En consecuencia, cuando se produce la des-
gasificación se puede observar en el vaso/flauta de degustación, al mismo tiempo,
diferentes trenes de burbujas con frecuencias de formación distintas.
A medida que la burbuja asciende su tamaño (R) crece con el tiempo (t) [R
(t)= R (t= 0) + kt; k: velocidad de crecimiento]. Por otra parte, la velocidad (v)
de ascensión de la burbuja depende de su tamaño y ambas variables (v, R) se
relacionan a través de la expresión siguiente:
ραgR2/9η
v= 2ρ η (η: viscosidad; α: 0,6-0,8)
237
El tamaño de la burbuja es un indicador de la calidad de la espuma (Picinelli

y col., 2005). A medida que la burbuja es más pequeña la desgasificación se
ralentiza y, como consecuencia de ello, se hace menor la velocidad con la que
disminuye la sobresaturación y el aumento del radio crítico, por lo que la nu-
cleación se prolonga en el tiempo. En consecuencia, es importante analizar qué
factores afectan a la velocidad de crecimiento de la burbuja (k: dR/dt). De acuer-
do con Liger-Belair y col. (2002) la velocidad de crecimiento se define como:
≈0,63 R’θ
k≈ αρg/9η
θ/PB * D2/3 * [2α η]1/3 * ∆c (θ: temperatura; R’: constante de los gases;
PB: presión interna de la burbuja; D: coeficiente de difusión del gas; ∆c: diferencia de
concentración del gas entre el líquido, CL y el film de la burbuja, CF)
La presión interna de la burbuja (PB) es aproximadamente la atmosférica (Po),

ya que las otras contribuciones a la presión, como la hidrostática y la de Laplace
son despreciables frente a ésta. Por tanto, ∆c= CL − CF puede ser evaluada
mediante la expresión ∆c= CL - KH * Po.
Del conjunto de variables recogidas en la expresión que define k, únicamen-
te ∆c permite explicar las diferencias en las tasas de crecimiento de las burbujas
entre diferentes bebidas efervescentes, 350-400 µm/s para el “champagne” y
100-150 µm/s para la cerveza (Liger-Belair, 2005), ya que la cantidad de gas
disuelto en la cerveza es aproximadamente tres veces menor que en un vino o
sidra espumosa.
El tamaño final de una burbuja no sólo depende de la tasa de crecimiento
sino, también, de la distancia recorrida desde el lugar de nucleación a la superfi-
cie y de su velocidad de ascensión. Teniendo en cuenta estos factores, el radio o
tamaño de una burbuja se puede expresar del modo siguiente:
≈2,7 * 10-3 θ5/9 (1/ρ
R≈ ρg)2/9 (CL - KHPB/ PB)1/3 h1/3 (h: distancia desde la
microcavidad a la superficie del líquido)
A la vista de esta ecuación, se puede considerar que la concentración de gas

carbónico disuelto en el líquido (CL) es el factor principal que permite explicar
las diferencias existentes en el tamaño de la burbuja entre bebidas efervescentes.
En este sentido, hay que tener en cuenta que la sidra natural o la cerveza tienen
menor concentración de gas carbónico disuelto que las bebidas de segunda fer-
mentación como el cava, las sidras espumosas o el “champagne”. Esta expresión
también muestra que a medida que se produce la desgasificación el tamaño de la
burbuja se hace menor.
Por otra parte, los materiales activos (tensoactivos, T) a nivel de superficie de
la burbuja, es el caso de las proteínas y glicoproteínas, modifican la composición
del film y alteran su velocidad de ascensión. Durante este movimiento se produ-
ce una incorporación de tensoactivos (dT/dt) y un incremento del área de la
superficie de la burbuja (dA/dt). Si dT/dt > dA/dt, se producirá un aumento neto
de materiales en la burbuja que provocará una ralentización de su movimiento
hacia la superficie y lo contrario ocurrirá si dT/dt < dA/dt, ya que en este caso,
238
se producirá una dilución de los materiales tensoactivos. Las experiencias hechas

en vinos espumosos demuestran que en los primeros instantes de la formación de
la burbuja (distancia recorrida inferior a 3 mm.) se produce una acumulación de
tensoactivos que provoca que la velocidad de ascensión sea pequeña. Por enci-
ma de 10 mm de recorrido ascendente de la burbuja, el incremento del área dilu-
ye la concentración de los tensoactivos provocando un aumento de su velocidad.
La burbuja, una vez que alcanza la superficie libre del líquido (normalmente
con un tamaño inferior a 1 mm.), no puede emerger al completo dado que el
empuje (ρgπR3) es inferior a las fuerzas capilares (σπR) que la retienen en el
seno del líquido. El film líquido de la superficie que está por encima de la bur-
buja se hace cada vez más delgado debido al drenaje del líquido, produciéndose
finalmente su ruptura lo que provoca una depresión en la superficie del líquido,
la salida de gotas del film (aerosol) y la proyección de un jet de éstas (figura 1).
Figura 1.–Ruptura de la burbuja en la superficie del líquido (Zamora, 2003)
Este proceso tiene consecuencias desde el punto de vista de la valoración aro-

mática de la bebida, ya que sustancias aromáticas anfifílicas, como alcoholes,
ácidos, aldehídos, tioles, etc., son concentradas en la superficie de la burbuja a lo
largo del recorrido desde la microcavidad a la superficie del líquido; al produ-
cirse la ruptura del film, estos aromas concentrados pueden ser fácilmente apre-
ciados por el consumidor.
Drenaje. Una vez formada la burbuja el film líquido que envuelve el gas
está sometido a un proceso de drenaje que provoca una reducción de su espesor,
lo que conduce finalmente a la inestabilidad y a la coalescencia de la burbuja.
La gravedad es la fuerza conductora de este proceso, actuando de manera di-
recta sobre el líquido e indirectamente sobre el ‘plateau border’ (zona líquida
de unión entre varias burbujas) mediante un mecanismo de succión capilar (fi-
gura 2). El caudal de drenaje puede ser evaluado a partir de la siguiente expre-
sión (Bamforth, 2004):
ρgδL/3η
Q= 2ρ η (δ: espesor del film; L: longitud del ‘plateau border’)
239
Figura 2.–Drenaje del film por succión en la zona del ‘plateau border’. P1>P2; P: presión de Laplace
Del conjunto de factores que afectan al caudal de drenaje, la viscosidad es el

más relevante. A medida que ésta aumenta se incrementa la estabilidad de la
espuma, ya que el caudal de drenaje disminuye. El tamaño de la burbuja también
afecta al drenaje; las burbujas más pequeñas presentan la mayor relación super-
ficie/volumen, por lo que el drenaje será más lento y dará lugar a una mayor esta-
bilidad de la burbuja. Por otra parte, el tiempo necesario para alcanzar un espe-
sor del film δ a partir de un espesor inicial δo, siendo δo >>> δ y para una altura
L del film, se puede estimar a partir de la expresión siguiente: t= 6ηL/ρgδ2 (Prins,
1988). Esta ecuación recoge la relación directa entre el tiempo necesario para
drenar un determinado volumen de film y la viscosidad y la relación inversa del
tiempo y el espesor final del film.
El drenaje por succión es un fenómeno que se produce en el ‘plateau bor-
der’. Este proceso está causado por la disminución de la presión de Laplace
en el centro del ‘plateau border’ como consecuencia de la diferencia de curvatu-
ra (figura 2). La fuerza de succión es función del espesor del film, de tal mane-
ra que a medida que el espesor es mayor la fuerza de succión también lo es
(Prins, 1988). El resultado de este fenómeno es la disminución del espesor del
film, que se produce más rápidamente que cuando el drenaje está gobernado por
la gravedad.
Maduración de Ostwald. Este fenómeno consiste en la transferencia de gas
desde las burbujas de menor tamaño a las mayores. La fuerza conductora es la
presión de Laplace (P= σ/r; r: radio de curvatura). También denominada presión
capilar, se origina como consecuencia de la curvatura del film de la burbuja. Se
trata de una fuerza perpendicular a la superficie esférica y dirigida hacia el cen-
tro de la curvatura. Como se puede inferir de su definición, las burbujas más
pequeñas están sometidas a una mayor presión capilar, por lo que el gas tiende
a ser transferido hacia las burbujas mayores para que esta presión disminuya.
El fenómeno de transporte está favorecido por el hecho de que la solubilidad del
gas es proporcional a la presión, por lo que éste se disuelve mejor en el film de
las burbujas de menor tamaño, favoreciéndose la difusión hacia las burbujas
de mayor radio. La relación entre el radio de una pequeña burbuja que está
240
transfiriendo gas y el tiempo de esta transferencia (t) está gobernada por la ecua-
ción de Vries (Prins, 1988):
θDsσ
R2= (Ro)2 – (4R’θ σt/Pδδ) * t (R: radio de la burbuja a un tiempo t; Ro: radio de la
burbuja a tiempo cero; s: solubilidad del gas; δ: espesor del film entre burbujas)
En esta ecuación se asume que la tensión superficial es constante a lo largo

del proceso de transferencia del gas; sin embargo, a medida que la burbuja se
hace cada vez más pequeña la mayor concentración de tensoactivos que se pro-
duce provoca que la tensión superficial disminuya, lo que ralentiza el proceso de
transferencia. La ecuación de Vries nos muestra el efecto de la solubilidad del
gas sobre la disminución del radio de la burbuja, lo que permite explicar la mayor
estabilidad de las espumas que contienen nitrógeno vs. aquéllas con gas carbóni-
co, ya que el nitrógeno es menos soluble que el carbónico. El espesor existente
entre burbujas juega un papel importante en la maduración de Ostwald; a me-
dida que el espesor aumenta la transferencia de gas se ralentiza, por ello, la ma-
duración está muy condicionada por los procesos de drenaje. Obviamente, a
medida que el gas difunda mejor (mayores valores de D) la transferencia se faci-
lita y la espuma se desestabiliza.
Coalescencia. La coalescencia entre burbujas provoca la desestabilización y
ruptura de la espuma. En estas circunstancias las fuerzas de repulsión electrostá-
tica de la doble capa eléctrica y las de impedimento estérico no superan las fuer-
zas atractivas de dispersión de van der Waals. De acuerdo con Robillard y col.
(1993) las partículas hidrofílicas de la interfase estabilizan los films a través de
repulsiones electrostáticas e impedimentos estéricos. Las repulsiones electrostá-
ticas estarían producidas por tensoactivos de pequeño tamaño con cabezas po-
lares con carga y el impedimento estérico estaría inducido por la presencia en la
interfase de macromoléculas como las proteínas y los polisacáridos (Prins,
1988).
Por otra parte, a diferencia de las partículas hidrofílicas, aquéllas de carácter
más hidrofóbico contribuyen a la ruptura del film mediante el proceso denomi-
nado “mecanismo de la partícula hidrofóbica”. La presencia de una partícula
hidrofóbica en la superficie de la interfase provoca un drenaje adicional de lí-
quido y de surfactante (ver figura 3a), en oposición al flujo de surfactante del
mecanismo de Gibbs-Marangoni1 (Nörenberg y Oetter, 2001) y ello produce la
disminución del espesor del film de la burbuja. Para que este drenaje ocurra el
coeficiente S (denominado “spreading”) debe ser positivo (Dussaud y col.,
1994); éste, es función de las tensiones superficiales del film, σF, de la partícula
hidrofóbica, σH, y de la tensión superficial entre la partícula hidrofóbica y el
film, σFH, y se define por medio de la expresión S= σF – (σH + σFH).
La ruptura de un film precisa la formación de un agujero en la película líqui-
da. Este proceso requiere superar una barrera energética que es directamente
1
Migración de tensoactivo a zonas donde el film se estrecha.
241
proporcional al cuadrado del espesor del film. Cuando este espesor es inferior a
°́
50 A, el movimiento térmico de las burbujas es lo suficientemente energético
como para superar la barrera energética de formación del agujero y el film
comienza a romper (Kinsella, 1981; Prins, 1988). La estabilidad del film está
condicionada, también, por la relación existente entre el diámetro del agujero
formado y el espesor del film. Si el diámetro es superior a la mitad del espesor
del film, el proceso de ruptura ocurre y, por el contrario, si el diámetro es menor
se establece un flujo de líquido hacia el agujero que contribuye a la estabilidad
del film (Prins, 1988).
Química de la espuma
Las moléculas anfifílicas, como las proteínas y otros surfactantes o tensoacti-
vos de menor tamaño molecular, son capaces de estabilizar las espumas (Fillery-
Travis y col., 2000) (ver figura 3b y 3c1). Las proteínas difunden hacia la inter-
fase gas-líquido, se concentran y reducen la tensión superficial. Posteriormente,
experimentan un cambio conformacional desplegándose (ver figura 3c1) y orien-
tando la parte polar (grupos hidrofílicos) hacia el medio líquido y la apolar (gru-
pos hidrofóbicos) hacia el interior de la burbuja. A continuación, los polipéptidos
interaccionan entre sí (mediante interacciones hidrofóbicas y electrostáticas y
puentes de hidrógeno) formando un film viscoelástico que es muy eficaz para
prevenir el drenaje de líquido del film y la coalescencia de la burbuja, al ser ésta
capaz de expandirse y comprimirse, reduciendo el efecto del estrés mecánico
(Zayas, 1997).
El mecanismo de estabilización de la espuma provocado por los tensoactivos
de pequeño tamaño está basado en su alta movilidad molecular y en el efecto
denominado Gibbs-Marangoni (ver figura 3b); este proceso provoca un aumen-
to de la resistencia del film a la deformación. Cuando se produce una deforma-
ción de la película líquida de la burbuja se origina un estrechamiento de ésta y
un incremento de la tensión superficial local, lo que es consecuencia de la dis-
minución de la concentración de tensoactivo (figura 3b); en estas condiciones, se
puede inducir la ruptura del film. Los surfactantes de menor tamaño y más móvi-
les migrarán (------→; figura 3b) por difusión hacia la zona deformada, mejo-
rando la elasticidad e impidiendo su ruptura.
Cuando ambos tipos de tensoactivos (macromoléculas y pequeños surfactan-
tes) coexisten en el medio líquido los mecanismos descritos de estabilización de
la espuma no operan eficazmente, ya que las macromoléculas proteicas restrin-
gen la movilidad necesaria de los surfactantes de menor tamaño molecular y
éstos, debido a su mayor movilidad, se incorporan a la interfase gas/líquido más
rápidamente que las macromoléculas tensoactivas, impidiendo, de este modo,
que se forme una red viscoelástica que estabilice la espuma (ver figura 3c2).
Estos procesos permiten explicar, en parte, por qué los ácidos grasos desestabi-
lizan la espuma de la sidra.
242
σH
σF
Figura 3.–a) drenaje de líquido y tensoactivo provocado por una partícula hidrofóbica (σ: tensión superficial;
F: film; H: partícula hidrofóbica); b) film estabilizado por tensoactivos de pequeña masa molecular mediante
el flujo de Gibbs-Marangoni; c1) film estabilizado por macromoléculas que proporcionan viscoelasticidad; c2)
film desestabilizado por presencia simultánea de macromoléculas y tensoactivos de pequeño tamaño.
Las proteínas que tienen una buena capacidad espumante son flexibles (la fle-
xibilidad molecular se relaciona inversamente con el número de puentes disulfu-
ro) y de pequeño tamaño, difunden rápidamente hacia la interfase (se incremen-
ta la presión de superficie, ∏) y se despliegan con facilidad, favoreciendo, con
ello, la formación de la espuma. Este despliegue en la interfase está condicionado
por el balance existente entre grupos hidrofóbicos e hidrofílicos de la proteína.
La hidrofobicidad de la proteína facilita el despliegue de ésta en la interfase,
aumentado su capacidad espumante. En este sentido, conviene resaltar que las
proteínas más hidrofóbicas contribuyen más a la formación de la espuma que
las hidrofílicas, de acuerdo con los trabajos de Brissonnet y Maujean (1993)
realizados en vinos base destinados a la elaboración de “champagne”. En el caso
de la sidra se ha observado, también, que en la espuma se recuperan mejor las
proteínas con un carácter más hidrofóbico y que, generalmente, este tipo de poli-
péptidos están asociados a sidras con correctas valoraciones del “comportamien-
to en vaso” (Expósito, 2007).
Por el contrario, aquellas proteínas que son capaces de formar fuertes agre-
gados dan estabilidad a la espuma (Bamforth, 2004). La estabilidad tiende a ser
más alta en el punto isoeléctrico de las proteínas, dado que, en este caso, al exis-
tir una carga neta próxima a cero se minimizan las repulsiones electrostáticas y
243
la hidratación y se incrementan las interacciones inter e intra-moleculares, modi-

ficándose, a la vez, las propiedades reológicas del film que se vuelve más visco-
elástico, lo que limita la coalescencia de las burbujas.
Por otro lado, Blanco-Gomis y col. (2007) han realizado estudios de la frac-
ción proteica en sidra natural asturiana, determinando 33 polipéptidos con pesos
moleculares comprendidos entre 8,0 y 154,0 kDa. Estos autores observaron, por
un lado, una asociación entre sidras con buenas propiedades espumantes y poli-
péptidos de medio y pequeño tamaño molecular (21,0; 22,9; y 25,8 kDa), lo cual
corrobora el papel positivo que juegan las proteínas de pequeño tamaño en la
formación de la espuma y, por otro, se detectó una significativa y positiva rela-
ción entre un polipéptido de 111,4 kDa y el tiempo de permanencia de la espu-
ma en la superficie del líquido, lo que pone en evidencia el papel que juegan las
proteínas de elevado tamaño sobre la estabilidad de la espuma.
Otras macromoléculas, como los polisacáridos, también estabilizan las espu-
mas. Esta propiedad puede ser explicada sobre la base de su capacidad para inter-
accionar con proteínas, formando complejos a través de interacciones electrostá-
ticas, hidrofóbicas, por puentes de hidrógeno (interacción del hidrógeno con
átomos electronegativos) y covalentes (por ejemplo, reacción de un grupo amino
con un carboxilo para generar una amida) (Schmitt y col. 1998) y por su efecto
sobre la viscosidad que, como se ha comentado, afecta al drenaje de líquido del
film de la burbuja.
Así, por ejemplo, López-Barajas y col. (2001) establecieron relaciones entre
el peso molecular de los polisacáridos presentes en vinos y las propiedades espu-
mantes de éstos, Moreno-Arribas y col. (2000) detectaron una relación positiva
entre la capacidad de formación de espuma de los vinos espumosos y la concen-
tración de polisacáridos y Mangas y col. (1999) observaron el efecto negativo de
los polisacáridos ácidos y neutros y el metanol sobre las propiedades sensoriales
de la espuma evaluadas por un grupo de expertos. En este caso, el metanol ejer-
cería un efecto indirecto sobre las propiedades espumantes, ya que se trata de un
alcohol ligado a las pectinas altamente metoxiladas que influirían sobre la esta-
bilidad de la espuma.
Los polifenoles son compuestos que interaccionan con las proteínas modi-
ficando sus propiedades y afectando, en consecuencia, a la formación y estabi-
lidad de la espuma. Las interacciones entre proteínas y compuestos fenólicos
pueden tener un carácter reversible a través de interacciones no covalentes, gene-
ralmente, por puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. También, pueden
ser irreversibles por interacciones covalentes producidas por la oxidación de los
polifenoles y posterior reacción de la quinona resultante con grupos terminales
de nitrógeno, oxígeno y azufre de las proteínas. En este sentido, conviene re-
saltar que la presencia de altos contenidos de cistina en los precipitados que se
producen en cerveza, puede ser explicado por el papel que este dímero del ami-
noácido cisteína juega en la formación de enlaces covalentes con las quinonas
(formas oxidadas de polifenoles) (Bishop, 1975).
244
Existen dos mecanismos de complejación entre polifenoles y proteínas, el

monodentado (el polifenol interactúa con la proteína por un solo lugar) y el poli-
dentado (el polifenol interactúa con la proteína por varios lugares) (Prigent,
2005). En el primer caso, los polifenoles de pequeño tamaño rodean la superfi-
cie de la proteína modificando su hidrofobicidad y facilitando su agregación y en
el segundo, intervienen polifenoles de mayor tamaño que interaccionan con las
proteínas formando una estructura en red que facilita, también, la formación de
agregados y la disminución de la solubilidad.
La asociación proteína – polifenol está afectada por la relación existente entre
la concentración de ambos, potenciándose la interacción cuando la concentración
es del mismo orden (Siebert y col., 1996); este efecto, también fue observado por
Prigent (2005) en soluciones modelo de proteína y procianidinas constatando,
además, que a medida que el grado de polimerización aumenta las interacciones
también lo hacen, si bien por encima de un grado de polimerización de 12 el
impedimento estérico limita la interacción proteína - polifenol.
La presencia de prolina en la proteína y el grado de hidroxilación del polife-
nol afectan a la asociación de ambas moléculas, observándose mayor interacción
cuando la proteína presenta restos de prolina y con la existencia de un mayor
grado de hidroxilación (Siebert y Lynn, 1998). El incremento de las interaccio-
nes entre proteínas con alto contenido en prolina y los compuestos fenólicos se
puede explicar por la interacción CH (anillo de la prolina) – π (anillo aromático
del polifenol). Por otro lado, el mayor grado de interacción proteína − polifenol,
que se produce con el aumento de grupos hidroxilos de éste, se puede explicar
por el incremento en los puntos de enlace con la proteína, lo que favorece la for-
mación de puentes entre proteínas y la estructura en red.
Como ya se ha comentado, las propiedades de las proteínas están afectadas
por la presencia de los compuestos fenólicos. Así, por ejemplo, se ha descrito un
efecto estabilizador de la (+) catequina en espumas formadas por proteínas que
están inicialmente desestabilizadas por la presencia de tensoactivos de pequeña
masa molecular. Sarker y col. (1995) establecieron que este flavanol mejoró la
espumosidad y la estabilidad de la espuma por medio de: a) un aumento del espe-
sor del film; b) una limitación en el drenaje y la difusión lateral de los materia-
les adsorbidos en la interfase; y c) un aumento en el valor del módulo elástico y
viscosidad de la superficie de la burbuja. No obstante, de acuerdo con los traba-
jos de Bishop (1975) en cerveza, aquellas proteínas existentes en la espuma que
facilitan su estabilidad estarían químicamente más unidas a polisacáridos que a
los compuestos fenólicos.
Por otra parte, la solubilidad de la proteína disminuye en presencia de pro-
cianidinas de un grado medio de polimerización (7,4) y este efecto es más acu-
sado a pHs próximos al pI de la proteína (Prigent, 2005). También, las prociani-
dinas con un grado medio de polimerización incrementan la estabilización de la
espuma, presumiblemente al limitar la maduración de Ostwald (Prigent, 2005),
resultando más eficaz esta estabilización a pHs próximos al pI de la proteína.
245
Probablemente, estos efectos también pueden ser reproducidos en el caso de

