Manual de Biotecnologia Molecular Revision 2017

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología Molecular
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR
ELABORADO POR:
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona
Dr. Noé Valentín Durán Figueroa
Dra. Estela Flores Gómez
M. en C. César A. Jiménez Sierra
México D. F. Agosto 2017

PRÓLOGO
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA.

1. Las personas que trabajen en el Laboratorio de Biotecnología deberán utilizar bata, así como
los accesorios necesarios para un trabajo seguro (guantes, googles, tapa boca, etc.).
2. Los alumnos deberán traer el siguiente material durante las sesiones de laboratorio: Papel
higiénico, franela, cerillos, masking tape; dentro del material que los alumnos deberán dejar en
el laboratorio están: jabón, ligas y frascos de vidrio y plástico.
3. Queda estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento, beber o fumar dentro del
Laboratorio de Biotecnología.
4. Las personas que se encuentran en el Laboratorio de Biotecnología deberán observar un
comportamiento adecuado.
5. Los reactivos y materiales se pedirán con vale, el cual contendrá: los materiales solicitados, el
nombre del solicitante, proyecto o materia en la que trabaja. Es responsabilidad del usuario
entregar el material limpio, seco y en buen estado).
6. Debido a la limitación de material, se pedirá solamente aquel material que se requiera en la
sesión de trabajo, el cual deberá entregar a la brevedad posible.
7. En caso de pérdida o deterioro del material, la persona responsable del mismo tendrá que
reponerlo antes de finalizar el semestre correspondiente, de lo contrario no se entregará
calificación de laboratorio o proyecto.
8. Los usuarios de los equipos deberán anotar su nombre, fecha, hora y material con el cuál se
trabaje en la bitácora correspondiente. Al concluir su trabajo se deberá apagar, limpiar y/o tapar
el equipo.
9. Se deberán seguir las indicaciones señaladas para el uso del equipo y en caso de duda se
preguntará a los profesores o al responsable del Laboratorio de Biotecnología. En caso de
encontrar alguna falla se avisará inmediatamente al encargado de la práctica y/o al responsable
del Laboratorio de Biotecnología.
10. Cuando un equipo requiera ser usado durante un cierto período, se deberá avisar al
responsable del Laboratorio de Biotecnología, registrar el trabajo en la bitácora y colocar una
etiqueta en un lugar visible indicando: el periodo por el cual permanecerá prendido. las
condiciones de uso, el nombre del responsable, el nombre del usuario, el nombre de la materia
o proyecto y la, fecha y hora.
11. En caso de trabajos extra-clase del laboratorio, se consideran extensiones del laboratorio en
cuestión, por lo cual, alguno de los profesores encargados de la materia tendrá que hacerse
cargo del grupo
12. Al concluir la sesión de trabajo, se deberá entregar el material limpio y seco, limpiar el área de
trabajo, revisar y cerrar todas las conexiones de luz, agua y gas, así como verificar que los
equipos estén apagados.
13. Todo material que se deje almacenado en el refrigerador, congelador u otra parte en el
Laboratorio de Biotecnología, deberá ser debidamente etiquetado, indicando: fecha, nombre,
material y sustancia almacenada. Todo material que no cumpla con esta condición será
desechado.
14. No se admitirán personas ajenas al Laboratorio de Biotecnología, toda persona no acreditada
para trabajar en dicho laboratorio será invitada a retirarse.
15. Todo equipo deberá de tener un responsable que vigié limpieza, su calibración, su instalación y
su buen funcionamiento. Ello con el objeto de darle un buen uso y mantenimiento para el
funcionamiento óptimo del trabajo en el laboratorio de docencia e investigación.
16. Ningún equipo puede ser extraído del Laboratorio de Biotecnología sin el consentimiento del
responsable de dicho laboratorio. Para efecto de préstamo de equipo o material, se deberá
llenar el formato de préstamo de equipo, en donde el solicitante se compromete a
responsabilizarse del equipo y a contribuir de forma económica para la reparación que se tenga
que hacer al equipo.
17. Los profesores que utilicen el Laboratorio de Biotecnología deberán obedecer el presente
reglamento. Así también, deberán hacer respetar dicho reglamento por los estudiantes y
mantener en buenas condiciones de funcionamiento y limpieza el equipo e instalaciones del
laboratorio.
18. Todo profesor que efectúe alguna práctica de laboratorio o dirección de proyectos de
investigación deberá estar pendiente de sus estudiantes y de sus experimentos y
responsabilizarse de todo incidente que ocurra durante la utilización del Laboratorio de
Biotecnología.
19. Cualquier usuario de algún equipo del Laboratorio de Biotecnología, deberá solicitar su
utilización con el responsable del Laboratorio de Biotecnología. Una vez obtenido el visto bueno
para su uso, deberá anotar en el cuaderno propio a cada equipo: su nombre, el nombre de su
responsable, las condiciones de uso, la fecha y la hora.
20. Todo usuario del Laboratorio de Biotecnología deberá respetar·la clasificación y el orden de los
reactivos existentes en el laboratorio.
21. Todo profesor con acceso al almacén del Laboratorio de Biotecnología deberá respetar el orden
del equipo, material y sustancias ahí almacenadas. Así también, en caso de extraer algún
equipo, material o reactivo del almacén deberá avisar encargado del Laboratorio de
Biotecnología a fin de mantener los inventarios al día.
22. El responsable del Laboratorio de Biotecnología, junto con el presidente de la Academia de
Biotecnología realizarán las demandas necesarias al Jefe de Departamento de Bioprocesos, en
relación al abasto de agua destilada, material de seguridad (guantes, googles, tapa boca, etc.)
de tal forma que la seguridad en el Laboratorio de Biotecnología sea mantenida.
23. Toda persona que no cumpla con dicho reglamente será sancionada por la Academia de
Biotecnología en base a la infracción cometida.
Reglamento aprobado por la Academia de Biotecnología de UPIBI en su cuarta reunión ordinaria

del primer semestre 2001-2002 del 9 de noviembre de 2002.
EVALUACIÓN DEL LABORATORIO
La evaluación del laboratorio comprende los siguientes aspectos:
Rubro Valor porcentual
Trabajo de Laboratorio 20
Presentación de la práctica 20
Análisis y Discusión de Resultados 20
Informe de la Práctica 20
Examen escrito 20
El informe de la práctica considera los siguientes elementos:
Sección Valor porcentual
Introducción
Metodología
Objetivos
Resultados
Análisis y discusión
Conclusiones
Referencias
Relación de prácticas
PRÁCTICA 1. Bioseguridad
PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN
PRÁCTICA 3. Extracción de ADN
PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

PRÁCTICA 5. Extracción de ARN
PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina
PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.
PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes
PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido
PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)
PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum)

utilizando Agrobacterium tumefaciens
PRÁCTICA 1. Bioseguridad
BIOSEGURIDAD
Debe entenderse como una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la salud de adquirir infecciones en el
medio laboral. Compromete también a todas aquellas otras personas que se encuentran
en el ambiente asistencial, ambiente éste que debe estar diseñado en el marco de una
estrategia de disminución de riesgos. Esta fue la definición de bioseguridad surgida por la
necesidad de trabajar frente a ciertos agentes biológicos infecciosos, teniendo por objeto
proteger la salud del individuo.
Sin embargo, actualmente y debido al surgimiento de la Biotecnología moderna y a la
mayor consideración sobre el impacto ambiental de la actividad humana, se ha
considerado a la Bioseguridad como responsable de la protección de diversos aspectos.
Los principios de bioseguridad se pueden resumir en:
A) Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los
servicios, independientemente de conocer o no su serología. Todo el personal debe
seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y
de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a
accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal
del paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las personas,
independientemente de presentar o no patologías.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y

otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la utilización de
materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de
barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero
disminuyen las consecuencias de dicho accidente.
C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de

dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados
en la atención de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo.
NORMATIVIDAD SOBRE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

APLICABLE EN MÉXICO
En México, existe normatividad, tanto Nacional como Internacional, la cual dicta las
normas bajo las cuales debe laborarse con Organismos Genéticamente Modificados a
cualquier nivel. Dentro de estas normas, se encuentran:
ü Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio sobre
Diversidad Biológica.
ü Protocolo de Nagoya-Kuala Lumpur sobre Responsabilidad y Compensación

