PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE COMPLEJOS PROTEICOS DEL RECEPTOR

ACOPLADO A PROTEÍNA G EN CONDICIONES NATIVAS

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen la familia más grande de receptores
de membrana y son de gran importancia terapéutica. La identificación de proteínas asociadas a
GPCR es un paso importante hacia una mejor comprensión de estos receptores. Sin embargo,
los métodos actuales no son satisfactorios ya que solo los dominios de receptores aislados
(bucles intracelulares o colas carboxilo terminales) pueden usarse como "cebo". Presentamos
aquí un método basado en purificación de afinidad en tándem acoplada a espectrometría de
masas que supera estas limitaciones ya que la totalidad el receptor se usa para identificar
complejos proteicos formados en células de mamíferos vivos. Los receptores humanos de
melatonina MT1 y MT2 se eligieron como modelos de GPCR. Ambos receptores se marcaron con
la etiqueta de purificación de afinidad en tándem en sus colas carboxilo terminales y se
expresaron en células 293 de riñón embrionario humano. Se optimizaron las condiciones de
solubilización y purificación del receptor. El método fue validado por la co-purificación de
proteínas Gi, que son socios de interacción de GPCR bien conocidos, pero que son difíciles de
identificar con los ensayos de interacción proteína-proteína actuales. Se identificaron varias
proteínas asociadas a MT1 y MT2 nuevas y funcionalmente relevantes; algunos de ellos eran
comunes a ambos receptores, y otros eran específicos para cada subtipo. Tomados en conjunto,
nuestro protocolo permitió por primera vez la purificación de proteínas asociadas a GPCR en
condiciones nativas en cantidades adecuadas para el análisis de espectrometría de masas.

Con más de 800 miembros, los GPCR1 constituyen la mayor familia de receptores de membrana
(1, 2). Responden a una amplia variedad de estímulos extracelulares y son el objetivo de
aproximadamente la mitad de los medicamentos recetados para enfermedades humanas (3).
Los GPCR son controladores clave de los procesos fisiológicos, como la neurotransmisión, el
metabolismo celular, la secreción, la diferenciación celular y el crecimiento. La topología
prototípica de los GPCR consiste en un segmento extracelular amino terminal, un núcleo
hidrofóbico de siete hélices transmembrana (7TM) que interaccionan entre sí para formar un
barril tridimensional dentro de la membrana plasmática y una cola carboxilo terminal citosólica
(C -cola). Mientras que los aminoácidos dentro del núcleo 7TM extracelular y / o hidrófobo del
receptor están implicados en la unión del ligando, el dominio intracelular del receptor
compuesto por tres bucles y la cola C es importante para la transducción de señal (4).

Se han usado varias estrategias para identificar complejos asociados a GPCR. Los primeros
trabajos utilizaron columnas de afinidad con ligandos biotinilados para purificar los complejos
de proteína del receptor G de la somatostatina de los tejidos (5). Posteriormente, basado en el
trabajo pionero de Husi et al. (6), se llevó a cabo un análisis proteómico más sistemático de los
complejos proteicos asociados a GPCR utilizando anticuerpos específicos del receptor (7). Sin
embargo, la aplicación general de estos enfoques se vio limitada por la disponibilidad de
herramientas adecuadas (ligandos marcados, anticuerpos, etc.) para cada GPCR. Más tarde, los
dominios intracelulares aislados se usaron ampliamente para identificar proteínas asociadas a
GPCR como cebo en pantallas de dos híbridos de levadura o para generar matrices de afinidad
para la purificación de proteínas que interactúan a partir de extractos celulares (8-11). Usando
la cola C completa del receptor 5HT2c expresada como proteína de fusión GST, se han
identificado más de 15 proteínas (12). Además, se han usado con éxito motivos de interacción
proteína-proteína aislados tales como motivos de reconocimiento de dominio PDZ de GPCRs
para identificar parejas que interactúan con los motivos de reconocimiento de dominio PDZ de
los receptores 5HT2a, 5HT2c y 5HT4 (13, 14).
Aunque se pudieron identificar varias proteínas que interactúan con GPCR, estos métodos
obviamente tienen limitaciones importantes ya que los subdominios receptores aislados 1) no
imitan la topología de GPCR (dominio 7TM, disposición de bucles intracelulares y cola C y
oligomerización de receptores), 2) hacer no proporcionan un entorno de membrana adecuado,
y 3) no permiten el reclutamiento de complejos de proteínas tras la activación del agonista. No
es sorprendente que las parejas de interacción bien conocidas de los GPCR, tales como las
proteínas G heterotriméricas, sean difíciles de identificar usando estas técnicas.

