PREPARACIÓN DE MEDIOS Y EVALUACIÓN DE

ESTERILIZACIÓN

Jersson J. Naranjo-Vasquez1​ ​, Edwin A. Quiroga-Quiroga2​ ​, Juan D.

Gamboa-Moreno3​ .​

Biotecnología industrial y ambiental. Ingeniería agroindustrial, Facultad de Ingeniería,

Departamento de Química, Universidad de Antioquia, Sede de estudios ecológicos y agroambientales,
1​
​ udea.edu.co​, 2​ ​edwin.quiroga@udea.edu.co.​ ​3​juand.gamboa@udea.edu.co​.
jersson.naranjo@

RESUMEN

Los medios de cultivos y la esterilización son ampliamente usados en los laboratorios de

microbiología, ya que son necesarios para poder realizar muchos estudios a microorganismos; En este
laboratorio se realizó la preparación de un medio de cultivo conocido como caldo peptonado y
después se procedió a realizar esterilización por diferentes medios, calor seco, calor húmedo y
esterilización química. Después se procedió a realizar siembras de ​E.coli ​con diferentes
concentraciones en agar nutritivo y se incubaron a 37.5° por 20 horas aproximadamente, para
posteriormente, poder evaluar los métodos de esterilización utilizando el conteo de células viables.
Finalmente se pudo observar la alta efectividad de los métodos de esterilización utilizados.

PALABRAS CLAVES: ​Esterilización, cultivo, E. coli, UFC.

INTRODUCCIÓN. Uno de los sistemas más importantes para la

Medios de cultivo
Un medio de cultivo es una técnica de
laboratorio que consta de un gel o una solución
que contiene los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y
temperatura, el crecimiento de virus,
microorganismos, células, tejidos vegetales o
incluso pequeñas plantas. Según lo que se
quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u
otras condiciones. Generalmente se presentan
desecados en forma de polvo fino o granular
antes de ser preparados; ya preparados pueden
encontrarse en estado sólido, semisólido o
líquido. El objetivo último del cultivo es
variado: antibiograma, identificación,
multiplicación.
identificación de microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El
material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el
Cultivo. Se han preparado más de 10.000
medios de cultivo diferentes.
Esterilización
Se denomina esterilización al proceso por el
cual se obtiene un producto libre de
microorganismos viables. El proceso de
esterilización debe ser diseñado, validado y
llevado a cabo para asegurar que es capaz de
eliminar la carga microbiana del producto o un
microorganismo más resistente.
Dado que la esterilidad no se puede demostrar
de manera absoluta, sin causar la destrucción
completa de todas las unidades del lote de
producto terminado; se define la esterilidad en
términos probabilísticos, en donde la
probabilidad de que una unidad de producto
esté contaminada es aceptablemente remota.
Se considera que un producto crítico es estéril,
cuando la probabilidad de que un
microorganismo esté presente en forma activa
o latente es igual o menor de 1 en 1.000.000
(coeficiente de seguridad de esterilidad 10^-6).
Los agentes que matan microbios son
denominados microbicidas (cida= “matar”) o
más comúnmente denominados “germicidas”.
Si el agente específicamente destruye
bacterias, es llamado bactericida; si mata
hongos es denominado fungicida. Tras una
exposición del objeto esterilizado al aire o a
sus alrededores, éste se habrá contaminado de
nuevo con microorganismos.
Los métodos térmicos de esterilización son
comúnmente los más utilizados para eliminar
los microorganismos, incluyendo las formas
más resistentes como lo son las endoesporas.
Métodos de esterilización que se van a utilizar
Esterilización vía seca: La esterilización por
vía seca o calor seco es una variante de la
autoclave en la que no se usa vapor, al ser
menos agresivo (en ausencia de agua el calor
se transfiere peor al material) se utiliza a más
alta temperatura y durante más tiempo. El
calor seco desnaturaliza las proteínas, funde
los lípidos de las membranas y provoca
desecación de los microorganismos.
Este método es menos corrosivo para los
instrumentos metálicos y permite esterilizar
sustancias en polvo o viscosas no volátiles y
también las que puedan formar emulsiones con
el agua.
Esterilización con Autoclave: Es el método de
referencia, utiliza calor húmedo en equipos
que se denominan autoclaves, formados por un
recipiente o cámara de esterilización de
paredes gruesas y cierre hermético que permite
usar vapor a presión y temperatura elevada. El
fundamento físico es el de una olla a presión.
Se considera el método más efectivo porque
actúa coagulando las proteínas de los
microorganismos, provocando su eliminación.
Con hipoclorito de sodio al 15%: Son los
desinfectantes de mediano nivel más
económicos, efectivos e inocuos para el
hombre. Pueden presentarse como cloro puro,
combinado con una sulfonamida (Cloramida
T) o en sus formas más utilizadas: Hipoclorito
de sodio (en solución acuosa) o de calcio (en
tabletas).
OBJETIVOS.
● Aprender a preparar un medio de
cultivo líquido para microorganismos
(caldo peptonado).
● Realizar esterilización por diferentes
medios (Calor seco,Calor húmedo y
esterilización química)
● Evaluar la efectividad de los métodos
de esterilización utilizados.
MATERIALES Y MÉTODOS.
● Beakers de 50 ml
● Erlenmeyer de 250 ml
● Micropipeta
● Balanza
● Autoclave
● Caldo extracto de malta (45 ml)
● E. coli (100 ml)
METODOLOGÍA.
preparación de medios de cultivo.
Caldo peptonado: Con ayuda de una probeta,
se separó 100 ml de agua y con ayuda de una
báscula se pesó el 17% de extracto de malta, es
decir 1,7 gramos de extracto de malta; se
realizó una dilución de éste en un erlenmeyer y
se sometió a calentamiento durante 40 minutos
en una plancha homogeneizando la mezcla con
un magneto como se muestra en la ​imagen 1 y
2.​

