PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

PROYECTO PILOTO PARA LA APLICACIÓN DE FITORREMEDIACIÓN

A SUELOS CONTAMINADOS POR METALES PESADOS
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Situación problemática

Uno de los problemas más señalados por la sociedad a nivel mundial y que ocupa un lugar
prominente es la progresiva degradación de los recursos naturales causada por la gran
diversidad de contaminantes tóxicos orgánicos e inorgánicos, tanto en la atmósfera, el agua,
el suelo y subsuelo, procedentes de diversas actividades industriales que generan un
irremediable deterioro en el planeta. Las actividades mineras depositan sus residuos con
metales pesados en la superficie del entorno minero causando la contaminación del suelo, y
representando un problema ambiental de gran preocupación mundial (Alkorta et al. 2010).
Las consecuencias directas de esta contaminación del suelo son la desaparición de la
vegetación, pérdida de su productividad y disminución de la biodiversidad; indirectamente se
menciona la contaminación del aire, y aguas superficiales y subterráneas (Wong 2003).
Actualmente existen estudios tendientes a resolver la contaminación originada por metales
pesados en suelos, mediante estrategias basadas en el uso de plantas que tienen la propiedad
de acumular metales pesados. Este proceso denominado “fitorremediación” consiste en la
remoción, transferencia, estabilización y/o degradación y neutralización de compuestos
orgánicos, inorgánicos y radioactivos que resultan tóxicos en el suelo. Por tal sentido, el
Ministerio del Ambiente, de conformidad con lo dispuesto en la ley 28611, articulo 1, decreta
aprobar los estándares de calidad ambiental (ECA) para suelos (Minam, 2012).

Esta novedosa tecnología tiene como objetivo degradar y/o asimilar los metales pesados
presentes en el suelo, lo cual tiene muchas ventajas con respecto a los métodos
convencionales de tratamientos de lugares contaminados. En primer lugar, es una tecnología
económica, de bajo costo; en segundo lugar, posee un impacto regenerativo en áreas donde
se aplica; y por último, su capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento vegetal
(Harvey et al., 2002).

Por lo expresado, la tecnología de fitorremediación de suelos es factible especialmente con

materia orgánica, como aserrín de bolaina, humus de lombriz, entre otros cuyos costos son
bajos.1

Identificación de situaciones futuras

En general, los suelos originales de las minas se degradan o se pierden irreversiblemente,

generando nuevos suelos modificados formados por materiales poco aptos para el desarrollo
de procesos biológicos (Becerril et al. 2007).
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Actualmente para la recuperación de suelos contaminados con metales pesados se tienen

varias tecnologías (Diez 2008), estas generalmente recurren al uso de plantas metalófitas que
pueden utilizarse en los procesos de fitorrestauración y fitorremediación para recuperar
sedimentos y aguas contaminadas por metales pesados, eliminando los contaminantes del
ambiente o haciéndolos inocuos

Presentación alternativa

La fitorremediación consiste en el uso de plantas para remediar in situ suelos, sedimentos,

agua y aire contaminados por desechos orgánicos, nutrientes o metales pesados, eliminando
los contaminantes del ambiente o haciéndolos inocuos.

Existen las denominadas plantas metalófitas, que han desarrollado los mecanismos fisiológicos
para resistir, tolerar y sobrevivir en suelos degradados por actividades mineras (Becerril et al.
2007). Estas especies pueden restringir la absorción los metales o translocarlos hacia las hojas
o absorberlo y acumularlo activamente en su biomasa aérea (Baker & Proctor 1990). Algunas
plantas modifican las condiciones de la rizósfera produciendo exudados radiculares o la
alterando el pH (Adriano 2001, Wenzel et al. 2003). Los grados de acumulación metálica van
desde trazas hasta más del 1% de la materia seca de la planta (Diez 2008).

Formulación del problema

2. JUSTIFICACIÓN

La limpieza de suelos contaminados por la actividad industrial requiere cuantiosas inversiones

y la fitorrestauración es una alternativa viable en algunos casos. En este proceso se
concentran compuestos y elementos contaminantes en la especie vegetal, se metabolizan y
transforman en otros compuestos. Este mecanismo natural puede tomar un mayor tiempo que
otros procesos, pero reduce impactos ambientales y costos, al tiempo que mantiene la
apariencia natural de la zona afectada (EPA, 1997). Ejemplos de dos contaminantes de origen
industrial que afectan el suelo son el Cd y el Zn.

Los suelos contaminados pueden contener niveles de concentración de Cd superiores a 57

mg/kg y se llegan a encontrar niveles con 160 mg/kg en los alrededores de las industrias
procesadoras de metales (Albert, 1997).

En cuanto al Zn, su contenido en la corteza varía de 17 a 125 mg/kg, los valores más altos se
encuentran en suelos aluviales mientras que los más bajos en suelos orgánicos (histosoles). El
valor promedio es de 64 mg Zn/kg.