interacciones covalentes entre polifenoles oxidados de pequeño tamaño y las
proteínas.
Los lípidos son uno de los factores de desestabilización más importantes de
la espuma. Estas moléculas se adsorben en la interfase y pueden romper las inter-
acciones establecidas entre proteínas originando una pérdida de elasticidad y
fuerza del film de la burbuja (ver figura 3c2). El efecto de los ácidos grasos sobre
las propiedades de la espuma ha sido ampliamente estudiado (Dussaud y col.,
1994; Dickie y col., 2001; Cooper y col., 2002; Gallart y col., 2002; Margolles y
col. 2003; Wilde y col., 2003).
Así, por ejemplo, Wilde y col. (2003) propusieron diferentes mecanismos de
desestabilización de la espuma en función de la longitud de la cadena del ácido
graso, estableciendo que los ácidos grasos de pequeño tamaño (<C10) no son sufi-
cientemente activos a nivel de superficie para destruir la capa proteica que esta-
biliza la burbuja, aquéllos de cadena intermedia (C12-C14) e insaturados (C18:1 y
C18:2) presentan la suficiente capacidad de adsorción superficial como para debi-
litar la estructura proteica adsorbida y romper la espuma. Los ácidos grasos de
cadena larga saturados (C16 y C18) forman un agregado hidrofóbico que rompe la
espuma mediante el mecanismo de la partícula hidrofóbica (Dussaud y col.,
1994), al establecer un puente de contacto entre burbujas con eliminación del
líquido del film, lo que conduce a la coalescencia de éstas.
El efecto desestabilizador de los lípidos puede limitarse si están presentes
proteínas que específicamente enlazan y transfieren moléculas lipídicas (“Lipid-
binding proteins”, LBPs y “Lipid Transfer Proteins”, LTPs). Estas proteínas son
capaces de interaccionar con los lípidos a través de interacciones hidrofóbicas,
bien a nivel de superficie o mediante una cavidad hidrofóbica de la proteína
(Fillery-Travis y col., 2000). Se trata de moléculas de pequeño tamaño (≈ 10
kDa) cuya utilización en cerveza ha sido testada con el fin de mejorar la espu-
mosidad y estabilidad de la espuma (Dickie y col., 2001; Cooper y col., 2002).
Descriptores sensoriales de la espuma en la sidra natural y efecto

de los factores físico-químicos: una hipótesis
El “comportamiento en vaso” de la sidra natural está determinado por tres
parámetros sensoriales básicos, a saber, el “espalme”, el “aguante” y el “pegue”
(ver capítulo 5). Cuando la botella de sidra se descorcha se produce la desgasifi-
cación como consecuencia de la existencia de una sobresaturación de gas car-
bónico.
A medida que el gas se elimina a través de las burbujas la sobresaturación va
disminuyendo y, como consecuencia de ello, las burbujas serán cada vez más
pequeñas (existe una relación directa entre el tamaño de la burbuja y el valor de
la sobresaturación del gas). Las primeras burbujas contendrán en su pared los
246
tensoactivos más hidrófobos y móviles, produciéndose una espuma que podría

tener un carácter más seco. Las burbujas superarán, debido a su tamaño y empu-
je, las fuerzas capilares de la superficie y formarán una espuma por encima de la
superficie libre del líquido cuyo grado de estabilidad afectará directamente al
atributo “espalme”. Este descriptor sensorial está relacionado con la estabilidad
de la espuma y, por tanto, con el proceso de drenaje y de incorporación en el film
de macromoléculas que aporten diferente grado de viscoelasticidad.
Pasado este primer proceso accede a la superficie del líquido una espuma,
probablemente más húmeda, con incorporación de proteínas más hidrofílicas y
formada por burbujas más pequeñas. Éstas puede que no superen las fuerzas
capilares, al tener un diámetro reducido y ser pequeño el empuje, por lo que per-
manecerán por debajo de la superficie libre del líquido hasta que los procesos de
desestabilización (coalescencia y maduración de Ostwald) provoquen la ruptura
de las burbujas; la acumulación y ruptura de éstas son procesos relacionados con
el atributo denominado “aguante”. Por último, la adherencia de una espuma fina
al vaso, una vez degustada la sidra, es un fenómeno relacionado con el atributo
“pegue”; éste, por tanto, estaría condicionado por la formación de la espuma más
húmeda, compuesta por finas burbujas, y por el tipo de “espalme” de la sidra.
Así, por ejemplo, en caso de que el “espalme” sea incorrecto quedarían restos de
espuma de carácter más seco, formada por burbujas de mayor tamaño, lo que ori-
gina un incorrecto “pegue” (“espumona”). Por el contrario, la rápida desapari-
ción de la primera espuma (buen “espalme”) y la formación posterior de una
espuma más fina, provocaría que la sidra tenga un buen “pegue”.
Propiedades espumantes
Las propiedades espumantes se determinan para evaluar las características
de la espuma en las bebidas efervescentes; estas propiedades son las siguientes:
1.- el nivel máximo de espuma alcanzado (HM) mediante el barboteo de un gas,
expresado en unidades de longitud o volumen, 2.- el nivel estable de espuma
conseguido durante el barboteo de un gas en un tiempo prefijado, expresado
en unidades de longitud, volumen o de tiempo [coeficiente de Bikerman (Σ)] y
3.- el tiempo que tarda la espuma en desaparecer una vez que el barboteo del gas
cesa. A partir de estos parámetros se evalúan tres aspectos básicos de la espuma:
a) la capacidad espumante o espumosidad, ligada a la altura o volumen máximo;
b) la vida media de la burbuja, relacionada con el coeficiente Σ; y c) la estabili-
dad de la espuma, relacionada con el tiempo (Ts) empleado en la desaparición de
ésta una vez que cesa el barboteo del gas.
El procedimiento analítico que se sigue es una modificación del método de
Bikerman (1938). La muestra líquida, previamente desgasificada y filtrada y/o
centrifugada, se deposita en una columna de vidrio provista de una membrana de
vidrio “fritado”, a través de la cual se hace pasar el gas, generalmente, carbóni-
co. El tipo de pretratamiento de la muestra para eliminar impurezas, el volumen
247
y tiempo de desgasificación de ésta, la presión y caudal del gas carbónico duran-

te el barboteo, el tiempo de barboteo y la temperatura de medida de las propie-
dades espumantes deben ser fijados.
En las figuras 4 y 5 se recoge, por un lado, una esquema del equipo utilizado
para estimar los parámetros de espuma (Pueyo y col., 1995) y, por otro, la evo-
lución de la altura de la espuma a lo largo del proceso de medida de las propie-
dades espumantes (Zamora, 2003). Como se puede ver, el perfil de la curva de la
altura de la espuma con el tiempo pasa por un valor máximo, posteriormente
alcanza una meseta donde la formación y destrucción de las burbujas se equili-
bra y finalmente, una vez que el barboteo del gas cesa, la espuma desaparece en
un tiempo determinado.
Algunos autores (Robillard y col., 1993), evalúan la capacidad espumante a
partir de la medida de la expansión de la espuma (E), estimada como la relación
entre los volúmenes de la espuma y la muestra, fijando un tiempo (80 s) de medi-
da con el fin de mejorar la reproducibilidad de la determinación de la capacidad
espumante. La vida media de la burbuja se puede estimar a partir del coeficien-
te de Bikerman (Σ, medido en unidades de tiempo) que se define como la rela-
ción entre el volumen de espuma alcanzado en la fase estacionaria y el caudal del
gas de barboteo; Σ es independiente de la presión del gas de barboteo y de la
porosidad del vidrio “fritado”. La medida de la altura/volumen estable de espu-
ma se efectúa una vez transcurrido un tiempo de barboteo, que es variable según
autores. Así, por ejemplo, Robillard y col. (1993) emplean dos minutos, mientras
que Picinelli y col. (2005) miden la altura estable después de 10 minutos de bar-
boteo.
Otros autores, como Moreno-Arribas y col. (2000), emplean 20 minutos para
todo el proceso de medida de las propiedades espumantes, esto es, desde el ini-
cio del barboteo del gas hasta que la espuma desaparece una vez que el gas deja
de barbotear. También, en lo referente a los caudales de barboteo del gas carbó-
nico existe una gran variabilidad entre autores; así, por ejemplo, Robillard y col.
(1993) emplean caudales de 20,0 y 10,0 L/h, mientras que Pueyo y col. (1995) y
Picinelli y col. (2005) emplean 4,5 y 1,8 L/h, respectivamente.
Figura 4.–Equipo para la determinación de los parámetros de espuma. 1: columna de vidrio graduada;
2: membrana de vidrio; 3: controlador de flujo (Pueyo y col., 1995)
248
Figura 5.–Evolución de la altura de la espuma durante el proceso de medida de las propiedades espumantes;
Ts: tiempo de estabilización de la espuma; He: altura estable; Hm: altura máxima (Zamora, 2003)
Los parámetros de espuma están relacionados con la evaluación sensorial de

la espuma. En el caso particular de los vinos espumosos, Gallart y col. (2004)
detectaron correlaciones positivas y significativas entre los parámetros HM
(mm.), Σ (s) y Ts (s) y determinados descriptores de la calidad sensorial de la
espuma, como la impresión global, el área de la espuma (proporción de superfi-
cie del líquido cubierta por las burbujas) o el collar (conjunto de burbujas adhe-
ridas siguiendo la circunferencia de la copa).
Por otra parte, conviene señalar los estudios realizados para determinar la
influencia de la tecnología de elaboración de las bebidas efervescentes, como los
vinos y sidras espumosas, sobre sus propiedades espumantes. Así, por ejemplo,
Hidalgo y col. (2004) y Picinelli y col. (2005) estudiaron la influencia de la
segunda fermentación y el tipo de levadura utilizada en la toma de espuma sobre
los parámetros de espuma. En el caso de las sidras espumosas se concluyó que
la cepa de levadura afecta a la capacidad espumante y a la vida media de la bur-
buja, resultando que con el empleo de una cepa vínica la espumosidad es mayor
y el coeficiente Σ es menor en comparación con una levadura sidrera. Respecto
a la segunda fermentación, se observa que mientras en los vinos espumosos,
durante la toma de espuma, se produce una disminución de la espumosidad y el
coeficiente Σ (Hidalgo y col., 2004), lo que fue atribuido al incremento del grado
alcohólico, en el caso de las sidras espumosas el tiempo de envejecimiento afec-
ta a la espumosidad y estabilidad de la espuma, detectándose un máximo en la
capacidad espumante que es función del tipo de levadura utilizada en la toma de
espuma (Picinelli y col., 2005). Los tratamientos tecnológicos previos a la
segunda fermentación también afectan a las propiedades espumantes. Así,
Robillard y col. (1993) encontraron que la estabilidad de la espuma y la capaci-
dad espumante de los vinos espumosos disminuye si el vino base es sometido a
un proceso de filtración antes de la toma de espuma, no encontrando un efecto
de este tratamiento sobre la vida media de la burbuja.
249
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251
10. Técnicas instrumentales en el control
de proceso de la sidra
Domingo Blanco Gomis, Cristina Botas Velasco y Daniel Díaz Llorente
Las técnicas de análisis de los alimentos se han desarrollado rápidamente en

los últimos años. De hecho, han aparecido nuevas y potentes técnicas analíticas
a la vez que se han mejorado las existentes. Las técnicas quimiométricas y la
automatización de la instrumentación han facilitado la optimización de los méto-
dos analíticos, asegurando la correcta interpretación de la gran cantidad de datos
que son capaces de suministrar las modernas técnicas analíticas.
Éstas intervienen, por necesarias, en todo el proceso productivo: desde el aná-
lisis de las materias primas hasta el control de calidad del producto final, pasan-
do por el seguimiento del proceso de elaboración. Su utilidad se extiende al con-
trol de los cambios o alteraciones que puede experimentar el producto durante su
transporte y almacenaje y a la implementación de nuevas tecnologías en el pro-
ceso de elaboración. En el caso de la manzana y la sidra, se han empleado en el
conocimiento de su composición química y bioquímica. De esta forma, es posi-
ble seleccionar los frutos más adecuados para la elaboración de sidra de calidad,
establecer su momento óptimo de madurez industrial y controlar las etapas
de fermentación y maduración y los posibles defectos que pueden presentar las
sidras elaboradas. No menos importante es la detección de fraudes y adultera-
ciones, así como su adaptación a las normas impuestas por el Consejo Regulador
de la Denominación de Origen Protegida “Sidra de Asturias”, sin olvidar la
detección de sustancias tóxicas o peligrosas, como pueden ser los residuos de
productos fitosanitarios o toxinas.
En este capítulo se lleva a cabo una breve revisión de las distintas técnicas
instrumentales que se emplean en la actualidad para los fines mencionados. Se
comentan los principios generales de las técnicas y sus aplicaciones más signifi-
cativas en el sector sidrero, desde las técnicas espectroscópicas más clásicas,
tanto moleculares como atómicas (Espectroscopia de Absorción UV-Vis o Ab-
sorción Atómica), a las más modernas o de reciente aplicación (Espectroscopia
en el Infrarrojo Cercano o Plasmas Inductivamente Acoplados); aunque, son las
técnicas de separación las más relevantes en este campo, en particular, la croma-
253
Domingo Blanco Gomis, Cristina Botas Velasco, Daniel Díaz Llorente
tografía de gases (tradicional y de alta velocidad) y de líquidos de alta eficacia

(HPLC clásica, capilar y de alta velocidad). A esta batería de técnicas se ha uni-
do, recientemente, la Electroforesis Capilar por su eficacia, rapidez y bajo costo.
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Introducción
Las técnicas cromatográficas son, hoy por hoy, las herramientas analíticas
más potentes de que dispone la industria alimentaria, en general, y el sector de
las fermentaciones industriales, en particular. De hecho, se incluyen en el res-
trictivo grupo de los denominados “Sistemas de Análisis Total”, entendiendo por
tal todo sistema analítico automatizado, controlado por ordenador, capaz de in-
troducir la muestra, separar sus componentes, identificarlos y determinarlos.
De entre las distintas técnicas cromatográficas disponibles, dos destacan por
su importancia en el control de la industria de la sidra: la cromatografía de gases
(GC, Gas Chromatography) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC,
High Performance Liquid Chromatography). Como norma general, la primera se
aplica al análisis de sustancias volátiles y térmicamente estables a las tempera-
turas de operación de la técnica (por ejemplo, aromas); mientras que la HPLC se
aplica a cualquier otra sustancia que no cumpla los requisitos anteriormente men-
cionados (por ejemplo, ácidos orgánicos o azúcares).
La aplicación de las técnicas cromatográficas permite, por una parte, estable-
cer la composición cualitativa y cuantitativa de un producto y, por otra, asegurar
la calidad con un notable incremento de la productividad. Se emplean tanto para
el control de las materias primas (manzanas) como del proceso y productos fina-
les (zumos, sidras, vinagres, licores o aguardientes de sidra). En lo que respecta
a la materia prima, las técnicas cromatográficas permiten, por un lado, su carac-
terización y tipificación, lo que facilita su selección para la obtención de un pro-
ducto de calidad con unos atributos definidos y, por otro, el estudio de los cam-
bios que se producen durante la maduración y el almacenamiento, con el fin de
establecer su época óptima de madurez industrial y el aseguramiento de la cali-
dad sanitaria, chequeando la presencia o no de productos fitosanitarios. El con-
trol de proceso permite evaluar distintas tecnologías de elaboración y, una vez
fijada ésta, controlarla con el fin de que no se produzcan desviaciones que afec-
ten a la calidad del producto final. El control de éste permite comprobar y en su
caso certificar si el producto obtenido cumple las expectativas previstas y las
normas exigidas en las figuras de protección como, por ejemplo, la DOP “Sidra
de Asturias”.
La cromatografía se define como un método físico de separación en el que los
diferentes componentes de una muestra compleja se distribuyen entre una fase
fija o estacionaria (columna cromatográfica) que tiende a retenerlos y una fase
móvil (gas: GC; líquido: HPLC; también, se puede emplear un fluido en condi-
254
10. Técnicas instrumentales en el control de proceso de la sidra
ciones supercríticas: SFC) que tiende a arrastrarlos a través de la columna. En

función de los valores de las constantes de distribución de las distintas especies
entre las dos fases, las diferentes sustancias avanzan a distinta velocidad y son
finalmente separadas a la salida de la columna con lo que pueden ser identifica-
das y cuantificadas individualmente, haciendo uso de un sistema de detección
adecuado (ionización de llama (FID), UV-Vis, espectrómetro de masas (MS),
etc.). Para el lector interesado existe una extensa bibliografía, tanto a nivel de
monografías especializadas (“Basic Gas Chromatography” McNair y Miller,
1998, John Wiley and Sons, New York; “Introduction to Modern Liquid
Chromatography”, Snyder y Kirkland, 1980, John Wiley and Sons, New York)
como de revistas científicas (Journal of Chromatography, Chromatographia,
Journal of Liquid Chromatography, LC-GC), en donde pueden aumentar sus
conocimientos sobre el tema.
Cromatografía de gases
En cromatografía de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza
de una columna cromatográfica, produciéndose la elución por el flujo de un gas
inerte denominado gas portador. A diferencia de la mayoría de los otros tipos de
cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su
única función es la de transportarlo a través de la columna. Existen dos tipos de
cromatografía de gases: la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía
gas-líquido (GLC). La cromatografía gas-líquido tiene gran aplicación en todos
los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cro-
matografía de gases (GC), a pesar de que este hecho deje a un lado la cromato-
grafía gas-sólido.
En la GSC se produce la retención de los analitos en una fase estacionaria
sólida como consecuencia de la adsorción física. Esta técnica ha tenido una apli-
cación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o
polares y a la obtención de picos de elución con colas muy significativas (como
consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo que la
cromatografía gas-sólido no ha encontrado una gran aplicación excepto para la
separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.
La cromatografía gas-líquido se basa en la distribución del analito entre una
fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sóli-
do inerte. El concepto de cromatografía gas-líquido fue enunciado por primera
vez por Martin y Synge (1941), quienes fueron, también, los responsables del
desarrollo de la cromatografía de reparto líquido-líquido. Tuvo que pasar, sin
embargo, más de una década antes de que Jones y Martin (1952) demostraran
experimentalmente la importancia de la cromatografía gas-líquido. Tres años
más tarde, en 1955, apareció en el mercado el primer aparato comercial para cro-
matografía gas-líquido. Desde entonces las aplicaciones de esta técnica han cre-
cido de una forma espectacular, estimándose en 1985 que estaban en uso unos
200.000 cromatógrafos en todo el mundo.
255
Instrumentación. Actualmente, más de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen

unos 130 modelos de cromatógrafos con un coste que varía desde unos 1.500
hasta 90.000 euros. En las últimas décadas la instrumentación ha evolucionado
y mejorado notablemente, los equipos son fiables y están altamente automatiza-
dos y controlados totalmente por ordenador a un coste moderado; y tal vez lo
más importante es el desarrollo de nuevas columnas abiertas capaces de separar
multitud de analitos en un tiempo relativamente corto. Actualmente, para reducir
el coste y el tiempo de análisis con el fin de aumentar la productividad del labo-
ratorio, se está imponiendo el uso de la GC de alta velocidad. De hecho, ya se
puede aplicar al análisis de rutina con lo que se pueden llevar a cabo los mismos
análisis reduciendo el tiempo a la quinta parte.
Los componentes básicos de un cromatógrafo de gases son (ver figura 1) el
gas portador, el sistema de inyección de la muestra, la columna, el horno, el
detector y el sistema de recogida y tratamiento de datos. Entre los gases porta-
dores, que deben ser químicamente inertes, se encuentran el helio, el nitrógeno y
el hidrógeno. La elección de los gases está, con frecuencia, determinada por el
tipo de detector que se utiliza y por el caudal requerido. Con el suministro del
gas se encuentran asociados reguladores de presión, manómetros y medidores de
caudal. Los cromatógrafos de gases actuales vienen equipados con medidores
electrónicos de caudal controlados por ordenador. El sistema de inyección debe
asegurar que la muestra sea introducida como un “tapón” de vapor debido a los
requerimientos de eficacia de la columna. La inyección lenta o de muestras
demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una mala reso-
lución. El método de inyección más común consiste en introducir la muestra
mediante el uso de una micro-jeringa a través de un septum en una cámara de
volatilización a alta temperatura y en el caso de las columnas capilares, que exi-
gen volúmenes del orden de 10-3 µL, se emplea un inyector conocido como
split/splitless que permite pasar solamente una pequeña fracción programable de
la muestra a la cabeza de la columna. Las columnas cromatográficas son el cora-
zón de la separación y, actualmente, se emplean casi exclusivamente las capila-
res abiertas, salvo en ciertas aplicaciones especiales. Sus longitudes varían desde
Figura 1.–Representación esquemática de un cromatógrafo de gases
256
menos de 2 hasta 100 m de longitud o más y están fabricadas en sílice fundida.