Recientemente se ha descrito un método de purificación por afinidad en tándem (TAP) (15). Es

importante destacar que este método supera las limitaciones antes mencionadas y se puede
aplicar potencialmente a cualquier proteína. La proteína de interés de longitud completa se
puede expresar en células de mamífero donde se conservan la localización subcelular y las
modificaciones postraduccionales. Además, el reclutamiento de complejos proteicos puede ser
inducido por tratamiento de las células con diferentes compuestos hormonales o
farmacológicos. Para realizar una purificación por cromatografía de afinidad en dos pasos de
complejos formados en células intactas, el método TAP se basa en la presencia de una etiqueta
TAP compuesta por dos dominios de unión a IgG, un sitio de escisión de proteasa de virus de
tabaco (TEV) y un dominio de unión a calmodulina (dieciséis). El método TAP se ha utilizado con
éxito para la identificación de alto rendimiento de proteínas solubles involucradas en complejos
que interactúan en levaduras y células de mamíferos (17, 18). Sin embargo, la purificación de los
complejos proteicos de membrana en general y de los complejos asociados a GPCR en particular
no ha tenido éxito.

En el presente estudio, desarrollamos un método de TAP modificado adecuado para la

purificación de complejos asociados a GPCR. Los receptores humanos de melatonina MT1 y MT2
se eligieron como modelos de GPCR. Ambos receptores se marcaron con la etiqueta TAP en sus
colas C, y se establecieron clones estables correspondientes en células HEK 293. La solubilización
y purificación del receptor se optimizó en experimentos a pequeña escala, y los complejos
asociados a receptores se purificaron a partir de experimentos a gran escala y posteriormente
se identificaron mediante nano-LC-nanoESI MS / MS.
RESULTADOS Y DISCUSIONES

Expresión funcional de las proteínas de fusión MT1-TAP y MT2-TAP en células HEK 293

Los receptores de melatonina MT1 y MT2 humanos se marcaron con la etiqueta TAP en sus colas
C, y se establecieron clones estables correspondientes en células HEK 293. Las células HEK 293
son de origen humano, están extremadamente bien caracterizados en términos de transducción
de señal GPCR, pueden producirse en cantidades que son compatibles con el análisis
proteómico, y no expresan cantidades significativas de receptores de melatonina endógenos. El
análisis de transferencia de Western con anticuerpos específicos del receptor reveló bandas
inmunorreactivas al tamaño molecular esperado de 85 kDa en un clon HEK-MT1-TAP que
expresa 1,0? 0,2 pmol de MT1-TAP / mg de proteína (n? 3) y en un clon HEK-MT2-TAP que
expresa 340? 41 fmol de MT2-TAP / mg de proteína (n? 3) (Fig. 1, ayb). Las constantes de afinidad
(Kd) del agonista del receptor de melatonina [125I] MLT fueron 85? 53 (n? 3) y 267? 78 pM (n?
3) para MT1-TAP y MT2-TAP, respectivamente, que están de acuerdo con los valores
previamente informados para los receptores de tipo salvaje (25). La expresión de los receptores
en la superficie celular se evaluó mediante microscopía de fluorescencia usando anticuerpos
específicos del receptor (Fig. 1, c-f). Los receptores marcados con TAP y de tipo silvestre se
expresaron todos en la membrana plasmática de los clones HEK 293 transfectados de manera
estable. La incubación de los clones HEK-MT1-TAP y HEK-MT2-TAP con melatonina condujo al
aumento transitorio esperado de la fosforilación de ERK1 / 2, que era comparable a la obtenida
para los receptores de tipo salvaje (Fig. 1g). En conjunto, estos datos demuestran que la adición
de la etiqueta TAP no afecta la localización subcelular y la funcionalidad del receptor de
melatonina.

