Universidade Federal de Goiás

Agronomia 
Bioquímica de Biomoléculas  
  Professor Guilherme Rocha
 
 
 
 
 

IV Relatório de aula prática- 

Ação enzimática: EFEITO DA TEMPERATURA 
 

Hugo Silva Pereira

Kellen Cristina Cardoso Neto
Letícia Pereira Silva
Marcela de Souza Lopes
Rodrigo de Melo Bussons
Vitor Pimenta Arão de Brito

Goiânia
2018
  MATERIAL

Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL);

Tampão acetato 0,05 M pH 4,7;
Sacarose 0,2 M;
Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
Pipetas graduadas de 1 e 10mL;
Tubos de ensaio;
Banho maria;
Espectrofotômetro.

 OBJETIVO

Verificar a influencia da temperatura na atividade enzimática.

 PROCEDIMENTO

Montar os tubos seguindo a tabela abaixo:

Tabela 1.
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8
Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Apos a montagem dos tubos, o tubo 1 deverá ser o tubo testemunha/branco, o

qual não terá adição de enzimas e o tubo 2 deverá ser mantido a 25°C, ou seja
temperatura ambiente. Os tubos 3, 4 e 5 devem ser incubados em banhos maria,
nas respectivas temperaturas: 37°C, 55°C e 100°C, por 2 (dois) minutos, somente
apos isso pode-se colocar a Invertase 0,1 mg/mL. Seguindo a tabela abaixo:

Tabela 2.
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Invertase 0,1 mg/mL (mL) - 0,2 0,2 0,2 0,2

Após a adição da Invertase 0,1 mg/mL os tubos deveram serem incubados por 5
minutos seguindo as temperaturas da tabela a seguir:
Tabela 3.
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Temperaturas - 25°C 37°C 55°C 100°C

Feito isso, deve-se adicionar 1,0 mL de ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) em

cada tubo e aquecer todos a 100°C durante 5 minutos. E logo após, adicionar 6,5
mL de água destilada em todos os tubos e os agitarem para homogenizar as
soluções. Feito a homogenização, deve-se adicionar 1,0 mL de cada tubo em 5
frascos.

 RESULTADOS

Após a retirada do banho maria final de 100°C por 5 minutos, foi possivel
observar colorações diferentes nos tubos, sendo os tubos 1 e 5 com coloração
amarela bem parecidos, sem modificação de quando foi adincionado o ADNS, e
os outros 3 tubos (2, 3 e 4) ficarem com uma coloração marrom-escuro, bem
semelhantes.

Uma parte do liquido, 1,0 mL, de cada um dos 5 tubos foram colocados em 5
frascos (1,0 mL de cada tubo/frasco) e levados ao espectrofotômetro e assim ler
as absorbâncias a 540 nm. O frasco (1) do tubo 1 deverá ser utilizado como
branco, então o espectrofotômetro será zerado no frasco 1, e assim medir nos
outros frascos a absorbância de cada tubo.

Tabela 4.
Tubo Absorbância
1 0,000
2 1,747
3 1,731
4 1,724
5 0,006

Os reativos acrescentados, como o tampão acetato, ADNS e enzima invertase,

participaram na ação enzimática mediante ao efeito da temperatura. O tampão a
pH 4,7 influenciou na conformação tridimensional. Quando acrescido
de invertase, enzima que hidrolisa a sacarose, gerando a separação dos
monossacarídeos, glicose e frutose. A glicose, um açúcar redutor, quando em
solução com ADNS, coloração amarela, irá o oxidar em um ácido, Ácido 3
aminos 5 nitrossalicílico, conferindo uma coloração castanha. No tubo 1, não foi
acrescido invertase, ou seja, não houve hidrolise obtendo o açúcar redutor
glicose, portanto, a coloração que era esperado quando ADNS fosse adicionado
seria amarelo. Diferentemente dos outros tubos que foram adicionados a enzima
invertase, nos tubos 2,3 e 4 houve a presença do açúcar redutor, portanto, a
coloração mudou. O que interferiu na tonalidade da cor foi o efeito de
temperatura que as soluções foram submetidas. Muito embora, como as
temperaturas foram constantes no momento em que foi adicionada a enzima
invertase no tubo 5, que estava no banho maria a 100°C, a enzima foi
desnaturada no mesmo momento, assim não houve atividade enzimatica, ou seja,
não houve hidrolise. As diferenças de coloração entre os tubos 2, 3 e 4 só pode
ser avaliado atraves do espectrofotômetro, assim comparando as temperaturas
que foram submetidas, e as absorbâncias que foram lidas, conclui-se que a
temperatura, seguindo o procedimento acima, ideal para a reação de ADNS com
o açúcar redutor, glicose, é a de 25°C. Muito embora quando as temperaturas são
constantes no momento da aplicação da enzima não há grandes diferenças.