Como la temperatura de la columna es un parámetro importante que ha de ser
controlado para un trabajo preciso, la columna se introduce en un horno de tem-
peratura programable. La temperatura óptima de la columna depende del punto
de ebullición de los constituyentes de la muestra y del grado de separación reque-
rido. Se puede trabajar en modo isotérmico o con programación de temperatura,
siendo este último conveniente para muestras que presentan un amplio intervalo
de temperaturas de ebullición.
Respecto a los detectores empleados en cromatografía de gases, se puede
decir que durante el desarrollo de la técnica se han empleado docenas, siendo los
más comunes: el detector de ionización de llama (FID), de conductividad térmi-
ca (TCD), de captura de electrones (ECD), de espectrometría de masas (MSD),
etc. El detector FID ha sido y es el más utilizado. Se basa en la pirolisis e ioni-
zación de los compuestos orgánicos, contenidos en el efluente de la columna, en
una llama de hidrógeno/aire y medida de la corriente resultante. Merece una
mención especial el detector de espectrometría de masas (MSD), ya que no sólo
sirve para detectar y cuantificar los analitos a la salida de la columna sino, tam-
bién, para identificarlos. La combinación cromatografía de gases-espectrometría
de masas (GC-MS) constituye uno de los denominados métodos acoplados, que
proporcionan al químico analítico una potente herramienta para la identificación
de los componentes de mezclas complejas.
Aplicaciones. La principal aplicación de la cromatografía de gases al sector
de la sidra ha sido el estudio de los compuestos volátiles que conforman el aroma
del producto. Esto se debe a que la cromatografía de gases es la técnica por exce-
lencia para resolver muestras complejas de compuestos volátiles y térmicamen-
te estables. El aroma de muchos productos alimentarios consiste en mezclas, en
ocasiones, de varios cientos de compuestos. El análisis del aroma, su identifica-
ción y evaluación cuantitativa, puede constituir una fuente de información muy
útil para el conocimiento de la calidad organoléptica. El aroma de la sidra deter-
mina no sólo su calidad sensorial si no que, también, es un buen indicador de
cómo afectan los distintos parámetros tecnológicos al proceso de elaboración.
Ya en los años 60 Sugisawa y col. (1962) identificaron 26 compuestos volá-
tiles en zumos de manzanas ‘McIntosh’ por cromatografía de gases preparativa
previa extracción líquido-líquido. Ensayando diferentes empaquetamientos de
columna y condiciones operativas consiguieron separar e identificar 12 alcoho-
les, 11 ésteres y una dicetona. Cinco años después Gascó y col. (1967) emplea-
ron la cromatografía de gases para estudiar los cambios producidos en el aroma
de zumos de manzanas austriacos y españoles tras la exposición a diferentes
radiaciones. Observaron que los aromagramas del zumo de manzana español
irradiado eran similares a los del zumo sin irradiar, mientras que los de los zumos
austriacos variaban notablemente. Éstos últimos, además, desarrollaban un olor
muy desagradable. Identificaron 29 compuestos en los zumos austriacos y 38 en
los españoles.
257
El primer análisis semicuantitativo lo llevó a cabo Martin Mira (1969), inves-

tigando los compuestos volátiles por cromatografía de gases de zumos de man-
zanas de dos variedades diferentes. Se identificaron 25-26 compuestos compa-
rando sus tiempos de retención con los de patrones. El análisis semicuantitativo
se hizo mediante las alturas de pico y se observaron diferencias fundamentales
en el aroma de las dos variedades estudiadas.
Pocos años después Brule (1973) empleó, por primera vez, un cromatógrafo
de gases acoplado a un espectrómetro de masas para identificar, inequívocamen-
te, los compuestos formados tras el calentamiento a 95º C durante 1 hora de zu-
mo y concentrado de manzana, identificando un β-glicol, el 1,3-octanodiol, que
no había sido referenciado con anterioridad.
Williams (1975a) determinó por cromatografía de gases los alcoholes y éste-
res de zumos y sidras pertenecientes a cuatro variedades. Además, evaluó el
potencial aromático de las sidras mediante un panel de expertos, relacionándolo
con el cociente entre el contenido en acetato de hexilo y en acetato de 2- o 3-
metilbutilo. El mismo autor determinó los compuestos minoritarios en un extrac-
to de concentrado de sidra (Williams y Tucknott, 1978) por GC-MS, identifican-
do 55 compuestos en sidra no publicados hasta la fecha.
Mangas y col. (1993a) evaluaron el contenido de los componentes mayorita-
rios del aroma de bajo punto de ebullición en 12 sidras obtenidas por diferentes
métodos tecnológicos, definidos en función de la velocidad de prensado y siste-
ma de clarificación. Los resultados cromatográficos demostraron que la veloci-
dad de prensado influía en el contenido en acetato de etilo, metanol, 1-propanol,
isobutanol, 2-metilbutanol y 3-metilbutanol. Del mismo modo, el sistema de cla-
rificación empleado afectaba al contenido en 1-propanol, isobutanol, 2-metilbu-
tanol y 3-metilbutanol. Se observó que el efecto sinérgico de ambos factores
influía sólo al 3-metilbutanol, mientras que el contenido en 1-butanol era inde-
pendiente de la tecnología empleada. Los mismos autores (Mangas y col., 1996a)
desarrollaron una técnica sencilla, por GC-MS previa extracción en fase sólida
(SPE), para determinar los compuestos volátiles minoritarios que conforman el
aroma de la sidra. Con este método determinaron los alcoholes, ésteres, lactonas,
fenoles y los ácidos grasos de longitud de cadena media-larga. El mismo año
(Mangas y col., 1996b) estudiaron la influencia de la materia prima y el nivel de
maduración de los destilados de sidra sobre la composición aromática de éstos,
utilizando la GC con inyección directa de la muestra. Empleando análisis cluster
y factorial consiguieron obtener agrupamientos naturales entre los aguardientes
estudiados sobre la base del tiempo de maduración y la materia prima.
El empleo del análisis de componentes principales (PCA) y discriminante
lineal (LDA), junto con el análisis de volátiles mediante GC, permitió a Cabranes
y col. (1998) tipificar diferentes sidras en función de la temperatura de fermen-
tación y de la presencia de la levadura Kloeckera apiculata.
Rye y Mercer (2003) utilizaron la cromatografía de gases y un sistema elec-
trónico de detección de sustancias volátiles (nariz electrónica) para estudiar y
258
verificar los cambios producidos en la composición de volátiles en sidras tras el

procesado térmico y el almacenaje. Comprobaron que un tratamiento térmico
entre 60 y 80º C provocaba que el perfil aromático de la sidra permaneciese inva-
riable tras siete días de almacenaje. Por su parte, las muestras no tratadas térmi-
camente experimentaban modificaciones en su perfil aromático.
Rodríguez Madrera y col. (2003) estudiaron los compuestos volátiles presen-
tes en el aguardiente de sidra y la influencia que sobre ellos tenía el sistema de
destilación, el tipo de madera de roble y el tiempo de maduración empleados.
Rodríguez Madrera y col. (2005) combinaron el método de extracción por purga
y trampa junto con GC-MS y GC-FID para analizar los ésteres minoritarios en
sidras comerciales. Obtuvieron recuperaciones entre el 93 y el 117% y precisión
en el rango 2,2-10,9%. En el mismo año, Madrera y Mangas (2005) consiguie-
ron tipificar con un 92% de éxito aguardientes de sidra según procedieran de
zumo de manzana fresco o de concentrado, aplicando técnicas quimiométricas a
los datos de volátiles obtenidos por GC-MS y GC-FID.
La aparición en el mercado de la microextracción en fase sólida (SPME) per-
mitió a Wang y col. (2004) desarrollar un método de análisis más rápido para la
determinación de volátiles en sidra por GC-MS. Además, se reducían los costes
al no tener que consumir enormes cantidades de disolventes orgánicos en la
extracción. Esta técnica de extracción, acoplada a un cromatógrafo de gases de
alta velocidad, permitió la separación de 27 aromas de la manzana de sidra en
menos de ocho minutos (Arias Abrodo y col., 2010). El tratamiento quimiomé-
trico de los datos posibilitó la diferenciación entre variedades dulces y ácidas.
Picinelli Lobo y col. (2005) correlacionaron las características sensoriales de
21 destilados de sidra con el contenido en volátiles, compuestos furánicos y poli-
fenoles de bajo peso molecular. Consiguieron predecir tres descriptores senso-
riales usando siete aromas como variables predictoras y un modelo por mínimos
cuadrados parciales (PLS) con dos componentes principales.
Komthong y col. (2006) estudiaron el efecto de la adición de ácido ascórbico
sobre el aroma del zumo de manzana, empleando una evaluación sensorial y la
cromatografía de gases. De los resultados obtenidos concluyeron que la adición
de ácido ascórbico aumentaba los aromas no naturales y verdes, mientras que
disminuían los aromas frescos, frutales y con olor a manzana.
Herrero y col. (2006) evaluaron la influencia de la temperatura de fermenta-
ción (15 vs. 22º C) y el momento de inoculación de los microorganismos en la
composición de volátiles durante la elaboración de la sidra. Del estudio realiza-
do se desprende que la fermentación se puede llevar a cabo de forma secuencial,
comenzando con la fermentación alcohólica a 15º C hasta su finalización. A con-
tinuación, se desarrolla la fermentación maloláctica a 22º C.
Mediante microextracción en fase sólida y GC-MS, Fan y col. (2006) estu-
diaron el efecto del origen geográfico de la madera de roble, empleada para la
elaboración de sidra, en el aroma del producto final. Los resultados demostraron
259
que no había diferencias significativas entre utilizar roble francés o americano,

pero que las diferencias eran notables si el roble era de origen chino.
Recientemente Xu y col. (2007) han empleado la evaporación de aromas asis-
tida por disolventes (SAFE) y la microextracción en fase sólida para determinar
los compuestos aromáticos en sidra por cromatografía de gases-olfatometría
directa y por GC-MS. La comparación de las dos técnicas de extracción mostró
que la técnica SAFE produce altas recuperaciones de los ácidos y de compues-
tos que contienen grupos hidroxilo, mientras que la SPME mejora las recupera-
ciones de ésteres y de compuestos altamente volátiles.
Rodríguez Madrera y Suárez Valles (2007) describieron dos métodos basa-
dos en la cromatografía de gases con inyección directa para el análisis cuan-
titativo de compuestos volátiles en aguardiente de sidra. En todos los casos
los coeficientes de correlación fueron superiores a 0,999. El primer método, de-
sarrollado para los 15 volátiles mayoritarios, posee límites de detección com-
prendidos entre 0,325 y 1,663 mg/L, recuperaciones entre 95 y 109% y reprodu-
cibilidades < 5,4%. El segundo método, desarrollado para los 24 compuestos
minoritarios, posee límites de detección en el rango 0,086 – 0,332 mg/L, recu-
peraciones entre 94 y 109% y reproducibilidades < 9,6%. Además, la exactitud
de los métodos se evaluó analizando muestras de whisky certificadas y cinco
muestras de ensayos interlaboratorio.
Por último, Peng y col. (2008) llevaron a cabo un estudio de selección de le-
vaduras para la elaboración de sidra. Para ello, eligieron ocho levaduras común-
mente utilizadas y las emplearon en fermentaciones separadas. A continuación,
realizaron un análisis sensorial y una determinación de los volátiles por SPME
y GC-MS. De los resultados se desprende que la levadura más adecuada para
la elaboración de sidra es una Saccharomyces cerevisiae, referenciada como
F14.
Actualmente, el Departamento de Química Física y Analítica de la Universi-
dad de Oviedo, en colaboración con el Servicio Regional de Investigación y
Desarrollo Agroalimentario (SERIDA), está trabajando en un proyecto de opti-
mización de nuevas técnicas para el análisis de aromas en manzana y determi-
nación del perfil aromático de variedades acogidas a la Denominación de Origen
Protegida “Sidra de Asturias”. En este proyecto se emplean técnicas como la
SPME y la cromatografía de gases de alta velocidad, con el fin de desarrollar
métodos de análisis más rápidos que los reportados hasta la fecha.
Otra aplicación muy interesante de la cromatografía de gases, en el campo de
la elaboración de la sidra, es la determinación de ácidos grasos. Éstos proceden,
por un lado, directamente de la manzana y, por otro, de la fermentación del mosto
de manzana. Se estudian en la sidra, especialmente, por su influencia en la eva-
luación visual de ésta que está determinada por el atributo global denominado
“comportamiento en vaso”, que engloba los descriptores “espalme”, “aguante”
y “pegue”.
260
Blanco-Gomis y col. (2001a) publicaron, por primera vez, un método para

determinar los ácidos grasos presentes en la sidra por GC-MS y GC-FID. Para
poder llevar a cabo el análisis por cromatografía de gases se optimizó la ex-
tracción y la reacción de derivatización que transforma los ácidos grasos (no
volátiles) en sus ésteres metílicos (volátiles). La validación del método mostró
que el procedimiento analítico desarrollado permitía la correcta cuantificación de
los ácidos grasos en sidra. El método fue aplicado a 59 muestras de sidra perte-
necientes a tres cosechas consecutivas y la aplicación de técnicas quimiométri-
cas como PCA (Principal Component Analysis), LDA (Linear Discriminant
Analysis) y el análisis Bayesiano, permitió diferenciar sidras elaboradas con
manzanas cultivadas en Asturias de aquéllas producidas fuera de la región. Los
mismos autores (Blanco-Gomis y col., 2002) determinaron los ácidos grasos en
30 zumos monovarietales de seis variedades de manzana de sidra en tres cose-
chas consecutivas. La concentración de los ácidos grasos en los zumos y la apli-
cación de técnicas quimiométricas (LDA, PCA, Soft Independent Modelling of
Class Analogy (SIMCA)) permitió diferenciar los zumos de manzana por grupos
tecnológicos, dulce o ácido.
También, cabe destacar la importancia de la cromatografía de gases en el aná-
lisis de 1,3-octanodioles y 1,3-dioxanos. Los primeros están presentes en las
manzanas, llegando a concentraciones del orden de 100 mg/Kg en manzanas de
sidra. Estos β-glicoles son efectivos en el control de microorganismos asociados
a infecciones, pero son inocuos para los humanos. Durante la fermentación del
mosto los 1,3-dioles reaccionan con los aldehídos, producidos por las levadu-
ras, sintetizándose acetales cíclicos volátiles que forman parte del aroma de la
sidra.
El primer trabajo publicado sobre la existencia de 1,3-octanodiol fue el lle-
vado a cabo por Brule (1973), quien demostró que su concentración aumentaba
después del tratamiento térmico del zumo. Schwab y col. (1989) emplearon la
cromatografía de gases para identificar la forma glucosilada del 1,3-octanodiol
en zumos de manzana y determinar la configuración absoluta del mismo median-
te derivatización con un agente quiral, concluyendo que el isómero (R) es el que
está presente en las manzanas. Posteriormente, Beuerle y col. (1996) ampliaron
el estudio a cinco variedades de manzana donde detectaron la forma insaturada
del 1,3-octanodiol (5(Z)-octen-1,3-diol) y sus posibles metabolitos, 3-hidroxioc-
tanoato y 5(Z)-3-hidroxioctanoato de etilo. Los mismos autores (Beuerle y
Schwab, 1997) demostraron, por primera vez, empleando la cromatografía de
gases que los 1,3-dioles y sus formas glucosiladas derivaban biosintéticamente
del ácido linoleico. Dos años después demostraron que la β-oxidación enzimáti-
ca era la responsable de la generación enantioselectiva de los 1,3-dioles en man-
zanas (Beuerle y Schwab, 1999).
Respecto a los acetales cíclicos derivados de los 1,3-dioles, Dietrich y col.
(1997) identificaron, por primera vez, los 1,3-dioxanos derivados del acetaldehído
en sidra francesa y determinaron su configuración absoluta y su conformación.
261
Posteriormente, Kavvadias y col. (1999) completaron el estudio con acetales de-

rivados de otros aldehídos.
Una última aplicación, que merece ser comentada, es la determinación
de acroleína en sidra y sus destilados por cromatografía de gases con detector
de nitrógeno-fósforo (Ledauphin y col., 2006). La acroleína puede ser el origen de
algunos defectos organolépticos muy importantes en bebidas derivadas de la
manzana. Para su determinación fue necesaria una etapa previa de derivatización
con la hidracina de la 3-metilbenzotiazolona (MBTH) para formar azinas. El
método fue validado, demostrando su adecuado funcionamiento para el análisis
requerido.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

En este tipo de cromatografía la mezcla que contiene los compuestos a sepa-
rar se inyecta en una columna rellena de fase estacionaria, a través de la cual es
forzada a pasar una fase móvil líquida impulsada por una bomba de alta presión.
Dentro de la columna la mezcla se separa en sus componentes en función de su
interacción entre las dos fases. Esta separación puede ser modificada eligiendo
adecuadamente tanto la fase móvil como la estacionaria, el flujo de la fase móvil
o la temperatura de la separación.
Existen diferentes modalidades de HPLC, dependiendo de la naturaleza de la
interacción entre las fases y la muestra: cromatografía de adsorción, de partición,
de intercambio iónico, de exclusión por tamaños, de intercambio de ligandos y
de afinidad. Los principales procesos empleados en HPLC son los de partición o
reparto, intercambio iónico y exclusión por tamaños. Se utilizan partículas de
reparto con tamaños de unos pocos micrómetros (µm); esto permite obtener un
gran número de platos (relacionado con la eficacia de la columna), pero al mismo
tiempo obliga a vencer una elevada contrapresión durante el transporte de la fase
móvil a través de una delgada columna de separación (de unos pocos milímetros
de diámetro). Todas las piezas deben interconectarse entre sí sin dejar volúme-
nes muertos, en la medida de lo posible, y deben soportar presiones de hasta 300
bares como mínimo.
Un equipo cromatográfico de HPLC (ver figura 2) está formado por los depó-
sitos de los disolventes, un sistema de bombeo para impulsar la fase móvil, una
válvula de inyección para introducir las muestras en el sistema cromatográfico
en flujo continuo y a altas presiones, una columna cromatográfica que contiene
la fase estacionaria, un detector para determinar las sustancias separadas y un sis-
tema de captura, registro y tratamiento de datos (computadora).
La HPLC es la técnica de separación más utilizada por su sensibilidad, fácil
adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separación de especies no volátiles y su aplicación a sustancias de primordial
interés en la industria. En la bibliografía encontramos numerosas aplicaciones de
262
Figura 2.–Representación esquemática de un cromatógrafo para HPLC
análisis por HPLC de moléculas de interés en sidras, como los azúcares, los áci-
dos orgánicos, los aminoácidos, las proteínas, los ácidos grasos, los polifenoles,
los pesticidas y toxinas como la patulina.
Análisis de ácidos orgánicos por HPLC. Los ácidos orgánicos juegan un papel
fundamental en la calidad y valor nutricional de los alimentos, a la vez que con-
tribuyen a sus propiedades sensoriales de forma muy significativa, de ahí que
sean unas de las sustancias más habitualmente analizadas en este tipo de matrices,
entre las que se encuentran las bebidas fermentadas, como la sidra. Su origen se
debe a procesos bioquímicos desarrollados en el fruto y a la actividad de algunos
microorganismos (levaduras y bacterias) sobre el mosto, aunque también se pue-
den encontrar por adición como acidulantes, estabilizantes o conservadores.
En la sidra, los sabores agrio, ácido e irritante se adscriben al ácido láctico, a
la acidez total y al ácido acético, respectivamente. La fermentación o transfor-
mación maloláctica disminuye la sensación de acidez y mejora el sabor de la
sidra al convertir el ácido málico en ácido láctico, de sabor más suave, menos
ácido. Los ácidos orgánicos se caracterizan por su grupo carboxílico y se clasifi-
can por el tipo de cadena carbonada (alifáticos, alicíclicos, aromáticos y hetero-
cíclicos), la extensión de su insaturación (saturados e insaturados), la sustitución
(sustituidos y no sustituidos) y el número de grupos carboxílicos que posean
(monocarboxílicos, dicarboxílicos, etc.). En la tabla 1 se recogen los ácidos orgá-
nicos más frecuentemente analizados en manzana o sidra, con sus constantes de
disociación.
263
Tabla 1.–Constantes de disociación de ácidos orgánicos en disolución acuosa a 25º C
Monocarboxílicos Di- y tricarboxílicos

Ácido pK Ácido pK Ácido pK1 pK2 pK3
Fórmico 3,75 Láctico 3,83 Succínico 4,22 5,70

Acético 4,53 Pirúvico 2,39 Fumárico 3,09 4,60
Propiónico 4,87 Quínico 3,58 Málico 3,46 5,21
Butírico 4,83 Siquímico 4,76 Cítrico 2,79 4,30 5,65
La importancia de los ácidos orgánicos en alimentos ha promovido el de-

sarrollo de un gran número de métodos para su determinación: volumétricos,
electroquímicos, enzimáticos o cromatográficos. En la actualidad, la Cromato-
grafía Líquida de Alta Resolución, por su rapidez, sensibilidad y fiabilidad, es la
elección adecuada para el análisis individualizado de los ácidos presentes en todo
tipo de alimentos y, por lo tanto, en manzanas y sidra. Además, el tratamiento de
muestra es sencillo. Para sidras basta con eliminar el carbónico por ultrasonidos
durante cinco minutos, microfiltrar (0,45 µm) e inyectar en el sistema cromato-
gráfico. Para el análisis de ácidos orgánicos en manzanas, la muestra se corta y
se tritura, se lixivian los ácidos en una mezcla hidro-alcohólica (20%) durante
dos horas y se microfiltra e inyecta el lixiviado.
El método más habitual para la separación y determinación de ácidos orgáni-
cos en manzana y sidras por HPLC es la cromatografía en fase inversa, aunque
también se pueden emplear la cromatografía de exclusión iónica (técnica habi-
tualmente empleada en la industria vitivinícola), de intercambio iónico o pares
iónicos. Para una mayor información puede consultarse el capítulo 17 sobre áci-
dos orgánicos del Handbook of Food Analysis (Nollet, 2004).
Los procedimientos descritos para la separación de ácidos orgánicos en man-
zana y sidras por cromatografía de reparto son muy similares y emplean una fase
estacionaria de octadecil-silano (ODS, C18) y una fase móvil acuosa tamponada
a pH 2-2,5. Así, Coppola y Starr (1986) han determinado los ácidos quínico,
málico y cítrico en zumo de manzana empleando una columna Supelcosil LC-18
(250 x 4,6 mm, 5 µm) y una fase móvil constituida por un 2% de KH2PO4/H3PO4
a pH 2,4. Blanco Gomis y col. (1988a) determinaron los ácidos málico, cítrico,
quínico, succínico, láctico y siquímico en extracto de manzana y sidra emplean-
do una columna Spherisorb ODS-2 (250 x 4 mm, 5 µm) y una fase móvil cons-
tituida por una reguladora 0,01 M de KH2PO4/H3PO4 a pH 2,25. Para mejorar las
prestaciones analíticas en la determinación de ácidos orgánicos se pueden emple-
ar columnas de pequeño diámetro (2,1 mm) (Blanco y col., 1991). Tanto la rapi-
dez del análisis (30% inferior), el gasto de disolventes (cinco veces menos) como
la sensibilidad (dos veces mayor) son notablemente mejores. Siguiendo esta
misma línea, se ha propuesto la determinación de los ácidos presentes en zumo
de manzana mediante la moderna HPLC capilar (Blanco y col., 1996).
264
Más recientemente, Aktas y col. (2005) han propuesto un método para la

separación y determinación de los ácidos fumárico, oxálico, tartárico, ascórbico,
láctico, málico, succínico y siquímico en zumo de manzana mediante RP-HPLC
(Reversed Phase-HPLC). Por otro lado, Yamamoto y col. (2008) propusieron un
método para la determinación de adulteraciones en zumos, midiendo la rotación
óptica del ácido málico con el apoyo de la cromatografía de intercambio anióni-
co, utilizando una reguladora de fosfatos como eluyente y detectando a 210 nm.
Zhang y col. (2008) propusieron un método de HPLC para estudiar la evolución
de los ácidos orgánicos cítrico, pirúvico, málico, láctico, succínico, fórmico, acé-
tico, adípico, propiónico y butírico en sidra y determinar el efecto de los nutrien-
tes (fosfato de diamonio, tiamina, biotina, niacinamida y ácido pantoténico)
sobre el metabolismo de estos ácidos. La adición de ácido bórico a la fase móvil
facilitó la separación del ácido láctico y succínico y la derivatización post-
columna con ácido p-toluenosulfónico 5 mM, bis-(2-hidroxietil)- iminotris
(hidroximetil) metano (Bis-Tris) 20 mM y EDTA 0,1 mM, mejoró la sensibilidad
de la detección.
Análisis de azúcares por HPLC. El contenido de hidratos de carbono afecta a
la calidad de los productos sidreros, puesto que en el proceso de obtención de la
sidra, una vez realizada la fermentación alcohólica por la flora levaduriforme,
estos compuestos se utilizan como fuente de carbono por las bacterias lácticas y
acéticas para llevar a cabo, entre otros, procesos de acetificación (picado láctico)
y síntesis de polisacáridos extracelulares (alteración de la grasa) y cuerpos cetó-
nicos; además, influyen significativamente en las características gustativas de la
sidra (Godshall, 1988). De hecho, una excesiva cantidad de azúcares residuales
infermentables por levaduras promueve una sensación gustativa rechazable por
el consumidor habitual de sidra natural. Además, pueden ser empleados (fructo-
sa, glucosa, sacarosa y sorbitol) como marcadores de adulteraciones en combi-
nación con la prolina y los fenoles (Thavarajah y Low, 2006).
Debido a la gran similitud que poseen sus fórmulas químicas, su inestabilidad
en medio básico, la complejidad de las muestras y la baja concentración en que
se encuentran algunos azúcares en las mismas, resulta difícil el análisis de estos
compuestos. Es necesario contar con técnicas analíticas que presenten una selec-
tividad y una sensibilidad adecuadas, como las cromatográficas, que se han con-
vertido en una herramienta imprescindible para la determinación rápida y espe-
cífica de los azúcares. Este hecho, se pone de manifiesto por el gran número de
publicaciones, referentes al tema, que se encuentran en revistas especializadas.
Así, encontramos métodos de separación de azúcares sobre geles de sílice (Wang
y col., 1984; Bai y col., 1997), fases amino enlazadas (Akiyama, 1991; Kwon y
Kim, 1995), intercambiadores aniónicos (Kerheve y col., 1995) y catiónicos
(Blanco y col., 1988b) y fases inversas C18 (Kerns y Linhardt, 1995; Yasuno y
col., 1997) entre otros muchos ejemplos.
El sistema de detección es uno de los problemas más importantes para la
determinación de estos compuestos, ya que absorben en el rango de 190-210 nm
265
donde lo hacen fuertemente la mayoría de los compuestos orgánicos presentes en