Suplementario al Protocolo de Cartagena Sobre Seguridad de la Biotecnología.
ü Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (2005).
ü Reglamento de la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente
Modificados (2013).
ü Programa Sectorial de Medio Ambiente y Recursos Naturales (2013-2018).
ü Ley Federal de Protección Ambiental (2013).
ü NOM-164-SEMARNAT/SAGARPA-2013. Norma Oficial Mexicana que establece
las características y contenido del reporte de resultados de la o las liberaciones
realizadas de organismos genéticamente modificados, en relación con los posibles
riesgos para el medio ambiente y la diversidad biológica y, adicionalmente, a la
sanidad animal, vegetal y acuícola.
ü Ley Nacional de Mecanismos Alternativos de Solución de Controversias en Materia
Penal.
Dentro de la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados, en su

artículo tercero se presentan las siguientes definiciones:
V. Bioseguridad: Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención

que se deben asumir en la realización de actividades con organismos genéticamente
modificados, con el objeto de prevenir, evitar o reducir los posibles riesgos que dichas
actividades pudieran ocasionar a la salud humana o al medio ambiente y la diversidad
biológica, incluyendo los aspectos de inocuidad de dichos organismos que se destinen
para uso o consumo humano.
VI. Biotecnología moderna: Se entiende la aplicación de técnicas in vitro de ácido

nucleico, incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN y ARN) recombinante y la inyección
directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la
familia taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de
la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección
tradicional, que se aplican para dar origen a organismos genéticamente modificados, que
se determinen en las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley.
ELEMENTOS DE BIOSEGURIDAD
El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales
infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados.
El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en
laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente
peligrosos.
La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato del
laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas
técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad adecuados. El
uso de vacunas puede brindar un mayor nivel de protección del personal. La contención
secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a
materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y
prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y
técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación
del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación
apropiada de estos elementos.
Equipos de Seguridad (Barreras Primarias).

Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes
cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las
exposiciones a materiales biológicos peligrosos
Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de seguridad, un recipiente
cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el centrifugado.
Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias)

El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes
trabajan en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se
encuentran fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad
de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio.
Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de

combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e
instalaciones de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las
operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechadas de
los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio (tabla 1).
Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2)
Grupo de Barrera Primaria Barrera Secundaria Tipo de
NIVEL Agentes Prácticas
Riesgo (Equipos) (Instalaciones) Laboratorio
Que no causen
Mesa de Laboratorio
Bajo riesgo enfermedad en
con servicio de agua y
individual individuos Prácticas
Campana de drenaje. Enseñanza
I Bajo, adultos microbiológicas
flujo laminar Básica
Riesgo saludables comunes
Comunitario (Cepas
silvestres)
NBS 1. Acceso
Asociados con Limitado. Deben
enfermedad en utilizarse Gabinetes de
humanos, en señalamientos, se Bioseguridad
donde haya deben tomar medidas Clase I o II, Servicios de
riesgo de de precaución en equipo para salud, Hospital
Moderado
infección por material punzo prevenir de nivel
riesgo
heridas cortante. Debe contar derrames o primario,
individual, NBS 1. Además, debe
II percutáneas, con manual de difusión de laboratorios de
Riesgo existir autoclave.
ingestión y Bioseguridad aerosoles. El diagnóstico y
comunitario
exposición de definiendo personal debe Laboratorios de
limitado
membrana procedimientos y utilizar Bata, nivel
mucosa políticas de guantes y cubre Universitario
(Shigella, confinamiento, bocas o careta,
Staphylococcus, desinfección de zonas de ser necesario.
Sporotrix) y materiales y
atención médica.
Agentes
autóctonos o NBS 2, Separación de
exóticos con NBS 2. Acceso los corredores de
Todas las
riesgo de controlado. acceso, puertas dobles
Alto riesgo anteriores,
transmisión por Procedimientos (sistema de exclusa). Laboratorios de
individual, incluyendo
III aerosoles y que rutinarios de Debe evitarse la Diagnóstico
Bajo riesgo protección del
causen desinfección de ropa, recirculación del aire. Especializado.
comunitario sistema
enfermedades desechos y material Presión de aire
respiratorio.
serias o letales previo al lavado. negativa en el área de
(Brucilla, trabajo
Hystoplasma)
Agentes
peligrosos o
exóticos con alto Gabinetes de
NBS 3. Ropa (trajes) NBS 3. Debe ser una
riesgo de causar Bioseguridad
individuales, zona aislada, con
enfermedad Tipo 3. Trajes
equipados en cuartos sistemas individuales Laboratorios
Alto riesgo mortal por individuales
previos al área de de obtención y que trabajan con
Individual, transmisión por sellados con
IV trabajo. Regadera a la liberación de vacío, agentes
Alto riesgo aerosoles o sistema de
salida del Laboratorio. sistema de suministro patógenos
Comunitario agentes similares respiración
Mecanismo de y descontaminación de peligrosos
con forma de autónomo y
descontaminación del aire, generador de
transmisión presión de aire
área de trabajo. energía auxiliar.
desconocida positiva
(EBOLA, SARS,
B. Antracis)
NBS = Nivel de Bioseguridad
OBJETIVO
• Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su

aplicación activa en el trabajo de laboratorio
ACTIVIDADES
Actividad dinámica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio y
las medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos.
Identificar y describir los equipos en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuados
para la utilización de estos equipos.
CUESTIONARIO PREVIO
1. ¿Qué es la Bioseguridad?
2. ¿Qué barreras de bioseguridad se emplean en el laboratorio?
3. ¿Qué actitudes y medidas de bioseguridad se emplean en el laboratorio?
4. Menciona 5 microorganismos con los que se puede trabajar ne el laboratorio dado su nivel
de bioseguridad?
5. ¿Qué medidas de bioseguridad se deben aplicar cuando se trabaja con plantas GM en
lugar de microorganismos?
REFERENCIAS
1. Centers for Disease Control and Prevention; Biosafety; Última actualización:
30/03/2015; Última consulta 07/07/2017; URL:
http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf
2. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

Nueva Ley DOF 18-03-2005
PRÁCTICA 2. Manejo de Micropipetas.

INTRODUCCIÓN
Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad

de medir de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es
crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de biología
molecular para medir volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como
micropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 µL,
0.5-10 µL, 10-100µL, 20-200 µL, 100-1000 µL, 1000-5000 µL. .
OBJETIVOS
Objetivo General
• Cuantificar ADN por métodos espectrofotométricos.

Objetivos específicos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,
Adquirir destreza en la utilización de micropipetas para la medición de volúmenes
pequeños.
Determinar la concentración de ADN y pureza de una muestra.
Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de
diferente tamaño para la medición de diferentes volumenes.
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Agua desionizada
Balanza analítica con límite de 0,0001 g
Tapas de cajas de petri de plástico
Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
Muestra de ADN en solución de concentración desconocida
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
MANEJO DE LA MICROPIPETA
Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la

micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la
micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de
volumen”. Si es necesario, cambiar el volumen mediante el “dispositivo” del control o
mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su
mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita).
NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.
1) Partes de la micropipeta
a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1.
b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura
2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta según corresponda.

b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si
continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia
abajo, este corresponde al segundo punto de resistencia “alto” o "tope".
d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta
una profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la
presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo
abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta
produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez
el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido
durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.
3) Expulsión de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.

b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este
procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden
gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al
oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.
d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las

soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferirá volúmenes inexactos.
4) Calibración de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un

procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta
práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión
y calibración.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación
(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la
micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µL y 1000 µL. Para P200 revisar los
volúmenes de 60 y 200 µL. Para P10 revisar 3 y 10 µL.
a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la
caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a
25ºC, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa
de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g, 60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a
0.003 g.
d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen, tarando después de cada
medición.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 ° C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen
5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)
Valor medio
X = Σ Xi /n donde Xi= pesadas, n= número de pesadas
Volumen medio
V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valor del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)
Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100
Desviación estándar
S = Z . Ö Σ(Xi – X)2
n–1
Coeficiente de Variación
CV= (S*100)/V
Límites de tolerancia para micropipetas
Volumen (µL) E% nominal CV% nominal
1 0.8
5-10
20-50 0.7 0.4
100-1000 0.5 0.2
Llenar las siguientes tablas con los resultados obtenidos.
Agua
Volumen _
Micropipeta X1 X2 X3 %E CV S
(µL) x
1000
P1000
300
200
P200
60
10
P10
3
Glicerol
Volumen _
Micropipeta X1 X2 X3 %E CV S
(µL) x
1000
P1000
300
200
P200
60
10
P10
3
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

INTRODUCCIÓN
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza.
Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o
una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio
no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o
costosas) en los protocolos de purificación.
Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:
• Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes

celulares
• Remoción de macromoléculas y componentes celulares
• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado
Homogenización de la muestra
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para
grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las
domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual
consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La
rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la
muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos
mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como
por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de
los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y,
manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la
muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con
lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de
interés.
Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos
particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células
bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la
pared celular. Para facilitar la solubilización de los componentes celulares, y la ruptura de
membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico
(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las
membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente
quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas
(dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas
Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros

pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño
(como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo
tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en
forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente
entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos
utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo
general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero
por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas y lípidos

Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus
grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico
no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los
lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica.
En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la
extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.
Precipitación de ácidos nucleicos

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en
la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y
deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la
desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los
mismos.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN

• Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ADN
• Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa
MATERIALES
• Reactivos y Materiales
• Acetato de Sodio (3 M)
• Etanol absoluto
• Etanol 70%
• Fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).

