PRÁCTICA 1.

DETERMINACIÓN
DE PROTEÍNAS POR EL
MÉTODO DE BRADFORD EN
LECHE COMERCIAL
TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR TRIMESTRE 18P

PROFESOR: Dr. SALINAS ARREORTUA NOE

INTEGRANTES:
LÓPEZ REYES NAXHIE
MENDOZA ROMERO RAFAEL
NIETO DÍAZ MARINA BELÉN

UNIVERDIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA
INTRODUCCIÓN
Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber su propia frecuencia característica de la radiación
electromagnética. Este proceso transfiere energía a la molécula y provoca una disminución en la
intensidad de la radiación electromagnética incidente. Por consiguiente la absorción de la radiación
atenúa el rayo incidente y de acuerdo con la Ley de Lambert-Beer esta absorbancia está relacionada
linealmente con la concentración de las especies absorbentes y con la longitud de la trayectoria de la
radiación (tamaño de la celda ≈1cm). (Skoog, 2009)

Partiendo del principio anterior fundamento de la espectroscopía de absorción, el método de Bradford,

también llamado ensayo de Bradford, es utilizado para la cuantificación de proteínas, consiste en la
formación de un compuesto de absorción de coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos
y/o aromáticos de las proteínas y el colorante azul Coomassie G-250;se mide a una longitud de onda
λ=595nm es un método sensible en un rango de 1-25µg, es sencillo, barato y rápido además de que la
susceptibilidad a la interferencia con sustancias extrañas se da con detergentes y soluciones alcalinas. En
la siguiente figura se muestra la formación del compuesto de absorción.

Imagen extraída de: https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/metodos-espectroscopicos-y-curva-

patron.pdf

Hay que recordar que el colorante Comassie Blue G-250, en solución ácida existe en dos formas una azul
y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul y forman el compuesto/complejo proteína-colorante
como se dijo anteriormente y como se muestra en la imagen anterior. En la siguiente imagen se muestran
las dos formas azul y naranja del colorante:

Imagen extraída de: https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/metodos-espectroscopicos-y-curva-

patron.pdf
Existen otros métodos alternativos para la cuantificación de proteínas; el método de Biuret, por ejemplo,
permite cuantificar proteínas en un medio alcalino que contiene iones de Cu2+, estos iones de cobre
reaccionan con los grupos amino del enlace peptídico de las proteínas formando un complejo de color
púrpura, 1 Cu2+ se acomleja con 4 NH; la intensidad en la coloración, es decir, la cantidad de complejos
formados, es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos. La sensibilidad en el método de Biuret es
muy baja (rango de 100 a 1000μg) por lo que su uso es recomendable en soluciones enriquecidas en
proteínas. La absorbancia en Biuret se mide a una λ=545nm, tiene pocos agentes interferentes como el
sulfato de amonio.

Por otro lado existe otro método llamado método de Lowry, al igual que en el método de Biuret se forma
un producto coloreado en un medio alcalino donde las proteínas interactúan con los iones de cobre II
pero a diferencia de éste la reacción se realiza en presencia de tartrato para evitar la precipitación
además de que es necesario emplear un reactivo de Folin-Ciocalteu llamado ácido fosfomolibdotúngstico
que al reducirse con los grupos fenol de las proteínas (determina residuos aromáticos) provocará una
coloración azul en la dilución, la intensidad del color dependerá de la concentración de proteínas. La
absorbancia en Lowry se lee a una λ=750nm y el rango de cuantificación es de 5-100µg de proteína, tiene
interferencias con varias sustancias buffers, detergentes, lípidos, etc.

Otro método es el BCA, ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo
púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico
capaz de monitorizar el ion cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la
cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros métodos. La absorbancia se lee a 562nm en este método. En la siguiente
tabla se muestra un resumen de los métodos colorimétricos y otros no mencionados.
OBJETIVO: Cuantificar proteínas presentes en la leche comercial por el Método de Bradford
DESARROLLO
Material.