Con respecto a la contaminación de suelos, las fuentes antropogénicas de Zn se relacionan

con la industria de metales no ferrosos así como con prácticas agrícolas que involucran la
utilización inapropiada de fertilizantes y biosólidos. Un problema adicional con el Zn son los
cambios en su especiación, por ejemplo, un suelo labrable con pH de 6.1 y 1.25 % de materia
orgánica, acondicionado con biosólidos enriquecidos con Zn, incrementa las especies
disponibles de este elemento de 3% a 21% y las intercambiables de 21% a 34% (Kabata-Pendias
y Pendias, 1992).
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El uso de plantas en el proceso de fitoextracción, son una alternativa para la restauración de

suelos contaminados con estos metales ya que tiene ventajas competitivas en cuanto a costos
(aún cuando no se incluye la incineración en éstos), comparada con otras alternativas.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivos generales

Evaluar la capacidad de asimilación y concentración de cadmio y zinc por especies vegetales

comestibles para su uso en fitoextracción de suelos contaminados con estos metales.

3.2 Objetivos específicos

1. Definir las especies vegetales comestibles para su aplicación en la fitoextracción en suelos

contaminados con cadmio y cadmio-zinc.
2. Evaluar el crecimiento de las especies vegetales de interés en sustratos selectos
controlando parámetros como humedad del suelo, temperatura y humedad relativa.
3. Evaluar la capacidad de bioconcentración y bioasimilación de los contaminantes estudiados
en las especies vegetales cultivadas.

4. MARCO TEÓRICO

4.1 Antecedentes

Existen antecedentes que analizan la presencia de metales pesados altamente contaminantes

en áreas alrededor de centros mineros o lugares donde se haya retirado una compañía
minera. Para estos casos el uso de la fitorremediación es una de las muchas alternativas para
solucionar este problema. En Perú, han realizado muchos estudios concernientes a este tema,
tal es el caso del realizado por (Henostroza et al. 2011) que analizó la concentración de
metales pesados en agua, sedimentos y organismo marinos en la zona costera de Pampa
Melchorita, Cañete y Cerro Azul. Incluso existen estudios que usan sustancias quelantes como
el EDTA y DPTA sobre la vegetación en un suelo contaminado por Cu, Zn y Cd. (Pastor J et. al
2005).Los países de rápida industrialización no son ajenos a este problema, en países en
desarrollo como India, China, Brasil y Bangladesh, ha llevado a una grave contaminación
ambiental y se ha convertido en una amenaza para los ecosistemas locales. La posibilidad de
limpiar el medio ambiente contaminado con la biota de las plantas está atrayendo mucha
atención de los científicos ambientales frente a las costosas tecnologías tradicionales de
limpieza del sitio. Los métodos clásicos, como la excavación, el tratamiento térmico y el
lavado químico del suelo, suelen ser caros y destructivos. (Wenzel WW et. al 2004).
La solución propuesta que es la fitorremediación, uso de plantas adecuadas para limpiar los
sitios contaminados, es una tecnología emergente que emplea el uso de plantas para limpiar
las áreas contaminadas. El cultivo y cosecha de las plantas son procesos baratos comparados
con los enfoques de ingeniería tradicionales que implican una intensa manipulación del suelo.
(Singh N & Ma L 2003)

Debido a los avances tecnológicos, las emisiones de metales por las actividades industriales se
han reducido fuertemente, como consecuencia, las concentraciones de metales en el aire han
disminuido significativamente. Sin embargo, la acumulación de metales en los suelos sigue
conduciendo a mayores riesgos debido a la lixiviación en las aguas subterráneas y
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superficiales, la absorción por las plantas y la ingesta directa o indirecta por la población
humana. Cuando están presentes a niveles aumentados de biodisponibilidad, tanto los
metales esenciales (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni, Mo) como los no esenciales (Cd, Pb, Hg, Cr) son
tóxicos. (Kärenlampi S et. al 2000).

Urtica dioica L. (subespecie dioica), comúnmente conocida como "ortiga" pertenece a la

familia de Urticaceae. Las hojas de las plantas tienen pelos urticantes, causando irritación a
la piel. La planta crece en las regiones templadas en todo el mundo. El hábitat natural
incluye tierra de desecho, setos, maderas, etc., con un crecimiento perenne de 1,2 m por 1 m
a una velocidad rápida. Varios estudios se han realizado sobre la acumulación de metales
pesados (Cu, Zn, Pb, Cd y Hg) en Urtica dioica, pero hay escasez de datos sobre la absorción
de Cr por Urtica dioica. (Khan KS 2006).

