MANUAL

DE
ANDROLOGIA
E MANIPULAÇÃO DE
S Ê M E N E Q Ü IN O

PROF. DR. FREDERICO OZANAM PAPA

PROF. ASS. DR. MARCO ANTONIO ALVARENGA
DR. JOSÉ ANTONIO DELL’AQUA JR.

2007
 ÍNDICE

1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO EQÜINO...................... 03

2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO MACHO................................... 04

3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHÃO.................... 06

3.1. PÊNIS E PREPÚCIO....................................................................................................... 06
3.2. TESTÍCULOS................................................................................................................... 08
3.3. EPIDÍDIMO, GLÂDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMÁTICOS................ 09

4. EXAME ANDROLÓGICO........................................................................................ 11
4.1. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 11
4.2. MATERIAL NECESSÁRIO............................................................................................ 12
4.3. SEQUÊNCIA DO EXAME.............................................................................................. 12
4.4. COLHEITA DO SÊMEN................................................................................................. 13
4.5. ANÁLISE DO SÊMEN..................................................................................................... 13
4.5.1. EXAMES IMEDIATOS..................................................................................................... 13
4.5.2. EXAMES MEDIATOS...................................................................................................... 14
4.6. MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO............................................. 22
4.7. PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS..................................................... 24

5. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN.................. 25

5.1. DILUIÇÃO....................................................................................................................... 25
5.2. REFRIGERAÇÃO............................................................................................................ 25
5.3. INSEMINAÇÃO............................................................................................................... 25

6. CONGELAÇÃO DE SÊMEN................................................................................... 26
6.1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 26
6.2. MATERIAL NECESSÁRIO............................................................................... .......... 26
6.3. SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO.......................................................................... 26
6.4. LAUDO PARA SÊMEN CONGELADO........................................................... ........... 26
6.5. PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMÁTICA................................................................................................................. 30

2
1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO
GARANHÃO

3
2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO
MACHO
Para que os testículos possam produzir espermatozóides de maneira contínua é
necessário que o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas, esteja em sincronia, de tal forma
que os hormônios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades
adequadas.
O hipotálamo é uma região cerebral localizada no diencéfalo, responsável pela
liberação de GnRH. Este hormônio peptídico via sistema porta hiposisário vai até a
hipófise, onde é reconhecido pelas células lá presentes desencadeando a secreção das
gonadotrofinas (FSH e LH) que através corrente da sangüínea se dirigem até os testículos,
resultando na produção de esteróides (estrógeno e testosterona), que participam da
formação dos espermatozóides.
Os hormônios envolvidos na reprodução são liberados através de retroalimentação
positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produção é estimulada ou inibida, de
maneira a se manter concentrações adequadas para a plena produção espermática.
Nos testículos há a presença de dois tipos de células. As células de Leydig que
produzem testosterona pelo estímulo do LH, testosterona esta que é “ligada” por uma
proteína ligadora de andrógenos (ABP) a luz das células de Sértoli (estimulada pelo FSH)
produtoras da ABP e responsáveis pelo controle da espermatogênese.
Conforme há um aumento das concentrações de testosterona circulante, ocorre
uma retroalimentação negativa a nível do hipotálamo resultando numa diminuição dos
pulsos de liberação de GnRH desencadeando uma menor liberação de gonadotrofina (LH)
que diminui a produção de testosterona pelos testículos. Quando existe a necessidade de
uma maior produção deste hormônio ocorre uma retroalimentação positiva e os níveis
testosterona são novamente restabelecidos.
Outro hormônio que participa dos processos de regulação da secreção de GnRH é
a inibina produzida pelas células de Sértoli, ela promove uma maior ou menor liberação dos
pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreção do FSH afetando a produção da
ABP e da própria inibina.
É de grande importância o conhecimento deste mecanismo para um bom
diagnóstico de alterações reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua
função reprodutiva e qualidade espermática.
Segue abaixo o esquema do eixo hipotálamo - hipófise – gônadas.

4
5
3. PRINCIPAIS PATOLOGIAS DO SISTEMA
REPRODUTIVO DO GARANHÃO

3.1. PÊNIS E PREPÚCIO

Fimose
Incapacidade de expor o pênis comumente, podendo ser congênito ou adquirida, por
traumas ou infecções. Tratamento: cirúrgico.

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Parafimose

Dificuldade de retração do pênis, principalmente devido a lesões de medula, lesões

do músculo retrator do pênis, estenose. Tratamento: limpeza de lesões no pênis, compressas
de água fria, aumento do diâmetro do óstio prepucial.

Balanopostite

Inflamação do pênis (balanite) e prepúcio (postite), freqüentemente ocorrem

simultaneamente balanopostite. Agentes causadores: P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma,
Ureaplasma, Chlamydia, Protozoa , Virus, , Sendo mais comum em garanhões as lesões
parasitárias causadas por Habronema ou mesmo miíases ou também por traumatismos.
Tratamento: Retirada da causa, tratamento antibacteriano (infecções secundárias) com
antibióticos sistêmicos de eliminação pela urina, ivermectina (infecções parasitárias),
organofosforado (habronemose).

Hematoma peniano

Geralmente devido a ruptura da túnica albugínea, por traumas no momento da

cópula, freqüentemente o hematoma ocorre no dorso do pênis, a identificação da patologia
é dada pela inspeção e palpação. Tratamento: o tempo de recuperação esta diretamente
envolvido com a evolução do quadro, hidroterapia (ducha 3 x ao dia), punção se necessário,
colocar suspensório, anti-inflamatórios não esteróide, antibióticoterapia

Edema prepucial

Traumatismos, picada de insetos ou ofídios. Tratamento: baseado nos agentes

causadores.