los alimentos y los disolventes. Por esto, la medida del índice de refracción (RI),
que es una técnica de detección universal que no requiere pasos de derivatiza-
ción, es el sistema de detección más empleado para estos analitos (Mangas y col.,
1998a; Calull y col., 1992). Otros detectores empleados son el fluorescente con
derivatización antes (Meyer y col., 2001) o después (Coquet y col., 1994) de la
columna, cuya ventaja es su alta sensibilidad aunque está limitado a los com-
puestos que reaccionen con el agente de derivatización, o los detectores electro-
químicos, amperométricos (del Álamo y col., 2000) y columbimétricos (Okada,
1988), entre otros.
En cuanto a las separaciones de azúcares en muestras de sidras Blanco Gomis
y col. (2001b) optimizaron un método de RP-HPLC-UV (307 nm) para la se-
paración y determinación simultánea de aldosas (glucosa, galactosa, xilosa,
arabinosa, ribosa, fucosa y ramnosa) y ácidos urónicos (ácido D-glucurónico y
D-galacturónico) en el rango de 82 a 182 ng/mL, previa derivatización con ácido
p-aminobenzoico. Para ello, emplearon una columna “narrow-bore” C8 (200 x 2,1
mm d.i., 3,5 µm), una fase móvil de citrato de sodio y acetonitrilo en régimen de
gradiente a un flujo de 0,15 mL/min y una temperatura de 45º C. Posteriormente
(Blanco Gomis y col., 2004), emplearon este mismo método, junto con técnicas
quimiométricas (PCA y análisis Bayesiano), para establecer la concentración
mínima de zumo de manzana concentrado que puede ser detectado en la elabo-
ración de sidra natural.
Estos mismos autores (Blanco y col., 2004a) llevaron a cabo un estudio com-
parativo de la determinación de azúcares (glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa,
ribosa, fucosa, ramnosa y fructosa) en aguardientes de sidra por HPLC de inter-
cambio aniónico, empleando la detección amperométrica de pulsos, y la RP-
HPLC con detección espectrofotométrica, previa derivatización con p-amino-
benzoico. Esta tecnología analítica fue empleada por Blanco Gomis y col. (2003)
para clasificar los aguardientes de sidra por su edad y tipo de barril de roble
empleado en el envejecimiento. Para ello, se apoyaron en las técnicas quimio-
métricas de análisis Discriminante Lineal (LDA), análisis Bayesiano y Mínimos
Cuadrados Parciales (PLS).
Análisis de aminoácidos por HPLC. Los aminoácidos son los monómeros de
las proteínas. Están formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, un
grupo amino, un hidrógeno y una cadena (R) de composición variable, que
determina las propiedades de los diferentes aminoácidos.
Es importante estudiar la evolución de los aminoácidos durante la madura-
ción de la manzana por su influencia en los procesos de biotransformación del
fruto. Además, algunos aminoácidos están implicados directamente en el proce-
so de maduración y conservación del fruto; otros, como el ácido aspártico, el glu-
támico, la asparagina y la fenilalanina tienen un posible efecto fungistático di-
recto, por lo que pueden influir, junto con otras sustancias inhibidoras presentes
en el fruto, en el crecimiento de hongos. Los compuestos nitrogenados están
266
implicados en las transformaciones microbianas que se desarrollan durante el

proceso de elaboración de la sidra, al ser utilizados por los microorganismos para
su crecimiento. A lo largo de la elaboración de la sidra la actividad de la micro-
biota en los distintos procesos, como la fermentación alcohólica, transformación
maloláctica, oxidación del etanol, etc., depende del nivel de nitrógeno existente.
Los aminoácidos tienden a desaparecer durante la fermentación y reaparecer des-
pués en menor concentración, aunque en mayor variedad, como consecuencia de
la excreción y autolisis de las levaduras.
El análisis de los aminoácidos se emplea, también, en la detección de adulte-
raciones de zumos de manzana. Así, por ejemplo, una concentración de prolina
superior a 15 mg/L en zumo de manzana es un indicador de la existencia de posi-
bles mezclas de uva o pera con manzana.
Kuneman y col. (1988) analizaron el perfil de aminoácidos, previa derivati-
zación con 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina, en zumos de frutas (entre ellas
la manzana) por RP-HPLC-DAD (RP-HPLC-Diode Array Detector). Por otro
lado, Wrolstad y col. (1990) estudiaron los cambios del perfil polifenólico y ami-
noacídico durante la elaboración y almacenamiento de zumos de manzana con-
centrados, para lo cual desarrollaron un método de HPLC-DAD.
Blanco-Gomis y col. (1998) caracterizaron zumos de manzana, clarificados
mediante tecnología de membranas de flujo tangencial, mediante análisis de ami-
noácidos y riboflavina por HPLC e interpretación de los resultados mediante téc-
nicas quimiométricas (K Nearest Neighbors (KNN), LDA y análisis Bayesiano).
Estos mismos investigadores (Mangas y col., 1998b) llevaron a cabo un estudio
quimiométrico (PCA, LDA y Partial Least Squares (PLS-2)) de diversas varia-
bles químicas (azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, polifenoles y pectinas)
analizadas mediante HPLC y FIA (Flow Injection Analysis), para tipificar man-
zanas en función de su grado de maduración.
En 2005, Suárez Valles y col. publicaron un estudio sobre la influencia del
tipo de levadura y el tiempo de envejecimiento en el cambio de aminoácidos
libres en sidras espumosas. Para ello, desarrollaron un método analítico para el
análisis de los aminoácidos libres por HPLC-DAD con derivatización automáti-
ca pre-columna con o-ftaldehído y ácido 3-mercaptopropiónico. Este método se
aplicó a la monitorización de los aminoácidos durante la segunda fermentación
y envejecimiento de las sidras espumosas.
Actualmente, se siguen haciendo estudios para mejorar el análisis de amino-
ácidos por HPLC; Versari y col. (2007) compararon dos métodos cuantitativos
de HPLC (adiciones estándar vs calibración externa) para el análisis de amino-
ácidos en zumos de frutas (entre ellos el de manzana). Por otro lado, Schilling y
col. (2008) estudiaron las interacciones covalentes entre la quinona del ácido
clorogénico y los derivados de dos aminoácidos, el tert-butoxicarbonil-L-lisina y
el N-acetil-L-cisteína mediante HPLC-ESI-MS (HPLC-Electrospray Ionization-
MS). Demostraron, en un sistema modelo a pH 7, la formación de productos de
267
adición covalente para ambos derivados, mientras que para muestras de zumo de
manzana a pH 3,6 la interacción covalente fue observada sólo para el derivado
N-acetil-L-cisteína. Con estos resultados, junto con otros divulgados por otros
grupos, concluyeron que las interacciones covalentes de las cadenas laterales
amino con los compuestos fenólicos pueden contribuir al potencial alergénico de
ciertas proteínas de los alimentos.
Análisis de proteínas por HPLC. Las proteínas o polipéptidos son biopolí-
meros formados por una colección de 20 aminoácidos. Aparte de su valor nutri-
cional, las proteínas en alimentos son importantes ingredientes funcionales. Las
propiedades funcionales de las proteínas se definen como propiedades físicas y
químicas que afectan al comportamiento de las mismas en los alimentos durante
los procesos de elaboración, almacenamiento, preparación y consumo.
En relación con las bebidas fermentadas cabe destacar dos propiedades
funcionales, la actividad superficial que da lugar a la formación de espumas
(Andrés-Lacueva y col., 1996) y la formación de turbidez que aparece como con-
secuencia de la precipitación de ciertas proteínas en el seno del líquido (Mesquita
y col., 2001), que es una característica indeseable en este tipo de bebidas.
Por otra parte, la fracción proteica de los productos agrícolas, al no estar
influenciada por la naturaleza del suelo o las diferentes condiciones climatológi-
cas y ser una característica genética, es un instrumento de caracterización y tipi-
ficación de los alimentos. De hecho, diferentes autores han recurrido al análisis
de la fracción proteica para la caracterización de mostos procedentes de distintas
variedades de uva (Moreno-Arribas y col., 1999).
En el análisis de proteínas se puede emplear una gran variedad de técnicas
que van desde las clásicas o globales, como el método Kjeldahl, empleado por
Hansen (1970) para determinar el contenido de compuestos nitrogenados en
manzanas, hasta las instrumentales (HPLC, Capillary Electrophoresis (CE)),
pasando por las inmunoquímicas (Kano y Kamimura, 1993). De todas las moda-
lidades de HPLC, las más empleadas para la separación de proteínas son la cro-
matografía en fase inversa (Santoro, 1995), por su alto poder de resolución y la
cromatografía de interacción hidrofóbica (Hydrophobic Interaction (HI)-HPLC)
(Dawes y col., 1994, Lina y col., 2000). Realmente, las aplicaciones en sidra son
inexistentes si se exceptúa la aportación de Gomis y col. (2003a) que pusieron
a punto un método de análisis de proteínas en función de su hidrofobicidad, uti-
lizando RP-HPLC-UV (220 nm) como técnica de separación y la diálisis como
método de limpieza y preconcentración de las proteínas. Este método emplea una
columna C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 µm, 300 Å) como fase estacionaria y un gra-
diente de elución de agua-acetonitrilo acidificados con 0,1 % de ácido trifluoro-
acético.
Análisis de fenoles por HPLC. Actualmente, se considera que los compuestos
fenólicos son uno de los constituyentes más importantes de los alimentos por su
contribución al color, aroma y sabor (astringencia y amargor), así como por sus
268
propiedades antioxidantes, bactericidas, antivíricas y probablemente antitumora-

les, que los hacen imprescindibles en una dieta saludable. Se encuentran abun-
dantemente en los frutos y vegetales y en sus productos derivados, como los
zumos de frutas, la sidra o el vino. Desde un punto de vista estructural los com-
puestos fenólicos incluyen un amplio rango de moléculas caracterizadas por
poseer, al menos, un anillo aromático con sustituyentes hidroxílicos, además de
otros grupos funcionales como ésteres, éteres metílicos y glucósidos. Debido a la
diversidad de compuestos incluidos bajo esta denominación, los compuestos
fenólicos se agrupan en diferentes clases: no flavonoideos (alcoholes, aldehídos,
ácidos, cumarinas, etc.); flavonoideos (flavonas, isoflavonas, flavonoles, flava-
nonoles, flavanoles, flavanonas, antocianos, calconas, auronas, dihidrocalconas)
y compuestos fenólicos polimerizados (taninos hidrolizables y condensados y
ligninas).
Muchos son los métodos que se han desarrollado para su determinación, tanto
global como individualizada. La mayoría de los autores emplean la cromatogra-
fía de líquidos (HPLC). Debido a la presencia de anillos aromáticos en su estruc-
tura molecular, el sistema de detección más ampliamente usado es la absorción
UV y, en el caso de precisar una identificación más segura, la espectrometría de
masas (Bernillon y col., 2004). Una revisión muy completa de las distintas téc-
nicas empleadas para el análisis de fenoles se puede encontrar en el handbook de
Nollet (2004). En este apartado nos referiremos exclusivamente a los métodos
analíticos propuestos para el análisis de polifenoles en manzanas y sus derivados
industriales (zumos de manzana, sidras y aguardientes de sidra).
Sin duda la HPLC, en su modalidad de fase inversa y detección con regleta
de diodos, es la técnica más empleada en la determinación de polifenoles en todo
tipo de matrices, incluida la manzana y sus derivados. Dada la complejidad de
los polifenoles de la manzana (ácidos cinámicos, flavonoles, dihidrocalconas y
flavanoles) suele ser necesario emplear gradientes de elución en los que se varía
la cantidad de modificador orgánico (metanol o acetonitrilo) a lo largo del pro-
ceso de elución. Para el aislamiento de los polifenoles de las muestras se han
propuesto distintos procedimientos. En el caso de los frutos se suele recomendar
un protocolo similar al descrito para ácidos orgánicos, aumentando la concentra-
ción de disolvente orgánico hasta el 80%. Para la separación y, en caso nece-
sario, concentración de los polifenoles en zumos y sidras se han recomendado la
extracción líquido-líquido con acetato de etilo (Suárez Valles y col., 1994) o
la extracción sólido-líquido empleando Sephadex LH20 (Spanos y col., 1990;
Wall y col., 1996; Suárez y col., 1996) y Amberlita XAD-2 (Tomás-Barberán y
col., 1993).
Empleando estas metodologías, el grupo de investigación del SERIDA ha
publicado distintos procedimientos basados en la RP-HPLC para el análisis de
fenoles en manzanas, zumos y sidras (Suárez y col., 1998, 2005; Mangas y col.,
1999a), con y sin inyección directa. En el año 2000, Picinelli y col. publicaron
un estudio sobre la formación de polifenoles de bajo peso molecular durante el
269
proceso de elaboración de la sidra, monitorizando mediante RP-HPLC-DAD dos

fracciones fenólicas, neutra y ácida y comparándolas con el contenido en manza-
nas. Los fenoles mayoritarios detectados durante la elaboración de la sidra fueron
el ácido clorogénico, un compuesto con espectro similar al ácido p-cumárico y
la floricina. El estudio mostró un descenso significativo, durante la elaboración
de la sidra, del contenido de los flavan-3-ol y un aumento de la concentración de
ácido cafeico y un compuesto con espectro similar al ácido clorogénico.
Por otro lado, el empleo de técnicas quimiométricas (SIMCA, LDA, KNN)
ha permitido (Mangas y col., 1997) tipificar aguardientes de sidra de diferentes
edades obtenidos de manzanas frescas y concentrados de manzana, teniendo en
cuenta los contenidos de compuestos fenólicos y furánicos. Por su parte, Alonso-
Salces y col. (2004) clasificaron las sidras en función de su perfil polifenólico y
según su origen: vascas o francesas. Recientemente, Marks y col. (2007) han
determinado el perfil fenólico de sidras inglesas, llegando a la conclusión de que
se puede adaptar el proceso de elaboración de la sidra para aumentar el conteni-
do en polifenoles de la misma, lo que supone un valor añadido a la calidad del
producto por el potencial beneficio para la salud que tendría su consumo.
Análisis de ácidos grasos por HPLC. La técnica recomendada para el análi-
sis de ácidos grasos es la GC. Sin embargo, podemos encontrar en la bibliogra-
fía aplicaciones de la HPLC al análisis de estos ácidos. Su determinación impli-
ca, en la mayoría de los casos, un proceso previo de derivatización que permita
la introducción de grupos cromóforos o fluorescentes para favorecer su detec-
ción. Los derivados más empleados, para el análisis de ácidos grasos por HPLC
con detección UV, son los fenacil ésteres (Engelmann y col., 1988). Otros deri-
vados utilizados son los metoxifenacil ésteres (Miller y col., 1978), los naftacil
ésteres (Wood y Lee, 1983), las metoxianilidas (Hoffman y Liao, 1976), los pen-
tafluorobencil ésteres (Netting y Duffield, 1984), las nitrofenilhidracidas (Miwa
y col., 1991) y los p-nitrobencil ésteres (Hirata y Sumiya, 1983).
Aunque el detector UV es el más utilizado, hay importantes aplicaciones con
el detector de fluorescencia. Éste presenta la ventaja de su alta sensibilidad, por
lo que su uso es recomendable para el análisis de trazas. Los reactivos con pro-
piedades fluorescentes más empleados son los antrimetil ésteres (Kargas y col.,
1990). También hay aplicaciones con detectores electroquímicos (Fuse y col.,
1997).
De acuerdo con estos principios, Fujimori y col. (2005) desarrollaron un
método mediante RP-HPLC-UV para el análisis de ácidos grasos, a partir de los
p-nitrofenacil derivados, en el extracto lipofílico de cuatro tipos de vinagre, entre
ellos el vinagre de sidra. Identificaron nueve ácidos grasos predominantes en el
vinagre de sidra, de 16 a 22 átomos de carbono, siendo los mayoritarios el pal-
mítico, esteárico, oleico y linoleico. A modo de ejemplo, conviene resaltar que el
vinagre de sidra (procedente de USA) mostró un contenido mucho mayor de los
ácidos palmítico y oleico en relación con los otros vinagres.
270
Análisis de patulina por HPLC. La patulina es una micotoxina producida por

diversos tipos de hongos de los géneros Penicillium, Aspergillus y Byssochla-
mys. Comenzó a analizarse por HPLC en mantequilla de manzana en 1975
(Ware), por lo que se encuentra entre los primeros analitos, relacionados con la
manzana, analizados por HPLC. En este método, la patulina se extrae con aceta-
to de etilo y el extracto se limpia en una columna de sílice, eluyendo con bence-
no/acetato de etilo (75:25). Para la separación cromatográfica se emplea una
columna en fase normal (25 cm ZorbaxSil) y una mezcla de isooctano/éter etíli-
co/ácido acético (750:250:0,5) como fase móvil, detectando la patulina a 254 nm
y obteniendo recuperaciones en el rango de 89,0 a 112,1 %. Poco después, en 1978,
Stray realizó el primer análisis de patulina en zumo de manzana en fase inversa
(10 cm; Partisil-10 ODS), obteniendo un límite de detección (LD) de 1µg/L y
recuperaciones algo inferiores a las obtenidas para la mantequilla de manzana
(82,6 ± 2,8 %).
El análisis de la patulina se ha mejorado recientemente (Moukas y col., 2008).
Estos autores han desarrollado un método de HPLC en fase inversa para al aná-
lisis de patulina en zumos de frutas, obteniendo unos límites de detección y cuan-
tificación de 0,23 µg/kg y 1,2 µg/kg, respectivamente y con recuperaciones del
99,5% (RSD% = 0,73). Como fase estacionaria se empleó una columna C18
(Synergi Hydro-RP, Phenomenex 250 x 4,6 mm, 4 µm), como fase móvil una
mezcla de agua/acetonitrilo/ácido perclórico (990:10:1) a 1 mL/min y la detección
se llevó a cabo a 276 nm.
Análisis de productos fitosanitarios por HPLC. El empleo de pesticidas supo-
ne un peligro para los consumidores, debido a que tanto las propias sustancias
como sus productos de degradación o reacción pueden dejar residuos en los ali-
mentos que pueden tener efectos adversos para la salud. Por ello, resulta esencial
mantener el nivel de residuos de pesticidas en los alimentos en niveles acepta-
bles desde el punto de vista toxicológico y disponer de técnicas de análisis sen-
sibles y precisas para su control. Por este motivo, actualmente, se siguen publi-
cando métodos para su detección y cuantificación en alimentos. Este es el caso
de los trabajos desarrollados por Topuz y col. (2005) y Yang y col. (2008), que
utilizaron diferentes métodos de extracción en fase sólida antes de separar los
analitos por RP-HPLC sobre una columna C18 y una mezcla de acetonitrilo-agua
como fase móvil. Ello permitió pre-concentrar las muestras, además de minimi-
zar el consumo de disolventes orgánicos en el pre-tratamiento de las mismas. En
ambos casos se utilizó una regleta de diodos (DAD) como sistema de detección.
El método de Topuz y col. (2005) se aplicó a la separación y detección de cua-
tro pesticidas (folpet, clorotalonil, quinometionato y tetradifón) y un herbicida (tri-
fluralino) en muestras de zumos de frutas (manzanas, cerezas y melocotones). La
pre-concentración, a partir de 25 g de zumo de fruta, se llevó a cabo sobre un car-
tucho C18 y la detección se efectuó entre 220 y 260 nm. El rango de recuperacio-
nes en patrones fue del 93,8 al 99,5% (RSD < 3,4%) para concentraciones com-
prendidas entre 1 y 16 µg/kg. Los límites de detección oscilaron entre 0,5 y 1 µg/kg.
271
El método de Yang y col. (2008) se empleó para la separación y cuantifi-

cación de carbamatos en manzanas y sus zumos. Se utilizó la micro-extracción
en fase sólida (SPME), acoplada a la HPLC, como sistema de extracción y pre-
concentración de los analitos en un solo paso. En este método se empleó una
fibra de 60 µm de polidimetilsiloxano/divinilbenceno para la SPME con un
tiempo de extracción de 40 minutos a temperatura ambiente. El extracto de los
pesticidas, presentes en la fibra, se transfirió a la fase móvil en la interfase
SPME-HPLC y la detección se llevó a cabo a 210 nm. El método demostró ser
lineal en el rango de 0,05 a 1,0 mg/kg. El límite de detección obtenido en las
muestras de manzana para el metilcarbamato y el isopropil 3,4-dietoxicarbanila-
to fue de 15 y 5 µg/kg, respectivamente y en los zumos de 15 y 3 µg/L, respec-
tivamente. Las recuperaciones y la reproducibilidad fueron excelentes y, gracias
al empleo de la SPME, se eliminó el consumo de disolventes orgánicos en el pro-
ceso de extracción.
Una alternativa a la detección UV para el análisis de pesticidas por HPLC en
zumos de frutas es la detección quimioluminiscente. Orejuela y Silva (2003)
detectaron tres pesticidas (carbarilo, carbofurano y propoxur) mediante la qui-
mioluminiscencia del peroxioxalato. Como paso previo a la separación, fue ne-
cesario hidrolizar y derivatizar los analitos con cloruro de dansilo en presencia
de bromuro de cetiltrimetilamonio como catalizador. Como en los métodos ante-
riores, la separación se llevó a cabo sobre una columna C18 (250 x 4,6 mm,
4µm) con una mezcla de acetonitrilo, agua y metanol (55:37:8) como fase móvil
a 1 mL/min. El porcentaje de recuperación del método fue del 93% para con-
centraciones comprendidas entre 10 y 100 mg/L, con un límite de detección por
debajo de los 3 µg/L para los tres pesticidas.
Los tres métodos descritos son comparables entre sí y aplicables a la detección
de pesticidas en sidra.
Análisis de sulfitos y aminas biógenas por HPLC. La HPLC es una técnica
muy versátil que puede ser utilizada en la determinación de sulfitos en sidras
(Lea y col., 2000) y manzanas (McFeeters y Barish, 2003) o de aminas biógenas
previa derivatización fluorescente (Garai y col., 2006; Li y col., 2006).
ELECTROFORESIS CAPILAR
Introducción
La Electroforesis Capilar (CE) es una técnica de separación no cromatográfi-
ca basada en la diferente movilidad de las sustancias bajo la acción de un campo
eléctrico. Combina el poder de separación de la electroforesis convencional con
el apoyo instrumental propio de la HPLC. La separación de las sustancias se
lleva a cabo en el interior de un tubo capilar, normalmente de sílice fundida,
cuyas dimensiones oscilan entre 10 y 100 cm de longitud y 25 y 100 µm de diá-
metro interno, lleno de una disolución tampón (BGE, Background Electrolyte).
272
Figura 3.–Representación esquemática de un equipo de CE. EOF: flujo electroosmótico;