Estudios posteriores sobre la Urtica dioica muestra que debido a su mayor absorción de Cr y
su baja producción de biomasa, Urtica dioica, comúnmente conocida como 'Ortiga' puede ser
considerada como la planta adecuada para la remediación de sitios contaminados con Cr.
Como la ortiga crece tanto en climas tropicales y fríos, por lo tanto, su valor como "Nature
Cleaner" es universal. (Khaled M et. al 2010).
Así existen diversos estudios que muestran al girasol, la lechuga y calabacín como agentes que
presentan gran tolerancia al Zn y una absorción selectiva del mismo. (Beltrán M 2001)

4.2 Bases teóricas

Entre los muchos tipos de contaminantes existentes, los metales pesados (MP) y
metaloides destacan por su elevada toxicidad y persistencia, siendo la contaminación
por estos de las más preocupantes por su difícil eliminación del medioambiente, ya que
en comparación con compuestos químicos o biológicos que pueden ser degradados, estos son
indestructibles.
En los países desarrollados la legislación obliga a la recuperación de suelos y aguas
contaminados usando métodos para disminuir su concentración en la biosfera de manera
físico-química o biológica (biorremediación). Además, los metales se encuentran presentes
de forma natural en la tierra a todos los niveles, aunque en los últimos años su
concentración se ha incrementado remarcablemente debido a la actividad
antropogénica. L a actividad humana con la agricultura y la industria han cambiado la
distribución de estos, liberándolos a los ecosistemas y causando serios problemas
medioambientales. Aunque muchos metales son esenciales en cantidades trazas, en
mayores concentraciones son tóxicos. Este tipo de metales son llamados oligoelementos o
microelementos (Fe, Zn, Cu, Co, F, Cr, Mn, I, Mo, Se, V) y son requeridos en cantidades
menores de un 0,1% siendo esenciales para los organismos, que los requieren para
formación de tejidos o de diversas estructuras proteicas como la hemoglobina o las
hormonas tiroideas. El problema aparece cuando la concentración aumenta ya que
pueden volverse muy tóxicos y causar estrés oxidativo, especialmente los metales de
transición que pueden ceder electrones en reacciones redox (Fe 2+/3+, Cu +/2+). Sin embargo,
otros metales y metaloides (Pb, Cd, Hg, As, Ba, Sr, Tl, B, Al, Li, Be, Rb) son tóxicos a
cualquier concentración ya que pueden reemplazar a otros metales en enzimas
interrumpiendo la función de estas moléculas (Hossain y col., 2012).

Tratamiento de residuos industriales contaminados con metales pesados

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Existe un gran número de tratamientos a los que se pueden someter los residuos tóxicos y
peligrosos, cuya finalidad se dirige básicamente a la recuperación de recursos
(materiales y energéticos), la detoxificación, y la reducción de volumen previa a su
disposición final.
Los metales pesados no pueden ser degradados, sino solo inmovilizados para extraerlos desde
matrices sólidas o de soluciones, respectivamente, a fin de disponer de ellos de modo seguro.

Entre las técnicas para tratar física, química y biológicamente estos metales contra la
contaminación se tiene:

Lavado: implica la adición de una solución a los sedimentos contaminados para que
ocurra la transferencia de los contaminantes desde los sedimentos a la solución de lavado.
Es más apropiado para los metales ligados débilmente en forma de hidróxidos, óxidos y
carbonatos.

Precipitación: El método tradicional de eliminación de metales pesados a partir de

soluciones, es la alcalinización del efluente (comúnmente con carbonato o soda cáustica). El
aumento de pH provoca la precipitación de los metales pesados como hidróxidos. Estos
últimos suelen ser precipitados coloidales, por lo que ocupan gran volumen y
coprecipitan con otros elementos. Por ejemplo, se estima que la precipitación como
hidróxido de 100 mg L-1 de Cu(II), Cd(II), Hg(II) producen alrededor de 1000, 900 y 500 mg L -1
de desechos sólidos, respectivamente. La generación de grandes volúmenes de hidróxidos es
claramente un inconveniente en este proceso. También se pueden mencionar otras
limitaciones como, por ejemplo, la baja eficiencia al tratar efluentes diluidos, la
presencia de elementos anfóteros o complejantes en la solución, la necesidad de trabajar con
pH muy altos y la baja selectividad.

Separación pirometalúrgica: los procesos pirometalúrgicos emplean altas temperaturas

para volatilizar metales en suelos contaminados. Temperaturas entre 200-700 ºC son
empleadas para volatilizar los metales. Luego de la volatilización, los metales son
recuperados e inmovilizados. Este método es aplicado a mercurio. Otros metales como
arsénico, plomo, cadmio y cromo pueden requerir pretratamientos con agentes
reductores o fundentes para ayudar a la fusión.

Quelación: emplea agentes generados por microorganismos que tienen la capacidad de

formar complejos estables con metales. Su uso ofrece un enfoque prometedor para la
extracción de los metales de los suelos contaminados. Hay cinco factores principales
en la selección de agentes quelantes para la extracción de metales de los suelos: (1)
Los agentes quelantes deben ser capaces de formar complejos muy estables en un amplio
rango de pH, (2) los complejos metálicos que se forman no se deben adsorber en la
superficie del suelo, (3) los agentes quelantes deben tener una baja biodegradabilidad
si los reactivos deben ser reciclados para su reutilización en el proceso, (4) los reactivos
utilizados deben ser rentables; (5) la recuperación del metal debe ser rentable.