Optimización de la solubilización y purificación del receptor

El paso crucial para la purificación exitosa de los GPCR y las proteínas asociadas consiste en la
solubilización suave pero eficiente de las células para extraer cantidades máximas de complejos
de membrana intactos. Para cuantificar la cantidad de MT1 y MT2 solubilizados, utilizamos
células que expresan receptores MT1 y MT2 marcados con Rluc (luciferasa de Renilla) (19). Estas
células se incubaron durante la noche con concentraciones variables de detergentes, y el
rendimiento de solubilización se determinó midiendo la actividad de la luciferasa en las
fracciones solubles y no solubles (Fig. 2a). La cantidad de receptor solubilizado aumentó en
función de la concentración de detergente y alcanzó los máximos en 50% (CHAPS), 65%
(Brij96V), 70% (digitonina) u 80% (dodecilmaltosida).

Los datos obtenidos con Nonidet P-40 no pudieron analizarse en este ensayo ya que Nonidet P-
40 inhibe la actividad de la luciferasa. Se obtuvieron resultados comparables para MT1-Rluc y
MT2-Rluc. Se usaron concentraciones mínimas de detergente, que proporcionaban una
solubilización máxima del receptor, para estudiar la cinética de solubilización (figura 2b). Ambos
receptores se solubilizaron progresivamente con el tiempo alcanzando una meseta después de
15 h. Para experimentos adicionales, los receptores se solubilizaron con CHAPS al 0,5%,
digitonina, dodecilmaltosida o Nonidet P-40 o con 0,25% para Brij96V durante 15 h.

Para evaluar la integridad topológica de MT1-TAP solubilizado y MT2-TAP, se usó su capacidad

para unir [125I] MLT. Las membranas preparadas a partir de células HEK-MT1-TAP y HEK-MT2-
TAP se marcaron con [125I] MLT. Los receptores se solubilizaron y se inmovilizaron sobre perlas
recubiertas con IgG a través de los módulos de unión a IgG de la etiqueta TAP (figura 2c).
Digitonin y Brij96V se eligieron para experimentos adicionales ya que el 40-50% de los sitios de
unión a [125I] MLT se retenían rutinariamente en microesferas de IgG en estas condiciones.
Usando estas condiciones de solubilización optimizadas, se llevó a cabo todo el procedimiento
de TAP. La purificación de los receptores funcionales se controló en cada paso con el [125I]
ensayo de unión a MLT. El rendimiento global de los receptores marcados con [125I] MLT varió
de 27? 3 (digitonin) a 15? 2% (Brij96V) y de 33? 2 (digitonin) a 25? 5% (Brij96V) (n 5) para MT1 y
MT2, respectivamente (Fig. 3, ayb). La co-purificación de las proteínas asociadas a la
estimulación de melatonina se evaluó por la presencia de la? subunidad de la proteína
heterotrimérica Gi (Gi?) (20, 21). Mientras que Gi? se detectó fácilmente durante la purificación
de MT1-TAP y MT2-TAP solubles en digitonina (figura 3c), Gi? rara vez se co-purificó cuando se
usó Brij96V (no mostrado) porque este detergente aparentemente desestabilizó la interacción
receptor / proteína G. La integridad de la proteína G heterotrimérica se confirmó adicionalmente
mediante la presencia de la subunidad G en la etapa de purificación final en presencia de
digitonina (no se muestra), que se usó para experimentos adicionales.

Purificación e identificación de proteínas asociadas a MT1 y MT2

El objetivo final del procedimiento de etiqueta TAP es la purificación de cantidades suficientes

de receptor para identificar proteínas asociadas mediante análisis de espectrometría de masas.
Para alcanzar este objetivo, se prepararon membranas brutas de? 1 109 HEK-MT1-TAP, HEK-
MT2-TAP y células HEK 293 no transfectadas, y la fracción solubilizada con digitonina se sometió
al procedimiento TAP. Los eluidos se separaron por unidimensional electroforesis en gel, y
dependiendo de los niveles de expresión de receptor, las proteínas se detectaron, ya sea por
Coomassie azul (MT1-TAP,? 1 pmol / mg) o por tinción con plata (MT2-TAP,? 0,3 pmol / mg )
(Fig. 4, ayb). Mientras que solo unas pocas bandas eran visibles en células HEK 293 no
transfectadas (NT), varias bandas de proteína específicas estaban reproduciblemente presentes
en las células que expresan MT1-TAP y MT2-TAP (n? 4). Los carriles se extirparon
sistemáticamente y se digirieron con tripsina, y los péptidos resultantes se analizaron mediante
nano-LC-nano-ESI MS / MS y se identificaron con el software de Mascot en las bases de datos
Swiss-Prot y TrEMBL.

Se detectaron varias proteínas abundantemente expresadas, en su mayoría de origen

mitocondrial o ribosomal, en los tres carriles (NT, MT1-TAP y MT2-TAP) y se clasificaron como
proteínas no específicas. Las proteínas presentes repetidamente en el carril MT1-TAP o MT2-
TAP pero ausentes del carril NT se consideraron específicamente asociadas a MT1 o MT2,
respectivamente (Tablas I y II). Constantemente, ambas proteínas de cebo (MT1 y MT2) se
identificaron en los carriles correspondientes. Cada receptor se identificó en dos regiones, a 45
y 90 kDa, correspondientes a la forma dimérica monomérica y resistente a SDS de los receptores,
respectivamente (26). Esto indica que ambos receptores alcanzaron su estructura cuaternaria
completamente funcional.

De manera importante, la presencia de proteínas G heterotriméricas en complejos asociados a

MT1 y MT2 se confirmó mediante espectrometría de masas. De acuerdo con el conocido
acoplamiento de los receptores de melatonina a las proteínas Gi, los tres Gi? se identificaron
isoformas (péptidos específicos para Gi \ beta 1-3) y dos isoformas G diferentes (péptidos
específicos para G1,4). La co-purificación de proteínas G y receptores valida nuestro método y
proporciona una gran ventaja en comparación con otros ensayos de interacción proteína-
proteína actualmente disponibles en los que la interacción proteína G / receptor generalmente
se pierde. Estos resultados demuestran claramente que nuestro procedimiento puede
identificar proteínas de interacción GPCR funcionalmente relevantes que se asocian solo con
receptores intactos expresados en el entorno de membrana natural.
Se identificaron varias proteínas asociadas al receptor de melatonina previamente
desconocidas. Curiosamente, estas proteínas se localizan en diferentes compartimentos
subcelulares (citosol, membrana plasmática y diferentes compartimentos de la membrana
intracelular, como el retículo endoplásmico). Las proteínas asociadas al receptor de la
melatonina podrían dividirse en tres grupos funcionalmente distintos: proteínas que
probablemente participen en la biosíntesis del receptor, el tráfico intracelular y la señalización
/ regulación de los GPCR (cuadros I y II). La función de las proteínas restantes, clasificadas como
"otras", se desconoce o parece que no se relacionan directamente con la función de GPCR
conocida. Este es el caso de la ribonucleoproteína A0 heterogénea nuclear específica de MT1
que se sospecha que participa en la maduración de ARNm (27) y es un sustrato principal para la
proteína quinasa 2 activada por MAPK, que se activa por estimulación de p38 MAPK promovida
por GPCR (28 )

Filamin A y receptor de insulina sustrato 4 (IRS4) se identificaron como miembros comunes de

complejos asociados a MT1 y MT2. De acuerdo con estos hallazgos, se ha demostrado que la
filamina A interactúa previamente con otros miembros de la familia de los GPCR, incluidos la
dopamina D2 / D3 (29, 30), los receptores de calcio (31, 32) y opioides (33). El papel de IRS4 está
menos documentado. Se ha descrito la implicación de IRS4 en la señalización del receptor del
factor de crecimiento fibroblástico (34) e interactúa con la proteína fosfatasa 4 (35).