µep: movilidad electroforética
Una fuente de alimentación de corriente continua suministra una elevada dife-

rencia de potencial (5-30 kV) y gracias a la conductividad eléctrica del tampón
se origina una corriente eléctrica entre los extremos del tubo. Cada sustancia
introducida en el capilar se desplaza por su interior a una velocidad que depen-
de de su carga eléctrica global, su estructura, la viscosidad del medio y la dife-
rencia de potencial aplicado, que son los principales factores responsables de la
separación (ver figura 3).
Existen distintas modalidades de operación en CE, lo que hace que sea una
técnica muy versátil. Se diferencian, fundamentalmente, en la naturaleza del con-
tenido del capilar, siendo los modos básicos de operación los siguientes: Electro-
foresis Capilar Zonal (CZE), Cromatografía Micelar Electrocinética (MECK),
Electroforesis Capilar en Gel (CGE), Isoelectroenfoque (CIEF) e Isotacoforesis
(CITP).
Sus principales ventajas frente a la HPLC o a la GC son una alta eficacia, un
amplio rango de aplicación a diferentes tipos de analitos, flexibilidad, robustez y
bajos costes de análisis. Su fiabilidad es comparable a la obtenida por HPLC y
GC aunque, en general, la sensibilidad y reproducibilidad es menor si se compa-
ra con la HPLC. No obstante, con los avances instrumentales esta situación está
cambiando. Desde el punto de vista ambiental, también, la CE tiene mejores
prestaciones, ya que, no requiere grandes cantidades de disolventes orgánicos
peligrosos. Los residuos producidos en una jornada de trabajo van desde los
microlitros hasta unos pocos mililitros.
Análisis de ácidos orgánicos por CE

Arellano y col. (1997) desarrollaron un método rápido, sensible y cuantitati-
vo para analizar simultáneamente por CE, con detección indirecta UV, los ácidos
273
orgánicos e inorgánicos presentes en vinos y zumos de frutas. El límite de detec-

ción del método está comprendido entre 0,006 y 1,07 mg/L para todos los anio-
nes (cloruro, nitrato, sulfato, oxalato, tartrato, malato, succinato, citrato, fosfato,
acetato y lactato).
Yang y col. (2000) optimizaron un método de CZE con detección ampero-
métrica, empleando un electrodo de cobre (0,12 V vs SCE (electrodo saturado de
calomelanos)), para el análisis de ácidos di- y tricarboxílicos (oxálico, málico,
tartárico y cítrico) en frutas (entre ellas, la manzana). Para la separación emple-
aron una disolución reguladora de fosfatos de pH 6,2, bromuro de cetilpiridinio
(0,4 mM) para invertir el EOF (flujo electroosmótico) y β-ciclodextrina (20 mM)
como agente complejante, obteniendo límites de detección entre 4 y 8 fmol.
Sawada y Nogami (2004) han utilizado la CE con detección por espectrome-
tría de masas para el análisis de los ácidos succínico, málico, tartárico, maleico
y cítrico en zumo de manzana, obteniendo límites de detección comprendidos
entre 1,1 y 3,5 mg/L.
Análisis de azúcares por CE

Se ha demostrado que la CE es una alternativa a la HPLC como técnica de
rutina en el control de azúcares en zumos de manzana, naranja y uva (Klockow
y col., 1994; Klockow y Paulus, 1996), teniendo en cuenta los resultados obte-
nidos (eficiencia, sensibilidad, linealidad y repetibilidad) al analizar muestras de
zumos por CZE y HPAEC-PAD (cromatografía líquida de alta resolución de
intercambio aniónico con detector amperométrico de pulsos). También, se han
desarrollado métodos de CZE (Noe y col., 1999) para la separación y cuantifi-
cación (límite de detección, 25 fmol) de los enantiómeros de azúcares reducto-
res, empleando feniletilamina como derivatizante quiral. Con este método se
pueden analizar y separar los enantiómeros de las aldosas, ácidos urónicos y des-
oxialdosas presentes en bebidas (vino, zumo de manzana y café instantáneo) en
un solo análisis.
Análisis de proteínas por CE

La determinación de los pesos moleculares de las proteínas se pueden llevar
a cabo a través de varias técnicas: la cromatografía de exclusión por tamaños
(SEC), la electroforesis clásica en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) o la
electroforesis capilar sobre geles (CGE). La base de las tres técnicas consiste en
la existencia de un medio que actúa como tamiz molecular. La SEC presenta
ciertos inconvenientes, como la presencia de mecanismos mixtos de separación
debidos a las interacciones electrostáticas o hidrofóbicas de las proteínas con la
fase estacionaria y la conformación tridimensional de éstas. La CGE es la elección
más adecuada para este tipo de determinaciones, ya que presenta ciertas venta-
jas sobre la electroforesis clásica, como la detección en línea (sin necesidad de
274
recurrir a procedimientos de tinción), la realización de un análisis cuantitativo, su

mayor eficacia y mejor resolución en la separación, su automatización y mayor
rapidez.
Empleando esta técnica, Gomis y col. (2003b) han separado cinco proteínas
con pesos moleculares comprendidos entre 14.400 y 66.200 Da en menos de 15
minutos. Para ello, emplearon un capilar de sílice fundida (24 cm, 100 µm d.i.)
con una reguladora de tris (hidroximetil) aminometano (0,05 M)-ácido aspártico
(0,035 M), SDS (0,1% m/v) y acrilamida (4% m/v), pH 8,0 y ácido benzoico
como patrón interno. El voltaje aplicado para la separación fue de -7 kV.
Mediante esta metodología fueron cuantificados polipéptidos en la sidra.
Blanco y col. (2004b) también realizaron un estudio comparativo de cuatro
tratamientos de muestra para aislar el contenido proteico de la sidra: precipita-
ción con etanol, diálisis, filtración en gel y ultrafiltración. La ultrafiltración,
mediante el uso de filtros de corte, previa limpieza de la muestra, fue el más efec-
tivo para el análisis de proteínas por CGE.
En 2007, Blanco-Gomis y col. caracterizaron las sidras asturianas en función
del contenido proteico y los parámetros de la espuma (evaluados por el método
Bikerman). El perfil de polipéptidos, basado en el peso molecular, junto con téc-
nicas de exploración y clasificación, como el análisis de componentes principa-
les (PCA) o el análisis discriminante lineal (LDA), permitieron la tipificación de
las sidras en función de la tecnología de extracción del zumo de manzana y las
propiedades sensoriales de la sidra relacionadas con el comportamiento en vaso
(propiedades espumantes).
Análisis de fenoles por CE

El uso de detectores electroquímicos (ED) acoplados a la CE hace que esta
técnica, además de ser rápida, eficiente y reproducible, con un consumo mínimo
de muestra y de disolventes, sea una técnica muy selectiva, ya que únicamente
se detectan las sustancias electroactivas. La CE-ED ha sido aplicada al análisis
de fenoles en alimentos (Cao y col., 2001a; Cao y col., 2001b) y, en particular, a
zumos de manzana y sidra (Youyuan Peng y col., 2005). En estas matrices se
determinaron, simultáneamente, floricina, (-)-epicatequina, ácido clorogénico y
miricetina. La separación se llevó a cabo en un capilar de sílice fundida (75 cm,
25 µm d.i.), empleando una disolución reguladora de boratos (50 mM, pH 8,7) y
un voltaje de 18 kV. La detección amperométrica permitió obtener límites de
detección entre 0,1 y 0,5 mg/L.
Análisis de patulina por CE

Tsao y Zhou (2000) han desarrollado un método para la detección y cuantifi-
cación de patulina en manzana por MECK con detección UV (273 nm), que
cumple las características fijadas en la Directiva 2003/78/CE para el análisis de
275
patulina en alimentos. El límite de detección alcanzado fue de 3,8 µg/L y el

rango de recuperación estuvo comprendido entre el 95,2 y el 105,4 %.
Análisis de productos fitosanitarios por CE

Hernández-Borges y col. (2005) pusieron a punto un método de CE para el
análisis simultáneo de cinco pesticidas (ciprodinil, ciromazin, pirifenox, pirimi-
carb y pirimetanil) en alimentos, entre los cuales se encuentra la manzana, en el
que combinan la SPME con diferentes estrategias de pre-concentración en línea.
El electrolito utilizado consistió en una mezcla de cloruro de cetiltrimetilamonio
(0,4 M) y ácido acético (0,4 M) a pH 4 con un 5% (vol/vol) de 2-propanol. El
límite de detección obtenido para los zumos fue de 3,1 µg/L.
TÉCNICAS ESPECTROCÓPICAS ATÓMICAS
Introducción
Básicamente, las técnicas espectroscópicas atómicas (absorción, emisión o
fluorescencia) consisten en transformar la muestra en átomos en estado de vapor
(atomización) y medir la radiación electromagnética absorbida o emitida por éstos.
Espectrofotometría de absorción atómica (AAS)

La absorción atómica es el proceso que ocurre cuando los átomos de un ele-
mento en estado fundamental absorben energía radiante a una longitud de onda
específica y luego la pierden en forma de calor. La absorción selectiva a las di-
versas longitudes de onda origina el espectro de absorción característico de cada
elemento.
Las muestras se vaporizan y se convierten en átomos libres en un proceso
denominado atomización. Sobre el vapor atómico originado se hace incidir la
radiación electromagnética que será absorbida parcialmente por el analito; esta
absorción se produce de forma selectiva para cada elemento a unas determinadas
longitudes de onda. Los espectros atómicos están constituidos por picos estre-
chos (teóricamente líneas) y bien definidos, originados por transiciones entre dis-
tintos niveles de energía electrónica, lo que hace que estas técnicas sean selecti-
vas y sensibles. Para la obtención del vapor atómico pueden utilizarse distintos
sistemas de atomización como la llama, que es el resultado de una reacción exo-
térmica entre un gas combustible y un agente oxidante gaseoso, el arco eléctri-
co, el láser, los plasmas y las microondas de alta frecuencia, los filamentos y las
bandas atomizadoras, el horno de grafito (GFA), que es el sistema de atomi-
zación electrotérmica (ET) más empleado, y la generación de hidruros (HG)
acoplada a la espectrofotometría de absorción atómica (HG-AAS), que es una
alternativa a la atomización electrotérmica.
276
La absorción en la llama está directamente relacionada con la concentración

de analito en la disolución problema mediante la Ley de Lambert-Beer, mientras
que en el horno de grafito la absorción depende de la cantidad total de analito
introducido y no de la concentración de la muestra original.
La espectrofotometría de absorción atómica se aplica a la determinación y
cuantificación de trazas metálicas. Se pueden determinar unos 70 elementos
(todos los del sistema periódico excepto los halógenos, carbono, nitrógeno, fós-
foro, azufre y gases nobles).
Análisis de manzanas, zumos de manzana y sidra por AAS. Son muchos los
trabajos publicados para la determinación de metales en bebidas aunque muy
escasos los empleados para no-metales, por lo cual hemos decidido hacer un
pequeño cuadro resumen de las aplicaciones de esta técnica al análisis de sidras,
zumos de manzana o manzanas (tabla 2).
Tabla 2.–Cuadro resumen de las aplicaciones de la AAS al análisis de sidras, zumos de manzana o manzanas
Año Autores Analitos Técnica Muestras
1966 Bradfield y Osborne Pb, Cu, Zn, Fe y Mn Llama-AAS Sidra

y colorimetría
1968 Temperli y col. Ca y Mg Llama-AAS Zumo
1982 Brause y Raterman K Llama-AAS Zumo
1985 Contreras López y Metales pesados Llama-AAS Sidra, zumo y
López Bobo manzana
1993 Arruda y col. Al FIA-ET-AAS Zumo
1994 Arruda y col. Se FIA-ET-AAS Zumo
1995 Berkovic y col. Fe, Zn y Al AAS Zumo
1996 Mena y col. Cd ET-AAS Sidra
1997 Yebra-Biurrun y col. Ácido ascórbico(*) FIA-Llama-AAS Zumo
1997 Mena y col. Pb FIA-FG-AAS Sidra
1998 Lendínez y col. Cr ET-AAS Sidra
2000 Ashraf y col. Cr, Ni, As, Fe, Mn, AAS Zumo
Cd, Cu, Hg, Pb, Zn,
Na, K, Mg y Ca
2006 Seruga y Laslavic Al ET-AAS Zumo
2008 Ince y Coskun Cu, Fe, Cr, Mn, Zn, Llama-AAS Zumo
Pb, Na, Mg, Ca y K
(*)Determinación indirecta del ácido ascórbico (0,2-25 µg/mL) en zumo de manzana, basado en sus propiedades
reductoras.
277
Espectrofotometría de emisión atómica u óptica
La espectrofotometría de emisión óptica (OES) se basa en la vaporización,

disociación, ionización y excitación de los diferentes elementos químicos de una
muestra. Para disociar las moléculas en átomos libres se utilizan fuentes térmi-
cas como llamas, hornos y descargas eléctricas. Más recientemente otro tipo de
descargas eléctricas, llamadas plasmas, han sido utilizadas como fuentes de ato-
mización y excitación para la OES, siendo el plasma inductivamente acoplado
(ICP) el más popular (ver figura 4). Un plasma es un gas ionizado, eléctrica-
mente neutro y confinado en un tubo de descarga. Es un estado de equilibrio
entre partículas cargadas y neutras de un gas ionizado. Las temperaturas alcan-
zadas son notablemente superiores a las de la absorción atómica. Una de las ven-
tajas de estas fuentes de plasma es que, también, permiten la determinación de
no metales, como cloro, bromo, yodo y azufre.
Durante el proceso de desexcitación de los átomos neutros e iones en el in-
terior de un plasma, se producen las emisiones de radiación electromagnética en
la zona del UV-Vis. Estas radiaciones, características de cada elemento, se se-
paran en función de su longitud de onda y finalmente se mide su intensidad.
La selección de la longitud de onda nos permite identificar el metal, mientras que
la intensidad de la radiación emitida nos proporcionará la información para poder
cuantificarlo.
El plasma ICP produce, de forma casi exclusiva,
iones monoatómicos y monopositivos (M+)
que posteriormente se pueden extraer a
un Espectrómetro de Masas (MS) para
su análisis. La mayor parte de los ele-
mentos de la tabla periódica se pue-
den ionizar en un ICP y detectar
posteriormente en el MS (elemen-
tos que no se pueden determinar
son H, C, N, O, F y los gases
nobles). La interpretación de un es-
pectro de masas elemental es sim-
ple, ya que las abundancias isotópi-
cas de los elementos naturales son
conocidas y el espectro de masas
refleja esta abundancia isotópica.
Análisis de metales por Plasma
de Acoplamiento Inductivo (ICP).
Son muchas las aplicaciones del
ICP a la determinación de metales
en alimentos y bebidas aunque
Figura 4.–Representación esquemática de un ICP no tantas en el caso de zumos de
278
manzana, de las que podemos citar el análisis de Pb por ICP-OES (Marrero y

col., 2003), de V, Cr, Mn, Ni, Cu, Zn y Pb (Hague y col., 2008) por ICP-MS o
de trazas metálicas (Barnes, 1997) por ICP-OES. En manzanas se han analizado
compuestos de arsénico (B’Hymer y Caruso, 2002) y varios metales mediante
los complejos estables y cinéticamente inertes que forman con polisacáridos
(Szpunar y col., 1999), para lo cual se empleó la cromatografía de exclusión por
tamaños con detección ICP-MS en paralelo a un detector refractométrico (RI). El
método permitió la identificación de Pb, Ba, Sr, Ce y B complejados con polisa-
cáridos de alto peso molecular (> 50 kDa), mientras que otros metales (Zn, Cu y
Mg) eluían complejados con compuestos de bajo peso molecular.
García-Ruiz y col. (2007a) emplearon ICP-OES para determinar los elemen-
tos mayoritarios (Na, K, Ca y Mg) en muestras de sidra de diferentes proceden-
cias geográficas (Asturias, País Vasco, Inglaterra, Suiza y Francia), ICP-MS para
los elementos minoritarios y traza (Li, Be, B, Al, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni,
Cu, Zn, Ga, As, Se, Rb, Sr, Y, Mo, Cd, Sn, Sb, Cs, Ba, La, Ce, W, Tl, Pb, Bi, Th
y U) y MS-ICP-MS para determinar la relación de abundancias isotópicas del
87Sr / 86Sr. Mediante estudios estadísticos (análisis discriminante lineal) de los
datos obtenidos fueron capaces de clasificar el 100% de las muestras analizadas

según su origen geográfico. Estos mismos autores (García-Ruiz y col. 2007b,
2008) han desarrollado otros dos métodos para el análisis de metales (Rb y Sr)
en sidras por ICP-MS, previa separación por cromatografía iónica.
Tyson (1999) realizó una revisión bibliográfica del empleo de sistemas de
inyección de flujo, de flujo continuo y de HPLC acoplados al ICP para la deter-
minación de concentraciones traza de Cd, Pb y Se, así como de varios compues-
tos de arsénico y de selenio en diferentes muestras de zumos de frutas y vino.
Análisis de compuestos orgánicos por HPLC-ICP-OES. Peters y col. (2001)
aplicaron la cromatografía líquida acoplada a un detector ICP-OES para cuanti-
ficar carbohidratos (fructosa, glucosa, ribitol, melicitosa y sacarosa) en manzanas.
Para ello, emplearon una columna de intercambio de ligandos con calcio, mejo-
rando en un orden de magnitud los límites de detección obtenidos con un detec-
tor UV y en dos los obtenidos con un detector de RI.
Más recientemente, en 2006, Paredes y col. desarrollaron un método de
HPLC-ICP-OES para la determinación simultánea en alimentos (entre ellos el
zumo de manzana) de carbohidratos (glucosa, fructosa, sacarosa, sorbitol y lac-
tosa), ácidos carboxílicos (cítrico, tartárico, málico, láctico y acético), alcoholes
(glicerol, etanol y metanol) y metales en un solo análisis. Para su separación
emplearon una columna de intercambio catiónico. Los cromatogramas fueron
obtenidos midiendo la señal de emisión del carbono a 193,09 nm. Las ventajas
de este método, frente a otros que emplean sistemas de detección convenciona-
les (RI, UV y DAD), son: (i) los compuestos orgánicos y los metales pueden
ser determinados simultáneamente; (ii) el método de detección es universal; (iii)
se puede obtener una calibración completa, en una sola inyección, para los
279
compuestos orgánicos no volátiles; (iv) los límites de detección absolutos son

menores o similares a los obtenidos con los sistemas de detección convencio-
nales.
TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS MOLECULARES
Introducción
La espectroscopia molecular se basa en la interacción entre la radiación elec-
tromagnética y los distintos estados electrónicos, vibracionales y rotacionales de
las moléculas. Según el tipo de interacción que se mida, las técnicas espectros-
cópicas moleculares se clasifican básicamente en absorción, luminiscencia y dis-
persión molecular y, en función de la zona del espectro en la que se realicen las
medidas, hablaremos de ultravioleta/visible (UV/Vis) o infrarrojo (IR). En el
sector de la sidra se pueden destacar las aplicaciones de la espectroscopia de
absorción UV/Vis y del infrarrojo cercano (NIR).
Espectroscopia UV-Vis
En esta técnica se realizan medidas de la radiación electromagnética en la re-
gión de longitudes de onda comprendidas entre 190 y 780 nm. El espectro resul-
tante se denomina espectro de bandas, ya que se superponen las líneas de los dis-
tintos niveles vibracionales dentro del estado electrónico fundamental. Seleccio-
nando la longitud de onda adecuada se pueden llevar a cabo análisis cuantitati-
vos de una gran variedad de especies, tanto inorgánicas como orgánicas.
La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la trans-
mitancia (T) o de la absorbancia (A) de disoluciones que se encuentran en cu-
betas transparentes que tienen un camino óptico de b cm. Normalmente, la
concentración c de un analito absorbente está relacionada linealmente con la
absorbancia a través de la ecuación:
A = -log T = log P0/P = εbc
P y P0 son las potencias medida e incidente, respectivamente, y ε el coefi-
ciente de absortividad molar.
Instrumentación. Los instrumentos para medir la absorción de radiación
ultravioleta, visible e infrarrojo cercano están compuestos por uno o más de los
siguientes componentes (ver figura 5): fuentes, selectores de longitud de onda,
recipientes para la muestra, detectores de radiación, procesadores de señal y dis-
positivos de lectura.
Aplicaciones. Las principales aplicaciones del la espectroscopia UV/Vis en el
campo de la sidra son el análisis de polisacáridos y polifenoles totales y las deter-
minaciones enzimáticas de moléculas sencillas como los ácidos orgánicos, los
azúcares, etc. Como instrumentación analítica se utiliza un espectrofotómetro
280
Figura 5.–Representación esquemática de espectrofotómetro UV-Vis
UV/Vis de doble haz, con una fuente de deuterio para la zona UV y otra halóge-
na para la zona visible, disponiendo de una red holográfica de 1.440 líneas/mm
como sistema de selección de longitud de onda.
El análisis de los polisacáridos totales, ácidos y neutros se lleva a cabo una vez
extraídos éstos por precipitación con etanol (sidra: etanol, 1:5, v/v). El precipita-
do, que contiene los polisacáridos, es reconstituido en agua; a continuación, los
polisacáridos ácidos son determinados de acuerdo con el método propuesto por
Kintner y Van Buren (1982), utilizando como reactivo cromóforo el m-hidroxi-
difenilo y haciendo la lectura colorimétrica a 523 nm. Para la determinación de los
polisacáridos neutros se emplea el método orcinol-sulfúrico, detectando el com-
plejo coloreado a 423 nm (Mangas y col., 1999 b). En realidad con este método
se cuantifican los polisacáridos totales (neutros y ácidos), por lo que para estimar
los polisacáridos neutros es necesario corregir la interferencia producida por los
polisacáridos ácidos. Para ello, se utiliza la curva de calibración del ácido galac-
turónico (azúcar ácido constituyente de las pectinas) con el orcinol-sulfúrico.
Para el análisis de los polifenoles totales, Mangas y col. (1993b) han pro-
puesto un método automatizado (FIA; Flow Injection Analysis), basándose en el
enasyo colorimétrico de Folin-Ciocalteu. La detección se efectúa a 673 nm, que
es el máximo de absorción de los óxidos de tungsteno (W8O23) y molibdeno
(Mo8O23). Éstos se forman a partir de la reacción de los polifenoles en medio
alcalino (Na2CO3) con una mezcla (reactivo de Folin-Ciocalteu) de los ácidos
fosfotúngstico (H4PW12O40) y fosfomolíbdico (H4PMo12O40).
Los métodos enzimáticos utilizan enzimas específicos que catalizan reaccio-
nes bioquímicas (fosforilaciones, oxidaciones, reducciones, etc.) donde inter-
viene la molécula que se pretende cuantificar. En el caso particular de los ácidos
orgánicos, los métodos enzimáticos emplean el cofactor enzimático NAD+/
NADH o NADP+/NADPH como especie molecular detectable a 340 nm. Estos
métodos se caracterizan por su elevada sensibilidad y selectividad y son idóneos
para el análisis de isómeros ópticos como el D (-)-láctico y L (+)-láctico. El con-
trol de estos ácidos es de gran interés en el seguimiento de la fermentación malo-
láctica y/o la detección de alteraciones provocadas por las bacterias lácticas.
281
Espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR)