Biosorción: es la remoción de metales pesados contenidos en soluciones acuosas

mediante la unión a biomasa. Se conoce una variedad de biomateriales que pueden unirse
a estos contaminantes, como bacterias, hongos, algas y residuos industriales y agrícolas.
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Bioprecipitación: se utilizan microorganismos capaces de generar metabolitos que

precipitan con muchos de los metales pesados. Un grupo importante de estos
microorganismos son las bacterias sulfatoreductoras. Estas bacterias anaeróbicas son
capaces de formar sulfuros a partir de la reducción de sulfatos, lo que permite,
debido a la habitual baja solubilidad de los primeros, separarlos del medio líquido.

Fitorremediación: es el empleo de plantas para remover contaminantes del ambiente.

Existen distintos tipos de fitorremediación que involucran procesos de estabilización,
extracción, volatilización, degradación e inmovilización. La fitorremediación es un método
apropiado para descontaminar superficies extensas, no introduce alteraciones en el medio, la
generación de productos secundarios es mínima y el suelo puede ser reutilizado. Pero debe
tenerse en cuenta que no puede ser empleado a grandes profundidades, los tiempos
del proceso pueden ser prolongados y la biodisponibilidad de los metales es un factor
limitante para la captación.

BIORREMEDIACIÓN. UNA NUEVA ESTRATEGA PARA LA CONTAMINACIÓN DEL MEDIO

AMBIENTE

La biorremediación consiste en la utilización de organismos vivos para la remediación ambiental. Los

más usados son los microorganismos (tanto bacterias como algas y hongos), las plantas
(fitorremediación) y los nemátodos (vermirremediación). Esta tecnología se presenta como
amigable desde el punto de vista medioambiental, de bajo coste y gran aceptación pública.
Además, con su desarrollo y mejoramiento gracias a la investigación que actualmente muchos
grupos en el mundo llevan a cabo, se podrían aplicar en los procesos industriales que son
contaminantes reduciendo costes o sustituyendo algunas de sus etapas, especialmente si se
pudieran aplicar estas técnicas in situ a pie de fábrica (Gargouri y col., 2011).
Debido a su simplicidad genómica y a su facilidad de cultivo, los microorganismos han sido
objeto de un vasto estudio para su uso en biorremediación. Las bacterias, por
ejemplo, tienen alta capacidad para la degradación de compuestos de múltiple
naturaleza y esta degradación puede llegar hasta diferentes niveles. Si la sustancia se
degrada completamente se habla de mineralización, proceso ideal que no siempre
ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sino transformadas en otras
(biotransformación). La biotransformación puede ser peligrosa, ya que la nueva
sustancia formada puede ser tan nociva o más que la de partida. Aunque, hay sustancias que
no son degradadas y se las denomina recalcitrantes. Además, las bacterias tienen un papel
fundamental en los ciclos biogeoquímicos, en el desarrollo sostenible de la biosfera y
la gran diversidad de sus metabolismos abre una amplia gama desde el punto de vista de la
elección del mejor microorganismo para la detoxificación o degradación de un determinado
compuesto. Por todo esto, las bacterias se han utilizado con éxito en la descontaminación
tanto de compuestos orgánicos como de MP. Aunque también se ha investigado sobre el
uso de hongos (micorremediación). Uno de los principales papeles de los hongos en los
ecosistemas es el de descomposición, ya que segregan enzimas extracelulares y ácidos que
degradan la lignina y la celulosa, compuestos formados por largas cadenas de
carbono. Estas estructuras químicas son muy similares a las de muchos contaminantes
actuales.

Los mecanismos usados por las plantas son muy variados (Figura 10) (Pilon -Smits,
2005):
a) Fitoextracción: Los agentes contaminantes pueden ser absorbidos y almacenados.
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En este caso, la translocación del metal a las hojas es un proceso esencial que debe
producirse cuando la biomasa de la raíz no es suficientemente abundante (Tangahu y col.,
2011).
b) Fitofiltración: La eliminación de los contaminantes se produce por absorción o
adsorción, quedando limitado el movimiento de éstos. Estos procesos engloban la
rizofiltración (uso de raíces de plantas), blastofiltración (uso de plántulas) o
caulofiltración (uso de tallos extirpados) ( Mesjasz-Przybylowicz y col., 2004)
c) Fitoestabilización: Los tóxicos son quelados por compuestos orgánicos e
inmovilizados en el suelo. Las plantas pueden inmovilizar metales pesados en suelos
por la captura de la raíz, precipitación, complejación del metal o reducción de su estado de
oxidación en la rizosfera.
d) Fitovolatilización: Los compuestos son tomados del suelo y convertidos en otros
volátiles que son evaporados a la atmósfera. Esta técnica puede usarse con algunos metales
pesados como Hg o Se (Padmavathiamma y Li. 2007).
e) Fitodegradación: Las enzimas de la planta, tales como, dehalogenasas y oxigensas,
degradan los contaminantes. Este proceso es independiente de los microorganismos
rizosféricos. Las plantas pueden incorporar compuestos orgánicos tóxicos y
detoxificarlos mediante sus actividades metabólicas.