Laceração prepucial

Lesões traumáticas no prepúcio, dependendo da extensão e tempo de evolução

sutura com plastia local almejando evitar alterações no óstio prepucial, se o tempo de
evolução for maior que 24hs ferida já contaminada tratamento tópico (limpeza, agentes
desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrização por segunda intenção.

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3.2. TESTÍCULOS

Degeneração testicular

Condição adquirida decorrente de fatores que afetam a homeostase testicular.

Muitos deles envolvendo alterações da termorregulação testicular como piques febris , o
processo de degeneração é classificado em graus I, II e III, quanto maior o grau maior a
severidade da patologia. Podem também ser de origem medicamentosa ( Anabolizantes e
corticoesteróides ). O prognóstico é bom a não ser nos casos onde já houve perda de massa
testicular e formação de tecido conjuntivo. Tratamento: retirada da causa e tempo mínimo
de 60 dias.

Hipoplasia e aplasia testicular

A aplasia testicular é a ausência de um ou dos dois testículos é de rara incidência.

Já a hipoplasia (diminuição do tamanho testicular) uni ou bilateral é mais comumente
encontrada, ambas patologias são de origem genética causadas por um gene recessivo de
penetrância incompleta. Tratamento: por se tratar de uma patologia de origem genética
deve-se afastar o animal da reprodução.
Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degeneração
necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degeneração os testículos
tinham tamanho normais, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alterações do
ejaculado não se alteram como no caso da Degeneração Testicular,

Orquite

Freqüentemente causada por uma infecção ou traumatismo e associada a

epididimite.
Aguda: aparecimento súbito, presença de aumento de temperatura local, dor,
aumento de volume, perda da função, animal se locomove pouco. Causas infecciosas mais
comuns nos equinos são: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp,
Staphilococcus spp., B. abortus, E. coli, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia,
Protozoa, Virus. Tratamento: Ducha, antiinflamatório sistêmico (Sulfa +Trimetropin,
Enrofloxacina).
Crônica: aumento de volume, alteração da consistência e perda da sensibilidade
dolorosa acentuada.

Neoplasias testiculares

Os tumores testiculares são raros, os mais comumente diagnosticados em

garanhões são os seminomas (de células germinativas), sendo encontrados também os
tumores das células intersticiais (células de Leydig) e os tumores das células de Sertoli.

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Diagnóstico: Acomete idosos, superfície dura e irregular, lesões circulares a Ultra-
sonografia. Tratamento: retirada cirúrgica do testículo afetado.

Hérnia inguino-escrotal

Presença de conteúdo abdominal na bolsa escrotal, pode haver presença de alças

sem prejuízo do trânsito intestinal, entretanto pode ocorrer o encarceramento das alças com
parada do trânsito intestinal. Testículo aumentado e frio dor aguda e intensa, Tratamento:
cirúrgico com retirada do testículo do lado acometido e fechamento do anel.

Rotação testicular

O testículo afetado mantém seu posicionamento horizontal em relação ao eixo

cranio-caudal do animal, porém com giro de 180o observado pela alteração de localização
da cauda do epidídimo em relação à parede abdominal. Tratamento: depende do grau de
rotação, podendo dispensar intervenção desde que não haja interferência na qualidade
seminal do garanhão ou exigir o reposicionamento do testículo com utilização de sedação
ou até procedimento cirúrgico.

Torção Testicular

No testículo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos

casos de torção de 90° a cauda do epidídimo estará em posição lateral ou medial e nos
casos de torção de 180° a cauda do epidídimo estará em posição cranial. Dependendo do
grau de torção pode haver comprometimento circulatório e, nesses casos, o tratamento é
cirúrgico com a retirada do testículo afetado.

3.3.EPIDÍDIMO, GLÂNDULAS ANEXAS E CONDUTOS

ESPERMÁTICOS

EPIDÍDIMO:

a)Defeitos congênitos:
• Aplasia Segmentar: todo ou parte do epidídimo, vasos deferentes ou vesículas
seminais podem estar ausentes.
• Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular.

b)Granuloma Espermático: obstruções congênitas dos ductos e se encontram na

cabeça do epidídimo. Os granulomas podem alcançar tamanho suficiente para obstruir
outros tubos eferentes.

c)Espermatocele: Dilatação cística do condutodo epidídimo, com acúmulo de

espermatozóides. Oclusão congênita ou adquirida. As espermatoceles progridem para

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granulomas. O esperma condensado na espermatocele ou no granuloma tem uma cor
amarela e de consistência caseosa como pus na infecção por Corinebacterium spp.

d)Epididimite: Esta afecção às vezes coexiste com a orquite .A fibrose inflamatória

produz na fase crônica endurecimento e aumento de volume do epidídimo, sobretudo do
corpo. Pode haver aderência entre as capas parietal e visceral da túnica vaginal com
obliteração parcial ou total. Epididimites: mais freqüente na cauda .
Infecções do epidídimo pelos agentes=> Strep Beta Hemolítico,P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma ,
Ureaplasma , Chlamydia, Protozoa , Virus.
Sintomas: podem ser agudos ou crônicos como dor, temperatura elevada, sensibilidade,
tumefação da cauda do epidídimo. Nódulos no conduto deferente facilmente perceptíveis à
palpação=>obliteração=>azoospermia,
quando os dois condutos estiverem afetados.
Geralmente a infecção atinge=>testículos e as vesículas seminais. Diminui a libido pelo
componente Dor ,podendo haver piospermia.
Diagnóstico: exame bacteriológico, Ultra-sonografia alterações a palpação.
Prognóstico: grave por agentes específicos , reservado devido obliteração dos condutos e
aspermia.
Tratamento: Específicos: sulfa+ trimetropin , Cloranfenicol .

CONDUTOS ESPERMÁTICOS:

a) Espermiostasia: Azoospermia de origem excretora devido obliteração total ou

parcial da vias espermáticas, cuja etiologia pode ser:
traumática, infecciosa e hereditária.
Lesões: cabeça epidídimo bastante espessa e saliente , corpo é duro e com
superfície irregular, cauda distendida e saliente na base do testículo. Ao corte estas
estruturas apresentam material caseoso, seco, branco, aglomerado celular denso: numerosos
espermatozóides alterados e ou anormais, restos células epiteliais e grandes células
macrófagas.
Patogenia: Com o estreitamento das vias , congênito ou adquirida, o sêmen não pode ser
expulso e se acumula nos segmentos do epidídimo e depois nos tubos seminíferos inclusive
provocando alteração na espermatogenese. Geralmente ocorre espermofagia .
Sintomas: fertilidade baixa em 1 ou 2 anos , instalando-se a seguir a esterilidade. A libido é
mantido , a ejaculação é mínima e constituida por secreções vesico uretrais
Prognóstico: negativo. Os de origem hereditária devem ser descartados. Unilaterais de
outras origens devem sofrer castração do testículo afetado.

b) Fístula Uretral: Traumas na porção do pênis=>hemospermia grave.

Diagnóstico: Exame de sêmen e Endoscopia.
Tratamento: Cauterização, Cirurgia e Tratamento com antibióticos e sulfas.

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GLÂNDULAS ANEXAS:

a) Vesiculite: Inflamação aguda e crônica.

Causa de perda econômica prematura em touros: redução da qualidade do sêmen e da
motilidade pós-descongelação.
Idade pode ser fator predisponente .
Causa: Bactérias, Vírus, Chlamydia, Fungos e Protozoários., Staphilococcus spp.,
Streptococcus spp., Escherichia coli, Leptospira interrogans , Proteus mirabilis , Clamydia
psittaci, Candida guilliermondii ,Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae,
Ureaplasma.
Em geral não apresenta dor (micção, defecação e ejaculação). Sêmen: piospermia, sem
alteração da motilidade imediata, havendo diminuição da viabilidade após algum tempo.
Palpação: difícil diagnóstico de vesiculite, abscedação: rara, Ultrasom: dificil diagnóstico
pelas características da vesícula seminal => antes da cobertura repleta (anecóica), após
ejaculação => vazia.
Tratamento clínico: antibioticoterapia sistêmica após antibiograma, muitos antibióticos não
conseguem penetrar na luz da glândula em concentração terapêutica. Antibióticos precisam
ter alta solubilidade em lipídeos, baixo peso molecular, afinidade por proteínas plasmáticas,
pKa alto, pH alto (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina, Cloranfenicol).
Endoscopia: lavagem (5x) da glândula com solução salina e antibióticos (ticarcilina sódica
ou ampicilina sódica).
Remoção Cirúrgica: não é usada rotineiramente, podendo apresentar complicações pós-
operatórias como: hemorragias, infecções e lesões nos nervos pélvicos (ligados à ejaculação).

4. EXAME ANDROLÓGICO

4.1. INTRODUÇÃO
O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas de um macho. O
potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre quando este for para
exposições, iniciar uma estação de monta, diagnostico de sub ou infertilidade, ocorrência da
puberdade, destinado a criopreservação de sêmen, etc.
A avaliação destina-se a observação das condições semiológicas, bem como as
condições de sanidade, alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula por
alterações locomotoras ou alterações do sistema genital (impotência coeundi) e problemas
espermáticos (impotência generandi).
O laudo de um exame andrológico nunca é definitivo (para o resto da vida
reprodutiva), sempre deve-se levar em consideração que o animal logo após o exame pode
vir a sofrer de alguma patologia que leve-o a depreciações em sua qualidade espermática,
por isso o laudo não deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo em que
ocorre a espermatogênese mais o trânsito epididimário).

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4.2. MATERIAL NECESSÁRIO

A) ficha para anotações + caneta

B) paquímetro
C) fita métrica
D) luva de palpação
E) vagina artificial
F) copo coletor
G) microscópio
H) mesa aquecedora (37°C)
I) lâminas e lamínulas
J) câmara de Neubauer
K) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker)
L) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl ou palheta de 0,5ml
M) corantes para patologia espermática

4.3. SEQÜÊNCIA DO EXAME

A) Identificação do animal:
• Nome, registro, idade, raça

B) Identificação do proprietário:
• Nome, endereço, telefone, nome da propriedade

C) Exame do animal:

• Anamnese (animal estabulado ou a campo, quanto tempo se cobrir, doenças

anteriores, medicamentos aplicados)
• Exame clínico geral (verificação dos parâmetros respiratório, cardíaco, digestivo,
aprumos, sensibilidade na coluna)
• Exame clínico específico do aparelho reprodutivo (padrões normais)
Prepúcio – sem nenhuma alteração, edema, lesões etc.

Pênis – sem nenhuma alteração, escaras, edema, hematoma, forma.

Glândulas anexas – Palpação retal (somente deverá ser realizada a palpação retal se ficar
constatado quadro de piospermia ou hemospermia).

Testículos e Bolsa escrotal – Observa-se bem o escroto, se não há feridas, bernes, edema,
varicocele (dilatações vasculares), então palpa-se os testículos que no eqüino têm a
forma ovóide e posicionamento horizontal em relação ao animal. Devem ter mobilidade
dentro da bolsa, ausência de dor a palpação, simetria, consistência fibroelástica. Devem
ser feitas mensurações individuais de cada testículo, que demonstram com maior

12
 exatidão a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxílio de um
paquímetro. Comprimento 5 a 12cm (do polo proximal até o polo distal do testículo),
largura 4 a 8 cm (medida latero-madial, na porção média do testículo), altura 4 a 8 cm
(medida infero-superior, na porção média do testículo).

Epidídimos – Devem ser palpados verificando sua presença, sensibilidade, forma e

localização (cabeça acoplada ao polo cranial, corpo localizado na face medial dos
testículos e cauda geralmente bem definida na região caudal dos testículos, apresentado
consistência fibro-eslástica de tamanho variando de 1x1 a 3x3, conforme idade do
animal e freqüência de ejaculados).

4.4. COLHEITA DO SÊMEN

A colheita do sêmen é efetuada por auxílio de vagina artificial, onde o animal deve
ter um condicionamento prévio para que este monte em uma égua em cio ou em manequim.

• Colheita com vagina artificial: a vagina artificial modelo Botucatu é composta de um

tubo rígido, uma mucosa de látex, um copo coletor protegido de luz e alterações de
temperatura. (Anexo1). A vagina deve preenchida com água quente, para permanecer
com temperatura de 42-45°C para colheita. O animal condicionado saltando sobre o
manequim, deve ter o pênis desviado e introduzido na vagina artificial. A constatação
da ejaculação pode ser verificada com as seguintes características:
• Movimento da cauda para cima e para baixo/ contração dos músculos perianais/
sapatear/ fluxo pulsátil uretral da ejaculação.

4.5. ANÁLISE DO SÊMEN

4.5.1. EXAMES IMEDIATOS

Logo após a colheita o sêmen deve ser analisado segundo suas características
macro e microscópicas.

• Volume = Podendo variar de 20 á 100ml

• Cor = desde branco acizentado até um branco leitoso.
• Densidade = Varia do tipo aquoso até leitoso – diretamente relacionado com a
concentração espermática
• Odor = “Suis-genesis”
• Motilidade espermática = Se faz uma pequena gota de sêmen entre lâmina e
lamínula aquecidas a 37°C e realiza-se a visualização em microscópio com
aumento de 200 vezes. A motilidade espermática é analisada segundo uma
escala de porcentagem variando de 0 a 100% (Motilidade Total=MT,
porcentagem de células móveis). Caso a amostra esteja muito concentrada

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 deve-se realizar uma diluição em meio diluidor (por ex. Kenney), esta diluição
pode ser 1:1 ( Motilidade ideal ≥ 70%)
• Vigor espermático = Concomitantemente com a motilidade espermática se
avalia o vigor espermático na escala de 0 a 5 (velocidade com que o
espermatozóide se desloca, quanto maior a velocidade maior o valor).
(Vigor ideal ≥ 3)

4.5.2. EXAMES MEDIATOS

São realizados no momento da colheita, entretanto podem ser analisados
posteriormente.

• Concentração espermática = Retira-se do volume ejaculado uma

alíquota de 20µl utilizando-se uma pipeta de Sahli ou micropipeta e coloca-se
em um tubo de ensaio contendo 1ml de água destilada aquecida ou 1 gota de
sêmen em 19 gotas de água destilada. Após boa homogeneização, monta-se
uma Câmara de Neubauer (ver esquemas), preenchendo seus 2 retículos,
conta-se todos os espermatozóides presentes em 5 quadrados de cada retículo
(vide exemplo), sendo que a variação entre cada uma dos lados da câmara
(retículos) não pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operação).
Após a operação calcula-se a média aritmética, o valor encontrado é
representado pela letra (n).

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 A concentração espermática média para um garanhão adulto colhido na vagina
artificial é de 0,1-0,2x109 espermatozóides por ml. (100 a 200 milhões/ml)

Ex:. De um dos lados da Câmara de Neubauer=Retículo

3 =

2
Neste exemplo temos 12 espermatozóides azuis que deverão ser contados para
efeito de calculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas azuis,
relativos ao cinco quadrados representados, levando-se em consideração o posicionamento
da cabeça. Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são
contados.

15
 Após a contagem das células espermáticas (n),utilizamos a seguinte fórmula para
cálculo da concentração espermática.

Concentração espermática = n espermatozóides/mm3

1 5 1
x x
10 25 20 ou 50

n = Número médio de células contadas nos dois lados da Câmara de Neubauer

1 = Altura entre a lamínula e a Câmara de Neubauer em mm

10
5 x 1 = 5 quadrados contados X a área do quadrado 1 mm2
25 25
1
= Diluição realizada (1 gota de sêmen em 19 gotas de água dest. ou 20µl de
20 ou 50 sêmen em 1ml de água dest.)

O resultado encontrado é referente a concentração de espermatozóides no

ejaculado por mm3, para converter esse dado para ml, basta multiplicá-lo por 103 (1000).

Ex:. Foram contadas 100 células de um lado câmara (em cinco quadrados) e 104
células do outro lado (variação entre os lados menor que 10%), tira-se a média aritmética, o
n = 102 (espermatozóides), colocando-se na fórmula, adotando a diluição de 1/20, temos:

Concentração espermática = 102 , resolvendo a equação

1 5 1
x x
10 25 20
Concentração espermática = 102 x 103 espermatozóides por mm3, convertendo
para ml (x103), a concentração espermática desse touro foi de 102 x 106 espermatozóides
por ml.
“Dica” Sempre que a diluição efetuada for de 1/20, basta multiplicar o n (número
médio contado nos retículos) por milhão (106 )e tem-se direto a concentração por ml. No
exemplo passado n = (102) multiplicado por 106, tem-se 102 x 106 espermatozóides por
ml. (102 milhões/ml)

• Patologia espermática = Coloca-se uma gota de sêmen em uma lâmina e

realiza-se um esfregaço, fixa-se o esfregaço em metanol e cora-se a lâmina
com corantes Ex:. Karras modificado por Papa et al (1998) (1 min Rosa
Bengala lava-se a lâmina em água corrente fraca, então põe-se 1 min no
Tanino lava-se novamente e 30 segundos no Azul Vitória, lava-se a lâmina,

16
 deixa secar, observa-se em microscopia óptica aumento de 1000x). Conta-se
200 células, percorrendo a lâmina de forma homogênea como mostra o
esquema abaixo e classificando os espermatozóides conforme suas patologias,
obtendo no final as porcentagens de espermatozóides normais e de cada
patologia.

Esquema de como se deve percorrer a lâmina para leitura de patologia

espermática.

As patologias espermáticas são divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a

infertilidade e Defeitos Menores não interferem diretamente sobre a fertilidade.

• Defeitos Maiores

1. Acrossomo:
2. Patologia da cabeça:
Subdesenvolvida ..............................................................
Isolada patológica ............................................................
Estreita na base................................................................
Piriforme..........................................................................
Pequena anormal .............................................................
Contorno anormal ............................................................
“Pouch formation” ...........................................................
3. Gota proximal:
4. Formas teratológicas:
5. Defeito de peça intermediária:
(Desfibrilação, fratura, edema, pseudogota) ........................
6. Patologia da cauda:
Fortemente dobrada ou enrolada.........................................
Dobrada com gota..............................................................
Enrolada na cabeça............................................................
7. Formas duplas:

17
 • Defeito Menores

1. Patologia da cabeça:
Delgada ............................................................................
Gigante, curta, larga, peq. normal....................................
Isolada normal...................................................................
2. Patologia da cauda e implantação:
Retro e abaxial, oblíquo.....................................................
Dobrada ou enrolada.........................................................
3. Gota Citop. Distal:

Esquema das patologias espermáticas encontradas:

A = Patologias de Acrossomo

B = Patologias de Cabeça

C = Patologias de Inserção de
Cauda

D = Patologias de Peça
Intermediária

E = Patologias de Cauda

F = Formas Teratológicas

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Descrição das patologias do quadro anterior:
A) = Acrossomo C1 = normal D4 = estreita
A1 = normal C2 = reta D5 = disforme
A2 = grande C3 = invertida D6a e b = ruturada
A3 = com grânulos C4 = estreita D7 = repregueada
A4 = oblíquo C5 = larga D8 = tipo axial
A5 = pequeno C6 = simétrica D9a e b = tipo fibrilar
A6a = sptz s/ acrossomo C7 = excêntrica (abaxial) E) = Cauda
A6b = solto C8 = paraxial E1 = gota proximal
A7a e b = deformações C9 = retroaxial E2 = gota distal
B) = Cabeça C10 = rutura do colo E3 = gota presa na cauda
B1a, b e c = normal C11 = ausência genética E4 = gota presa na PI
B2 = estreita da cabeça E5 = fortemente dobrada
B3 = piriforme D) = Peça Intermediária (PI) E6 = espiraliforme
B4 = lanciforme D1 = normal E7 = enrolada cabeça
B5 = raquetiforme D2 = curta E8 = rudimentar
B6 = globuliforme D3 = comprida F) = formas duplas
B7 = gigante
B8 = anã
C) = Inserção
Elementos figurados do sêmen
(Modificado de Mies Filho,1982).

a) espermatozóides normais
b) gotas livres
c) anormalidades primárias
d a h) anormalidades secundárias
d) cabeças isoladas
e) gotas proximais
f) gotas distais
g) cauda dobrada com gota
h) acrossomas livres
i) formações ciliares (medusas)
k) células epiteliais de descamação
l) células linhagem espermática =
casos de degeneração testicular
m) hemácias
n) piócitos

• Principais causas das patologias espermáticas

A) Cabeça
Acrossomo = As alterações no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou
destacado, podem ser devido ao choque térmico, manipulação indevida ou senilidade.

19
 A presença de um grânulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode
ser origem hereditária ou relacionado a degeneração testicular e está ligado diretamente
com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade.
O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presença de vacúolos na
região equatorial da cabeça não mais no acrossomo, formando um colar na cabeça do
espermatozóide são invaginações da membrana nuclear devido a rarefação da cromatina,
apresentam relação direta com a presença de hipoplasia ou degeneração testicular.
Alterações na forma da cabeça como: estreita na base, piriforme, lanciforme,
anã, são patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degeneração
testicular. Sendo mais comum em cavalos as cabeças sub-desenvolvidas nos casos de
Degeneração Testicular,

B) Colo
Defeitos de inserção como: Abaxial, paraxial e retroaxial, são devido a presença
de “goteira”, falha na formação do espermatozóide. A localização da “goteira” definirá o
tipo da inserção. A inserção abaxial (mais encontrada nos eqüinos e considerada como
normal para cavalos), pode não afetar a fertilidade, pois o espermatozóide tende a se
adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatível com a fertilização. As
inserções paraxial e retroaxial apresentam uma maior relação com a infertilidade pois
impossibilitam o deslocamento necessário do espermatozóide para a fecundação.
Gotas citoplasmáticas proximais ou distais são restos de citoplasma que são o
nutriente do espermatozóide durante o trânsito epididimário. O espermatozóide durante sua
maturação pelo epidídimo permanece três dias na cabeça do epidídimo ainda com a
presença da gota, posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde
deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no
epidídimo, que dissolveriam a gota. A presença de gotas em grades quantidades podem ser
devido: 1) animal imaturo, que começou a produção a pouco tempo, nestes casos colheitas
seriadas resolvem, um animal que está há muito tempo em descanso sexual também pode
vir a apresentar gotas, devido a um diminuição no trânsito epididimário, da mesma forma
colheitas periódicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfunção epididimária
devido a alterações de temperatura (deficiência na termorregulação) levando a um
desequilíbrio iônico Na+ e K+, causando alterações no ciclo de maturação; 3) degeneração
testicular, levando a disfunção epididimária; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma
patologia hereditária a gota sempre irá aparecer no ejaculado.

C) Peça Intermediária
Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degeneração do plasmalema,
afetando a região das mitocôndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a saída
da gota e mais grave afetando a conformação das microfibrilas que podem se soltar
patologia vista em animais idosos.
Cabeça destacada (isolada), “goteira” rasa quando se forma podendo ser
decorrente de problema de inserção paraxial ou de origem genética.
Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditária.

20
D) Cauda
Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, são devidas a
uma diminuição no número de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de caráter
hereditário, estes animais apresentam elevado nível de Zn no sêmen. Outra causa da
apresentação de defeitos de cauda no espermatozóides pode ser devido a choque osmótico
ou térmico e disfunções de epidídimo.
E) Outras anormalidades
Aglutinação de cabeça (head aglutination), os espermatozóides chegam em
blocos ao epidídimo, e neste local há presença de antiaglutininas que promovem a
separação das células, uma disfunção epididimária pode levar ao desenvolvimento desta
patologia.
Espermatozóides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo
na espermatogênese (de animais maduros) havendo a liberação no ejaculado de células
primordiais espermatócitos, espermatogônias, espermátides.
Medusa, restos ciliares do epidídimo por disfunção epididimária, geralmente nos
casos de recuperação de degeneração testicular.
Pseudogota, semelhante a gota citoplasmática, porém situada na porção média da
PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2
camadas de mitocôndrias.

21
4.6. MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO

fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA -
BOTUCATU
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubião Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326

CERTIFICADO ANDROLÓGICO
A.) IDENTIFICAÇÃO DO REPRODUTOR
Nome: Raça: Idade: Registro:
Proprietário: Propriedade:
Endereço:
B.) EXAME CLÍNICO
1. Histórico:
2. Geral:
3. Sistema Genital - Prepúcio: Pênis:
Testículos: Esquerdo Direito
Dimensões (comp., larg. alt.)cm
Simetria
Forma
Posição
Consistência
Sensibilidade Dolorosa
Mobilidade
Epidídimo
Genitália interna:
4. Comportamento sexual (libido):
C.) ESPERMIOGRAMA
I. Método de coleta: Vagina Artificial Data: Horário:
II. Características do ejaculado:
1. Volume ejaculado : ml 5. Motilidade :
2. Cor : 6. Vigor (0-5) :
3. Aspecto : 7. Concentr. (x106/mm3) :
4. Turbilhonamento : - 8. Total esperm. (x109) :
III. Características morfológicas (anexo I):
a. Defeitos maiores: % b. Defeitos menores: % Total: %
IV. Outros elementos: (1. Medusa, 2. Células primordiais, 3. Células gigantes, 4. Leucócitos, 5. Hemácias, 6.
Não detectados Células epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactérias.)

D.) OBSERVAÇÃO:
E.) CONCLUSÃO:
-----------------------------------

22
Local, ........... Data, .../..../...... Méd. Veterinário Responsável
CRMV

23
 fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 821.2121 - Ramal 2249/2326

CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO - (ANEXO I)

NOME: REGISTRO:

I.) MORFOLOGIA ESPERMÁTICA (KARRAS Mod. PAPA et alii,1987)

A.- TOTAL DE DEFEITOS MAIORES: %

1. Patologia da cabeça: 4. Formas teratológicas :

Subdesenvolvida :
Isolada patológica : 5. Defeito de peça intermediária (Desfibrilação,
Estreita na base : fratura, edema, pseudogota) :
Piriforme :
Pequena anormal : 6. Patologia da cauda :
Contorno anormal : Fortemente dobrada ou enrolada:
“Pouch formation” : Dobrada com gota :
2. Acrossomo : Enrolada na cabeça :
3. Gota proximal : 7. Formas duplas :

B.-TOTAL DOS DEFEITOS MENORES: %

1. Patologia da cabeça: 2. Patologia da cauda e implantação:

Delgada : Retro e abaxial, oblíquo :
Gigante, curta, larga, peq. anormal: Dobrada ou enrolada :
Isolada normal : 3. Gota Citop. Distal :

C - TOTAL DE FORMAS ANORMAIS: %

II.) OUTROS ELEMENTOS:

1. Medusa : 5. Hemácias :
2.Células primordiais: 6. Células epiteliais:
3. Células gigantes : 7. Cristais :
4. Leucócitos : 8. Bactérias :

III.) EXAMES COMPLEMENTARES (Termoresistência, espermocultura, outros):

-----------------------------------
Local, ........... Data, .../..../...... Med. Veterinário Responsável
CRMV

24
 4.7. PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS

Médias de características morfológicas de sêmen de garanhões descritos em vários

estudos
Características Dowsett and Pattle Pickett et al Jasko et al
Espermatozóides Não relatado 51 ( 15 ) 52.5 (20.1 )
normais (%)
Cabeças anornais 7.1 (5.9 ) 9(8) 6.4 ( 6.9 )
Cabeças destacadas 2.6 ( 4.8 ) 5(6) 1.3 ( 1.7 )
Gota citoplasmatica 13.1 ( 10.3 ) 3(5) 15.5 ( 11 )
proximal
Gota citoplasmatica 8.1 ( 11.7 ) 3(4) 13.5 ( 11.4 )
distal
Peça intermediária Não relatado 11 (11) 7.4 ( 7.1 )
anormal
Cauda anormal 10.9 ( 9.2 ) 20 (13 ) 2.4 ( 3.9 )

25
5. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE
SÊMEN

5.1 Diluição:
• Diluir sêmen com meio á base de Leite (Botu-Sêmen), contendo como antibióticos de
preferência uma associação de Amikacina e Penicilina cristalina, podendo ser utilizada
a gentamicina.
• Diluir no mínimo o sêmen fresco com 2 partes de meio (Ideal 3:1 Meio: Sêmen).
• Utilizar dose inseminante com 1 bilhão de espermatozóides viáveis.
• Não diluir a uma concentração entre 20 e 50 de milhões de espermatozóides por ml..
• Envasar em recipiente plástico com a menor quantidade de ar possível.
• OBS: Para garanhões que não refrigeram bem a utilização do diluente Botu-Turbo é
uma opção adequada, devendo com este diluente o transporte ser realizado a 5°C.

5.2 Refrigeração:

• Colocar em recipiente adequado. Lembrando-se que quando do resfriamento até 5°C

deve-se utilizar Containers adequados como o Equitainer ou seu similar nacional
Botutainer (Anexo2),seguindo regras indicadas pelo fabricante para montar o sistema.
Este sistema permite manter a temperatura de 5°C por um período máximo de 48 horas
• Para resfriamento entre 15 e 20°C podemos utilizar a Botu-Box (Anexo3).
• Manter fonte de gelo biológica congelada por pelo menos 24 horas em Freezer (-10°C).
• Não manter o sêmen por um período de tempo superior a 24 horas quando refrigerado a
15°C.

5.3 Inseminação:

• De preferência inseminar antes de 24 horas de refrigeração, queda de fertilidade é

esperada quando da refrigeração por mais que 24 hs.
• Inseminar a cada 24 horas.
• Aplicar HCG ou GnRH(deslorelina) para induzir ovulação e garantir só uma IA.
• Não é necessário aquecer em banho-maria . Insemine o sêmen resfriado utilizando o
Botu-IA® (Anexo4).
• Para a avaliação é necessário aquecer por pelo menos 5 minutos a 37°C

26
 CONGELAÇÃO DE SÊMEN

INTRODUÇÃO

A congelação do sêmen trouxe vários benefícios ao sistema de produção dos

eqüinos, facilitando o armazenamento por período indeterminado e a comercialização deste
material genético, controlando doenças sexualmente transmissíveis e principalmente
acelerando o ganho genético.
Nos eqüinos esta técnica vem sendo aperfeiçoada, e já apresenta resultados
satisfatórios de fertilidade com novos diluentes e crioprotetores.

MATERIAL NECESSÁRIO

A) vagina artificial
B) microscópio
C) mesa aquecedora
D) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker)
E) lâmina e lamínula
F) palhetas de 0,25 ou 0,5ml (identificadas)
G) Câmara de Neubauer
H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl
I) álcool polivinílico ou bolinhas para lacrar palhetas
J) diluente para congelação (BOTU-CRIO®)
K) uma geladeira (no local) a 5°C para estabilização
L) termômetro
M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largurax 38cm Altura)
N) grade para as palhetas (local onde são colocadas as palhetas p/ estabilização)
O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nível do N2
P) botijão de N2 (no local)
Q) Banho-Maria

SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO

a) Preparo do laboratório

Antes de iniciar a colheita do sêmen para congelação, preparar os materiais no

laboratório ou sala onde será realizada a congelação. Aferir a geladeira se está entre 4 e
6°C, podendo também utilizar o sistema (Botutainer para refrigeração). Descongelar os
diluentes e colocá-los no banho Maria a 37°C, separar um tubo de ensaio com 19 gotas de
água destilada para a concentração espermática.

27
b) Colheita do Semên

O sêmen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo Botucatu.

- Análise dos parâmetros macro e microscópicos do sêmen.

- Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100
milhões de espermatozóides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de
palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozóides viáveis do
ejaculado.

- Ex: Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentração

espermática de 100 milhões por mL. Total de espermatozóides viáveis neste
ejaculado: 50 mL x 100 milhões x 80% = 4 bilhões de espermatozóides viáveis
dividido por 100 milhões = 40 palhetas

- Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído
na proporção de 1:1 com Botu-Semen (Biotech–Botucatu) 600xg ou 2200 rpm por
10 minutos (Ex. centrífuga da Fanem/Baby/n°2 por 10 minutos).

- Cálculo do volume final de ressuspensão: cada palheta contém 0,5mL, ou seja,

multiplicar o número de palhetas por 0,5 que é o volume final da suspensão com o
diluente de congelação.

- Ressuspensão: Após a parada da centrífuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser

imediatamente desprezado e os “pellets” devem ser ressuspendidos no diluidor de
congelamento Botu-Crio®, previamente aquecido e calculado.

- Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5mL.

- Estabilização: 20 minutos em refrigerador a 5oC.

- Resfriamento rápido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrogênio, mantendo entre 3 e

6 cm acima do nível do nitrogênio líquido, em caixa isopor térmica tampada (37 a
45 litros).

- Congelação: imersão das doses no nitrogênio líquido.

- Descongelação: Sempre retira-se uma palheta da partida congelada para avaliação

do procedimento. Esta palheta pode ser descongelada em Banho-maria a 46°C por
20 segundos e em seguida imergir a 37ºC. Aguardar 10 minutos pós descongelação
a temperatura de 37ºC para avaliação definitiva.

- Análise do sêmen pós-descongelação: Retirando-se a palheta do Banho-maria,

deve-se secá-la bem com uma pano ou toalha de papel, para evitar que alguma gota

28
de água entre em contato com o sêmen, posiciona-se a bolha para ponta da palheta e
corta-se com uma tesoura na porção onde se localiza o lacre (álcool polivinílico).
Verifica-se a motilidade, vigor, a concentração e faz-se um esfregaço, para análise
da patologia espermática ou utiliza-se uma preparação com 40µl de solução de
trabalho para fluorescência com 10µl de sêmen. Caso não possua microscópio de
epi-fluorescência, a amostra congelada poderá ser enviada a faculdade Para análise.

Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja

apta inseminação artificial.

Motilidade total ≥ 50% Vigor ≥ 3

Porcentagem de patologia espermática aceita:
Defeitos menores ≤ 20% Defeitos maiores ≤ 20%
Defeitos Totais ≤ 40%

Cuidados na Inseminação

Programe o momento da ovulação com HCG e ou GnRH(deslorelina).

Inseminar entre 12 horas antes até 6 horas após a ovulação.

Não diluir a dose inseminante,pois isto pode ser altamente lesivo e provocar
dano osmótico.

29
LAUDO UTILIZADO PARA SÊMEN CONGELADO

fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618- 000- Botucatu/SP-RubiãoJunior- Fone/FAX (014)6802-6.249//6326

LAUDO DE ANÁLISE FISCAL DO SÊMEN CONGELADO DE EQUINO

I.-) IDENTIFICAÇÃO
ESTABELECIMENTO :
PROPRIETÁRIO:
NOME DO REPRODUTOR: RAÇA: EMBALAGEM:
PARTIDA: Data:
II.-) EXAME FÍSICO PÓS-DESCONGELAÇÃO:
MÉTODO DE DESCONGELAÇÃO:
VOLUME DA DOSE:
TOTAL DE ESPERMATOZÓIDES DA DOSE:
ANÁLISE SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA :
VIGOR (0-5):
ANÁLISE COMPUTADORIZADA ( HTM-IVOS 10)
ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PELA FLUORESCÊNCIA:

V.-) OBSERVAÇÃO:

VI.-) CONCLUSÕES:

Local, ...............Data............... Med. Veterinário Responsável

CRMV

30
6.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA
MEMBRANA PLAMÁTICA

Atualmente, um fator de grande importância pesquisado pela sociedade científica,

é a integridade da membrana plasmática (IMP) do espermatozóide na pós-descongelação.
As colorações simples como o Karras por exemplo não conseguem identificar se a
membrana plasmática esta integra ou não. Assim sendo foram desenvolvidas provas que
possibilitam identificar essa integridade como:

1. Coloração supra-vital utilizando eosina

É uma prova simples onde se coloca uma gota de sêmen na extremidade de

uma lâmina + uma gota deste corante, homogeneiza-se bem as gotas e se realiza
um esfregaço. Após a secagem da lâmina leva-se ao microscópio em aumento de
400 vezes e conta-se 200 células, sendo que os espermatozóides que estiverem
com a coloração vermelha estavam com a membrana lesada e permitiram a entrada
do corante os demais que não se coraram são classificados como íntegros e o valor
é expresso em porcentagem.

2. Choque osmótico (Dell'Aqua Jr., et al, 2002)

Outra prova bem simples de ser realizada, submete-se o espermatozóide a
um estresse osmótico utilizando água destilada aquecida a 37°C, coloca-se uma
gota de sêmen em 19 gotas desta água destilada e conta-se também 200 células,
sendo que as que apresentarem dobramento de cauda são consideradas íntegras e
as que permanecerem retas lesadas. A fisiologia do processo é que as membranas
íntegras começam a receber um grande influxo de água pois a água vai do meio
menos concentrado no caso a água que tem osmolaridade 0, para o gradiente mais
concentrado no caso a célula espermática com osmolaridade próximo de
280Mosmol e esse excesso de pressão dentro da célula faz com que esta se
deforme dobrando a cauda. As células que não tinham a membrana íntegra não
fazem esta troca osmótica e permanecem esticadas, o resultado é expresso em
porcentagem, descontando-se os espermatozóides que já apresentavam caudas
dobradas como patologia espermática. Ex. 60% de células dobraram a cauda após
o choque osmótico e o touro tinha 5% de caudas dobradas ou enroladas como
patologia espermática, logo concluímos que este animal tem 55% de células com
integridade de membrana plasmática.

3. Sondas fluorescentes

É uma técnica mais refinada, que necessita de um microscópio de

epifluorescência, cujo o custo é elevado, porém pode-se destinar a dose a um
centro que possua esse equipamento para realização do exame. São utilizados duas
sondas fluorescentes (“corantes”), um é um éster de carboxifluoresceína substância
apolar que penetra em membrana íntegra, ela é metabolizada no citoplasma do

31
 espermatozóide por esterases lá presentes e transformado em fluoresceína que não
consegue sair da célula e emite uma coloração verde. O outro corante é uma
substância polar que não consegue penetrar em membrana íntegra. Só o faz
quando ela está lesada ao penetrá-la atinge o núcleo do espermatozóide e libera um
RNAm que codificará as organelas a produzirem uma fluorescência vermelha.
Então as células que se coram de verde são as com membrana íntegra e as que
expressarem cor vermelha apresentam algum tipo de lesão em sua membrana.

AUTORES

Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa - Professor Titular do

Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP- PhD e Pós-Doutorado em
Reprodução Animal - Hannover- Alemanha.
Email: papa@fmvz.unesp.br
Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga - Professor Adjunto do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP PhD em Reprodução Animal - Pós -
Doutorado-Universidade do Colorado - USA
Email: malvarenga@fmvz.unesp.br

Dr. José Antonio Dell'Aqua Junior - Médico Veterinário,

Mestrado, Doutorando e Pós-Doutorando na área de Reprodução
Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP
Email: dellaquajunior@uol.com.br

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