Esta técnica se basa en la interacción de la materia con la radiación electro-
magnética a longitudes de onda comprendidas entre 780 y 2.500 nm. El espectro
NIR de alimentos comprende amplias bandas que provienen de absorciones
superpuestas correspondientes, principalmente, a sobre tonos y combinaciones
de modos de vibración que implican enlaces químicos C-H, O-H y N-H. Esto
hace a la técnica muy factible para medidas en sistemas orgánicos y biológicos.
La radiación que interacciona con una muestra puede ser absorbida, transmitida
o reflejada. Así, hay diferentes modos de medida en espectroscopia NIR que
permiten diversas aplicaciones. En la práctica, los modos comunes son transmi-
tancia, interactancia, transflectancia, transmitancia difusa y reflectancia difusa,
siendo las dos últimas las más frecuentemente empleadas.
Las medidas de transmitancia difusa son llevadas a cabo normalmente en la
región del espectro entre 800 y 1.100 nm, donde las absorciones débiles propor-
cionan datos útiles que son obtenidos utilizando grosores de muestra de 1-2 cm,
como es el caso de la carne, el queso o el grano entero. En el rango de longitu-
des de onda 1.100-2.500 nm, la cantidad de dispersión hace que la transmitancia
a través de 1 cm de espesor de muchas muestras sea insignificante. Esta situa-
ción se llama reflectancia difusa, porque la mayor parte de la radiación inciden-
te es reflejada. Esta medida es conveniente para muestras gruesas como frutas y
cereales.
La espectroscopia de transmitancia y reflectancia tiene su origen en el es-
pectrómetro desarrollado por Hardy (1935). Poco tiempo atrás, Kubelka y
Munk (1931) desarrollaron los análisis de reflectancia difusa. El espectrómetro
Hardy tenía la capacidad de medir la transmitancia en muestras ópticamente
transparentes y la reflectancia difusa con una esfera de integración. La espec-
troscopia de transmisión en la zona espectral del infrarrojo quedó validada con
la incorporación del interferómetro de Michelson y el análisis por transformada
de Fourier.
La región del infrarrojo cercano fue considerada poco útil porque las bandas
de absorción eran demasiado débiles, pero la reflectancia difusa fue utilizada en
gran medida para la evaluación del color y el aspecto. En los años 50 Norris y col.
(1953) la aplicaron en la detección automática de manchas de sangre en huevos.
Posteriormente, el equipo utilizado para esta aplicación fue empleado en la reso-
lución de otros problemas, como la detección de corazón hueco en patatas y
acuoso en manzanas. En estos casos se utilizaba la región del infrarrojo cercano,
comprendida entre 750-900 nm, que era el rango permitido por la instrumenta-
ción, concretamente por el monocromador y el tubo fotomultiplicador.
En los años 60, Norris extendió el rango a aproximadamente 2,6 µm, utili-
zando un monocromador para el infrarrojo cercano y un detector de sulfuro de
plomo. La fuerza de las bandas de absorción en este rango de longitudes de onda
y el camino óptico eficaz para las medidas de reflectancia difusa en materiales
282
secos, demostró ser compatible con la instrumentación disponible. Esto propor-

cionó un método para determinar la composición de muchos materiales, elimi-
nando los procedimientos laboriosos del análisis químico, excepto la calibración
del instrumento. La aplicación más importante de la espectroscopia NIR es el
análisis multicomponente de muestras sólidas agrícolas por reflectancia difusa.
Así, por ejemplo, se pudo hacer rutinario el análisis cuantitativo directo por NIR
de muestras tan complejas como granos y semillas oleaginosas.
Las medidas de reflectancia difusa son aplicables a muchos sólidos no metá-
licos o líquidos que no son ópticamente transparentes. En transmitancia, la rela-
ción entre la composición y la atenuación de la radiación transmitida se describe
por la ley de Lambert-Beer. Sin embargo, esta ley no se debe aplicar a los datos
de reflectancia difusa, debido a la dispersión de la luz producida por la muestra.
Cada fotón de la radiación incidente sigue un camino único a través de la mues-
tra, lo que hace que el paso óptico efectivo sea una función de la suma de muchos
pasos diferentes dentro, a través y fuera de la muestra en el lado reflectante.
En espectroscopia NIR la señal radiométrica se expresa, generalmente, como
absorbancia aparente o como el logaritmo de la reflectancia recíproca (log 1/R).
Según Williams (1975b) esta aproximación fue introducida por Norris en los
años 70 y es análogo al log (1/T) empleado en la ley de Lambert-Beer. En la
práctica, la reflectancia de la muestra se normaliza con respecto a la de un patrón
interno. La característica más importante del patrón interno es que debe ser esta-
ble en el tiempo e idealmente no debería producir absorción. Se han desarrolla-
do muchas aplicaciones analíticas de NIR por regresión lineal múltiple con datos
espectrales expresados como log (1/R) o como la derivada del log (1/R).
La función (1-R)2/2R, deducida de la teoría de Kubelka-Munk, donde R es la
reflectancia normalizada, se utiliza ampliamente en la espectroscopia visible, el
infrarrojo medio y el infrarrojo cercano. En el modelo de Kubelka-Munk, las pro-
piedades esenciales de la muestra se describen por la constante de dispersión (S) y
por la constante de absorción (K). Su cociente se relaciona con la reflectancia difu-
sa (R) de una muestra suficientemente gruesa por la función de Kubelka-Munk:
K/S = (1-R)2/2R
La muestra debe ser lo suficientemente gruesa para asegurar que no se trans-
mite la radiación a través de la misma. Para una dispersión S constante, la rela-
ción lineal entre la reflectancia y la concentración (C) se expresa como:
(1-R)2/2R = f*C, f = 2,303*a/S (a es la absortividad)
El análisis de muestras líquidas por espectroscopia de transmitancia ha esta-
do limitado por la fuerte absorción de los disolventes en el IR, la dificultad en la
preparación de la muestra, la eliminación de la dispersión, el efecto de la dilu-
ción en los disolventes y la interacción disolvente-soluto. Un modo práctico para
hacer más sensible y exacto el análisis IR es proceder como sugieren Kuehl y
Griffiths (1980), esto es, eliminando el disolvente y transfiriendo el extracto
283
seco, que contiene los analitos, a un medio translúcido sólido adaptado al análi-
sis por reflectancia difusa. Este método fue utilizado por Meurens (1982) para
medir disoluciones acuosas por espectroscopia de reflectancia difusa. Esta técni-
ca de análisis directo se conoce como Sistema de Extracto Seco para Infrarrojo
(DESIR). DESIR es una técnica de análisis líquido basado en medidas de radia-
ción IR difusa reflejada por solutos aislados en soportes sólidos. Así, por ejem-
plo, la muestra líquida se puede depositar en un filtro de fibra de vidrio
(Millipore AP25, Whatman GF/A, o Sartorius SM) de 47 mm de diámetro inter-
no, se seca en un horno microondas, tan rápido como sea posible, y se procede a
medir la reflectancia.
Instrumentación. La instrumentación utilizada en la región del infrarrojo cer-
cano es semejante a la empleada en la espectroscopia de absorción UV/Vis.
Como fuentes se emplean las lámparas de wolframio con ventanas de cuarzo. Por
lo general, las cubetas son de cuarzo o sílice fundida que son transparentes hasta
aproximadamente 3.000 nm. La longitud de las cubetas varía de 0,1 a 10 cm. Los
detectores normalmente son fotoconductores de sulfuro de plomo. Varios espec-
trofotómetros comerciales están diseñados para trabajar hasta 2.500 nm y de este
modo se pueden utilizar para obtener espectros en el infrarrojo cercano.
Comercialmente, se dispone de una multitud de fotómetros y espectrofotó-
metros diseñados específicamente para la región del infrarrojo cercano. Los más
sofisticados son instrumentos de doble haz con red de difracción, diodos en serie,
o transformada de Fourier. También, se puede disponer de instrumentos más sen-
cillos y baratos que constan de uno o más filtros de interferencia.
Aplicaciones en bebidas. La técnica NIR se ha utilizado para la determinación
on-line de ciertos constituyentes en bebidas alcohólicas como cerveza, vino y
licores; bebidas sin alcohol como zumos de fruta, te y refrescos; y otros produc-
tos como fórmulas nutricionales para niños y adultos. Algunas de estas aplica-
ciones se explican a continuación.
Recientemente, Zeaiter y col. (2006) aplicaron la espectroscopia Vis/NIR a la
monitorización en línea del contenido en etanol durante la fermentación alcohó-
lica del vino. Para su determinación, las muestras fueron escaneadas en el modo
de transmisión en el rango de 200-2.500 nm, a intervalos de 2 nm, empleando un
espectrómetro NIR. Para la calibración, desarrollaron modelos de regresión por
mínimos cuadrados parciales (PLS); y para corregir los modelos de predicción,
utilizados en los procesos de monitorización basados en métodos espectroscó-
picos, se aplicó la proyección ortogonal dinámica (DOP). Los resultados mos-
traron que este método mejora la robustez del modelo de calibración. La espec-
troscopia NIR, combinada con el análisis multivariante (PCA, DPLS (mínimos
cuadrados parciales discriminantes) y LDA), se ha empleado para la monitoriza-
ción del proceso de fermentación de vino tinto (Cozzolino y col., 2006). Las
muestras (n=652) fueron tomadas a diferentes tiempos de varias fermentaciones
a escala piloto y escaneadas en modo transmisión entre 400 y 2.500 nm. Los
resultados obtenidos indicaron que, independientemente de la variedad o la
284
cosecha, las muestras pertenecientes a un tiempo de fermentación dado pueden

ser clasificadas correctamente.
Además, también se puede evaluar el contenido en sólidos solubles y totales
durante el procesado en continuo de zumos de fruta (Singh y col., 1996). Estos
autores compararon tres sensores in-line: NIR, microsonda guiada y refractóme-
tro Maselli. Los resultados mostraron que los sensores NIR y la microsonda
guiada son mejores para evaluar los sólidos solubles y totales y que el refrac-
tómetro Maselli es excelente para predecir sólidos solubles bajo diferentes con-
diciones de operación. Por otro lado, la espectroscopia NIR permitió a Legrand
y col. (1995) establecer un método rápido y potente para detectar adulteracio-
nes en zumos de fruta sin necesidad de conocer la composición química de las
muestras.
Aplicaciones en manzanas y derivados. Leon y col. (2005) aplicaron la espec-
troscopia de transflectancia NIR para la detección de adulteraciones en muestras
de zumo de manzana. Evaluaron dos tipos de adulteraciones: adición de sirope
de maíz, alto en fructosa, y de azúcar. Se utilizó el método de regresión DPLS.
Los resultados mostraron que la certeza en la detección de zumo de manzana
auténtico y zumo de manzana adulterado fueron 86-100 % y 91-100 %, respec-
tivamente, dependiendo del tipo de adulterante y del nivel de adulteración.
Mediante el desarrollo de un dispositivo de adquisición basado en la espec-
troscopia NIR, Zou y col. (2007) determinaron el contenido en sólidos solubles
(SSC) de manzanas “Fuji”. Con este equipamiento se recogió el espectro NIR
mientras se hacía girar la manzana. Previamente, se seleccionaron los interva-
los del espectro óptimos por un procedimiento basado en mínimos cuadrados
parciales (PLS). Los resultados demostraron que este método es muy útil y efi-
caz para desarrollar modelos de alta precisión (error cuadrático medio en la pre-
dicción de 0,42 ºBrix) basados en regiones de longitud de onda óptimas.
Temma y col. (1996) examinaron la posibilidad de utilizar la espectrosco-
pia NIR para medir el contenido de azúcar en manzanas y zumos de manzana y
desarrollaron un instrumento compacto portátil para la medida de azúcar. Obtu-
vieron coeficientes de correlación de tan solo 0,84 y un error cuadrático medio
en la predicción de 0,71 ºBrix. Estos autores (Temma y col., 2002) mejoraron
seis años después su dispositivo, utilizando el tratamiento de la segunda deriva-
da para eliminar el ruido de fondo y obteniendo coeficientes de correlación supe-
riores a 0,94 y un error cuadrático medio inferior a 0,55 ºBrix. Con el fin de
mejorar la robustez en la determinación del contenido de azúcar en manzanas,
Sanchez y col. (2003) llevaron a cabo un estudio de la influencia de la tempera-
tura de la fruta y del espectrómetro y la luz ambiente sobre la validación del
método analítico. Los resultados demostraron que los dos primeros parámetros
afectaban a la precisión de la predicción, la temperatura de la fruta a través de un
modelo no lineal en el rango de temperaturas considerado, y la temperatura del
espectrómetro por medio de una función lineal entre 4 y 30 ºC. Controlando estos
285
parámetros consiguieron un error cuadrático medio en la predicción muy bajo,

tan solo de 0,073 ºBrix. El último avance en el análisis mediante NIR consiste
en utilizar la Transformada Wavelet (WT), que ha demostrado ser una eficaz y
potente herramienta en el tratamiento de datos debido a su localización dual.
Consiste en una evolución del análisis clásico por transformada de Fourier, per-
mitiendo la localización conjunta en los dominios de tiempo y frecuencia. Ying
y col. (2004) demostraron que el empleo de la transformada Wavelet mejoraba
la precisión en la predicción para la cuantificación del contenido de azúcar en
manzanas intactas.
Najam-ul-Haq y col. (2006) establecieron un sistema NIR para la determi-
nación del aminoácido L-lisina en zumo de manzana, previa separación por cro-
matografía en capa fina (TLC). Por su parte, Rodriguez-Saona y col. (2004)
utilizaron la espectroscopia NIR para evaluar la contaminación bacteriana por
E. coli en zumos de manzana y Reid y col. (2005) consiguieron diferenciar zu-
mos en manzana en función de la variedad de manzana y el tratamiento térmico
empleado.
Picinelli Lobo y col. (2006) optimizaron seis modelos de calibración fiables
para el análisis de rutina de diferentes parámetros en sidra (peso específico, aci-
dez total y volátil, grado alcohólico, pH y fructosa). La selección de las regiones
espectrales más adecuadas y los tratamientos matemáticos se optimizaron
tomando como criterio el valor de la suma de los cuadrados de los residuales de
la predicción, que mide la capacidad de predicción del modelo.
Inconvenientes de las técnicas NIR en análisis de alimentos. Aunque los cos-
tes de operación de NIRS son bajos, la instrumentación necesaria tiene un precio
elevado, lo que limita su aplicación práctica. Los esfuerzos de los investigadores
y de las organizaciones industriales para desarrollar instrumentos sencillos y a
bajo coste podrán revolucionar el uso de las técnicas NIR para la monitorización
en línea de alimentos.
Algunos modelos de calibración basados en la espectroscopia NIR, especial-
mente para aplicaciones en línea, no son fiables ni estables en la práctica. Por
ello, para los investigadores es prioritario seleccionar las herramientas quimio-
métricas adecuadas que construyan modelos robustos. En muchos casos, los mé-
todos convencionales no pueden ofrecer una solución satisfactoria a un proble-
ma por la complejidad de los datos. Por ello, también se necesita el desarrollo de
nuevos métodos quimiométricos para mejorar la fiabilidad y exactitud de los
modelos de calibración.
Además, hay otras limitaciones en la técnica de espectroscopia NIR, ya que
no es sensible al contenido mineral al no producirse absorción en la región NIR
del espectro. Una alternativa para solventar este inconveniente consiste en com-
binar diferentes técnicas de detección con la espectroscopia NIR, tales como la
fluorescencia de rayos-X y luz UV. En los últimos años, se han publicado varios
artículos describiendo el uso de técnicas combinadas que utilizan diferentes
métodos de detección (Cimander y col., 2002; Navratil y col., 2004).
286
La técnica NIR está aceptada ampliamente como una de las más prometedo-
ras herramientas analíticas para el control de procesos en línea. Es una técnica no
destructiva, fiable y exacta para monitorizar parámetros físicos y químicos
durante el procesado de alimentos. Además, vale la pena mencionar que la apa-
rición de sondas de fibra óptica mejora considerablemente la capacidad de las
técnicas NIR para monitorizar y controlar procesos, utilizando la detección
on/in-line remota.
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11. Elaboración de la sidra artesana
La materia prima: maduración, mezcla y condiciones higiénico-sanitarias

Maduración. La maduración es una etapa clave que influye notablemente en
la calidad tecnológica de la manzana destinada a la producción de la sidra.
Algunos componentes del fruto que influyen en el proceso de elaboración de la
sidra, como los azúcares, los ácidos orgánicos, los compuestos nitrogenados, los
polifenoles, las sustancias pécticas, los aromas, etc., experimentan notables cam-
bios a lo largo de la maduración.
La figura 1 recoge la evolución de los azúcares de la manzana en el transcur-
so del desarrollo y maduración de ésta. Como se puede observar, la fructosa y la
sacarosa se acumulan en la fase final de la madurez y el almidón disminuye, lo
que origina el incremento final de la glucosa.
Figura 1.–Evolución de los azúcares a lo largo de la maduración de la manzana (p: peso)
299
Por otro lado, una proporción de los azúcares sintetizados en la hoja y trans-
portados al fruto se convierte en almidón y ácido málico. Este ácido es almace-
nado, inicialmente, en el fruto y, posteriormente, se transforma parcialmente en
azúcares. En consecuencia, en la fase final de la maduración disminuye el ácido
málico (y la acidez, ya que este ácido es el mayoritario de la manzana), se acu-
mulan los azúcares y se degrada el almidón.
Otros componentes de interés tecnológico, como los polifenoles, el nitrógeno
y las pectinas, experimentan cambios importantes en las proximidades del
momento de maduración óptimo. Se ha observado que la concentración de los
compuestos fenólicos y el nitrógeno alcanza un mínimo con anterioridad a la
acumulación de los azúcares y el contenido de pectina aumenta notablemente en
el momento óptimo de madurez.
Los compuestos volátiles evolucionan significativamente durante la madura-
ción de la manzana. A modo de ejemplo, conviene destacar la existencia de un
máximo de la concentración de 1-hexanol, hexanoato de hexilo, butirato de hexilo
y acetato de isoamilo con posterioridad al pico climatérico (máxima producción
de anhídrido carbónico).
La transformación del fruto en su momento óptimo de madurez es muy
importante, habida cuenta de los cambios que experimentan los componentes del
fruto en la maduración. Es el caso, por ejemplo, de los azúcares (aportan dulzor
y son sustratos de la fermentación alcohólica), el ácido málico (componente res-
ponsable de la acidez, sustrato de la fermentación maloláctica y regulador del
crecimiento y desarrollo microbiano), los polifenoles (comunican color, astrin-
gencia y amargor y son precursores de fenoles volátiles), las pectinas (intervie-
nen en los procesos de clarificación), los compuestos nitrogenados (son factores
de crecimiento para los microorganismos) y los componentes volátiles (contri-
buyen al aroma del producto).
Para determinar, de un modo sencillo, el estado de madurez de la manzana se
puede utilizar el test de Lugol. Esta prueba mide el nivel de almidón del fruto a
través de una escala, siendo una de las más utilizadas la de 10 valores (figura 2).
Mediante la aplicación de una disolución de yodo al fruto, se consigue desarro-
llar una coloración azul que está producida por la presencia de almidón. El color
es más intenso a medida que la concentración de almidón es mayor y se produ-
ce una decoloración cuando el almidón se transforma en azúcares más sencillos.
La degradación del almidón comienza desde el corazón del fruto y se desplaza
por la pulpa hacia la periferia (figura 2).
El protocolo de este ensayo analítico es como sigue: a) seccionar el fruto por
la zona ecuatorial; b) de cualquiera de las dos partes cortar una rodaja de 5 mm.;
c) verter sobre una placa de 10 cm de diámetro y 3 cm de altura una disolución
de yodo/yoduro potásico (6,6 g de yoduro potásico y 3,3 g de yodo en 1 L); d)
colocar la rodaja de manzana sobre la disolución de yodo/yoduro de tal forma
que quede impregnada solamente la cara inferior; e) esperar cinco minutos,
300
observar la coloración de la cara inferior de la rodaja y comparar con la escala

para determinar el índice de almidón.
La recolección de la manzana se realizará en un estado de maduración tecno-
lógica próximo al óptimo (nivel de almidón C5-C7, figura 2, en función del tipo
de variedad), evitando un almacenamiento prolongado en sacos, en particular, si
las condiciones sanitarias e higiénicas de la materia prima no son las adecuadas,
la temperatura ambiente es alta (T>12º C) y si se ha efectuado una recolección
mecánica del fruto; ello permitirá recoger la manzana con un nivel de dureza ele-
vado que limite los daños derivados de su manipulación durante la fase de reco-
lección, transporte y almacenamiento, lo que reducirá el desarrollo de microor-
ganismos que producen micotoxinas y aromas desagradables que se incorporan
al mosto.
A continuación, las manzanas serán almacenadas en el “llagar”, fuera de los
sacos, hasta alcanzar la madurez tecnológica óptima (nivel de almidón D8-D10,
figura 2). Cuando ésta se haya alcanzado se realiza el procesado de la manzana.
El nivel de almidón elegido para la transformación del fruto, dentro del interva-
lo D8-D10 (figura 2), es función del comportamiento varietal en cuanto a su
dureza. Hay que realizar el procesado de los frutos con un nivel de firmeza que
permita llevar a cabo una eficiente etapa pre-fermentativa.
Mezcla. Una vez que los frutos han madurado, se mezclan con el objeto de
conseguir una composición equilibrada de los componentes de interés tecnológi-
co. En la figura 3 se recogen algunas variedades amparadas y reconocidas por la
Denominación de Origen Protegida “Sidra de Asturias”.
La mezcla debe contener una proporción equilibrada entre las variedades que
aportan acidez (ácidas, aciduladas, etc.) (40%), dulzor (dulces) (40%) y amargor
(amargas, dulce-amargas, etc.) (20%). Es conveniente realizar un control analíti-
co de la mezcla de manzana, determinando la acidez total (ver anexo 1) y los
compuestos fenólicos. También, es necesario analizar el nitrógeno asimilable
(ver anexo 1), al tratarse de un nutriente que influye de manera muy significati-
va en el desarrollo del proceso fermentativo y la maduración de la sidra.
Condiciones sanitarias y de higiene. Los frutos destinados a la elaboración de
sidra y otros derivados de la manzana, como el zumo, deberán estar en condi-
ciones higiénico-sanitarias óptimas. La manzana será cuidadosamente seleccio-
nada a fin de no incorporar frutos dañados o con podredumbre y el fruto deberá
lavarse. En este sentido, no debe olvidarse que las bacterias acéticas y lácticas y
las levaduras oxidativas y débilmente fermentativas son aportadas por la manza-
na, especialmente cuando el fruto está dañado o no presenta buenas condiciones
higiénicas. Por el contrario, la presencia en el fruto maduro de las especies de
levaduras más fermentativas, como Saccharomyces, es menos probable.
Las bacterias y las levaduras no-Saccharomyces compiten con las levaduras
del género Saccharomyces por los nutrientes del mosto, por lo que si las pri-
meras se encuentran en una proporción importante se limitará el crecimiento y
301
desarrollo de las levaduras fermentativas, lo que conlleva la evolución de fer-

mentaciones no deseables que dan origen a sidras de baja calidad.
La transformación del fruto: etapa pre-fermentativa