20 tubos de ensayo con rosca 1 espectrofotómetro

1 gradilla 1 marcador azul

2 micropipetas de 100µL 1 piseta con agua destilada

3 vasos de precipitados de 50mL Solución madre de caseína a concentración

conocida de 1mg de caseína/mL
1 pipeta graduada de 10mL
Reactivo Bradford
1 pipeta graduada de 1mL
Leche comercial Alpura Entera® 250mL
2 celdas para espectrofotómetro
Metodología.

Se preparó el reactivo de Bradford, con los siguientes reactivos:

Azul de coomasie G-250 5 mg

Etanol 2.5 ml
Ac. fosfórico 5 ml
agua Hasta 50 ml
Se mezclaron en el orden indicado, se disolvieron con agitación (usando agitador magnético) y a continuación se
filtró. Este reactivo se guarda en frascos ámbar. (No se preparó por los alumnos, fue suministrado por el
profesor)

Para preparar el patrón de Caseína. Se disolvió con agitación, usando agitador magnético, 10 mg de Caseína
(pesada en balanza analítica= 0.010g) en 10 ml de agua destilada, con lo que se obtuvo una disolución madre
con una concentración de 1 mg/ml. Preparar la curva patrón de caseína en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl (utilizando la técnica de micropipeteo normal referida
en los anexos). Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de caseína de un 1 mg/ml y el
correspondiente volumen necesario de agua, la curva estándar se preparó por duplicado de la misma forma
descrita anteriormente con la información de la tabla siguiente, a todos los tubos se añadió 3mL de reactivo
Bradford (con el uso de la pipeta graduada de 10mL) ya preparado suministrado por el profesor.
µg (prot) 0 10 20 30 40 50 60
µl (cas) 0 10 20 30 40 50 60
µl (agua) 300 290 280 270 260 250 240
µl total 300 300 300 300 300 300 300

En la preparación de la muestra problema se realizaron tres diluciones: una dilución 1:20 de la leche comercial
(se usó una pipeta graduada de 1mL para medir la leche y una pipeta graduada de 10mL para medir 19mL de
agua destilada); a continuación, se realizaron las diferentes diluciones de acuerdo con la siguiente tabla
(utilizando la técnica de micropipeteo reverso referida en los anexos):

Leche diluida A B C
V. leche (µl) 200 250 300
V. agua (µl) 2800 2750 2700
V. total 3000 3000 3000
Finalmente se añadieron 3 ml del reactivo de Bradford, con el uso de una pipeta graduada de 10mL, a todos los
tubos. Sin embargo, al momento de añadir el reactivo de Bradford, este se agotó, imposibilitando llevar a cabo la
repetición C del experimento y el duplicado de las muestras problema. Se agitaron los tubos y a continuación se
procedió a la lectura de la absorbancia a 595nm en el espectrofotómetro.

DIAGRAMA DE FLUJO.
 RESULTADOS
Se determinó la concentración de cada tubo mostrada en la tabla 1, con la concentración de la solución madre
(1µg/µL) como indica la siguiente fórmula:

TABLA1.
TUBO ESTÁNDAR (μL) AGUA DESTILADA (μL) VOLUMEN DE REACTIVO BRADFORD (mL) CONCENTRACIÓN (μg/μL)
1 0 300 3 0.000
2 10 290 3 0.033
3 20 280 3 0.067
4 30 270 3 0.100
5 40 260 3 0.133
6 50 250 3 0.167
7 60 240 3 0.200
Luego se midió la absorbancia con el espectrofotómetro y se obtuvieron los siguientes datos (Tabla 2), a los
cuales se sacó el promedio de las absorbancias (A1+A2/2) debido a que el experimento se hizo por duplicado, y
se sacó el error absoluto (absorbancia tubo “y1”/”y2” -absorbancia promedio) para colocar las barras de error en
la gráfica titulada “Curva estándar”.

TABLA 2.
ERROR ERROR
ABSORBANCIA ABSORBANCIA PROMEDIO DE ABSOLUTO ABSOLUTO
TUBO 1(λ=595nm) 2(λ=595nm) ABSORBANCIA A1 A2

1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2 0.052 0.048 0.050 0.002 -0.002

3 0.051 0.050 0.051 0.000 -0.001

4 0.066 0.074 0.070 -0.004 0.004

5 0.076 0.080 0.078 -0.002 0.002

6 0.093 0.105 0.099 -0.006 0.006

7 0.088 0.118 0.103 -0.015 0.015

Luego para conocer la relación que existe entre los datos de la tabla 2 se construyó la siguiente gráfica “Curva
Estándar” en el eje “y” se colocaron los valores de absorbancia (λ=595nm) y en el eje “x” los valores de
concentración mostrados en la tabla 1.
La ecuación de la recta obtenida al realizar la regresión lineal de los datos y=0.4655x+0.0178, tiene un
coeficiente de determinación R2 = 0.9049, lo que indica, que la relación de los datos es lineal y la ecuación
obtenida explica la variación de los datos en un 90.49%
Para la preparación de la muestra problema se hizo de acuerdo a la metodología:
 Se tomó 1mL de leche ALPURA
 Se agregaron 19mL de agua destilada
 Está es la primera dilución 1:20 FD=20
 Luego de la primera dilución 1:20 se tomaron 200μL y se llevaron a un volumen final de 3000μL
FD=3000/200=15 esto se coloco en el tubo A
 Luego de la primera dilución de 1:20 se tomaron otros 250μL y se llevaron a un volumen final de 3000μL
FD=3000/250=12
NOTA: Los factores de dilución se determinaron de acuerdo con la siguiente fórmula:
En base a lo obtenido anteriormente la ecuación de la recta sigue un comportamiento acorde con la Ley de
Lambert-Beer que establece que:

La absorbancia (A) es igual al producto de la concentración de la muestra (c) por una constante de
proporcionalidad conocida experimentalmente como coeficiente de absortividad o coeficiente de extinción (a)
por el tamaño de la celda (b=1cm comúnmente)
Así se determina en este caso la siguiente ecuación, de la cual se despeja la concentración de la muestra:

Pero para conocer la concentración real de la muestra la concentración obtenida hay que multiplicarla por los
factores de dilución correspondientes como se muestra a continuación:

Las ecuaciones anteriores es para obtener la concentración de la dilución 1:20, y se obtuvieron los siguientes
resultados de la tabla 3:

TABLA3.
VOLUMEN DE LA VOLUMEN DE VOLUMEN CONCENTRACIÓN
TUBO DILUCIÓN (µL) AGUA (µL) BRADFORD (mL) [A/0.4655] (µg/µL) ABSORBANCIA
A 200 2800 3 0.644 0.300
B 250 2750 3 1.117 0.520

Como se observa no pueden interpolarse los valores de absorbancia en la curva estándar, a pesar de esto
utilizamos la ecuación antes mencionada determinada por la curva estándar y calculamos la concentración
multiplicando por los FD correspondientes obtenemos la tabla 4:

TABLA 4. RESULTADOS CONCENTRACIÓN DE LA DILUCIÓN 1:20

CA (μg/μL) 9.667024705
CB (μg/μL) 13.40494092
Para obtener la concentración de la muestra problema multiplicamos las concentraciones anteriores por el
FD=20 y obtenemos la tabla 5 donde se muestra también la concentración señalada en el empaque y el % de
error:

TABLA 5. CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNA EN LA LECHE COMERCIAL
A (g/L) 193.34
B (g/L) 268.10
EMPAQUE (g/L) 31
%ERROR B -764.83
%ERROR A -523.68

Donde el porcentaje de error fue calculado con la siguiente ecuación:

DISCUSIÓN
Los datos obtenidos para realizar la curva estándar tiene una correlación lineal, con un coeficiente de
determinación R2 de 0.9049, por lo cual, se considera un buen ajuste de los datos al modelo de la Ley de
Lambert-Beer (A=a*b*c). La ecuación de la recta es y=0.4655x+0.01078, donde y=A y la pendiente es el
coeficiente de absortividad a=0.4655µL/µg*cm.

Al preparar las diluciones de la muestra de la leche comercial A y B por sugerencia de la ayudante aumentamos
los volúmenes como se muestra en la metodología llevando a un volumen final a 3mL pero sin aumentar
proporcionalmente el volumen del reactivo de Bradford por lo cual obtuvimos valores de absorbancia que no se
pueden interpolar en nuestra curva estándar (A=0.30 y B=0.52) por lo tanto, la concentración calculada a partir
de estos valores no coincide con el valor reportado en el empaque de la leche comercial (31g/L). Por lo antes
mencionado la preparación de la muestra problema no fue adecuada, no se realizaron las diluciones
correspondientes debido a una mala técnica en el micropipeteo reverso, así el % de error es muy superior a lo
esperado 764.83% y 523.68%. El aumento en el valor de la absorbancia pudo generarse también por luz parasita,
a que el complejo colorante-proteína se unió a las celdas de cuarzo, a que no se guardó la proporción del
Bradford con el volumen de la muestra, ya que, si para 300µL se requieren 3mL de reactivo Bradford para los
3000µL se debieron usar 30mL de reactivo; aparte hay que señalar que las muestras no fueron agitadas con
Vórtex lo cual también influyó en los resultados.

En un estudio realizado por Guzmán-Vera, A., Chávez- Servia y Carrillo-Rodríguez en 2012 con el objetivo de
evaluar el contenido de proteína, lisina y triptófano en el maíz nativo de la Mixteca oaxaqueña, con un tamaño
de 70 muestras de 300g de grano cada una, utilizaron el método Bradford, realizaron su curva estándar con
suero bovino 98% pureza Sigma por triplicado, reportaron los resultados en porcentaje de proteína en base
húmeda libre de aceite (p. b. h.) de 7.51% y en base seca libre de aceite (p. b. s.) 9.24% obteniendo un
Coeficiente de Variación del 5% aproximadamente. Concluyen que existen diferencias significativas entre y
dentro de los grupos de colectas de maíz Mixteco de diferente color de grano, en el contenido de proteína, lisina
y triptófano del grano entero. Así podemos observar la importancia con este ejemplo de aprender y llevar a cabo
una técnica de Bradford de forma adecuada cosa que no sucedió en la presente práctica.
CONCLUSIONES
 Para futuras determinaciones de proteínas por el método de Bradford se deben preparar correctamente
las diluciones y se debe llevar a cabo la agitación de las soluciones con Vórtex.

 Se recomienda en base a esta experiencia enjuagar las celdas con alcohol y con agua destilada para
evitar que el complejo proteína-colorante se una a la celda de cuarzo y se lleve a cabo una mejor
medición.

 Al aumentar el volumen de la muestra se debe aumentar forzosamente el volumen utilizado del reactivo
de Bradford para guardar la proporción.

 Con base a la experiencia obtenida durante la práctica y el artículo revisado concluimos que la técnica de
Bradford es importante en el trabajo experimental, sencilla, fácil, económica y rápida en su realización,
también es reproducible y repetible en un sin número de muestras.

REFERENCIAS.
1. Skoog D., West D., Holler J., Crouch S. (2001) Química Analítica (7ª Ed.). México: McGraw-Hill [575-
584pp]

2. Gutiérrez, G.. (2016). Prácticas de Bioquímica. México: Universidad Nacional Autónoma de México. [89-
91pp]

3. Martin Klingenberg. (2005). When a common problem meets an ingenious mind. Mayo de 2018, de
EMBO Reports Sitio web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1369176/

4. Tom Zinnen. (2004). The Micropipette Story. 2018, de University of Wisconsin–Madison Biotechnology
Center Sitio web: https://www.biotech.wisc.edu/outreach/resources/the-micropipette-story

5. Vera G. A., Chávez S. J. L. y Rodríguez C. J. C. (2012) Proteína, Lisina y triptófano en poblaciones nativas
de maíz mixteco. Rev. Fitotec. Mex. (35)5; [7-13pp]. Recuperado de:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-73802012000500004

6. Fernández Reyes E. y Galván Cejudo A. Métodos para la cuantificación de proteínas. Disponible en:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/acym/27_METODOS_PARA_LA_CUANTIFICACION_DE_PROTEI
NAS.pdf

7. Dante Maugeri y Paula Iribarren DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. QUÍMICA BIOLÓGICA TRABAJO DE

LABORATORIO. Disponible en:
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/QuimicaBiol/1489768
358.pdf

ANEXOS
Historia de la micropipeta

Las micropipetas más simples poseían un mecanismo fijo en el que el volumen a aspirar no podía ser modificado,
estas micropipetas fueron inventadas en 1957 por Heinrich Schnitger de la universidad de Marburg, Alemania
mientras trabajaba con novedosas técnicas de cromatografía por intercambio de aniones para cuantificar
metabolitos ricos en fosfato. Para Schnitger el pipeteo tradicional con la boca era algo tedioso y sumamente
peligroso ya que empleaba sustancias corrosivas y tóxicas como el ácido fosfórico, por eso usó su ingenio y su
habilidad para diseñar y fabricar una micropipeta rudimentaria a partir de una jeringa de Tuberculin, este
dispositivo poseía los elementos básicos de la micropipeta moderna, un pistón y un resorte, pero poco a poco su
diseñador la fue perfeccionando alentado por los colegas que con agrado se dieron cuenta de la utilidad del
dispositivo en diversas disciplinas para pipetear sustancias acuosas. Un mes después de construir su primer
prototipo Schnitger presentó una solicitud de patente para su invención a la cual tituló ‘‘Dispositivo para el
pipeteo rápido y exacto de volúmenes pequeños de líquido’’ (“Vorrichtung zum schnellen und exakten
Pipettieren kleiner Flüssigkeitsmengen”), finalmente en 1961 la patente fue concedida y en ella se describían
todas las características esenciales de una micropipeta: el pistón operado por resorte, el segundo resorte coaxial
para expulsar líquido residual, y la punta desechable que contenía los líquidos. (Klingenberg. 2005)

Primeras versiones de la micropipeta de volumen fijo

1957-1961

La siguiente gran innovación que recibió la micropipeta fue la incorporación de un selector de volumen, la
micropipeta ajustable es un invento originario de Wisconsin desarrollado a través del trabajo conjunto de varias
personas incluyendo al inventor Warren Gilson y a Henry Lardy, un profesor de bioquímica en la universidad de
Wisconsin-Madison. La micropipeta de volumen ajustable fue inventada en 1972, su funcionamiento básico
consiste en la incorporación de un pistón pequeño que se desplaza en un tubo, este pistón se ajusta para
determinar la cantidad de aire que se desplaza al apretar el botón, una vez que se desplaza el aire el líquido que
se aspira toma su lugar, siendo el volumen aspirado igual al volumen desplazado (Zinnen,2004).

MICROPIPETAS - Pautas generales y Técnicas de pipeteo

Pautas generales
  Revisar la pipeta al inicio del día de trabajo para retirar suciedad y polvo

 Ajustar el volumen en el rango especificado para la pipeta

 Sujetar la pipeta de forma que el reposamanos de la pipeta descanse sobre el dedo índice

 Para maximizar exactitud, la pipeta, la punta y el líquido deben estar a la misma temperatura

 Comprobar que las puntas son las adecuadas para la pipeta

 Usar las puntas una sola vez

 Enjuagar la punta varias veces en el líquido a pipetear antes del pipeteo para mejorar la exactitud (pre-
enguaje)

 No volver la pipeta del revés, de forma que el líquido de la punta afecte al interior de la pipeta
 Evitar contaminaciones de las puntas usando el eyector y los guantes
 Guardar las pipetas hacia arriba

 Calibrar las pipetas de forma regular, al menos una vez al año

Técnicas de pipeteo
Pipeteo Normal (forward pipetting):

Recomendada para soluciones acuosas como tampones, ácidos diluidos y bases

1. Regular el volumen y presionar el émbolo hasta el primer tope

Introducir verticalmente la punta en el líquido. Ver la profundidad adecuada en la siguiente tabla

Volumen (μL) Profundidad óptima de inmersión (mm)

0,1 - 1 1
1- 100 2-3
101 - 1000 2-4
1001 - 10000 3-6
2. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del
recipiente para dejar los excesos de líquido del exterior de la punta
3. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer tope y después hasta el
segundo. De esta forma vaciamos totalmente la punta
4. Sacamos la punta del recipiente tocando las paredes del mismo y dejamos el émbolo en su posición inicial
Pipeteo Reverso (reverse pipetting)

Esta técnica se usa para pipetear soluciones con una gran viscosidad o tendencia a formar espuma. Sólo se
puede realizar con pipetas de desplazamiento de aire

1. Regular el volumen y presionar el émbolo hasta el segundo tope

Introducir verticalmente la punta en el líquido. Ver la profundidad adecuada en la siguiente tabla

Volumen (μL) Profundidad óptima de inmersión (mm)

0,1 - 1 1
1- 100 2-3
101 - 1000 2-4
1001 - 10000 3-6
2. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del
recipiente para dejar los excesos de líquido
3. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer tope. Este volumen es el
volumen ajustado. Mantener el émbolo fijo en esta posición. Quedará algún liquido en la punta que no se
debe dispensar.
4. El líquido restante en la punta se puede devolver al contenedor inicial o tirarlo junto con la punta.
5. Dejamos el émbolo en su posición inicial

Pipeteo Repetitivo (Repetitive Pipetting)

Esta técnica está especialmente indicada para pipeteo repetido del mismo volumen.

1. Regular el volumen y presionar el émbolo hasta el segundo tope

Introducir verticalmente la punta en el líquido. Ver la profundidad adecuada en la siguiente tabla

Volumen (μL) Profundidad óptima de inmersión (mm)

0,1 - 1 1
1- 100 2-3
 101 - 1000 2-4
1001 - 10000 3-6
2. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del
recipiente para dejar los excesos de líquido
3. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el émbolo hasta el primer tope. Este volumen es el
volumen ajustado. Mantener el émbolo fijo en esta posición. Quedará algún liquido en la punta que no se
debe dispensar. Este líquido se puede echar en el recipiente original o desechar con la punta.
4. Repetimos los pasos 2 y 3

Pipeteo de muestras heterogéneas

Esta técnica está especialmente indicada para pipeteo de muestras viscosas en las que no se puede lavar
previamente la punta con la muestra y se necesita pipetear el volumen total disponible. Por ejemplo, sangre
o suero

1. Regular el volumen y presionar el émbolo hasta el primer tope

Introducir verticalmente la punta en el líquido. Ver la profundidad adecuada en la siguiente tabla

Volumen (μL) Profundidad óptima de inmersión (mm)

0,1 - 1 1
1- 100 2-3
101 - 1000 2-4
1001 - 10000 3-6
2. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial
3. No sacar la punta del líquido. Volver a presionar el émbolo hasta el primer tope y dejar que vuelva a su
posición inicial. Sacar la punta del líquido tocando las paredes del recipiente para dejar los excesos de
líquido
4. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el émbolo hasta el segundo tope vaciando
completamente la punta
5. Dejamos el émbolo en su posición inicial