5. Hipotesis

En especies vegetales comestibles tales como la lechuga (Lactuca sativa), el calabacín

(Cucurbita moschata) y el girasol (Heliantus annus) se llevan a cabo los procesos de
bioconcetración y bioasimilación de cadmio y zinc, en cantidades suficientes para ser
consideradas en procesos de fitoextracción de sitios contaminados.

6. Metodología

En la búsqueda bibliográfica realizada se han utilizado las bases de datos Science

Direct, Pubmed, Redalyc, Lilacs a través de la plataforma de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos que nos permite consultar todos los recursos electrónicos que
contienen artículos de revistas, libros, informes, tesis... Las etapas que se han
seguido incluyen:

Etapa 1. Revisión de todos los artículos que hacían referencia a las siguientes palabras
clave: soil, phytoremediation, heavy metals, soil contamination, soil-heavy metals.
Los artículos revisados se encuentran datados entre los años 1996 y 2015.

Etapa 2. A partir de los artículos obtenidos en la Etapa 1, se ha realizado un análisis

preliminar de los estudios relacionados con el suelo y su contaminación; en especial
por metales pesados y, tanto sus fuentes como su impacto en los ecosistemas y en la
salud pública. También se ha revisado la legislación actual sobre residuos y suelos
contaminados.
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Etapa 3. Se ha desarrollado un segundo trabajo de revisión, con mayor detalle, de

aquellos artículos relacionados con la fitorremediación en general. Se integraron en
una sola lista los artículos de ambas bases de datos (en relación con las palabras clave
soil, phytoremediation, heavy metals, soil contamination, soil-heavy metals). Para
completar esta etapa se realizó un análisis de las tendencias temporales sobre dichos
artículos.

Etapa 4. Se han estudiado con mayor profundidad aquellos artículos correspondientes

a las técnicas de fitorremediación, en concreto de fitoextracción de metales pesados
relacionada con la biodisponibilidad de éstos en el suelo; los tipos de mecanismos de
absorción, traslocación y tolerancia de los metales pesados en las plantas conocidos
hasta el momento; y las limitaciones y las tendencias de estas técnicas. Esta última
etapa se inició a partir de los artículos localizados en las bases de datos descritas,
pero el proceso de revisión se amplió con nuevas referencias que aparecían en la
bibliografía de los trabajos previamente revisados.

6.1 Método experimental

6.1.1 Preparación y caracterización del suelo

Se llevará a cabo la caracterización de un suelo que previamente se preparará y se

contaminará con cadmio y zinc. El suelo debe contener 50% en masa de tierra de hoja
y 50% de tierra negra, en tres condiciones, para generar tres muestras experimentales
para cada especie vegetal, como se muestra en la tabla 1: la primera será sustrato
“testigo”, sin contaminar, usado como control de las otras dos; la segunda, será un
sustrato contaminado con aproximadamente 150 mg Cd/kg de suelo seco; la tercera,
será un sustrato contaminado con una mezcla de aproximadamente 150 mg Cd/kg y
350 mg Zn/kg de suelo seco. Las concentraciones de Cd y Zn se tomarán de los
criterios interinos de restauración de metales pesados de la PROFEPASEMARNAP
(2000), para uso industrial y agrícola, con un excedente para que la cantidad
biodisponible total fuera cercana a la ahí descrita.

Tabla 1: Muestras experimentales

Sustrato Lechuga Lechuga de hoja Calabacín Girasol

romana rizada (Lactuca (Cucurbita (Helianthus
(Lactuca sativa
sativa var. moschata) annus)
var. longifolia)
crispa)

Suelo “testigo” Testigo-vegetal Testigo-vegetal Testigo-vegetal Testigo-vegetal 4

1 2 3

Suelo Muestra “a”- Muestra “a”- Muestra “a”- Muestra “a”-

contaminado con
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aproximadamente vegetal 1 vegetal 2 vegetal 3 vegetal 4

150 mg Cd/kg de
suelo en peso
seco

Suelo Muestra “b”- Muestra “b”- Muestra “b”- Muestra “b”-

contaminado con vegetal 1 vegetal 2 vegetal 3 vegetal 4
aproximadamente
150 mg Cd/kg y
350 mg Zn/kg de
suelo en peso
seco

En primer lugar (antes de contaminarlos y de la siembra de semillas de cada especie)

se medirá el pH a los sustratos y según el valor obtenido, serán seleccionados de tal
forma que se encuentren en los intervalos idóneos para el crecimiento óptimo de cada
especie vegetal (la lechuga y el girasol pH 6.0-7.0 y el calabacín pH 5.5-7.0).

El suelo se contaminará con cristales de nitrato de cadmio Cd(NO 3)2· 4H2O y cloruro de
zinc ZnCl2, los cuales se disolverán previamente en agua. El suelo y la solución de
cristales se someterán a agitación durante 48 horas a 30 rpm, en un agitador
rotatorio, con capacidad de 30 ± 2 rpm para homogeneizar la mezcla, posteriormente
se colocaran 5 o 10 kg de suelo en cada caja, para finalmente sembrar las especies
vegetales seleccionadas.