• Cloroformo
• Agua desionizada
• TE (pH 8.0)
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Gradillas
• Medio LB líquido
• Termobloques
• Tubos de polipropileno 1.5 mL
• Centrifuga
• Vortex
Muestras biológicas
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de 150-200 rpm.
Una muestra de suelo (al menos un gramo).
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Extracción de ADN de E. coli

1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16 h) a
37°C con agitación constante de 150-200 rpm (el día anterior a la práctica).
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Repetir los pasos 2 y 3 en función de la turbidez del cultivo.
6. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril al paquete celular.
7. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células.
8. Agregar 500 µL de uma mezcla 1:1 de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0) y
cloroformo.
9. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
10. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
11. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la
muestra e inhibir reacciones posteriores.
12. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
13. Mezclar invirtiendo el tubo 3-5 veces.
14. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa, mezclar por inversión.
15. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
16. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
17. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la
pastilla.
experimento.
20. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel, hasta que todo el
etanol haya sido evaporado.
21. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar a -20°C.
Extracción de ADN de Suelo

1. Pesar 0.1 g de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
2. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril.
3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr una mezcla homogénea.
4. Agregar 500 µL de uma mezcla 1:1 de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0) y
cloroformo.
5. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
6. Recuperar la fase acuosa (fase superior), cuidando no llevar la fase orgánica o la capa
blanca formada entre ambas, y colocarla en otro tubo de 1.5 mL.
7. Adicionar 300 µL de Cloroformo, mezclar en vortex.
8. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
9. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL, con los mismos cuidados que en el paso 6.
10. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
11. Mezclar invirtiendo el tubo 3-5 veces.
12. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa, mezclar por inversión.
13. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
experimento.
15. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.
experimento.
18. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel, hasta que todo el
etanol haya sido evaporado.
19. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR
Cuantificación de ADN (Práctica 4)
1. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN.

2. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
3. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm.
Regulador TE
El regulador TE consta en una solución de TRIS 10 mM y EDTA 1mM). Usualmente se prepara a
partir de stocks de soluciones:
STOCK Vol para 100 mL

TRIS-HCl 1M pH 8.0 1 mL
EDTA disódico 1M pH 8.0 0.1 mL
Aforar con agua destilada
CUESTIONARIO PARA DISCUSIÓN

1. ¿Cuál es la función de cada uno de los reactivos y pasos que se llevan a cabo durante la
práctica?
2. ¿Por qué en la extracción de suelo se hace una segunda extracción con cloroformo? ¿Qué
ventajas y desventajas tiene adicionar este paso?
3. ¿Por qué precipitan los ácidos nucleicos al adicionar etanol? ¿Qué otro alcohol
puede emplearse?
4. ¿Cuándo es mejor resuspender el ADN con agua y cuándo con TE?
5. ¿Qué utilidad tiene obtener todo el material genético de una célula?
6. ¿En qué organelos de las células eucariontes es posible encontrar ADN?
7. ¿En qué difieren los métodos de obtención de ADN si la muestra es: una escena del
crimen, un hueso de dinosaurio, un cultivo bacteriano, tejido vegetal y tejido animal?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 4. Cuantificación y análisis de ácidos nucleicos

INTRODUCCIÓN
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad

y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles
de agarosa o de poliacrilamida o bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz
ultravioleta.
En la electroforesis, la agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los

valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato
confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las
moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante
tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Los más
comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el sybr safe, Gel
Red, Sybr Green, Sybr Gold, etc.
Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos
nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN
presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico
en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten
estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260
nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de ADN doble hebra,
40 µg/mL de ARN o 33 µg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra.
En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza

proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la
presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos.
Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible
estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La
presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el
esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta
pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta
que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde
gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de
agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el
ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los
cuales son detallados a continuación.
(a) Tamaño del ADN:
Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son
inversamente proporcionales al log del número de pares de bases.
Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases
hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de
diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las
moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño.
(b) Concentración de la agarosa:
Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes
concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas
para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.
Concentración del gel de agarosa Intervalo de peso

(% w/v) molecular (kpb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
(c) Conformación del ADN

El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con
un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico
peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de
agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la
concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente
eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente
(fundamentalmente en el caso de la forma I).
(d) Corriente aplicada
A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al
voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la
movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo
tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el
voltaje es incrementado.
(e) Otros factores
Otros factores que influyen (y que no se discutirán en esta INTRODUCCIÓN) son: la
dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la
temperatura y la composición del buffer de electroforesis.
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la cantidad de ADN por espectrofotometría y densitometría de las
bandas en un gel de agarosa
Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa
Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometría
Cuantificar el ADN por espectrofotometría
Evaluar la pureza del ADN mediante la relación de absorbancias 260/280
MATERIALES
Materiales y Reactivos
• Solución de Agarosa 0.5% w/v
• Solución para teñir ADN
• Regulador para electroforesis TBE 1X
• Regulador de carga 6x
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Agua desionizada
• Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
• Muestras de ADN
• Marcador de Peso Molecular (100pb)
• Cámara de Electroforesis
• Fuente de Poder
• Espectrofotómetro UV/Vis
Corrimiento de ADN en gel de agarosa
1. Colocar 100 mL de TBE en un vaso de precipitado de 250 mL.

2. Agregar 500 mg de agarosa
3. Calentar hasta fundir completamente
4. Adicionar 0.5µL de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Sybr green, etc.)
5. Mezclar por agitación y dejar enfriar el gel, preferentemente evitando exponer a la luz
6. Verter la solución en una canastilla para electroforesis limpia y seca
7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla
8. Dejar gelificar (preferentemente proteger de la luz)

9. Colocar la canastilla dentro de la cámara de electroforesis
10. Agregar buffer de corrimiento (TBE) hasta el nivel indicado por la cámara
11. Preparar las muestras a analizar (mezclar con buffer de carga, en proporción
adecuada a su concentración)
12. Colocar las muestras adentro de los pozos
13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 60 a 90 min
14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones
Cuantificación de ADN por espectrofotometría
1. Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras de ADN con agua destilada
2. Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas
3. Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas
4. Cuantifique las muestras en una celda adecuada a 260 y 280mn
5. Realice los cálculos correspondientes
Muestra Dilución Lectura Lectura Relación ADN ADN ADN

260 nm 280 nm 260/280 (ng/µL) (fg/µL) (mg/µL)
ADN1
ADN2
COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES
6x Amortiguador de carga
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)
Glicerina en agua 30% (v/v)
TBE
Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O
Tris base 54 g, Ácido Bórico 27.5 g, EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL
1. ¿Cuál es el principio básico de la separación por electroforesis?

2. ¿Qué colorantes pueden utilizarse para la visualización de ácidos nucleicos? ¿Cuál es
el principio por el que estos colorantes funcionan?
3. ¿Existe, además de estos colorantes y la luz UV otro método para cuantificar y analizar
los ácidos nucleicos?
4. ¿Qué tipo de contaminantes es posible visualizar en el gel de agarosa?
5. ¿Qué tipo de contaminantes es posible suponer se encuentran presentes por medio e la
relación de absorbancias 260/280?
6. ¿Qué problemas generan en cuanto al uso de los ácidos nucleicos la presencia deeste
tipo de contaminantes?
7. ¿Por qué es diferente el coeficiente de extinción molar para los diferentes tipos de
ácidos nucleicos (ADN, ADN de cadena sencilla, ARN) si todas estas moléculas están
compuestas por las mismas bases nitrogenadas?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 5. Extracción de ARN

Desde hace algunos años, se ha dedo cada vez mayor importancia a las diversas
moléculas compuestas o que involucran al ARN. Esto debido a la gran canida de funciones
relacionadas a estas moléculas que constantemente se han descubierto. Dentro de estás
están involucradas, la regulación de la transcripción-traducción, regulación del ciclo
celular, regulación del desarrollo celular, comunicación intercelular, entre otras.
Si bien, al igual que el ADN, es un ácido nucleico, la extracción de ARN resulta

mucho más complicada. Esto es debido a la diversidad de tamaños y localizaciones del
ARN, así como su mayor facilidad para ser degradado tanto por agentes internos como
externos a la célula.
La que aquí se presentan una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son
homogenizadas en tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-
cloroformo a pH reducido. El rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de
muestra y generalmente esta en un intervalo de 4-7 µg/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o
106 células.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ARN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Conocer la metodología básica para extracción de ARN,
Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ARN.
Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa
MATERIALES
Cloroformo: alcohol isoamílico (49:1, v/v)
Etanol
Isopropanol
Nitrógeno liquido
Fenol (equilibrado con TE a pH 6.0)
Acetato de sodio (2 M, pH 4.0)
Solución D (solución desnaturalizante)
Agua desionizada
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo

Gradillas
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
Material biológico
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubada por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de >200 rpm.
Una planta de tabaco o de lechuga fresca.
IMPORTANTE:
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo y cubrebocas.
De ser posible, todo el material con que se trabaje debe ser previamente tratado con algún
inhibidor de ARNasas (Di etil pirocarbonato,DEPC) o al menos esterilizado. Procurar
llevar a cabo todo el priceso en baño de hielo.
Sesión 1.
1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a
37°C con agitación constante de >200 rpm.
2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga están en condiciones sanas y frescas.
Sesión 2. Preparación de meustras biológicas y extracción de ARN.

Preparación del cultivo de E. coli
1. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
2. Centrifugar el tubo a 12 000 rpm. durante 2 min.
4. Si la concentración celular es muy baja, repetir los pasos 1 y 2 una o dos veces.
5. Mantener la pastilla celular en hielo
Preparación del tejido vegetal
6. Cortar cuidadosamente 1-2 g de tejido foliar.

7. Colocar el tejido en un mortero estéril libre de RNAsas y adicionar nitrógeno
líquido.
8. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener un polvo fino.

9. Transferir el macerado a un tubo nuevo estéril.
Extracción de RNA de células bacterianas y vegetales

El tratamiento siguiente es el mismo tanto para las células bacterianas como para el
tejido vegetal a menos que se indique lo contrario.
METODOLOGÍA I: Tiocianato de Guanidina
10. Adicionar 3 mL de la solución D.

11. Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador para el
caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de
1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con macerar con un pistilo de
plástico pequeño.
12. Transferir el homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de sodio
2 M, 1 mL de fenol (pH 6.0) y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamílico por cada
mililitro de solución D.
13. Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 5 min.
14. Centrifugar a 9000 rpm. por 5 min a 4°C.
15. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
16. Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar e
incubar a -20°C mínimo 1 hr.
17. Centrifugar a 10,000 g (9000 rpm.) por 30 min a 4°C.
18. Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solución D.
19. Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20°C.
20. Centrifugar 10 min a 4°C.
21. Decantar y adicionar 500 µL de etanol al 70%.
22. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 min.
23. Resuspender en 50-100 µl de H2O destilada estéril o regulador TE. Almacenar la
solución de ARN a -70°C.
24. Estimar la concentración de ARN midiendo la absorbancia de una dilución 1:200 de
la muestra a 260 nm.
25. Separar 5 µL de la muestra de ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Solución D
4 M Tiocianato de guanidina
25 mM citrato de sodio
0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio
0.1 M -mercaptoetanol
Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 mL de H2O, 17.6 mL de 0.75 M de

citrato de sodio (pH 7.0), y 26.4 mL de 10% (w/v) lauril sarcocianato de sodio. En una
parrilla a 65°C mezclar los ingredientes con ayuda de agitación magnética, guardar a
temperatura ambiente y adicionar 0.36 mL de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50 mL de la

solución D justo antes de usar.
METODOLOGÍA II: Trizol
10. Adicionar 1 mL de trizol frío a la muestra (vegetal o microbiana).

11. Incubar 5 minutos a temperature ambiente.
12. Adicionar 0.2 mL de cloroformo y mezclar por inversión.
13. Centrifugar 10 minutos a 10,000 rpm a 4 °C.
14. Inclinando el tubo a 45°, recuperar con la micropipeta la fase acuosa (superior) a un tubo
nuevo.
15. Adicionar 0.5 mL de Isopropanol frío a la fase acuosa.
16. Incubar por 10 minutos a 4 °C.
17. Centrifugar por 10 minutos a 10,000 rpm a 4 °C.
18. Desechar el sobrenadante, y resuspender la pastilla en 1 mL de etanol al 70 % frío.
19. Centrifugar 10 min a 10,000 rpm a 4 °C.
20. Desechar el sobrenadante.
21. Dejar secar el tubo (la pastille) sobre papel absorbente.
22. Resuspender ne 20-50 µL de agua libre de ARNasas.
1. ¿Por qué esta metodología emplea el fenol a pH 6 y no a 8 cómo en casos anteriores?

2. Además de lo empleado en éste protocolo ¿De qué manera pueden eliminarse el ADN y las
proteínas de la muestra?
3. ¿Qué tipos de ARN existen en la célula y qué funciones cumplen? (Mencionar al menos 7).
4. ¿Cómo pueden aislarse los diferentes tipos de ARN?
5. ¿Qué aplicaciones tienen los diferentes tipos de ARN?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina
Cuando se desea introducir un gen para expresión en bacterias, es necesario que este gen se
encuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresión deseados. El
vector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partír de la
cual se purifica. La extracción por lisis alcalina consiste en la lisis de las células utilizando
una solución con NaOH y SDS. Posteriormente la separación entre los restos celulares y el
ADN se logra por precipitación mediante la adición de una solución de acetato de potasio.
Para purificaciones más exhaustivas se utiliza una solución de fenol:cloroformo. Los ácidos
nucleicos se separan en la fase acuosa y las proteínas en la fase orgánica.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ADN plasmídico de E. coli.
Conocer la metodología básica para extracción de ADN plasmídico de bacterias.

Determinar la integridad del ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa.
MATERIALES
Soluciones
Solución de lisis alcalina I

Solución de lisis alcalina II
Solución de lisis alcalina III
Ampicilina (o el antibiótico adecuado para la cepa de trabajo)
Etanol
Fenol: cloroformo pH 8.0
TE (pH 8.0)
Medios de cultivo
Cajas con medio LB con ampicilina 100 µg/mL

Cajas con medio LB
IMPORTANTE:
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Sesión 1. Preparación de los cultivos de
1. Crecer E. coli transformada con un plásmido en medio LB (3 mL) adicionado con el
antibiótico a la concentración adecuada para el plásmido de trabajo durante toda la
noche, incubado por 14-16 h a 37°C con agitación constante de >200 rpm.
Sesión 2. Extracción de ADN plasmídico
2. Centrifugar a velocidad máxima por 30 segundos 2 mL del cultivo a temperatura

ambiente.
3. Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del medio.
4. Resuspender la pastilla en 100 µL de solución Alcalina I fría, mezclar
vigorosamente con ayuda del vortex.
5. Adicionar 200 µL de solución de lisis II recién preparada, cerrar el tubo y mezclar
invirtiendo el tubo cinco veces, NO USAR VORTEX. Poner el tubo en hielo
6. Adicionar 150 µL de solución alcalina III fría, cerrar el tubo e invertir el tubo cinco
veces para mezclar. Incubar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR).
7. Centrifugar a máxima velocidad por cinco minutos.
8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, cuidando no arrastrar sobrenadante.
9. Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y
centrifugar a velocidad máxima por 3 min.
10. Transferir la fase superior a un tubo nuevo.
11. Precipitar el ADN plasmídico adicionando 2 volúmenes de etanol absoluto, incubar
a -20ºC durante 20 minutos.
12. Centrifugar a máxima velocidad 5 minutos a 4°C.
13. Remover el sobrenadante.
14. Adicionar 1 mL de etanol al 70% (tener cuidado de no resuspender la pastilla),
15. Centrifugar a máxima velocidad por 2 minutos a 4°C.
16. Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una toalla secante para permitir
que la pastilla quede lo más seca posible.
17. Resuspender la pastilla en 50 µL de agua desionizada estéril o regulador TE y
guardar a -20°C.
Soluciones
Solución de lisis alcalina I

50 mM glucosa
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Guardar a 4°C
Solución de lisis alcalina II

0.2 N NaOH
1% (w/v) SDS
Preparar la solución al momento.
Solución de lisis alcalina III

5 M acetato de potasio, 60.0 mL
Ácido acético glacial, 11.5 mL
H2O, 28.5 ml
Guardar a 4°C
1. ¿Qué fenómenos químicos y biológicos ocurren cunado se adiciona caad una de las
soluciones de lisis alcalina?
2. ¿Por qué se prefiere hacer la extracción con Fenol : Cloroformo, y qué pasaría si se
omitiera este paso?
3. ¿Cuáles son los elementos básicos de un plásmido?
4. ¿Qué tipo de plásmidos existen?
5. ¿Qué otro tipo de vectores existen?
6. ¿A que se debe la presencia de múltiples bandas correspondientes al plásmido? ¿Cómo
puede saberse el tamaño real del plásmido?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.
La ligación de fragmentes de interés en plásmidos ha sido una metodología presente en casi

todos los estudios que tienen que ver con técnicas de Biología Molecular. Se han utilizado
diferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre los que se encuentran el pUC 19,
pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la inserción de un gen o de un fragmento del
gen en un vector, generalmente se lineariza el vector con enzimas de restricción y al mismo
tiempo se digiere el gen con las misma enzimas de restricción. Después de la linearización
del vector y de la restricción del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa en
presencia de ATP para que la enzima catalize la reacción de ligación.
Objetivo General
• Realizar la inserción de material genético dentro de un vector plasmídico.
• Conocer la metodología básica para cortar un vector utilizando enzimas de

restricción.
• Conocer la metodología básica para insertar material genético de interés
dentro de un plásmido previamente tratado con enzimas de restricción.
MATERIALES
• Plásmido
• Enzimas de restricción
• Material genético de interés (gen, producto de PCR o casete).
• T4 ADN Ligasa
• Buffer de restricción.
• Buffer de Ligación.
• Termo-Bloque.
MÉTODOLOGÍA
Sesión 1. Reacción de restricción
1. En un tubo estéril, adicionar 2 µl de buffer de restricción.

2. Adicionar 200-500 ng de plásmido.
3. Adiciona 1 U de la enzima de restricción.
4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL
5. Incubar a la temperatura y tiempo indicados para la enzima en el termobloque.
6. Inactivar la enzima a las condiciones indicadas por el fabricante.
Sesión 2. Reacción de ligación
7. Colocar 2 µL de buffer de ligación en un tubo estéril.

8. Adicionar 1 µL de T4 ADN ligasa.
9. Añadir (100-300 ng) de plásmido previamente tratado con enzima de restricción.
10. Agregar (500-900 ng) del fragmento a insertar deseado.
11. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL
12. Incubar a 22ºC durante 2 horas en el termobloque, o a temperatura ambiente toda la
noche.
13. Almacenar a -20ºC hasta el momento de su uso.

1. ¿Cuántos tipos de enzimas de restricción se conocen? ¿Qué características tiene cada
tipo?
2. ¿Para qué utilizan las bacterias las ER? ¿Por qué es importante la metilación?
3. ¿Qué características posee un sitio de corte?
4. ¿Qué aplicaciones adicionales tienen las ER?
5. ¿Qué tipo de ligasas se prefiere emplear? ¿Para qué necesitan las células ligasas?
6. ¿Qué contiene el buffer de la ligasa? ¿Cuál es la función de estos componentes?
7. ¿Cómo funciona el sistema de selección de colonias blancas y azules del gen Lac?
8. ¿Cómo se puede prevenir que se recircularice un vector con extremos compatibles?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener más de 10 millones

de copias de una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta. La
sensibilidad de ésta técnica requiere de cuidados para que la muestra no esté contaminada
previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, Mutagénesis, RTPCR)
con diferentes aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.
Objetivo General
• Obtener un producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR).
• Conocer la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa.
• Identificar la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector
en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.
MATERIALES
• Termociclador.
• ADN molde
• Tubos de polipropileno de 200 µL.
• Oligonucleótidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido
• Taq DNA polimerasa
• Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 µL
• 10X PCR buffer
• MgCl2
• dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200µL de

capacidad en hielo.
2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1.
Tabla 1. Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa

Concentración final Muestra (µL) Control negativo(µL)
AND molde 10 pg-1 µg 1 µL* -----
Iniciador Sentido 10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
Iniciador Antisentido10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
Buffer PCR 10X 1X 5 µL 5 µL
25 mM MgCl2 1-4 mM 6 µL* 6 µL*
dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 µL 5 µL
Agua MilliQ estéril 27.6 µL * 28.6 µL *
Taq polimerasa (5U/ µL) 1.25 U / 50 µL 0.2 µL** 0.2 µL**
*El volumen depende de la concentración final requerida.

** Se coloca al final en la reacción en frío.
3. Mezclar perfectamente la reacción por pipeteo y centrifugar unos segundos en caso
de ser necesario.
4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:
a) 95ºC 2 min
b) 95°C 30s (desnaturalización),
c) 55°C 30 s (alineamiento, la Tm puede veriar dependiendo de los oligos),
d) 72°C 1 min (elongación, el tiempo varía por la enzima y tamaño del producto)
e) Repetir los pasos b a d 30 veces
f) 72ºC 4 min.
g) 4ºC (refrigerar hasta el momento de uso)
5. Nalizar una muestra del fragmento amplificado por electroforesis en un gel de
agarosa.
6. Verificar que el tamaño amplificado por PCR sea el esperado.

1. ¿Qué criterios deben considerarse en el diseño de oligos (primers)?
2. ¿Cuál es la importancia de la Tm? Si los primers tienen Tm diferente ¿Cuál de las dos
se usa y por qué?
3. ¿De dónde se aislaron las primeras polimerasas? ¿Qué características son deseables
para el empleo de esta enzima?
4. ¿Por qué son necesarios los pasos extendidos de desnaturalización inicial y
polimerización final?
5. ¿Qué se puede modificar si no se observa amplificación?

6. ¿Qué se puede modificar si hay amplificación inespecífica?
7. ¿En qué consisten y para qué se usan la RT-PCR y qRT-PCR?
8. Investigar al menos tres aplicaciones adicionales de la PCR: Gibbson, SLIC,
Mutagénesis, Secuenciación, RAPD, etc.
REFERENCIAS

PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
Uno de las metodologías rutinarias en los laboratorios de Biología Molecular es la

preparación de células competentes. Las células competentes pueden ser almacenadas y
usarse para la propagación de vectores de interés. Hay varios métodos para preparar células
competentes pero quizá el más utilizado sea el que se realiza con cloruro de calcio ya que
es eficiente, barato y generalemente se obtienen poblaciones celulares con alta proporción
de transformantes.
OBJETIVOS
Objetivo General
Aprender a preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2.
Conocer la metodología básica para hacer células competentes de Escherichia coli

con CaCl2.
Determinar la viabilidad de las células calcio competentes de Escherichia coli.
MATERIALES
- CaCl2 (0.1 M)
- Glicerol
- Espectrofotómetro
- Gradillas para micro tubos
- Hielo
- Medio LB líquido (puede emplearse 2x YT o SOC)
- Micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Puntas para micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Tubos de polipropileno 1.5 mL estériles
- Centrífuga
1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas de agar LB
2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de médio LB e incubar a 37°C con agitación
a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).
3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación,
hasta que la densidad óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por 10

min a 4°C.
5. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min.
7. Resuspender el paquete celular en 30 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.
19. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete celular
en 2 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío.
20. Adicionar 1 mL de Glicerol estéril al 50%.
21. Alicuotar en tubos (100, 500 o 1000 µL por alícuota, según instrucciones del
profesor)
22. Las células competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48
h a 4ºC.
23. Para periodos de almacenamiento más largos, guardar en alícuotas de 100 µL en
tubos estériles de 1.5 mL a -70ºC. Las células se mantienen viables por
aproximadamente 3 meses.
1. ¿Cuál es el efecto del calcio para inducir células transformantes?

2. ¿Por qué es necesario mantener durante todo el proceso de inducción de competencia las
células en hielo?
3. ¿Cuál es la función del glicerol?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes
La ligación de fragmentos de ADN interés en plásmidos ha sido una metodología

fundamental en casi todos los estudios de transformación de organismos. Se han utilizado
este tipo de plásmidos como el pUC 19 linearizado con enzimas de restricción específicas,
una vez hecho esto se realiza una reacción de ligación plásmido-inserto con la enzima
ligasa.
El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para ser
propagado. Los metodos más utilizados para la INTRODUCCIÓN de DNA en células
competentes son la electroporación y la que involucra choque térmico. Las células
preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son las que se utilizan
mayormente. El proceso consiste en preparar las células (Práctica 9) y después incubarlas
con el vector a introducir, seguido de un choque térmico. Este método es eficiente y
generalmente da rendimientos aceptables para la inserción de vectores después de una
reacción de ligación.
Objetivo General
• Realizar la transformación de células competentes con un plásmido extraído

por lisis alcalina.
• Conocer la metodología básica para transformar células competentes con un

plásmido bacteriano
• Determinar la eficiencia de transformación de células competentes de
Escherichia coli preparadas con CaCl2.
MATERIALES
• Células competentes
• Incubadora
• Placas de agar LB-Ampicilina
• Reacción de PCR (Práctica 8)
• Termo-Bloque (Práctica 7)
• Plásmido
• Medio de cultivo líquido (LB, SOC, 2xYT)
A. Muestra de interés
1. Adicionar 4 µL de reacción de PCR a un tubo de polipropileno.

2. Adicionar 1 µL del buffer de ligación.
3. Adicionar 1 µL del Plásmido abierto con corte romo.
4. Adicionar 1U de ligasa, y completar la reacción a 20 µL con agua desionizada.
5. Mezclar la reacción suavemente, centrifugar brevemente.
6. Incubar por 16 h a 4°C.
B. Transformación y controles.
7. Descongelar en baño de hielo una de las alícuotas de células competentes (1h).

8. Preparar en 5 microtubos de 1.5 mL estériles alícuotas de 100 µL de células
competentes (mantener en el baño de hielo).
9. A una de las alícuotas, adicionar 1 µL de la mezcla de ligación (1); a otra alícuota,
adicionar 5 µL de la mezcla de reacción (5); a otra, adicionar 2 µL de un plásmido
control (sin cortar, control de transformación); a las últimas dos, no adicionar nada
(controles negativo y de viabilidad).
10. Incubar a 4 ºC durante 5 min.
11. Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 30 s.
12. Colocar el tubo a 4 ºC durante 2 min.
13. Adicionar 900 µL de medio altamente nutritivo (SOC o 2xYT).
14. Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora.
15. Sembrar por extensión con varilla 100-200 µL de los tubos 1, 5, CT, CN en placas
de medio LB con antibiótico.
16. Sembrar por extensión con varilla 100-200 µL del tubo CV, en placa de LB SIN
antibiótico.
17. Incubar las cajas durante 16 horas a 37ºC
18. Contar las colonias presentes en cada placa
1. ¿Cuál es el efecto del choque térmico?

2. ¿Qué otros métodos de transformación existen? ¿Qué ventajas y desventajas presentan
respecto a este?
3. ¿Qué criterios se consideran para elegir el adecuado entre los diferentes métodos de
transformación?
4. ¿Qué es un marcador de selección? ¿Cuál se utilizó y qué otros existen?

5. ¿Por qué es importante la selelción del vector y construcción génica adecuados para cierta
célula?
REFERENCIAS

PRÁCTICA 11. Expresión de proteínas recombinantes y detección por Inmunodetección

en estado sólido (Western blot)
La ingeniería genética puede diseñar un sistema de expresión de proteínas, desde obtener el

gen de interés, diseñar el casete de expresión, construcción del vector, hasta el sistema de
purificación. Sin embargo, existen numerosos sistemas de regulación celular, tanto
conocidos como penos considerados que pueden afectar el sistema de producción diseñado.
Por ello, una vez que se transforma un organismo, es necesario evaluar a nivel laboratorio
el funcionamiento del sistema de expresión, inicialmente a través de la medicoón de la
producción de proteína.
El western blot es una técnica inmuno enzimática utilizada en biología molecular para la
detección de proteínas en muestras crudas o extractos celulares. Esta técnica tiene múltiples
aplicaciones, tanto en el área de investigación como en la de diagnóstico clínico, en donde
es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.
La técnica consiste en realizar la separación de las proteínas de la muestra por electroforesis
en gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.i
nitrocelulosa), ya sea por gravedad, difusión o un campo eléctrico.
Una vez en la membrana, la proteína es identificada mediante un inmunoensayo, en donde
se liga a la proteína de interés un anticuerpo específico contra ella ligado a una enzima, la
cual permite la detección.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Conocerá y realizará la técnica de westtern blot para detección de proteína

mediante la reacción antígeno-anticuerpo.
• Conocer la metodología básica para realizar electroforesis en gel de

poliacrilamida.
• Conocer la metodología básica para realizar una electrotransferencia.
• Conocer la metodología básica para detectar proteínas por medio de un
inmunoensayo.
A. Expresión de proteína.
1. Inocular 5 mL de caldo LB con antibiótico con una asada de E. coli transformada con
un plásmido que promueva la expresión de la proteína de interés.
2. Incubar por toda la noche a 37 °C con agitación constante.
3. Inocular con 1 mL de medio un matras de 250 mL con 60 mL de medio LB.
4. Incubar a 37 °C con agitación constante.
5. Tomar muestras de 1 mL del caldo de cultivo cada 2h (tomar muestra t0), durante 8 o
12h, almacenarlas en congelación.
NOTA: En caso de tener un sistema de expresión inducible, se toma la muestra inicial, se

permite el corecimiento bacteriano por 4-6 horas, tras lo cuál se induce con el agente
apropiado y se comienza en este momento la toma de muestras.
B. Tratamiendo de la muestra.
6. Descongelar y centrifugar las muestras de la cinética.

7. Decantar el sobrenadante y adicionar 200 mL de agua destilada estéril a la pastilla.
8. Moler la pastilla con un pistilo hasta obtener una mezcla homogénea.
9. Centrifugar a 10,000 rpm por 5 minutos.
10. Recuperar el sobrenadante (extracto) en un tubo limpio.
11. Realizar diluciones 1:5, 1:10 y 1:100 del extracto.
12. Determinar la concentración de proteína por el método de Bradford.
13. A una muestra que contenga hasta 20 µg de proteína total se le adiciona amortiguador
de muestra hasta un volumen final de 85 µl.
14. Añadir 10 µl de solución de azul de bromofenol y 5 µl de ß-mercaptoetanol.
15. Incubar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.
C. Preparación del Gel.
16. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.
17. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.
18. Con agua, revisar que no haya fugas en el sistema, posteriormente secarlo.
19. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando
el persulfato de amonio y el TEMED al final.
20. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y
alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Con cuidado, colocar una
capa de agua sobre el gel. Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
21. Remover la capa de agua y dejar secar el remanente.
22. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.
23. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas.
Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
D. Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel.
24. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y ésta en la cámara.
25. Preparar amortiguador de corrida (Laemmli)1x.
26. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa hasta
cubrir los electrodos.
27. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 µl de cada muestra y
marcador de peso molecular en los pozos (pueden utilizarse las muestras de la
cinética microbiana, muestras de gamma globulinas obtenidas de acuerdo al Anexo
II o alguna otra con la que se cuente).
28. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder.
29. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.
30. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida
alcance el final del gel.
31. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la
cámara.
32. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador de
transferencia.
NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teñido para observar
el corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.
E. Electro transferencia.
33. Incubar trozos del tamaño del gel de fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de
espesor) en amortiguador de transferencia 30 min antes de iniciar el montaje de los
cartuchos.
34. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor al de los geles.
Este procedimiento debe ser llevado a cabo con guantes. Colocar en un recipiente
con amortiguador de transferencia.
35. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y cuidadosamente, marcar sobre la
membrana, con lápiz, el frente de corrida y el número de carril del gel.
36. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras scotch, dos papeles filtro, el gel,
la membrana de nitrocelulosa, dos papeles filtro más y dos fibras scotch más. Hay
que eliminar cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes capas.
37. Colocar el cartucho en la cámara de electrotransferencia de manera que el gel quede
hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+).
38. Llenar la cámara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado.
39. Cerrar la cámara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,
cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60ºC.
40. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.
NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teñir una de ellas para
observar la transferencia de las proteínas antes de proseguir con el siguiente paso.
F. Reacción inmunoenzimática
41. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y agregar solución de

bloqueo, de manera que cubra completamente la membrana. Incubar 2 horas a
temperatura ambiente con agitación continua.
42. Retirar la solución de bloqueo y realizar 3 lavados con PBS-Twen de 5 min. cada uno,
con agitación continúa.
43. Incubar la membrana con la solución de proteína complementaria a la que se
encuentre unida en la membrana (si se tiene antígeno en la membrana, incubar con
solución e anticuerpo, y viceversa) durante 2 horas.
44. Retirar la solución de proteínas y repetir el paso 42.
45. Se adiciona a la membrana la solución de avidina – HRP (peroxidasa de rábano) o
anticuerpo secundario marcado y se incuba por 2 horas con agitación continua.
46. Retirar la solución de conjugado y repetir el paso 42.
47. Se incuba la membrana en la solución de cromógeno / sustrato en agitación continua
hasta que aparezcan las bandas.
48. Se enjuaga la membrana con agua desionizada y se deja secar.

1. ¿Cuál es la ventaja e importancia de los inmunoensayos?
2. ¿Qué ventaja tiene la espresión de proteínas recombinantes de manera constitutiva o de
manera inducible?
3. ¿Qué información proporciona el Western blot que el ELISA no?
4. ¿Por qué para proteínas se prefeiren los geles de poliacrilamida sobre los de agarosa?
¿Qué ventajas y desventajas tienen unos y otros geles?
5. ¿Por qué es necesario transferir las proteínas a una membrana en lugar de hacer la
inmunotransferencia sobre el gel?
6. ¿Qué tipos de membranas pueden emplearse para la trasnferencia? ¿Qué ventajas y
desventajas tienen?
7. ¿Por qué es importante bloquear la membrana tras la transferencia de las proteínas del
gel?
8. Además de las enzimas ¿Qué otras señales pueden emplearse para la detección? ¿Qué
ventajas y desventajas tiene cada tipo?
9. ¿Qué ventajas y desventajas presenta el empleo de un segundo anticuerpo para la
detección?
10. Este sistema emplea SDS-PAGE, un sistema en condiciones desnaturalizantes. ¿Qué
inconveniente representa esto y qué otras opciones existen?
REFERENCIAS

ANEXO I
Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)
Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5
Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26 mL
Amortiguador pH 6.8 0.5 mL
Agua desionizada 1.22 mL
Persulfato de amonio 0.01 mL
TEMED 0.02
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
• Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%

Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°
C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico.
• Amortiguador del gel separador pH 8.8

Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador del gel separador pH 6.8

Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador de corrida 5X / SDS

Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y
aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.
• Amortiguador de muestra pH 6.8

Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar
el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a
100 mL.
• Persulfato de amonio al 10%

Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.
• Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL

Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeración.
• Solución teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de agua
desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el metanol y
adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.
• Solución desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.
• Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2
M y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4 ºC. Nota: No ajustar pH, oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar hasta 3
veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.
• Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)

Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB se
prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato de

sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con agua
desionizada.
• Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)

A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.
• Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardar
a –20 °C.
• Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%

Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml con
agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ámbar.
• Solución cromógeno / sustrato

Para HRP: Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de
PBS, agregar 25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara
inmediatamente antes de usarla.
ANEXO II
PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO
DE AMONIO.
INTRODUCCIÓN.
Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos está principalmente presente

en la fracción gamma de las proteínas del suero. Desde entonces se han diseñado diferentes
métodos para la obtención de esta fracción sérica.
Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos
específicos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus
antígenos. Así, los anticuerpos pueden ser precipitados por la adición del antígeno en
estado soluble, o ser adsorbidos al antígeno previamente insolubilizado. En ambos casos, el
complejo resultante puede disociarse por modificación del pH a valores entre 2.5 y 4.0 ó
9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentración de sales o la concentración del antígeno
soluble. Después, los anticuerpos se recuperan por alguno de los métodos de separación
inespecífica.
Las separaciones inespecíficas están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los
anticuerpos. Entre estos métodos, los más utilizados son la precipitación con etanol, con
sulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato de
celulosa, gel de almidón, etc.), cromatografía de intercambio iónico y filtración en tamices
moleculares.
Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la
precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. Generalmente, se
considera que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado de
pureza.
La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido
como “salting out”, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la
molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además
neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insolubiliza y precipita.
OBJETIVO.
Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitación con sulfato de amonio
a una saturación final del 33% y detección por medio de un gel de electroforesis con
gradiente desnaturalizante.
MATERIALES.
Material por grupo:
1 centrífuga clínica.
6 agitadores magnéticos
5.0 mL de BaCI2 al 10%.
1 parrilla con agitación.
Material por equipo:
10 mL de suero de conejo
10 mL de suero de humano.
20 mL de solución sobresaturada de sulfato de amonio.
5.0 mL de NaOH 2N.
50 mL de solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.
20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Papel indicador de pH.
Tubo para diálisis.
10 cm de hilo grueso.
2 tubos falcón de 15 mL, graduados.
2 vasos de p.p. de 100 mL
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
1 pipeta serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.
1 matraz Erlenmeyer de 25 mL.
1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.

2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un vaso de p.p., medio volumen de la
solución sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN
CONSTANTE. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%.
3. Continuar con la agitación durante 10-15 min después de terminar la adición del sulfato
de amonio.
4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcon y centrifugar los tubos a
temperatura ambiente a 3500 rpm durante 15 min.
5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del
suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la
mitad o un tercio del volumen original del suero.
9. Dializar contra SSRB en frío (4° C) y con agitación, durante 2 días, realizando 2 cambios
diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para
saber si efectivamente se eliminó el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de diálisis
se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera completa si ya
no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm.
durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Guardar las gamma globulinas para la separación de isotipos.
12. Determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford.
13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas.
REFERENCIAS.
Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods in
Immunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor.
Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoquímica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa
Médica Mexicana.
PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo ligado a enzimas (ELISA)
El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en inglés (enzyme
linked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.En este método
se utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad de
unión específica al antígeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reacción de
óxido-reducción, en la cual el sustrato se transforma en un producto colorido. En este
sistema el antígeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase sólida insoluble (micro pozos,
tubos o perlas de polivinilo o estireno). El método de ELISA tiene aplicaciones muy
variadas, lo cual lo hace muy versátil: diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o
parasitarias, cuantificación de hormonas, cuantificación de haptenos, titulación de
anticuerpos en bajas concentraciones, determinación de anticuerpos no precipitantes
Existen diversas variantes del método de ELISA, como son los métodos directo, indirecto y
en “sándwich”, y el método de ELISA competitivo. Estos permiten la determinación de
antígenos en fluidos biológicos, a excepción del método indirecto con que se detectan
anticuerpos.
En los métodos directos, el anticuerpo dirigido específicamente contra el antígeno es el que

lleva unida la enzima. En cambio en los métodos indirectos, el conjugado enzima-
anticuerpo reacciona con el primer anticuerpo, el cual ya reaccionó con el antígeno. En el
método de sándwich, el conjugado antígeno anticuerpo reacciona con el antígeno que se ha
unido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la fase sólida. El o los componentes que no
reaccionaron se eliminaron por lavados; por último se adiciona el sustrato de la enzima y se
mide la intensidad del color desarrollado, el cual es proporcional a la magnitud de la
reacción antígeno-anticuerpo.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno conocerá y realizará la técnica de ELISA para detección de antígeno o

anticuerpo.
Conocerá la metodología básica para adsorber antígenos en micro placas de ELISA.

Ligará antígenos o anti anticuerpos conjugados a antígenos adsorbidos en placas de
ELISA.
Determinará la presencia del antígeno deseado por la reacción de una enzima
conjugada a anticuerpo.
MATERIALES
Estufa regulada a 37 °C.
Placas de ELISA de poliestireno (fase sólida)
Antígeno “H” u “O”, solución al 5% en solución salina 0.85%.
Pipetas automáticas de 20-200 ml
Anticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRP
Suero humano control positivo y suero humano control negativo
Sustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2 al 30% (v/v) en 10 ml de regulador de
citratos 0. XM pH 5.0
Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina ó 2% de albúmina sérica bovina (BSA), en
regulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6
Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05%
Tween 20.
Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de
0.25% de gelatina.
Método de ELISA indirecto.
1. Adicionar 0.2 mL de antígeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4°C
durante 24 horas para permitir la adsorción del antígeno a la fase sólida.
2. Eliminar las soluciones por inversión de la tira de pozos, y desechar el líquido
remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.
3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solución de lavado. Dejar los pozos llenos con esta
solución durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solución de la manera
descrita en el paso 2. Repetir dos veces más con el fin de eliminar todo el antígeno no
adsorbido.
4. Bloquear con 0.1 mL de una solución de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a
37°C durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbió el
antígeno.
5. Repetir el paso 2.
6. Adicionar 0.1mL de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo.
Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37°C durante 30 minutos para
permitir la reacción antígeno-anticuerpo.
7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccionó.
8. Adicionar 0.1mL de conjugado (anticuerpo/enzima) diluido en PBSG, a todos los
pozos. Incubar a 37°C durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los
anticuerpos humanos que se hayan unido al antígeno en la fase sólida.
9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado.
10. Adicionar 0.1 mL de una solución recién preparada del sustrato de la enzima: H2O2 al
0.04% en regulador salino-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al 0.04%
(como cromógeno). Incubar en oscuridad para permitir la reacción enzimática y el

consecuente desarrollo de color (Nota: el cromógeno es fotosensible)
11. Detener la reacción enzimática adicionando 1 mL de H2SO4 8N en cada pozo.
12. Determinar la presencia o ausencia del antígeno de interés contra los controles de
manera visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.
1. Esquematiza el sistema de un ELISA directo, indirecto y ssanwich y competitivo.

2. ¿Qué otros tipos de ELISA existen, y qué aplicaciones tiene cada uno de ellos?
3. ¿Qué ventajas tiene el ELISA sobre el Western blot?
4. ¿Qué características deben cumplir los anticuerpos empleados para los inmunoensayos?
5. ¿Qué pasaría si se omitieran los lavados?
6. ¿Cómo se determina el título de anticuerpo o antígeno mediante ELISA?
7. ¿Qué pasaría si no se detiene la reacción enzimática?
REFERENCIAS
1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:43

2. Kemeny D. M. (1991) A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-
215.
3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme linked immunosorbet assay
(ELISA). A guide with abstracts of microplate application. Dynatech Laboratories, Inc.
4. Profesores del Departamento de Inmunología (1992) Manual de Prácticas de
Inmunología. ENCB, IPN pp.47-51.
Práctica 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando

Agrobacterium tumefaciens
INTRODUCCION
La modificación genética de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generación de especies resistentes a condiciones de estrés (sequía, heladas, alta salinidad,
etc), la mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminoácidos o
precursores de vitaminas, etc), obtención de plantas para fitoremediación (remoción de
metales pesados), la obtención de variedades con flores de color no convencional, la
producción de alguna proteína o metabolito con propiedades terapéuticas (vacunas,
anticuerpos, alcaloides, etc).
Esta última es de gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción de
metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto de
los sistemas de producción. Algunas de estas ventajas son: el costo de producción es en
muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, proteínas más complejas
(anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteínas que requieren un
procesamiento postraduccional, etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas y
granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
La modificación genética de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos los
cuales pueden ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se encuentra
el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol (PEG) con lo
cual se facilita la introducción del material genético. Sin embargo, el tratamiento con PEG
tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de células con pared celular
intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente en cultivo in vitro). Entre los
métodos físicos se encuentran principalmente la microinyección y el bombardeo de
micropartículas (también conocido como biobalística). Este último, que consiste en la
introducción del material genético al interior del núcleo utilizando micropartículas
aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular importancia en la última década, a
pesar del costo elevado, debido a que es altamente efectivo y reproducible.
A pesar de ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear de plantas
es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies relacionadas
como A. rhizogenes y A. vitis son patógenos no destructivos de plantas que tienen la
capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su
hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos
de la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1].
Desde el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.
tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha sido
fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas. Durante el
proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN
(ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los
genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la
síntesis de aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son utilizados por A.
tumefaciens como fuente de carbono y nitrógeno. El T-DNA esta localizado en el plásmido
Ti (Plásmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que además contiene los genes
vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el
genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las raíces
infectadas mediante un mecanismo semejante al de A. tumefaciens. En este caso el
plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido inductor de raíces; root inducing
plasmid).
Un hallazgo crucial que permitió el diseño de vectores para la transformación

genética de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que sólo las
secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo.
Algunos o todos los genes bacterianos del T-DNA pueden ser removidos originando
vectores desarmados, los cuales pueden transformar células vegetales sin los síntomas
generales de la infección bacteriana [3].
OBJETIVOS
Objetivo general
Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética
nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
Conocer el principio básico de la modificación genética nuclear de plantas
utilizando un vector binario.
Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención de plántulas
modificadas genéticamente.
Conocer y llevar a cabo la metodología para la identificación de plantas
modificadas genéticamente.
MATERIALES
Materiales biológicos
• Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un derivado del plásmido pBIN 19, el cual
contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del péptido de transferencia RbcS y se
encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene además el gen nptII que
codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere resistencia a
kanamicina en las células portadoras del gen.
• Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario desarmado que
porta los genes vir.
• Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de cultivo

a 25°C durante 4-6 semanas.
• Primers para la amplificación total o parcial por PCR del gen nptII.
Equipos
• Campana de flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora
orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,
Material de laboratorio
• Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,
cajas Petri desechables, algodón, bisturí, pinzas de disección, papel filtro, papel
aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un horadador
de 0.5 cm de diámetro.
Reactivos y medios de cultivos

• Medio LB, Medio MS, Medio NBM (Medio MS suplementado con vitaminas B5,
0.1 mg/L de ácido nicotinadelínico y 1 mg/L de benzilaminopurina),
Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100
mg/mL, etanol al 70%, solución de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre
(solución al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado
biología molecular.
Primera sesión. Preparación de material y medios de cultivo
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición de soluciones
y reactivos)
ampicilina 100 mg/mL

kanamicina 100 mg/mL
estreptomicina 100 mg/mL
carbamicilina 500 mg/mL
Medio LB
Medio NBM
5 cajas petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300

µg/mL.
5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25
µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos
5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500
µg/mL.
Segunda sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio sólido.
1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estría simple en

una de las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina.
2. Control. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con medio LB con
kanamicina y estreptomicina.
3. Incubar ambas cajas a 28 ºC por 36-48 h.
Tercera sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio líquido.
1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de medio

LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitación constante (200 rpm.) a 28ºC
durante 36-48 h.
Cuarta sesión. Preparación de Agrobacterium y modificación genética de N. tabacum
1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo

experimental de la tercera sesión a 7500 rpm. por 10 min. a 4 ºC en un tubo de
estéril de 50 mL.
2. Decantar el sobrenadante
3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo).
4. Disectar 3-4 hojas de plántulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia.
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas petri.
6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener explantes
de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma rápida y evitando
dañar de manera excesiva el tejido.
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión de A.
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro
estéril.
9. Colocar los explantes en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia
arriba. Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el
medio.
10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.
Quinta sesión. Transferencia de explantes a medio de selección
1. Después de 48 h tomar los explantes (cuarta sesión) y transferirlos a las cajas de

Petri con medio NBM (kan 100 µg/mL, car 200 µg/mL). Tener cuidado de que los
explantes mantengan la misma orientación y de dañarlos lo menos posible.
2. Colocar las cajas en incubación a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 3-4
semanas.
Sexta sesión. Preparación de material y medios de cultivo
Preparar el siguiente material:
Medio NBM
5 cajas petri con medio LB y antibioticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300

µg/mL.
5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25
µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos
5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500
µg/mL.
Séptima sesión. Transferencia de explantes a medio de selección fresco
Después de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con kanamicina 100
µg/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientación y de no dañar el tejido. Si los
explantes se han expandido mucho y son demasiado grandes, transferirlos a dos cajas.
Octava sesión. Transferencia de transformadas a medio para formar raíces
Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a medio MSB5
con kanamicina (100 mg/mL) y carbenicilina (200 mg/mL) para favorecer la formación de
raíces.
Novena sesión. PCR confirmatoria de la inserción del transgén
1. Tomar una porción de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 µL de solución (2

µL buffer 10X, µL dNTP 2mM, 2.5 µL de primer F (3pm/ µL), 2.5 µL de primer R
(3pm/ µL), 3 µL MgCl2 25mM, 1 µL Taq pol 1u/µmol y 7 µmol agua). Realizar
estos pasos en hielo.
2. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min a 94 °C, 35 ciclos
de 30s a 94°C, 30 s a 55°C, 30s a 72°C y 1 ciclo de 5 min. a 72°C.
3. Almacenar la reacción en refrigeración.
Décima sesión. Análisis de productos de PCR en gel de agarosa
1. Prepara un gel de agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.

2. En el pozo número 1 del gel correr el marcador de peso molecular
3. Correr el producto de PCR obtenido en la novena sesión en un gel de agarosa al
1%.
4. Correr también controles negativos y positivos a la par.
5. Teñir el gel con Rojo Texas.
CUESTIONARIO PARA DISCUSIÓN.

1. ¿Qué ventajas y desventajas representa el uso de plantas respecto al de bacterias?
2. ¿Cuál es la respuesta generada por las plantas ante el daño mecánico?
3. ¿Por qué es necesario eliminar Agrobacterium de los explantes después de cierto tiempo?
4. ¿Cuál es el procedimiento general para la micropropagación?
5. Mencionar el mecanismo de acción de los antibióticos empleados y cómo es posible que
algunos de ellos funcionen tanto para bacterias como plantas.
6. ¿Qué tipo ed marcadores de selección y genes reporteros pueden utilizarse en plantas?
7. ¿De qué otra manera puede emplearse Agrobacterium para llevar a cabo la transformación?
REFERENCIAS.
[1] Valderrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformación de

plantas mediada por Agrobacterium: “Ingeniería genética natural aplicada”.
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.
[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to Agrobacterium
infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1. Proceedings of the
Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-10440.
[3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.
[4]Bioline. HyperLadder I. Bandas de referencia para un gel de 1% agarosa.
www.bioline.com/images/guides/ladderguide/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe, in
Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology

Manual de Biotecnologia Molecular Revision 2017

Uploaded by

Document Information

Original Description:

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Manual de Biotecnologia Molecular Revision 2017

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

México D. F. Agosto 2017

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA.

Reglamento aprobado por la Academia de Biotecnología de UPIBI en su cuarta reunión ordinaria

EVALUACIÓN DEL LABORATORIO

La evaluación del laboratorio comprende los siguientes aspectos:

Rubro Valor porcentual

Análisis y Discusión de Resultados 20

El informe de la práctica considera los siguientes elementos:

Sección Valor porcentual

PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN

PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.

PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes

PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido

PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)

PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum)

Debe entenderse como una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y

C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de

NORMATIVIDAD SOBRE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

ü Protocolo de Nagoya-Kuala Lumpur sobre Responsabilidad y Compensación

Dentro de la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados, en su

V. Bioseguridad: Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención

VI. Biotecnología moderna: Se entiende la aplicación de técnicas in vitro de ácido

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias).

Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias)

Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de

• Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su

2. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

PRÁCTICA 2. Manejo de Micropipetas.

Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad

• Cuantificar ADN por métodos espectrofotométricos.

Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la

NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

a) Colocar una punta según corresponda.

a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.

d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las

La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)

Valor del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)

Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

Límites de tolerancia para micropipetas

Volumen (µL) E% nominal CV% nominal

20-50 0.7 0.4

100-1000 0.5 0.2

Llenar las siguientes tablas con los resultados obtenidos.

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:

• Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes

Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros

Extracción de proteínas y lípidos

Precipitación de ácidos nucleicos

• Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos

• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN