Análisis y discusión de resultados

Fundamentalmente existe un procedimiento básico para la extracción de ADN que se puede dividir en 5 pasos,
algunos de los cuales se realizan simultáneamente dependiendo del protocolo a usar (Puerta Bula and Uruena
Pinzon, 2005).

1. Ruptura de membranas. Una vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas
celulares para liberar el ADN. Esto puede ser llevado a cabo químicamente con detergentes (SDS, Triton o
detergentes comerciales). También se emplean métodos físicos, como aquellos basados en ultrasonido (Rocha,
P. J., 2002).

El detergente en solución salina utilizado en esta práctica contiene lauril sulfato de sodio, el cual limpia los
trastes removiendo grasas y proteínas. Éste actúa de la misma manera en el protocolo de extracción de
ADN, destruyendo las membranas celulares; el detergente disuelve los fosfolípidos, que son el componente
principal de la membrana plasmática y nuclear de las células. Al romperse las membranas celulares se permitió
la salida del ADN al exterior. La licuadora también ayudó en la ruptura de estas células.

2. Inhibición de enzimas que destruyen al ADN. Como un mecanismo de defensa natural, las células contienen
enzimas que destruyen al ADN (ADNasas). Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad de
las preparaciones de ADN. La inhibición puede realizarse mediante métodos físicos, tales como
desnaturalización por calor (a temperaturas de 65 C) o con métodos químicos. Estos últimos incluyen
tratamiento con solventes orgánicos (fenol y cloroformo), con antioxidantes (Ditiothreitol y β-mercaptoetanol),
con agentes quelantes (EDTA, EGTA) que capturan los iones magnesio necesarios para la funcionalidad de las
ADNasas, o con agentes caotrópicos que actúan removiendo el agua estructural de las proteínas (Rogers y
Bendich, 1988).

Para esta práctica se utilizó jugo de piña, solución ablandadora de carne y solución limpiadora de lentes de
contacto ya que eliminan las enzimas que degradan el ADN pues contienen una enzima, la papaína, que
contribuye a eliminar las enzimas que puedan contaminar el ADN. En los resultados se puede apreciar la
eficacia de cada sustancia para eliminar las enzimas mencionadas.

3. Eliminación de ARN

Se realiza mediante digestión del ARN con ARNasas como la ribonucleasa A de páncreas bovino. Este pasó
en algunos protocolos se lleva a cabo después de la extracción del ADN (Puerta Bula and Uruena Pinzon,
2005). En este caso de la extracción se obtuvo un producto filamentoso, este no es ADN puro ya que,
entremezclado con él, hay fragmentos de ARN y no se llevó a cabo su eliminación.

4. Eliminación de proteínas
La desproteinizacion se lleva a cabo con solventes orgánicos tales como el fenol y el cloroformo, los cuales
tienen la propiedad de desnaturar las proteínas. El fenol debe ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la
oxidación mediante la adición de 8-hidroxiquinolina. Por su parte, al cloroformo se la adiciona alcohol
isoamilico en proporción 24:1 volumen a volumen (v: v) con el fin de prevenir la producción de espuma y
facilitar la separación de las fases acuosas y orgánicas. Estos solventes se utilizan en una relación de 1:1 (v: v)
de la muestra que se pretende limpiar, quedando las proteínas desnaturadas en la interfase y el ADN en la fase
acuosa. Generalmente se recomienda realizar una extracción con fenol, seguida de una extracción con fenol-
cloroformo-alcohol isoamílico y, finalmente, una última extracción con cloroformo-alcohol isoamílico para
limpiar toda traza del fenol (Puerta Bula and Uruena Pinzon, 2005).

5. Concentración del ADN

Se logra mediante precipitación con etanol en presencia de cationes monovalentes a concentraciones de 0.1 a
0.5 M. El etanol en la presencia de estos cationes induce un cambio estructural en el ADN que causa la
agregación y precipitación del mismo. Adicionalmente, con este tratamiento se remueven los residuos de fenol
y cloroformo del paso anterior. Entre las sales más utilizadas se encuentran el acetato de sodio, acetato de
potasio, acetato de amonio y cloruro de litio (Puerta Bula and Uruena Pinzon, 2005).

Para aislar el ADN se hizo precipitar en alcohol frio ya que el ADN es soluble en alcohol, pero se torna
insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. En este
caso el alcohol formó una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa. Además de permitir
ver el ADN, el alcohol separo el ADN de otros componentes celulares, los cuales fueron dejados en la solución
acuosa.

Según (Rocha, P. J., 2002) todos los pasos anteriormente mencionados se basan en las características
fisicoquímicas del ADN. Pues aparte de ser una molécula de alto peso molecular, muy larga y delicada, es un
ácido capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes). Además, es soluble en soluciones
concentradas de sales (sal de cocina, por ejemplo), pero insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol).
Adicionalmente, el ADN es destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5.6, pero es
soluble a pH 8,0. Por lo tanto, los procesos de extracción, purificación y almacenamiento del ADN deben
mantener el pH óptimo y brindar una alta concentración iónica.

Bibliografía

Puerta Bula, C. and Uruena Pinzon, C. (2005). Prácticas de biología molecular. Bogotá́: Pontificia Universidad
Javeriana, pp.15-21.
Rocha, P. J. (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de aceite. Revista
Palmas, 23(3), pp. 9-17.

Rogers, S.O.; Bendich, A.J. (1988). Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual.
A6: 110. Kluwer Academic Publishers, Belgium.