A todos los sustratos se les determinará el pH (consecuente), la porosidad, los

nutrientes, la materia orgánica, la capacidad de intercambio catiónico, la textura, la
humedad, las concentraciones de metales “de fondo” y las de los metales
contaminantes Cd y Zn.

6.1.1.1 Determinación de pH

Para la determinación del pH se utilizará el método EPA 9045C (EPA,1995) y la lectura

se realizará con un potenciómetro ORION modelo 520A, con precisión de ± 0.05
unidades a 25 ºC. Las mediciones se llevaran a cabo por duplicado, cada semana y
para cada una de las especies vegetales seleccionadas.

6.1.1.2 Determinación de nutrientes

Para la determinación de nutrientes (nitrógeno, fósforo y potasio), se utilizarán dos

métodos, el primero cuantitativo y el segundo cualitativo. En ambos casos se correrán
“testigos” para determinar la cantidad de fondo.

1) Métodos cuantitativos:
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a) La determinación de nitrógeno (orgánico) total en suelos se llevará a cabo por el

método Kjeldahl modificado (Reyes,1996), para incluir a los nitratos. El nitrógeno
orgánico y de nitratos se convirtirán en sulfato de amonio, el cual se destilará en
ácido bórico y se titulará con ácido clorhídrico (0.1N), utilizando como indicador
verde de bromocresol-rojo de metilo. El porcentaje de nitrógeno total orgánico, se
obtendrá de la siguiente relación:

b) Determinación de fósforo. El método de Bray-I ha sido usado como un índice de

fósforo (P) disponible en suelos ácidos, aunque también da buenos resultados para
suelos neutros o ligeramente alcalinos (Reyes, 1996). La extracción con una solución
de fluoruro de amonio (NH4F) ácida (con HCl) y diluida, tendrá como finalidad
remover las formas de P fácilmente solubles en medio ácido, así como gran parte de
los fosfatos de calcio y una porción de los fosfatos de aluminio y de hierro (se
disuelven debido a la formación de un ion complejo con estos iones metálicos cuando
se encuentran en solución ácida). Las mediciones se llevarán a cabo en el
espectrofotómetro UV-visible Cary 50 Probe marca Varian empleando una longitud de
onda de 690 nm.

c) Para la determinación de potasio (K) en el suelo, se utilizarán las mismas muestras

digeridas que se usarán para la determinación de metales pesados, el K será leído con
el equipo de espectrofotometría de absorción atómica marca Varian Spectra AA-200,
con base en el método EPA 7610 (EPA, 1986).

2) Método cualitativo.

Se llevará a cabo con una prueba colorimétrica, en un “kit” Hanna Soiltest H3896
marca Hanna Instruments, donde el color será desarrollado por la adición de reactivos
y comparados con una carta de colores, el nitrógeno se determinará como NO 3, el
fósforo como P2O5 y el potasio como K2O, los resultados se reportarán como: altos,
medios, bajos o trazas (Hanna, 1999).

6.1.1.3 Determinación de materia orgánica

Esta determinación se llevará a cabo mediante el método de Walkley-Black, que se

refiere a la materia oxidable mediante el ácido crómico con H 2SO4, es un
procedimiento indirecto del cual se determinará el carbono (C) de la materia
orgánica, por ser un elemento relativamente constante en ella (Jackson, 1976).

6.1.1.4 Capacidad de intercambio catiónico (CIC)

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La determinación de la capacidad de intercambio de cationes supone el medir la

cantidad total de cargas negativas por unidad de peso de material. Su determinación
se llevará a cabo reemplazando los cationes intercambiables del complejo por medio
de una sal, donde la concentración del catión adsorbido se determina con los medios
apropiados. Cuanto más alto sea el contenido de arcilla y de humus en el suelo, mayor
será la CIC. (Jackson, 1976).

Para determinarla se tomará una muestra de suelo de 1 g, se agregará 100 mL de una

solución de cloruro de amonio 1M y se agitará durante 24 horas en un agitador orbital
L.E.D. marca Lab-Line Instruments. Luego, se lavará la muestra tres veces con agua
destilada. Al suelo recuperado con amonio se le agregará una solución de NaCl de
5000 ppm y se agitará por 24 horas. Una vez saturado de sodio se filtrará y
posteriormente se medirá el Na remanente en un equipo de espectrofotometría de
absorción atómica marca Varian Spectra AA-200.

6.1.1.5 Determinación de textura

La composición mecánica de un suelo, es decir, la distribución de los tamaños de las

partículas que los constituyen, se denomina textura. Esta característica se puede
determinar a través de la “prueba al tacto” (Siebe et al., 1996). Para realizar la
prueba se humedecerá una pequeña muestra de la fracción fina del suelo (<2nm),
cuidando que no se presente exceso de humedad en el momento de presionarla; es
decir, se usará una muestra a “capacidad de campo”. Posteriormente, al presionarla y
palparla se observarán las características del moldeado, consistencia y granulosidad
(formación de esferas y rollos según la guía de la “prueba al tacto”). Después a partir
del diagrama de texturas se determinará el porcentaje de arcilla, arena y limo que
corresponde a cada clase textual.