Limpieza y desinfección. Antes de elaborar es necesario realizar una limpieza
general de la bodega y, en particular, de la tonelería y maquinaria que va a entrar
en contacto con el fruto y el mosto de manzana.
El local donde se llevará a cabo la elaboración debe estar exento de zonas
mohosas y con olor a vinagre. En caso de existir las primeras, será necesario lim-
piar con una disolución acuosa de sulfato de cobre (1%), cloruro cálcico (1,5%)
y óxido de calcio (cal común) (1%). Las zonas donde haya olor a vinagre se pue-
den limpiar con una disolución de sosa al 4% (Ármas Benítez y col., 1986). En
todo caso, se aplicará a las paredes de la bodega hidróxido de calcio (cal apaga-
da) (2%) para dejarlas limpias.
En relación con la tonelería, hay que resaltar que en la elaboración de la sidra
artesana o de carácter familiar los toneles de madera siguen siendo muy utiliza-
dos, si bien van dando paso a otros materiales como la fibra de vidrio o el acero
inoxidable. La madera tiene el inconveniente de necesitar tediosas labores de
limpieza, al presentar una superficie rugosa y porosa, debido a la posible proli-
feración de distintos tipos de microorganismos como las bacterias lácticas (cau-
santes del “filado”), las bacterias acéticas (responsables del avinagrado) y los
mohos, que pueden conferir a la sidra olores o sabores desagradables (“mugor”).
Además, los toneles de madera necesitan un mantenimiento constante (recalcar,
azuelar, encalar y otras labores). Sin embargo, la sidra elaborada en madera pre-
senta unas características sensoriales únicas que la distingue de las sidras obte-
nidas en otros materiales.
Los recipientes de madera nuevos se someterán a una extracción de los tani-
nos y colorantes, que la madera nueva contiene, para evitar que se incorporen a
la sidra y le comuniquen mal gusto y un color excesivo. Suele hacerse con cal
viva y requiere sumo cuidado y personal experto (toneleros).
Una vez tratados los toneles, se aclaran con agua y se dejan secar para proce-
der a su azufrado (operación que consiste en quemar azufre en el interior del
tonel a una dosis aproximada de 2 g por cada 100 L de capacidad; la combustión
de 10 g de azufre produce, aprox., 13-14 g de SO2), evitando que el azufre se
derrame dentro del tonel. Para el azufrado se pueden utilizar los “azufrines” que
son pastillas de azufre de 5 y 10 g de peso.
Los toneles viejos que han permanecido vacíos durante largo tiempo y los que
han sido reparados no deben ser utilizados para almacenar mosto o sidra sin que
previamente se les aplique un tratamiento específico mediante encalado o cocido.
Los toneles usados que hayan contenido sidra sin aparentes alteraciones micro-
bianas, se lavan con abundante agua y, cuando el recipiente esté seco, se azufran.
302
A. Ligera decoloración central
2 3 4
B. Decoloraciones radiales crecientes
5 6 7
C. Decoloración en aumento de la zona central
8 9 10
D. Decoloración creciente de la periferia
Figura 2.–Test de regresión del almidón
303
Selección de 16 variedades utilizadas en la denominación de origen

protegida de la sidra de Asturias
2.ª Quincena de octubre
San Roqueña Xuanina Blanquina Solarina Coloradona Clara
1.ª Quincena de noviembre
Raxao Meana De la Riega Ernestina
2.ª Quincena de noviembre
Regona Durona de Limón Montés Collaos Perico Verdialona

Tresali
Figura 3.–Algunos ejemplos de variedades acogidas a la DOP “Sidra de Asturias”

(Dapena de la Fuente y Blázquez Noguero, 2009)
Por el contrario, en aquellos toneles que hayan contenido sidra con defectos
se debe seguir el protocolo de limpieza-desinfección siguiente: a) lavado con
agua y sosa al 5% (5 kg de sosa por cada 100 litros de agua), a continuación se
añade una disolución de ácido cítrico al 10-11% (10-11 kg de ácido por cada 100
litros de agua) y por último se enjuaga con agua abundante y se escurre; b) lle-
nado del tonel con una disolución de agua sulfitada al 0,2% (200 gramos de meta-
bisulfito potásico en 100 litros de agua) manteniéndola en el tonel varios días; c)
lavado y llenado del tonel con ácido peracético o peroxiacético y agua a una con-
centración de un litro de ácido por cada mil litros de agua, manteniendo la diso-
lución en contacto con el tonel durante dos días y finalmente se aclara el reci-
piente con agua; y d) una vez aclarados los toneles, se dejan secar y se azufran.
Cuando el tonel huele a moho se limpia con una disolución de detergente (a
base de amonio cuaternario; ver dosis recomendada por el fabricante), a conti-
nuación se lava con una disolución acuosa de cloruro cálcico (10%), luego se
enjuaga con abundante agua, se escurre y se azufra. Los depósitos de fibra y/o
acero se limpian con una disolución de sosa al 2% en agua caliente y se aclara el
tonel con abundante agua hasta lograr la neutralidad de ésta.
La maquinaria y el suelo del “llagar” se lavan con una disolución acuosa de
metabisulfito potásico (2%) y con abundante agua. También, la maquinaria se
puede limpiar aplicando una disolución acuosa de sosa al 4%, luego una diso-
304
lución de amonio cuaternario diluida

(40 mL de amonio cuaternario en 10 L
de agua) y finalmente se enjuaga con
abundante agua hasta desaparición de
la espuma generada por la sal de amonio.
Molienda. La molienda se efectúa,
generalmente, con molinos de marti-
llo con rodillos o de cuchillas con
rodillos que trocean el fruto (figura 4);
el tamaño de la pulpa de manzana es
determinante para conseguir la máxi-
ma eficiencia de la etapa de prensado,
siendo la granulometría elegida inver-
samente proporcional al grado de
dureza que presente el fruto. Por otro
lado, el material que entra en contacto
con la manzana y el mosto debe ser de
acero inoxidable a fin de evitar la in-
Figura 4.–Molino para obtener pulpa de manzana
corporación de metales como el hierro (cortesía de Mª Isabel Alonso Valdés y
y cobre. Ángel Vitienes Amandi)
Prensado. Esta operación se lleva a cabo, generalmente, en prensas de ca-

jón mecánicas o hidráulicas discontinuas (figura 5) que se caracterizan por uti-
lizar un tiempo prolongado de pren-
sado (2-4 días), durante el cual se
llevan a cabo diversos “cortes” de la
masa de prensado con el objeto de
facilitar la extracción del mosto e in-
crementar el rendimiento de esta etapa
(65-75%). Los tiempos de proceso son
variables y dependen de la temperatu-
ra y el estado de madurez e higiénico-
sanitario del fruto. En caso de que la
temperatura sea elevada, la manzana
esté blanda y no sea correcta su cali-
dad higiénico-sanitaria se debe acortar
el proceso de prensado tanto como sea Figura 5.–Prensa tradicional (cortesía sidra Trabanco,
posible. Lavandera-Gijón)
Clarificación. La realización de esta etapa está condicionada por el nivel de

turbidez del mosto. Cuanto más elevada sea ésta, mayor es la formación de alco-
holes superiores y sulfuros (olor a huevos podres) y la velocidad de fermenta-
ción. En estos casos, se debe proceder a clarificar el mosto (ver capítulo 2).
Además de las técnicas descritas en el capítulo 2, también se pueden eliminar
los sólidos mediante desfangado. En este caso, las partículas sedimentan por
305
gravedad durante 10 a 24 horas y, para que sea efectivo, no debe iniciarse la

fermentación, por lo que la temperatura debe ser inferior a 12o C y, además, se
recomienda añadir una pequeña cantidad de anhídrido sulfuroso (2 g/hL).
La fermentación
La fermentación es una sucesión de transformaciones bioquímicas de los
componentes del mosto llevada a cabo por levaduras y bacterias. El proceso más
relevante que se produce, una vez finalizada la etapa pre-fermentativa, es la fer-
mentación alcohólica. Ésta, es realizada por levaduras fermentativas del género
Saccharomyces, existiendo una sucesión de especies (S. bayanus y S. cerevisiae)
durante el desarrollo de este proceso.
También, otros géneros de levaduras con menos capacidad fermentativa que
Saccharomyces, como Hanseniaspora (Kloeckera), están presentes en el mosto
y a lo largo de la fermentación de éste. Durante la fermentación alcohólica, los
azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa) son transformados en un gran número de
componentes bioquímicos entre los que destaca, por su importancia cuantitativa,
el etanol y el gas carbónico. De manera simultánea y, en especial, al comienzo
del proceso fermentativo, una parte de los azúcares (del 5 al 10%) son transfor-
mados en glicerina y ácido pirúvico a través de la fermentación glícero-pirúvica.
La evolución de la fermentación alcohólica se puede conocer mediante el
control de la densidad y la temperatura. A través de este registro se evalúa la
velocidad fermentativa (g/L de azúcar consumido/día) y se detecta el final de
la fermentación que, en el caso de la sidra “natural”, se produce cuando la den-
sidad es inferior a 1.000 g/L. A partir de la densidad inicial del mosto se puede
estimar el grado alcohólico potencial que adquirirá la sidra. Un método sencillo
y aproximado de evaluar, a partir de la densidad, el nivel de azúcares y el grado
alcohólico potencial es como sigue:
a) Azúcares (concentración en g/L) ≈ [D (g/L)-1.000] x 2
b) Alcohol potencial ≈ Azúcares (g/L) x 0,06
A modo de ejemplo, si tenemos una densidad de 1.050 g/L la concentración
aproximada de azúcares sería de (1.050-1.000) x 2= 100 g/L y el grado alcohó-
lico potencial sería de 100 x 0,06= 6. Haciendo un cálculo más riguroso, la con-
centración de azúcares para una densidad D=1.050,0 g/L sería de 107,5 g/L con
un grado alcohólico en potencia de 6,35.
La temperatura de fermentación de la sidra debe mantenerse entre 12 y 14o C.
Una temperatura excesivamente baja al comienzo de la fermentación no favore-
ce un equilibrio apropiado entre levaduras débilmente fermentativas (p.e.,
Kloeckera/Hanseniaspora) y levaduras fermentativas del género Saccharomyces
y, por el contrario, si la temperatura es alta se pierde más gas carbónico y aro-
mas. Cuando la temperatura y el nivel de nitrógeno son elevados, la velocidad de
la fermentación es mayor y la sidra que se obtiene es de inferior calidad. Por el
306
contrario, cuando el proceso fermentativo es lento (por ejemplo, de dos a tres

meses) se obtienen sidras más afrutadas.
Si se produce una parada fermentativa (la densidad permanece constante en
el tiempo) y, en particular, si la temperatura de fermentación no es excesivamente
baja, p.e. T>8o C, es necesario proceder a un control microbiológico y del ni-
trógeno asimilable. Si existe un desequilibrio poblacional entre las levaduras
fermentativas y el resto de microorganismos, es imprescindible activar la fer-
mentación mediante la inoculación de levaduras seleccionadas (pie de cuba) y si
existe un déficit de nitrógeno asimilable, es recomendable añadir una sal de amo-
nio. En esta situación, es muy importante utilizar levaduras adaptadas al nicho
ecológico de la sidra. No hay que olvidar que, dentro de un mismo género y espe-
cie de levadura, las diferentes cepas pueden tener comportamientos tecnológicos
y capacidades de implantación distintos, como es el caso de las levaduras que
presentan el factor “killer”. En caso de que no se disponga de una levadura se-
leccionada para realizar el pie de cuba se puede añadir, al tonel donde se haya
producido la parada fermentativa, mosto en plena fermentación (D≈1.040 g/L,
adicionarlo al 50%).
Por otro lado, se ha observado que algunas cepas de levaduras pueden ser
consideradas como propias de cada “llagar” con lo que, si se precisa realizar un
pie de cuba, hay que incorporar cepas de levaduras correctamente contrastadas
desde un punto de vista tecnológico para elaborar sidra de calidad.
Por otro parte, cuando la fermentación se detiene y existen bajos niveles de
microorganismos y de nitrógeno, entonces cabe considerar que la sidra es esta-
ble desde el punto de vista microbiológico y se puede proceder al embotellado,
obteniéndose sidras con diferentes grados de dulzor. En estos casos, hay que
estar seguros de que la sidra esté correctamente estabilizada, a fin de evitar que
se produzcan alteraciones microbianas, como el “filado”, una vez que esté embo-
tellada.
La evolución de la tasa de microorganismos a lo largo del proceso fermenta-
tivo sigue el modelo de Monod (figura 6), en el que se pueden distinguir seis
fases: 1ª- latencia, 2ª- aceleración, 3ª- exponencial, 4ª- deceleración, 5ª- estacio-
naria y 6ª- declinación. En la fase de latencia la tasa de crecimiento es nula y las
levaduras están adaptándose al medio, comenzando a incrementarse dicha tasa
en la etapa de aceleración. La duración de estas dos fases está en función de las
condiciones existentes en el mosto de manzana para el desarrollo celular. A lo
largo de la fase exponencial (fermentación tumultuosa) la tasa de crecimiento es
constante y máxima. Posteriormente, se alcanzan las fases estacionaria y de
deceleración (fermentación lenta), donde se comienza a detectar una limitación
de los factores de crecimiento.
Durante la etapa de declinación la población de levaduras comienza a dismi-
nuir y se produce su autolisis, liberándose al medio líquido los constituyen-
tes celulares lo que estimula el crecimiento de otros microorganismos como las
307
Figura 6.–Evolución teórica de la tasa de microorganismos durante la fermentación
bacterias lácticas. Éstas son responsables de la fermentación maloláctica (con-

versión del ácido L (-) málico en L (+) láctico más anhídrido carbónico), entre
otros procesos. No obstante, hay que señalar que esta transformación se produ-
ce, generalmente, de manera simultánea con la fermentación alcohólica, salvo
que el mosto experimente una clarificación pre-fermentativa o se le añada anhí-
drido sulfuroso. Este producto es especialmente activo frente a las bacterias lác-
ticas. La fermentación maloláctica es conducida, generalmente, por bacterias
lácticas de la especie Oenococcus oeni (sin. Leuconostoc oenos).
La evolución de la fermentación maloláctica está condicionada por la com-
posición de la sidra (pH, etanol, polifenoles, SO2, etc.), la densidad celular de
bacterias malolácticas, el tipo de levadura que haya llevado a cabo la fermenta-
ción alcohólica y la presencia de bacterias acéticas. En este sentido, conviene
destacar que la flora levaduriforme produce, además de etanol, otros inhibidores
del crecimiento de las bacterias lácticas, como determinados polipéptidos y áci-
dos grasos (hexanoico, octanoico y decanoico); sin embargo, como se ha señala-
do, la presencia de productos de autolisis de las levaduras estimula el crecimien-
to de la flora láctica. Por otro lado, el desarrollo de las bacterias acéticas en los
primeros estadios de la fermentación favorece la fermentación maloláctica.
Esta fermentación produce importantes cambios sensoriales en la sidra, al
llevarse a cabo una notable pérdida de acidez (conversión de málico en láctico)
y un aumento de determinados componentes volátiles, principalmente: ácidos,
ésteres (succinato de dietilo, acetato de etilo, lactato de etilo, etc.) y alcoholes
(1-propanol, 2-butanol, etc.). Además, este proceso promueve una mayor estabi-
lidad microbiológica. Para su control se utiliza un análisis semi-cuantitativo,
mediante cromatografía de papel, de los ácidos málico y láctico (ver anexo 1).
A lo largo del proceso fermentativo se debe proceder al rellenado de los tone-
les y al final de la fermentación puede ser conveniente efectuar un trasiego. Este
proceso tiene por objeto separar las borras de fermentación de la sidra, a fin de
garantizar una adecuada estabilidad físico-química y microbiológica de ésta, y
308
homogeneizar las diferentes sidras que haya en la bodega. El trasiego se debe lle-
var a cabo al abrigo del aire y preferiblemente en días fríos y con alta presión
atmosférica.
La maduración
Una vez realizada la fermentación comienza el proceso de maduración de la
sidra. Los microorganismos mejor adaptados a las condiciones post-fermentati-
vas son las bacterias lácticas y determinadas levaduras no-Saccharomyces (por
ejemplo, Brettanomyces) mientras que las bacterias acéticas, al ser microorga-
nismos aerófilos, tienen mayor dificultad para su desarrollo; sin embargo, hay
que tener en cuenta que si se almacena la sidra en recipientes de madera o exis-
te una cámara de aire en el tonel, puede haber una concentración suficiente de
oxígeno que permita un desarrollo adecuado de las bacterias acéticas y de leva-
duras débilmente fermentativas y oxidativas. No obstante, hay que resaltar que
la actividad microbiana está regulada por la existencia de factores de crecimien-
to y superviviencia y por la ausencia de toxinas.
En particular, el nitrógeno es uno de los factores de crecimiento más impor-
tantes que influye notablemente en la estabilidad microbiológica de la sidra; de
ahí la importancia de partir de mostos con baja concentración de nitrógeno asi-
milable (inferior a 50 mg/L). En este sentido, conviene señalar que las cepas
autóctonas de sidra pertenecientes al género Saccharomyces están bien adapta-
das a ambientes empobrecidos en nitrógeno. La concentración de este nutriente
está determinada por diversos factores, entre los que cabe señalar los siguientes:
las condiciones agroecológicas del cultivo (en especial, el abonado de la planta-
ción), la variedad de manzana, el estado de madurez e higiénico-sanitario de la
materia prima, el lavado del fruto, el sistema de extracción, la clarificación pre-
fermentativa, la capacidad floculadora de los microorganismos, la filtración, la
centrifugación y el trasiego.
A lo largo de la conservación en el tonel la sidra experimenta una notable evo-
lución sensorial. Con carácter general, se observa un incremento del contenido
de la acidez volátil debido, fundamentalmente, a la actividad de las bacterias lác-
ticas y acéticas que es preciso controlar. Como consecuencia de ello, es necesa-
rio efectuar periódicos registros de dicha acidez con el objeto de conocer el grado
de acetificación de la sidra (ver anexo 1); de este modo, se podrán realizar las
correcciones oportunas en caso de detectar alteraciones microbianas importantes
que puedan limitar la venta del producto elaborado.
Embotellado
Cuando la densidad es inferior a 1.000 g/L y las cualidades aromático-gusta-
tivas y de turbidez del producto así lo aconsejen, se procederá al embotellado de
la sidra. La sidra debe haber experimentado un adecuado proceso de maduración,
309
cuyo final se puede fijar, de manera aproximada, cuando la acidez volátil sea
≥ 1,5 g/L (no sobrepasando el límite legal).
El embotellado se realizará en las mismas condiciones descritas para el tra-
siego. Debe llevarse a cabo evitando el contacto de la sidra con el aire y, antes
de proceder al mismo, es necesario comprobar la estabilidad de la sidra a las oxi-
daciones y a las condiciones de anaerobiosis (baja concentración de oxígeno) que
se producen a lo largo de la conservación en botella.
El oscurecimiento que se puede desarrollar cuando la sidra se mantiene en
contacto con el aire durante algunos minutos puede ser corregido por adición de
10 g/hL de ácido ascórbico (vitamina C) (se estima que 100 mg de ácido ascórbi-
co consumen aprox. 10 mg de oxígeno). Es recomendable que se añada una
pequeña dosis de anhídrido sulfuroso (alrededor de 3 g/hL) junto con el ácido
ascórbico. En algunos casos, además, puede ser necesaria la adición de ácido cítri-
co en una proporción de 50 g/hL. Sin embargo, la medida preventiva más eficaz
es evitar el contacto del mosto y/o la sidra con metales como el hierro y el cobre.
El test de estabilidad, frente a las condiciones de anaerobiosis que se produ-
cen en la botella, se lleva a cabo embotellando una pequeña proporción de sidra
y conservándola durante 15 días a una temperatura comprendida entre 25 y 30o
C. En caso de no detectar alteraciones microbianas que comprometan la calidad
de la sidra se procederá al embotellado.
El tapón de corcho es un elemento básico para conservar adecuadamente la
sidra en la botella, en consecuencia, se deben utilizar tapones de alta calidad, con
la menor porosidad posible y mínima concentración de microorganismos. El
tapón debe evitar la fuga de líquido, y la incorporación de oxígeno a la sidra debe
ser limitada pero no nula. La cámara de aire existente entre el nivel del líquido y
el tapón debe reducirse y el grado de penetración del tapón deberá ser tal que no
se hunda en la botella ni sobresalga de ella. Los tapones de corcho deben con-
servarse en la bodega a una temperatura de 18 a 20o C, evitando el contacto con
malos olores.
Actualmente, se utilizan otros tapones de calidad, como el corcho aglomera-
do, empleado tradicionalmente en las bebidas espumosas. También, se empiezan
a emplear los tapones de plástico o sintéticos por sus prestaciones y costes, aun-
que hay que tener en cuenta que, hoy en día, una parte de los consumidores vin-
cula la utilización del tapón de corcho con bebidas de calidad. Con el empleo de
los tapones sintéticos se evita la alteración denominada “gusto a tapón”, que se
origina como consecuencia de la formación de cloroanisoles (TCA y TeCA)
(nivel de percepción en agua de 0,03 a 4 ng/L).
Alteraciones de la sidra y sus correcciones

Las alteraciones más importantes que se desarrollan en la sidra son de ca-
rácter microbiano y son producidas, generalmente, por levaduras oxidativas y
310
débilmente fermentativas y por bacterias lácticas y acéticas. Dentro del grupo de

las bacterias, los microorganismos que más afectan al deterioro de la calidad
de la sidra son las bacterias lácticas, ya que habitualmente las condiciones de
conservación son microaerófilas y, por tanto, la flora acética y otros microorga-
nismos aerófilos tienen más dificultades para desarrollarse adecuadamente.
A continuación, se describen las alteraciones más relevantes y cómo se debe
proceder para limitar su incidencia y, en su caso, cómo corregirlas para que la
sidra presente las características apropiadas para su consumo.
Picado. Esta alteración, también denominada avinagramiento, es causada por
un grupo variado de microorganismos, desde levaduras no-Saccharomyces hasta
bacterias lácticas y acéticas. Consiste en un incremento excesivo del contenido
de ácido acético. Existen diferentes tipos de picado que se diferencian por el
grupo de microorganismos que lo originan y el mecanismo bioquímico que pro-
duce el ácido acético. Así, por ejemplo, las levaduras pertenecientes a los géne-
ros Hanseniaspora, Pichia, Candida y Brettanomyces incrementan la acidez
volátil (Manzanares y Vallés, 2005).
El desarrollo de estos microorganismos se puede limitar si la materia prima
posee unas correctas condiciones higiénico-sanitarias, y si al inicio del proceso
fermentativo existe una rápida y sólida implantación de levaduras fermentativas
del género Saccharomyces. Las levaduras no-Saccharomycess son sensibles al
sulfuroso, con lo que la aplicación de este producto en el mosto y/o durante
la maduración de la sidra, y la conservación de ésta al abrigo del aire, limita la
acción de estos microorganismos y se reduce la alteración del picado. Sin
embargo, el grupo bacteriano formado por las bacterias lácticas y acéticas es el
principal responsable de esta alteración.
Las bacterias acéticas transforman el etanol en ácido acético. Este proceso
requiere oxígeno, por lo que si la sidra se conserva al abrigo del aire el picado
ocasionado por las bacterias acéticas (picado acético) se reduce notablemente.
Las bacterias lácticas desarrollan esta alteración cuando en la sidra, una vez fer-
mentada, existen restos de azúcar (normalmente fructosa) que al degradarse pro-
duce, entre otros compuestos, ácido acético (picado láctico), ácido D (-) láctico
(en la mayoría de los casos) y, en ocasiones, manitol. La existencia de una peque-
ña proporción de oxígeno favorece el desarrollo del picado láctico. Esta altera-
ción, también, se puede producir durante la fermentación alcohólica, si existe
una proporción elevada de bacterias lácticas y, especialmente, si se produce una
parada fermentativa.
La utilización de una materia prima sana y limpia y el mantenimiento de los
utensilios de elaboración en buenas condiciones higiénicas limita el desarrollo
del picado. Las bacterias lácticas son sensibles al anhídrido sulfuroso, que debe
ser utilizado en el caso de que la acidez volátil se incremente notablemente.
La realización de un trasiego (Blouin y Peynaud, 2006) limita el desarrollo de
las bacterias lácticas al eliminar los nutrientes existentes en las borras, pero hay
311
que tener en cuenta que la realización de esta operación supone una incorpora-
ción de oxígeno que, como se ha señalado, favorece el incremento de la acidez
volátil. Por ello, es conveniente acompañar el trasiego con la adición de 3 g/hL
de sulfuroso y, si fuese necesario, corregir la acidez fija (ver anexo 1) para que
la acción de éste sea más eficaz (un pH bajo dificulta el desarrollo bacteriano).
La temperatura juega un papel importante en estos procesos, por lo que es
conveniente que durante la conservación de la sidra no se supere los 15º C
(Ribéreau-Gayon y col., 2008).
Filado. Es una de las alteraciones más significativas que se pueden desarro-
llar durante la elaboración de la sidra, siendo especialmente peligrosa cuando el
producto está embotellado, que es cuando el nivel de oxígeno es más reducido.
Se caracteriza por un aumento espectacular de la viscosidad que le comunica
a la sidra un aspecto aceitoso, no pudiendo, por ello, ser destinada al consumo
directo. Esta alteración está producida por bacterias lácticas. La viscosidad
observada se produce como consecuencia de la formación de un polisacárido, no
nitrogenado, estructurado a partir de unidades de galactosa, glucosa, manosa,
arabinosa y ácido galacturónico.
Para su corrección, a veces es suficiente la adición de 6 a 8 g/hL de anhídri-
do sulfuroso (12 a 16 g/hL de metabisulfito de potasio), 5 g/hL de tanino enoló-
gico y un ácido orgánico autorizado (cítrico, tartárico), si la acidez fija de la sidra
es baja (corregir siempre que la acidez fija sea < 50 meq/L).
En caso de que la alteración sea muy importante es preciso realizar, previa-
mente, un trasiego con aireación y, posteriormente, proceder al tratamiento seña-
lado anteriormente, incrementando la dosis de metabisulfito y procurando que la
concentración de sulfuroso total no supere el límite legal permitido, de acuerdo
con el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida “Sidra de Asturias”
(100 mg/L).
Una vez embotellada la sidra, es necesario proceder al batido de la misma
y consumirla rápidamente, ya que existe el riesgo de que la alteración pueda
desarrollarse de nuevo. Por ello, es muy importante realizar el test de estabilidad
frente a las condiciones de anaerobiosis antes de embotellar todo el tonel.
En todo caso, es conveniente señalar la importancia de mantener un buen
nivel de limpieza del equipamiento del “llagar” y de los materiales que entran en
contacto con el mosto y la sidra, y emplear una mezcla de manzana que propor-
cione bajo pH (3,5), un adecuado nivel de polifenoles (no inferior a 1 g/L) y baja
concentración de nitrógeno asimilable (inferior a 50 mg/L).
Degradación de la glicerina: amargor y picado alílico/acroleínico. Las bac-
terias lácticas, también, son capaces de metabolizar la glicerina dando lugar a la
alteración denominada Amargor. Esta alteración es consecuencia de la síntesis
de acroleína que, al interaccionar con los polifenoles, produce aductos amar-
gos, detectándose una pérdida importante de compuestos fenólicos en la sidra.
312
La degradación de la glicerina puede provocar un incremento de la acidez volá-

til (picado), ya que se sintetiza ácido acético con formación de 1,3-propanodiol
y/o alcohol alílico; este último, es el producto resultante de la reducción de la
acroleína. En ocasiones, asociado a la presencia de acroleína, se desarrolla un
fuerte olor muy desagradable que imposibilita la venta y el consumo de la sidra.
En estos casos es recomendable proceder a su re-fermentación. Para ello, es sufi-
ciente mezclar al 50% mosto de manzana en plena fermentación tumultuosa
(EXP7-EXP8 de levaduras Saccharomyces) con la sidra alterada. Finalizada la
fermentación, es conveniente sulfitar la sidra, corregir la acidez fija, si ésta es
baja, y consumirla rápidamente.
Gusto a Éster. Las levaduras de los géneros Pichia y Hanseniaspora (Kloeckera),
cuando se desarrollan desmesuradamente, producen importantes concentracio-
nes de los acetatos de etilo e isoamilo, provocando la alteración denominada
“gusto a éster o a pegamento”. En este sentido, cabe considerar que un nivel
correcto de limpieza de la bodega, unas condiciones higiénico-sanitarias adecua-
das de la materia prima, una rápida entrada en fermentación de las levaduras fer-
mentativas del género Saccharomyces y la adición en el mosto de una pequeña
proporción de anhídrido sulfuroso limitan el desarrollo de estas levaduras y, en
consecuencia, la aparición de esta alteración.
Formación de velo. Las levaduras oxidativas de los géneros Candida,
Hansenula y Pichia crecen fundamentalmente en la etapa post-fermentativa, en
particular si existe una cámara de aire en el recipiente, formando un film deno-
minado Velo. Su actividad sobre el etanol produce un incremento de la concen-
tración del ácido acético, acetaldehído, acetato de etilo y acetato de isoamilo. La
alteración se controla evitando que la sidra se conserve en contacto con el aire.
Es muy importante mantener bien llenos los toneles, rellenándolos periódica-
mente.
Framboisé. Esta alteración se pone de manifiesto por la presencia de un sabor
y olor muy desagradables, que es consecuencia de una gran acumulación de ace-
taldehído. Además, en las sidras alteradas se observa una fuerte turbidez que se
debe a la combinación del acetaldehído y los polifenoles. La existencia de un ele-
vado porcentaje de acetaldehído promueve la acumulación de otros componen-
tes que pueden alterar notablemente el aroma de la sidra, principalmente: aceto-
ína, diacetilo y tioacetaldehído. La incidencia de esta alteración se limita con una
baja concentración de nitrógeno asimilable y un pH ácido, jugando un papel
menor el anhídrido sulfuroso, ya que como es conocido, el acetaldehído se com-
bina muy fácilmente con el sulfuroso y cuando éste se une al acetaldehído su
efecto antimicrobiano se reduce (Bauduin y col., 2006).
Formación de fenoles volátiles. La presencia de fenoles volátiles a partir de
una determinada concentración provoca el defecto olfativo denominado “fenola-
do”, que engloba un conjunto de aromas entre los que cabe señalar, “farmacia”,
“especiado”, “cuadra”, “caballo”, “ahumado”, etc. Aunque las bacterias lácticas
tienen la capacidad de formar fenoles volátiles, son las levaduras del género
313
Brettanomyces/Dekkera las principales responsables de esta alteración. Estos

microorganismos son capaces de crecer en condiciones de anaerobiosis estricta
y se han detectado en sidras en la fase de maduración (Morrissey y col., 2004).
Se incorporan a la sidra a través del fruto y de los utensilios y equipamiento de
la bodega por lo que, para limitar su incidencia en la calidad de la sidra, hay que
cuidar las condiciones higiénico-sanitarias de la materia prima y del “llagar” y
en particular se debe poner especial atención a la limpieza de los toneles de
madera, siendo imprescindible su azufrado. También, si la sidra dispone de una
concentración de sulfuroso libre suficiente se limita el desarrollo de estos micro-
organismos durante la fase de maduración.
Otras alteraciones. Las bacterias lácticas transforman el ácido cítrico en ace-
toína y diacetilo, entre otros compuestos; éstos, alteran notablemente las carac-
terísticas sensoriales de la sidra. Por ello, la adición de este ácido orgánico para
corregir la acidez fija de la sidra debe de ir acompañada siempre de la incorpo-
ración de anhídrido sulfuroso. También, este grupo de microorganismos produce
aminas biógenas, como la histamina, que tiene su origen en la descarboxilación
de los aminoácidos.
Recomendaciones para evitar o limitar el desarrollo de las alteraciones

microbianas en la sidra
A fin de evitar o limitar el desarrollo de las alteraciones microbianas en la
sidra, cabe hacer las siguientes consideraciones:
• Blanquear las paredes del “llagar” por medio de una mezcla de cal viva y
sulfato de cobre (10:1).
• Limpieza exhaustiva de los elementos del molino, que entran en contacto
con el fruto y el mosto, y la prensa mediante una solución de sosa al 5%
(5 Kg por 100 litros de agua); a continuación, se elimina la sosa por lavado
con abundante agua, verificando la no existencia de restos de sosa median-
te el control del pH del agua de lavado (por ejemplo mediante tiras de pH).
• Limpieza y mechado de los toneles. Los recipientes de fermentación se
lavan con una disolución de sosa al 5%, se aclaran posteriormente con
abundante agua hasta que el pH sea neutro y, una vez eliminada el agua de
aclarado, se quema azufre en el interior del recipiente a razón de 2 g/hL,
evitando que el azufre líquido entre en contacto con el tonel.
• Lavado y selección de la materia prima; las condiciones higiénico-sanitarias
deben ser óptimas.
• Mezcla apropiada de manzana a fin de tener una concentración suficiente en
ácidos y compuestos fenólicos. El nivel de nitrógeno asimilable debe ser bajo.
• Procesado del fruto en el momento óptimo de maduración tecnológica. La
etapa de maceración en la prensa debe limitarse si la temperatura ambiente
314
es elevada y si las condiciones higiénico-sanitarias de la materia prima no

son las adecuadas.
• En caso de detectarse una proliferación excesiva de bacterias y levaduras
débilmente fermentativas en la etapa pre-fermentativa, es necesario llevar a
cabo una clarificación y, posteriormente, se debe inducir la fermentación
alcohólica con levaduras autóctonas seleccionadas del género Saccharomyces.
También, la sidra alterada se puede mezclar con otra en fermentación que
tenga suficiente cantidad de azúcares fermentables (por ejemplo, 1.040 g/L
de densidad).
• Durante el proceso fermentativo y en todas las operaciones tecnológicas, la
sidra se mantendrá al abrigo del aire. Únicamente, en caso de detectarse
la alteración del Filado será preciso incorporar un cierto nivel de oxígeno,
mediante el trasiego con aireación, con el objeto de facilitar el tratamiento
de esta alteración. Posteriormente, será necesario añadir sulfuroso (por
ejemplo, de 12 a 16 g/hL de metabisulfito de potasio) y tanino enológico
(5 g/hL) y corregir la acidez fija si fuese necesario.
• A lo largo de la etapa de maduración de la sidra hay que realizar controles
periódicos de la acidez volátil, particularmente si la temperatura ambiente
es alta; en caso de observar un aumento de esta acidez, se debe incorporar
sulfuroso en concentraciones moderadas (p.e., entre 3 y 5 g/hL) y si fuese
necesario (acidez fija inferior a 50 meq/L) corregir la acidez mediante la
adición de ácidos orgánicos autorizados (cítrico, tartárico).
315
ANEXO 1
Determinación de la acidez total. La medida de este parámetro se fundamen-
ta en una valoración ácido-base, utilizando sosa 0,1 N. El punto de equivalencia
de la valoración se produce a pH 7 y se emplea el azul de bromotimol como indi-
cador del mismo [cambio de color: de amarillo (pH ácido) a azul-verdoso (pH
alcalino)]. El procedimiento es el siguiente: se toman 10 mL de muestra (si es
sidra hay que desgasificarla, por ejemplo, pasándola por un embudo con algodón
hidrófilo) y se añaden 50 mL de agua destilada y unas gotas del indicador en un
vaso erlenmeyer. Mediante una bureta se añade sosa 0,1 N hasta viraje del in-
dicador. Si V (mL) es el volumen gastado de sosa, la acidez total, expresada en
g sulfúrico/L, es V (mL) x 0,49.
Análisis del nitrógeno asimilable. Se entiende por nitrógeno asimilable la

suma del ión amonio y los aminoácidos libres. Este ensayo se fundamenta en
el descenso de pH que se produce cuando el nitrógeno amínico reacciona con el
formaldehído. La disminución de pH se valora con sosa 0,1 N. El procedimien-
to es el siguiente: a 25 mL de muestra se le añade sosa 1 N hasta alcanzar pH 8.
La parte final del ajuste a pH 8 se hace con sosa 0,1 N. Se añade, a continuación,
6,5 mL de una disolución de formaldehído al 40% (pH 8, se ajusta con sosa 0,1
N), se agita y espera unos minutos. Se valora con sosa 0,1 N hasta alcanzar, de
nuevo, pH 8. Si el volumen de sosa gastado es V (mL), entonces la concentra-
ción de nitrógeno asimilable, en mg/L, es: V (mL) x 56.
Control de la fermentación maloláctica. Este ensayo se lleva a cabo median-

te cromatografía de papel. En un papel Whatman nº 1 (20 x 20 cm) se depositan
las muestras de sidra, separadas unos 3 cm, a una distancia de 4-5 cm del borde
inferior del papel. Se coloca éste sobre una disolución reveladora [50 mL de
disolución de indicador (1 L de butanol más 1 g de azul de bromofenol) más 20
mL de disolución acética (500 mL de acético puro se diluye a 1 L con agua)] de
tal modo que quede impregnado el papel 1,5 cm. La mancha de cada muestra no
debe sobrepasar 1 cm de diámetro. El papel y la disolución reveladora deben per-
manecer en contacto durante tres horas en una cubeta cromatográfica hermética.
Transcurrido ese tiempo se saca el papel y se deja secar en lugar aireado y seco.
Los ácidos se visualizan en color amarillo sobre un fondo azul. El orden ascen-
dente en el que aparecen los ácidos en el papel es el siguiente: parte inferior, el
ácido málico; parte superior, los ácidos láctico y succínico.
Determinación de la acidez volátil (método de García Tena). El ensayo se

fundamenta en la separación de los ácidos volátiles de la sidra, básicamente el
ácido acético, por destilación directa (ver figura 7) y posterior valoración de
éstos con sosa 0,0204 N, utilizando como indicador del punto de equivalencia la
fenolftaleína (solución al 1%). El procedimiento del ensayo es el siguiente: se
destilan 11 mL de muestra, recogiendo secuencialmente en dos probetas dos
volúmenes de destilado: 5,1 mL (1er) y 3,2 mL (2o). A continuación, se realiza la
316
Figura 7.–Destilador utilizado para la separación de los ácidos volátiles de la sidra. (método de García Tena)
valoración del 2º volumen (3,2 mL) con la sosa; se asume que esta fracción del
destilado contiene, aprox., 1/3 de la acidez volátil de la muestra. Si V (mL) es el
volumen de sosa gastado hasta lograr el viraje del indicador, entonces la acidez
volátil (expresada en g de acético/L) es 0,366 x V (mL).
Acidez fija (meq/L): [(acidez total en sulfúrico/49 – acidez volátil en acéti-

co/60) x 1.000].
317
BIBLIOGRAFÍA
Ármas Benítez, R.; Ayerra Balduz, P.; López Arias, M. 1986. Normas prácticas para la elaboración
de vinos en Canarias. Consejería de Agricultura, Ganadería y Pesca. Gobierno de Canarias.
Bauduin, R.; Le Quéré, J.-M.; Coton, E.; Primault, J. 2006. Factors leading to the expression of
“framboisé” in French ciders. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 39, 966-971.
Blouin, J. y Peynaud, E. 2006. Enfermedades y accidentes de los vinos. En “Enología Práctica,
Conocimiento y Elaboración del Vino”, Ediciones Mundi-Prensa, Madrid.
Dapena de la Fuente, E. y Blázquez Noguero, M.D. 2009. Descripción de las variedades de man-
zana de la D.O.P. Sidra de Asturias, SERIDA (editor), Villaviciosa, Asturias.
Manzanares, P. y Vallés S. 2005. Levaduras. No-Saccharomyces. En “Microbiología del Vino”,
Carrascosa, A.V.; Muñoz, R.; y González, R. (coordinadores), A. Madrid Vicente, Ediciones,
Madrid.
in traditional Irish cider fermentations. J. Applied Microbiology, 97, 647-655.
Ribéreau-Gayon, P.; Glories, Y; Maujean, A.; Dubourdieu, D. 2008. Naturaleza química, origen y
consecuencias de los principales defectos organolépticos. En “Tratado de Enología 2. Química
del Vino, Estabilización y Tratamientos”, Ediciones Mundi-Prensa, Madrid.
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Tecnología de la elaboración de sidra. Equipamiento industrial

Chapter · January 2010

Luis A. García Mónica Herrero

SEE PROFILE SEE PROFILE

Experimental Sciences Didactics View project

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2. Procesos pre-fermentativos ............................................................................................ 39

3. Bioquímica de los procesos de transformación del mosto de manzana

4. Microbiología de la sidra.................................................................................................. 105

5. La evaluación sensorial .................................................................................................... 137

6. Clarificación y estabilización de la sidra .................................................................. 175

7. Tecnología de la producción de sidra. Equipamiento industrial .................. 197

8. Sidras espumosas.................................................................................................................. 221

9. Físico-Química de la espuma. Propiedades espumantes .................................. 235

10. Técnicas instrumentales en el control de proceso de la sidra ........................ 253

11. Elaboración de la sidra artesana .................................................................................. 299

Los editores quieren agradecer, en primer lugar, a Daniel Díez Llorente y

Finalmente, queremos expresar nuestro máximo agradecimiento al inolvida-

Breve repaso a la estructura de la célula vegetal y sus funciones

Figura 1.–Célula vegetal

Composición de la manzana: descripción de sus componentes más relevantes

Azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos: biosíntesis. La fotosíntesis y la

La degradación del ácido málico se puede producir en la mitocondria, incor-

Figura 2.–Biogénesis de aromas en frutos (Baldwin, 2002)

la acil-CoA reductasa y el aldehído se convierte en alcohol mediante la alcohol

Otros ésteres y alcoholes de número impar de átomos de carbono se pueden

recibida por el fruto, la temperatura (las variaciones térmicas estimulan la sínte-

familias de polifenoles a lo largo del fruto no es homogénea. Así, por ejemplo,

supone 0,26 TOSC, se deduce que la casi totalidad de la capacidad antioxidante

singulete (1O2), el peróxido de hidrógeno (H2O2) o el ozono (O3); este conjunto

H2O2 + Fe (II) → OH• + OH- + Fe (III)

Figura 5.–Modelo de pared celular de acuerdo con Carpita y Gibeaut (1993)

El xiloglucano forma parte del grupo de las hemicelulosas. La mayoría de los

α-L-ramnosa y α-D-galacturónico, enlazados del modo siguiente: (1→2)-α-L-

1993; José-Estanyol y Puigdomènech, 2000). En las primeras, la hidroxiprolina

la menor ramificación que presentan las pectinas de la lámina media en relación

El etileno. La hormona de maduración

Figura 8.–Biosíntesis del etileno. SAM: S-adenosilmetionina; ACCS: 1-aminociclopropano-1-carboxilo sinte-

En la biosíntesis del etileno concurren tres enzimas importantes: la S-adeno-

aumento de la tasa de respiración que acompaña al proceso de maduración de

desarrollo de la manzana, como consecuencia de la fotosíntesis y de la transfor-

fenólicos (Morán, 1990; Blanco y col., 1992). La reducción del contenido de

La solubilización de la pectina podría estar justificada por la síntesis de nue-

Bloque tecnológico Acidez (g H2SO4/L) Taninos (g ácido tánico/L)

Amargo <3,29 >2,00

Variedad Bloque tecnológico

Durona de Tresali Ácido

Condiciones de higiene y sanidad de la materia prima y su efecto

La patulina es una micotoxina producida por hongos de los géneros Peni-

En este tipo de molino existe una gran variabilidad de tamaño de partícula y el

La eficiencia de la extracción mejora notablemente con un tratamiento con

Los sistemas de prensado más habitualmente utilizados en la industria de la

mente proporcionales al cuadrado del espesor inicial de la torta de prensado

propiedades sensoriales del mosto escurrido y el que finalmente se obtendrá me-

La astringencia, por el contrario, está fundamentada en las interacciones por

en el mosto de manzana los ácidos fenólicos (moléculas menos hidrófobas que

Clarificación pre-fermentativa: mecanismos y efecto sobre la composición

dades: pectín metilesterasa (PME), endo-poligalacturonasa (endo-PG) y pectín

Figura 4.– Sistema de flotación para la clarificación pre-fermentativa. P: presurizador

mayoritarios de la fracción polisacarídica de los mostos despectinizados. La ga-

pre-fermentativo utilizado, detectándose la mayor reducción cuando se utiliza la

La pared celular: composición y funciones

La membrana celular: composición y mecanismos de transporte