Imagen 3. Proceso de esterilización en

autoclave.
Imagen 1. Extracto de malta en Erlenmeyer
Evaluación de diferentes tipos de
esterilización
Conteo de células viables​: De un erlenmeyer
que contenía E. coli en caldo peptonado en
presencia de mecheros (​imagen 4.​), se
procedió a realizar diluciones decimales
tomando 1 ml y se diluyó este en un tubo de
ensayo con 9 ml de agua destilada llegando a
10​-3​ procediendo de la misma manera.

Imagen 2. Calentamiento y homogeneización

del medio

Posteriormente, se le colocó un tapón al

erlenmeyer y una cinta de esterilidad y se
introdujo en un autoclave con temperatura de Imagen 4. Espacio de trabajo para diluciones
121°C, Presión: 1,7 Psi durante 45 minutos (el decimales
procedimiento en la autoclave se hizo
paralelamente junto a la esterilización por
calor húmedo) ​imagen 3​. Finalmente se dejó
enfriar y se refrigeró.
 autoclave y enfriado se cultivó este en dos
cajas petri para luego llevarlos a incubación
por 24 horas a 37°C (​Imagen 7.)​.
Para la dilución 10​-2 se le aplicó 0.89 ml de
hipoclorito al 15% (puesto que se procedió
mal y se tomó 1 ml de la dilución 10​-2 por lo
que tocó recalcular la cantidad de hipoclorito
para 8 ml de esta dilución 10​-2​), dejando actuar
por 20 minutos , después se cultivó en una caja
petri para llevar a incubación por 24 horas a
una temperatura de 37°C.

Imagen 5. Dilución decimal 10​-3

Esta última dilución (​Imagen 5.)​ se utilizó

para cultivar en una caja de petri e incubar (24
hrs a 37°C) y luego realizar el conteo de las
UFC.

Imagen 7. Medio cultivado después del

proceso de la esterilización química

Por último el restante de la dilución 10​-3

simplemente se llevó al horno dejando este a
una temperatura de 100°C por unas 3 horas 15
minutos, luego de dejarlo enfriar 30 minutos
Imagen 6. Medios nutritivos inoculados aprox. se cultivó en una caja petri, se incubó
por 24 horas a 37°C .
Puesto que no fue posible realizar el conteo de
las UFC, y para poder obtener resultados
claros, se realizó de nuevo diluciones
decimales hasta 10​-6 ​y se incubó por 24 hrs a
37°C.

Métodos de esterilización: ​Para la evaluación

de los diferentes métodos de esterilización
(calor húmedo, calor seco y esterilización
química) se tomó los tubos obtenidos de la
dilución decimal realizada en el conteo de
células viables.
La dilución de 10​-1​, se llevó a la autoclave
junto a la preparación de medios de cultivo
(misma presión, temperatura y tiempo). Imagen 8. Proceso de esterilización por calor
Después del tiempo transcurrido en la seco en horno.
Los procedimientos de cultivo y de dilución
todos se realizaron en presencia de mecheros
para evitar la contaminación.
RESULTADOS.
Preparación de medio de cultivo:
Imagen 9. Mezclado de extracto de malta con
agua destilada.
Imagen 10. Proceso de esterilización del
medio de cultivo.
El medio de cultivo (caldo de peptona) fue
esterilizado con calor húmedo, para garantizar
su correcta esterilización se le adhirió cinta de
esterilidad. Después de esterilizado, el medio
se dejó enfriar y se almacenó a baja
temperatura en un refrigerador, para su
correcta conservación.
Determinación de células viables:
Imagen 11. Crecimiento de E.coli en
concentración 10-3​ para determinación de
células viables.
Imagen 12. Crecimiento de células de E. coli
en concentración 10-3​ .​
Las ​imágenes 11 y 12,​ muestran el
crecimiento de la siembra de E. coli que se
obtuvo al diluir el cultivo inicial hasta obtener
concentraciones de 10​-3​. Pero su crecimiento
fue abundante, por lo cual era incontable la
siembra realizada. Posteriormente se realizó
siembra en concentraciones de 10​-6​.
Imagen 13. Crecimiento de células de E. coli
concentración 10-6​ ​.
Imagen 14. Crecimiento de células de E. coli
concentración 10-6​ ​.
Las ​imágenes 13 y ​14,​ muestran el
crecimiento de la E. coli al ser diluido el
cultivo inicial en concentraciones de 10​-6​, de la
cual se pudo evidenciar crecimiento de 32, 14
y 52 unidades formadoras de colonias (UFC).
Método de esterilización química:
Imagen 15. Crecimiento de células de E. coli
de después de esterilización química del
cultivo.
En La ​Imagen 15.,​ ​evidencia el crecimiento de
E. coli. se presentó un crecimiento de
aproximadamente el 70% del área del cultivo.
Método de esterilización seca:
Imagen 16. Crecimiento de células de E. coli
de después de esterilización con calor seco
del cultivo.
La ​Imagen 16,​ muestra el crecimiento de
células de E. coli en las cuales el cultivo fue
sometido a esterilización en horno con
temperatura de 100°C, en el cual su
crecimiento fue de cero unidades formadoras
de colonia (UFC).
Método de esterilización húmeda:
Imagen 17. Crecimiento de células de E. coli
de después de esterilización del cultivo con
calor húmedo.
Imagen 18. Crecimiento de células de E. coli
de después de esterilización del cultivo con
calor húmedo.
Las ​imágenes 17 y ​18,​ evidencian el
crecimiento de células de E. coli en las cuales
el cultivo fue sometido a esterilización en
autoclave a temperatura de 121°C y presión de
1,7 psi durante 45 minutos. De las dos
siembras realizadas, se presentó crecimiento
de una unidad formadora de colonia (1 UFC)
del microorganismo en una (​Imagen 18)​ .
ANÁLISIS.
Determinación de células viables.
Las células del microorganismo E. coli
diluidas en concentraciones de 10​-3
proporcionó incontables unidades formadoras
de colonia (UFC) y esto es debido a que la
cepa pura presentaba mayor cantidad de dicho
microorganismo, por lo cual fue necesario
realizar la siembra del mismo pero en mayor
dilución (10​-6 ​), el promedio de unidades
formadoras de colonia en dicha dilución fue de
aproximadamente 33 UFC. Lo cual indica que
en la cepa pura la concentración del
microorganismo era de 33 X 10​6 ​por cada
mililitro del cultivo es decir, un mililitro
contenía aproximadamente 33 millones de
bacterias.
Generalmente, un cultivo de E.coli contiene
entre 1 y 2000 UFC/ml. (Navarro, M. 2007).
Pero al comparar el dato teórico con el
obtenido mediante la práctica, se evidencia
que la cepa del cultivo puro tenía una
sobrepoblación del orden de 10​3​, es decir,
cuando en promedio un cultivo contiene 2 X
10​3 UFC, en la práctica realizada dicho cultivo
fue de 33 X 10​6​. Existen diversas hipótesis que
podrían explicar el crecimiento excesivo de
dicho cultivo, como lo puede ser:
Manipulación inadecuada de temperaturas en
el periodo de conservación de la cepa pura,
exceso de nutrientes en el cultivo, periodos de
conservación de cepa pura prolongada. Sin
duda alguna, de dichas hipótesis posiblemente
la que da respuesta al fenómeno presentado es
la adición excesiva de nutrientes, pues el
crecimiento de los microorganismos se ve
limitado por la concentración de nutrientes en
el medio que crecen (Ramírez, J 2005).
Método de esterilización química.
En la esterilización realizada mediante adición
la adición de 1 ml de cloro 15%, de las
siembras realizadas, se presentó el crecimiento
de un microorganismo, el cual por su forma no
es E. coli, pues el crecimiento de este
microorganismo tiende a ser circular con borde
ondulado y la E. coli crece en forma de
pequeños círculos, como se muestra en la
(​Imagen 15)​ . Esto es debido a que dicho
compuesto químico tiene característica
desinfectadora, es decir, tiene la capacidad de
eliminar agentes patógenos, logrando una
reducción significativa de la cantidad de
microorganismos presentes en un medio, sin
embargo, no se garantiza la eliminación total
de éstos. (vignoli, 2002)
Método de esterilización seca:
Este método demostró una eficacia del 100%,
pues no se presentó crecimiento de E. coli en
la siembras que se realizaron después de
someter el cultivo a condiciones de
temperatura de 100°C durante 3 horas , esto se
debe a que el microorganismo de estudio crece
a temperaturas que oscilan entre los 7°C y
50°C (FAO, 2018), por lo cual se presenta la
REFERENCIAS.
muerte celular de dicha bacteria al someterlas
a temperaturas que estén por fuera de dicho
rango.
Método de esterilización húmeda:
En este método se obtuvo crecimiento nulo de
el microorganismo estudiado (E. coli), que al
igual que el método de esterilización anterior,
se presenta por alteración de las condiciones
de temperatura de crecimiento.
En éste método, se modificaron condiciones de
temperatura y presión, lo que garantiza una
esterilización más efectiva, teniendo la
capacidad de eliminar microorganismos
esporulados al causar la desnaturalización de
las proteínas que conforman a éstos.
En una de las siembras realizadas se presentó
el crecimiento de un microorganismo
contaminante, que por sus características de
crecimiento, podría tratarse de una levadura.
CONCLUSIÓN.
● Se logró realizar la preparación de
cultivo para microorganismos, así
como realizar diluciones seriadas y
conteos de UFC.
● Los métodos de esterilización vistos y
obtenidos en la práctica fueron
efectivos. En la muestra cultivada de
calor húmedo se presentó una UFC y
la muestra de esterilidad química una
mancha grande que cubre casi toda la
superficie, estos son asociados a
contaminación puesto que el
laboratorio no está adecuado
totalmente para realizar este tipo de
prácticas por ende es normal que se
presente contaminación.
● Unos de los errores más frecuentes es
la desconcentración, en una de los
cultivos en caja de petri que se fue a
realizar el conteo de células viables se
tomó la muestra del tubo 10​-2​, este tipo
de errores nos enseña a ser más
precavidos a la hora de proceder
puesto que los materiales asignados
son limitados.
● (Navarro, 2007) Determinación de
escherichia coli y coliformes totales
en agua por el mètodo de filtraciòn
por membrana en agar chromocult.
Agosto 7, 2018 del Instituto de
Hidrología, Meteorología y Estudios
Ambientales.
● Brock. Biología de los
Microorganismos. Madigan –
Martinko – Dunlap - Clark (12a. ed,
2009 y posteriores) Editorial Pearson
● Archundia García, Abel (1997).
«Capítulo 4: Esterilización y
antisépticos». Educación quirúrgica
para el estudiante de ciencias de
salud. México: Méndez-editores. pp.
81-109.
● (Ramirez, Contreras, Gómez, 2005)
La fase estacionaria en la bacteria
Escherichia coli. Agosto 7, 2018, de la
Revista Latinoamericana de
Microbiología.
● (Vignoli, 2002) Esterilización y
desinfección. Agosto 8, 2018.
● (OMS, 2018 ) E. coli. Agosto 7, 2018
de Organización Mundial de la Salud.
● Guías del laboratorio Biotecnología
Industrial y Ambiental. Agosto 8,
2018, de Universidad de Antioquia.