6.1.1.6 Determinación de la humedad

Para determinar la humedad del suelo se utilizará el procedimiento siguiente (Reyes,

1996): en un crisol a peso constante se colocará una muestra de 5 g de suelo secado al
aire libre y se pesará en una balanza analítica, se llevará a la estufa a 105 ºC durante
24 horas, y se dejará enfriar en el desecador; se registrará nuevamente su peso. El
porcentaje de humedad se determinará como sigue:

6.1.1.7 Concentración de metales en el suelo

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Se llevará a cabo por un lado, la medición de la concentración de los metales “de

fondo” del suelo “testigo” y por otro lado la concentración de metales pesados (Cd y
Zn), primero se realizará la digestión ácida del suelo, mediante el método EPA 3050A
(EPA, 1992), después las muestras serán analizadas por espectrofotometría de
absorción atómica con un equipo Varian Spectra AA-200.

Se emplearán los siguientes métodos EPA: el 7130 para el Cd, el 7420 para el Pb, el
7190 para el Cr, el 7471 para el Hg, el 7520 para el Ni, el 7061 para el As, el 7380
para el Fe, el 7210 para el Cu, el 7450 para el Mg y el 7950 para el zinc (EPA, 1986).

6.1.2 Selección y caracterización de las especies vegetales

Uno de los objetivos del proyecto es definir las especies vegetales comestibles más
adecuadas para su uso en el proceso de la fitoextracción en suelos contaminados con
cadmio y mezcla de cadmio y zinc (Cd+Zn). Fueron seleccionadas tres especies
vegetales comestibles, una de ellas en dos variedades, a saber:

1) La lechuga romana (Lactuca sativa var. longifolia) y la lechuga de hoja rizada

(Lactuca sativa var. crispa), se seleccionaron porque ya se han llevado a cabo estudios
en donde han sido usadas como cultivo indicador de asimilación de cadmio, dada la
alta acumulación de este metal en su tejido vegetal comparada con otras especies
vegetales (Brown et al., 1996). Se usarán dos variedades para estudiar variaciones en
su comportamiento en el proceso.

2) El girasol (Helianthus annus), porque ha sido usado en aplicaciones de campo para

la extracción de radionúcleos y nitratos (Schnoor, 1997), además se ha sugerido la
alta asimilación de cadmio en el girasol, y su traslocación a hojas y flores, en
contraste con otras especies, en los estudios preliminares de Li et al. (1996).

3) El calabacín (Cucurbita moschata), porque no hay algún reporte de estudios

efectuados con esta especie vegetal.

Después de la selección, se germinarán las semillas, se evaluará su crecimiento en los

diferentes sustratos (contaminados y sin contaminar), controlando las variables de
humedad del suelo, temperatura y humedad relativa para finalmente determinar si
son funcionales en el proceso de fitoextracción.

6.1.2.1 Germinación y crecimiento

Las semillas de cada especie vegetal se germinarán directamente en las cajas con 5 o
10 kg de suelo, a una profundidad de 2.5 cm y respetando el espacio requerido para el
desarrollo óptimo de cada especie (para la lechuga se deja una separación de 30 cm
entre planta y planta, para el girasol de 25 a 30 cm y para el calabacín de 50 cm a 100
cm). De acuerdo con el ciclo biológico de cada planta, se planeará la toma de
PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

muestras según la tabla 2, para cada una se realizarán 5 muestreos, cada 20 días para
el caso de la lechuga y el calabacín (hasta el día 100) y cada 15 días para el girasol
(hasta el día 75).

Tabla 2: Planeación de muestreos para cada especie vegetal.

Especie Tiempo de Ciclo Muestreo Muestreo Muestreo Muestreo Muestreo

vegetal germinación biológico 1 (días) 2 (días) 3 (días) 4 (días) 5 (días)
(días) (días)

Lechuga
romana
(Lactuca 7 75-90 20 40 60 80 100
sativa
var.llongifolia)

Lechuga de
hoja rizada
(Lactuca 7 75-90 20 40 60 80 100
sativa var.
crispa)

Calabacín
(Cucurbita 6 60-90 20 40 60 80 100
moschata)

Girasol
(Helianthus 5 60-75 15 30 45 60 75
annus)

De los cinco muestreos a realizar, la lechuga (Lactuca sativa var. longifolia), será la
única especie estudiada por triplicado, todas las demás y las plantas “testigo” serán
por duplicado. Se germinaron semillas en los diferentes sustratos para obtener el
número de plantas planeadas por caja y satisfacer la demanda de cada estudio como
se muestra en la tabla 3 (se sembrará de 2 a 3 semillas por cada planta requerida,
para garantizar que al menos una de ellas germinará).

Tabla 3: Planeación del número de plantas requeridas.

Especie vegetal Nº de plantas Nº de réplicas Nº de plantas Nº mínimo de

planeadas por requeridas para cajas por cada
caja los cinco vegetal y por cada
muestreos sustrato

Lechuga romana 4 a 5a 3 15 4
PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

(Lactuca sativa
var. longifolia)

Testigo de
4 a 5a 2 10 3
lechuga romana

Lechuga de hoja
rizada (Lactuca 4 a 5a 2 10 3
sativa var. crispa)

Testigo de
lechuga de hoja 4 a 5a 2 10 3
rizada

Calabacín
(Cucurbita 4b 2 10 3
moschata)

Testigo de
4b 2 10 3
calabacín

Girasol
(Helianthus 8a 2 10 2
annus)

Testigo de girasol 8a 2 10 2
a
5Kg
b
10Kg
Se registrará el peso de las semillas (para garantizar semejanza entre las que serán
sembradas), se plantarán, se regarán y se pondrán a germinar dentro del invernadero,
controlando temperatura y humedad relativa. En los días de muestreo se cortarán las
plantas, se registrarán los pesos de cada parte de la planta, se lavarán y se llevarán a
secar en la estufa a 50 ºC durante 2 horas para registrar finalmente el peso seco.

6.1.2.2 Concentración de metales pesados (Cd y Zn) en los tejidos vegetales

En los tiempos de muestreo establecidos, una vez que el tejido vegetal de cada parte
de la planta se encontraba seco, se llevarán a digestión ácida según el método EPA
3050A (EPA, 1992) y se determinarán las concentraciones de Cd y Zn empleando los
métodos EPA 7130 para el cadmio y el 7950 para el zinc (EPA, 1986). Los muestreos de
tierra y lixiviados (agua excedente que escurría de la caja), también se llevarán a
cabo en los mismos tiempos de muestreo.

7. Presupuesto
PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

Monto
Partida Descripción Porcentaje %
(S/.)
Bienes
2.3.11.12 Alimentos y bebidas para consumo animal 45.00 3
2.3.15.12 Papelería en general, útiles y Mat. de oficina 75.00 5
2.3.15.31 Aseo, limpieza y tocador (mat. De limpieza) 90.00 6
2.3.15.41 Electricidad, iluminación y electrónica - -
2.3.15.99.9 Otros (CD, diskette, usb) 60.00 4
2.3.18.12 Medicamentos - -
2.3.18.21 Mat. Insumos, instrumental y accesorios médicos, 150.00 10
quirúrgicos, odontológicos y de laboratorio
2.3.110.12 Material biológico - -
2.3.110.13 Animales para estudio - -
2.3.110.16 Productos farmacéuticos de uso animal - -
2.3.199.12 Productos químicos 690.00 46
2.3199.199 Otros bienes 120.00 8
2.6.61.21 Libros y textos para biblioteca - -
Servicios
2.321.21 Pasajes y gastos de transporte (interior) 60.00 4
2.3.21.22 Viáticos y asignaciones por comisión de servicio 30.00 2

2.3.21.299 Otros gastos (movilidad local) 30.00 2

2.3.22.13 Servicio de suministro de gas - -
2.3.22.23 Servicio de Internet - -
60.00 4
2.3.22.44 Servicio de impresiones, encuadernación y
empastado

2.3.27.119 Servicios diversos 90.00 6

2.3.27.31 Realizado por personas jurídicas - -
TOTAL 1500.00

8- Criptografía de actividades

Calendario de actividades.
PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

2018 2019

Actividades
MESES

Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr
Busqueda y revision bibliograficas
x x x x x x x
bibliografica

Capacitacion externa e interna x x x x x x x x x x x x

Redaccion del proyecto x x x x

Recoleccion x x x

Preparación del suelo x x

Caracterización de especies x x x
vegetales
Acondicionamiento y tratamiento x x x

Germinación y crecimiento x x x
Analisis de resultados I x x x x
x x x x

Analisis de resultados II x x x x x
Redaccion del proyecto final x x x x x
Entrega de resumen ejecutivo x

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

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24. EPA. Acid Digestion of Sediemnts, Sludges, and Solis, Método 3050A, Revisión 1, Julio,
1992.

25. EPA. Cd, K, Zn, Hg, Pb, Fe, Cu, Mg, As, Ni, Cr (Atomic Absorption, Direct Aspiration),
Métodos: 7130, 7610, 7950, 7471, 7420, 7380, 7210, 7461, 7061, 7520, 7190
respectivamente. Septiembre, 1986.
PROYECTO- FITORREMEDIACIÓN BIOTECNOLOGIA 2017-1

26. EPA. Guía del Ciudadano: Medidas fitocorrectivas. Organismo para la Protección del
Medio Ambiente (E.U.). Desechos Sólidos y Respuesta en Situaciones de Emergencia
(5102 G). EPA 542-F-96-025. Septiembre de 1996.