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PRÁCTICA 6.
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Y DETERMINACIÓN DE
LA CMI MEDIANTE PANELES COMERCIALES
7.1. INTRODUCCIÓN.
Los paneles de micropocillos que contienen sustratos o distintas
concentraciones de antibióticos, en forma liofilizada o congelada, permiten
identificar bacterias y determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de
varios antibióticos de forma rápida y sencilla.
Es suficiente añadir el inóculo bacteriano al panel (con lo que se hidrata a la
vez el sustrato o el antibiótico), incubar unas 18 horas, y detectar el crecimiento o
las reacciones bioquímicas. La detección puede hacerse en la mayoría de los casos
mediante equipos informatizados, que interpretan los resultados.
El sistema escogido en este caso es el panel Wider MIC/ID para bacterias
Gram-negativas, que permite determinar la CMI de 16 antibióticos por
microdilución en caldo e identificar la bacteria a nivel de especie mediante 26
pruebas bioquímicas.
7.2. Material:
• Colonias aisladas de la bacteria problema.
• Tubo con 3 ml de agua destilada.
• Tubo con 10 ml de agua destilada/0,5% Tween 80.
• Paneles Wider GRAM-NEGATIVOS REV2.
• Aplicador.
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Tabla 7.2. Interpretación de las pruebas bioquímicas del panel Wider REV2
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+ Enterobacter (INDOL−,VP−,LACTOSA+)
Serratia (INDOL−, LACTOSA TARDÍA)
Citrobacter diversus (INDOL+ VP+)
+ Klebsiella ODC
Enterobacter
Serratia Klebsiella (INMÓVIL, UREASA RÁPIDA)
Citrobacter − Citrobacter freundii (MÓVIL, UREASA −/+)
+ Escherichia CITRATO
Klebsiella
Enterobacter + E. coli (MÓVIL, LACTOSA+)
Citrobacter Escherichia LDC
Serratia
− coli − Yersinia (INMÓVIL, LACTOSA−)
Yersinia Yersinia
ONPG + Proteus + Proteus mirabilis (INDOL−,SH2+)
Providencia ODC Morganella morganii (INDOL+, SH 2− )
Morganella − Proteus vulgaris (SH2+)
Providencia (SH2− )
Salmonella APP
Shigella
Proteus + Salmonella (MÓVIL, SH2+)
− Providencia
Salmonella CIT
Morganella
− Shigella − Shigella (INMÓVIL, SH2−)
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Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter aerogenes
Aeromonas hydrophila
Klebsiella pneumoniae
Yersinia enterocolitica
Serratia marcescens
Citrobacter freundii
Providencia stuartii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Salmonella sp.
Shigella sp.
Prueba bioquímica: Siglas:
Oxidasa1 - - - - - - - - - - - + +
Oxidación/Fermentación O/F F F F F F F F F F F F O O
β-galactosidasa ONPG + + + + + + - - - - - - +
2
Producción de Indol IND + - - - - v - v + - + - +
Rojo de metilo RM + - (-) + (-) + + + + + + +
Voges-Proskauer VP - + + - + - - - - v - - -
Producción de SH2 H2S - - - (+) - - + - + + - - +
Ureasa URE - - + v (-) (+) - - + + v v -
APP (TDA) TDA - - - - - - - - + + + - -
Lisina descarboxilasa LYS + + + - + - + - - - - - v
Arginina dihidrolasa ARG (-) - - v - - v - - - - + +
Ornitina descarboxilasa ORN (+) + - (-) + + (+) v - + - - -
Utilización de citrato CIT - + + + + - (+) - (-) v + + -
Utilización de malonato MAL - + + (-) - - - - - - - + -
Utilización de tartrato TAR v + + + (+) (+) + v (+) (+) + v -
Hidrólisis de esculina ESC (-) + + - + (-) - - V - - - +
Producción de ácido a partir de:
Glucosa GLU + + + + + + + + + + + - +
Adonitol ADO - + + - v - - - - - - - -
Arabinosa ARA v + + + - + (+) v - - - - +
Inositol INO - + + - (+) v v - - - + - -
Lactosa + + + v - - - - - - - - v
Melobiosa MEL v + + v - - + v - - - - -
Rafinosa RAF (-) + + v - - - v - - - - -
Ramnosa RHA (+) + + + - - (+) v - - - - -
Sorbitol SOR (+) + + + + + + v - - - - -
Sacarosa SUC (-) + + v + + - - + (-) v - +
(+): habitualmente positivo; (-): habitualmente negativo; v: variable según cepas.
1
Si es necesaria la prueba de la oxidasa debe realizarse por separado (ver apartado 4.4)
2
El pigmento de Serratia marcescens puede simular un falso positivo en la prueba del Indol.
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7.5.2. Antibiograma.
• Aplique la definición de CMI a cada antibiótico, teniendo en cuenta que los
pocillos que aparecen transparentes el crecimiento ha sido inhibido, y en los que
aparecen turbios hay crecimiento. Algunas situaciones dudosas se comentan en
la Figura 7.1.
Figura 7.1. Interpretación del crecimiento para la determinación de la CMI en los paneles Wider.
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PRÁCTICA 7.
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN
5.1. INTRODUCCIÓN
Se describen dos técnicas de aglutinación aplicadas al diagnóstico
microbiológico.
Una de ellas es una aglutinación pasiva, y se utiliza para la identificación de
Staphylococcus aureus.
La otra técnica es una aglutinación directa para el serotipado de Salmonella.
5.2.1. Técnica.
• En una lámina o portaobjetos limpio se deposita una gota de reactivo.
• En ella se emulsiona con el asa una o dos colonias a analizar tomadas de una
placa de medio Chapman-manitol. Se hace rotar suavemente el porta durante
unos segundos.
5.3.1. Material:
• Antisuero
• 1 tubo de solución salina.
• Portaobjetos.
• Pipetas Pasteur.
• Cepa problema.
• Asa de cultivo.
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5.3.2. Técnica:
• Depositar una gota de solución salina en un portaobjetos limpio, con el asa
de cultivo o con una pipeta Pasteur y emulsionar una colonia. Si el
microorganismo está en fase lisa, no deben formarse agrupaciones ni
grumos.
• Depositar una gota de antisuero polivalente en otro portaobjetos, tomar una
colonia con asa de cultivo y emulsionarla hasta obtener una suspensión
uniforme. La lectura se realiza de 1 a 3 minutos, observándose la presencia o
ausencia de aglutinación.
5.3.3. Interpretación:
• Aglutinación con suero polivalente.
Si se ha utilizado un suero polivalente anti-Salmonella, un resultado positivo
confirma la identificación bioquímica. Los sueros polivalentes suelen contener
anticuerpos contra los antígenos representativos de los grupos A, B, C, D y E, y
contra el antígeno capsular Vi. De este modo se detectan los serovares más
comunes, así como Salmonella typhi, que puede dar reacción negativa al
enmascarar su antígeno Vi los antígenos somáticos O.
Un resultado negativo indica que no se trata de Salmonella o que pertenece a
otros serogrupos diferentes, y requeriría su comprobación por un laboratorio de
referencia.
• Aglutinación con sueros específicos.
Para identificar el serovar (por ejemplo, S. typhimurium o S. enteritidis ) es
necesarios utilizar antisueros monovalentes contra antígenos O y H (Tabla 5.1).
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PRÁCTICA 8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Candida albicans
8.1. INTRODUCCIÓN.
En esta práctica se plantea la detección de levaduras patógenas y la
identificación presuntiva de Candida albicans.
La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o
faríngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis.
8.2. MATERIAL:
• Torunda con muestra de exudado.
• Tubo con agua destilada estéril.
• Tubo con 0,5 ml de suero de caballo.
• Una placa de agar-sangre (ver Práctica 1).
• Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para hongos,
debido a su pH ácido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse por adición de
antibióticos antibacterianos, como tetraciclina o cloranfenicol.
8.3. TÉCNICA:
8.3.1. Siembra.
Se realiza con el hisopo según el método ya descrito (Práctica 1). Cuando se
pretende aislar únicamente hongos se empleará el medio de Sabouraud; en caso
contrario se utilizará agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura de
incubación: 25°C para hongos, y 37°C para levaduras y bacterias indistintamente.
8.3.2. Identificación.
Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura.
Pueden observarse en fresco (a 40x) o teñidas por el método de Gram (los hongos
salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x.
8.3.2.1. Prueba de la filamentación:
Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 ó 3 gotas
de esa suspensión y añadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37°C durante
3 horas.
Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos.
8.4. INTERPRETACIÓN.
La morfología celular permite asegurar que se trata de una levadura. La
producción de filamentos permite identificar presuntamente a Candida albicans
(también los produce Candida stellatoidea). La identificación puede confirmarse
mediante pruebas bioquímicas y de necesidades nutricionales (auxonograma).
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BIBLIOGRAFIA
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MIÉRCOLES Gastroenteritis PRÁCTICA 1: LEER PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN. PRÁCTICA 2: LEER PRUEBA DE LA BACITRACINA
infecciosas (1) SEMBRAR PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
HACER INFORME
PRÁCTICA 3: COPROCULTIVO (INDIVIDUAL)
JUEVES Métodos de difusión para el PRÁCTICA 1 LEER PRUEBAS COMPLEMENTARIAS. PRÁCTICA 7: AGLUTINACIÓN DE Staphylococcus
ensayo de la sensibilidad a
PRÁCTICA 3: IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN Y
antibióticos ε−TEST (sobre bacteria del urocultivo)
2ª SEMANA Vaginitis y vaginosis PRÁCTICA 6: INOCULACIÓN DE PANELES WIDER (Y PRÁCTICA 4: PRUEBA CAMP PARA Streptococcus
MOVILIDAD) CON EL AISLAMIENTO DEL PRÁCTICA 8: PRUEBA DE FILAMENTACIÓN DE
LUNES COPROCULTIVO. Candida.
MARTES Métodos de antibiograma PRÁCTICA 6: LECTURA DE LOS PANELES WIDER: PRÁCTICAS 4 y 8: LEER PRUEBAS CAMP Y
por dilución IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA. FILAMENTACIÓN
INFORME DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
APELLIDOS, NOMBRE:
GRUPO: FECHA:
Muestra n°:
Urocultivo
Recuento: colonias/ml
Bacteriuria: Significativa No significativa
Identificación (Práctica 4)
Tinción de Gram:
Aglutinación, si procede:
Resultado de la identificación:
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Antibiograma: (Práctica 6)
Antibiótico:
CMI:
Resultado (S ó R):
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Muestra propia:
Tinción de
Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias: Hemólisis
Gram:
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PRACTICA 3. COPROCULTIVO
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+ –
Aglutinación, si procede:
Abre-
Antimicrobiano CMI S R
viat.
Amoxicilina AMX
Amoxicilina/Clavulánico A/C
Piperacilina/Tazobactam P/T
Cefalotina CF
Cefuroxima CFX
Cefoxitina CX
Ceftazidima TAZ
Cefotaxima CTX
Cefepima CFP
Imipenem IMI
Ertapenem ETP
Meropenem MER
Gentamicina GM
Tobramicina TO
Amikacina AK
Nitrofurantoína FD
Acido nalidíxico NA
Ciprofloxacino CIP
Minociciina MIN
Aztreonam AZT
Trimetoprim/Sulfametoxazol T/S
Fosfomicina FOS
Colistina CL
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En agar-sangre:
1: 1:
2: 2:
En agar Sabouraud:
Resultado de la identificación:
Resultado de la identificación: