STUDIUL NADH-DEHIDROGENAZEI LA

BACTERIA PRODUCATOARE DE
BIOETANOL ZYMOMONAS MOBILIS

Biotehnologia se ocupă cu studiul oricărei tehnici care foloseşte organisme vii

(sau părţi ale acestora) pentru a obţine sau modifica produse, pentru a îmbunătăţi
caracteristicile unor plante şi animale sau a dezvolta microorganisme cu
întrebuinţări specifice (conform Societăţii Americane de Biotehnologie).

agent biologic
(microorganisme, virusuri, celule animale şi
vegetale,
componentele lor şi exproduse)

substrat aparatură pentru realizare produse

produs

Biotehnologie (regim
tehnologic)

Figura 1: Componentele de bază ale proceselor biotehnologice

Avantajele utilizării microorganismelor în realizarea proceselor

biotehnologice sunt:
 prezenţa unui aparat enzimatic foarte bogat şi foarte mobil;

1
  microorganismele au o mare capacitate de biosinteză, ceea ce le permite să-şi
procure elementele necesare vieţii din cele mai variate substraturi;
 agenţii biologici au o mare adaptabilitate la condiţiile de mediu, chiar şi la
cele mai vitrege; microorganismele se adaptează mult mai uşor la schimbările
de mediu comparativ cu plantele, ceea ce conduce la o asimetrie evoluţionară,
cu implicaţii asupra integrităţii plantelor.
În funcţie de natura lor, microorganismele se caracterizează printr-o viteză
mare de multiplicare, timpul de dublare a masei celulare fiind de 30 minute pentru
bacterii, 4 ore pentru drojdii, 18 ore pentru fungii.
Se apreciază ca biotehnologiile vor avea un rol important în furnizarea de noi
resurse energetice. În acest sens, cea mai importantă realizare este obţinerea
alcoolului etilic prin fermentaţie, deşi există câteva probleme legate de sursa de
materii prime şi randamentul procesului. Se estimează că bioetanolul are valoare
energetică superioară etanolului obţinut din produse petrochimice (1 galon de
bioetanol poate suplini 30 galoane de etanol convenţional). În acelaşi timp, utilizarea
bioetanolului drept combustibil constituie o soluţie parţială la problemele legate de
încălzirea globală,

Avantajele utilizarii bacteriei Zymomonas mobilis

 Microorganism utilizat în producţia unor băuturi alcoolice.

 Productivitate superioară în producţia de etanol comparativ cu drojdiile;
 Randament superior în producţia de etanol, selectivitate crescută;
 Toleranţă mare la pH-uri scăzute;
 Toleranţă mare faţă de etanol.
 Fermentează glucoza, fructoza, zaharoza

1. Date despre biologia Zymomonas mobilis

2
 Zymomonas mobilis este o cunoscută bacterie Gram-negativă, aerotolerantă,
strict fermentativă, care îşi obţine energia prin intermediul căii metabolice Entner-
Doudoroff [Conway, 1992]. Ea reprezintă o alternativă viabilă pentru producerea de
biocombustibil datorită randamentului mare de transformare a glucozei, fructozei
sau sucrozei în etanol [Doelle şi colab., 1993, Swings şi De Ley, 1977].
În multe părţi tropicale ale Americii, Africii si Asiei, unele tipuri de băuturi
alcoolice sunt foarte populare şi larg utilizate; acestea constând în seva plantelor ce
trece printr-o fermentaţie mixtă, coţinând bacterii din genul Zymomonas. În Europa,
aceste bacterii, în mod ocazional, se dezvoltă alterând berea, sucul de măr fermentat
(cidrul) şi sucul de pere [Swings şi De Ley, 1977].
La inceputul anului 1950, genul Zymomonas a capatat o anume faimă printre
biochimişti datorită descoperirii de către Gibbs şi DeMoss a faptului că în
catabolismul anaerob al glucozei se urmează mecanismul Entner-Doudoroff. Acest
fapt este foarte surprinzător , deoarece Zymomonas a fost primul exemplu (şi este
încă printre singurele) de organism anaerob care foloseşte o cale ce se desfaşoară în
principal strict la bacteriile aerobe [85]. Din microflora complexă a cidrului alterat,
Barker si Hillier [12] au izolat şi au purificat în 1911 o tulpină bacteriană. Acest
organism cauza aroma puternică, tipică şi gustul prin recontaminare în cidrul steril.
Organismele au tulpini mobile, libere sau în perechi, două a câte 1 m, cu margini
rotunjite; în culturile târzii, celulele sunt frecvent mai alungite; formele neevoluate
sunt de până la 200 m lungime şi capetele lor pot fi globulare sau de forma unui
clopot turtit, cu diametru de 25 m; sporii sunt absenţi; sunt facultativ anaerobe,
prezentând o creştere limitată şi lentă pe mediu solid, cultura era de un alb-cremos
şi “murdară”, acestea fermentează în mod special glucoza şi fructoza cu formare de
etanol şi CO2; maltoza şi lactoza nu au fost fermentate [Swings şi De Ley, 1977].
Descoperirea reprezentanţilor genului Zymomonas este atribuită lui Linder în
1924 care i-a purificat, dar adevărata descoperire a genului Zymomonas a fost făcută
de Barker şi Hillier în 1911, însă aceştia nu au dat un nume taxonomic latin noului
organism [Swings şi De Ley, 1977]. Zymomonas mobilis este o bacterie unică în
evoluţia lumii microbiene. Chiar dacă este clasificată drept un microorganism

3
anaerob, Zymomonas creste bine şi în condiţii aerobe. Se pare că îi lipseşte un sistem
oxidativ de transport de electroni şi produce o singură moleculă de ATP per
moleculă de glucoză metabolizată în ambele condiţii. De asemenea, şi-a înlocuit
sistemul de transport activ cu sistemul de difuzie facilitată. Poziţia taxonomică a
genului Zymomonas nu a fost bine definită, în principal datorită incertitudinilor
despre metabolismul aerob al acestora sau anaerob aerotolerant sau facultativ
anaerob [2].
Barker a purificat şi a studiat două noi tulpini izolate în 1943 şi 1948; acestea
au fost numite de Barker tulpina B şi respectiv tulpina C [Swings şi De Ley, 1977].
Ambele tulpini formează aproximativ 1,87 moli de etanol per mol de glucoză, CO 2 şi
puţin H2S, acetaldehidă şi acid lactic. Lactoza, rafinoza, maltoza, galactoza, ramnoza,
arabinoza, xiloza, dulcitolul, manitolul sau sorbitolul nu au fost fermentate. Catalaza
este prezentă. Prima tulpină a crescut într-un domeniu de pH de 3,75 până la 7,9,
pH-ul său optim fiind de 4,5 până la 6,5. Temperatura optimă a fost între 25 şi 31 oC.
La 41oC nu a avut loc creşterea. Pentru a inhiba creşterea bacilului care a cauzat
alterarea cidrului a fost necesar a se adăuga SO 2. de la 0,075 până la 0,1% [Swings şi
De Ley, 1977]. Vinul de palmier are o microfloră foarte complexă, dar este sigur că
tulpinile de Zymomonas sunt constituenţi bacterieni foarte importanti. Tulpinile de
Zymomonas sunt extrem de bine adaptate pentru nişele ecologice: sucroză, glucoză,
fructoză, aminoacizi şi factori de creştere sunt prezenţi în seva palmierului.
Organismele sunt rezistente la etanol, cresc la un pH scăzut şi în condiţii anaerobe
[Swings şi De Ley, 1977].
Cele două proprietăţi ale genului Zymomonas, consumarea rapidă a glucozei
prin fermentaţie alcoolică şi scăderea pH-ului mediului, au provocat un mare interes
printre microbiologii germani la începutul anului 1930 şi sugerează un număr
promiţător de aplicaţii pentru aceste bacterii [Swings şi De Ley, 1977].

4
 Tulpini de Zymomonas mobilis, CP4, resuspendate în lichid, după
centrifugare la 2500 g, imagine de 5600X mărită

5
 O posibilă aplicaţie tehnologică pentru Zymomonas este producţia industrială
a etanolului. Ecuaţiile de fermentaţie prezentate în literatură arată faptul că toate
tulpinile de Zymomonas produc mai mult de 1.5 moli de etanol per mol de glucoză
adăugat. Cele mai eficiente tulpini produc aproximativ 1,9 moli de etanol per mol de
glucoză, cantitate care este aproape egală cu cea produsă de Sacharomyces cerevisiae
[Swings şi De Ley, 1977]. Zymomonas creşte şi fermentează foarte rapid. Preferă un
pH scăzut şi previne contaminarea cu factori străini. Aceste bacterii pot creşte şi în
concentraţii mari de glucoza şi etanol [Swings şi De Ley, 1977].

Următoarele caracteristici permit identificarea genului Zymomonas:

1. Celule gram negative
2. Motile, în formă de bacili, cu dimensiuni de 1,0-2,0 x
4,0-5,0 μm, în mod uzual întalnite în perechi
3.Nesporulate, fără capsule, fără lipide sau glicogen
intracelular
4. Anaerobă, aerotolerantă
5. Glucoza şi fructoza sunt utilizate pentru a produce
cantitaţi aproape echimoleculare de etanol şi CO2, prin calea

6
 metabolică Entner-Doudoroff

6. Zaharoza este utilizată de multe tulpini şi este

însotită în multe cazuri de biosinteza levanului
7. O mare varietate de zaharuri sau de acizi graşi nu
sunt utilizaţi ca sursă de carbon
8. Testele pentru indol, roşu de metil, metil carbinol,
nitrit din nitrat, amoniac şi de lichefiere a gelatinei sunt
negative
9. Domeniul optim de pH= 7,00; domeniul de
temperatură= 25-310C, care facilitează creşterea tulpinilor
10. 47,5 până la 49,5% guanină plus citozină (G+C)

Aceste 10 caracteristici pot fi considerate drept o descriere minimă a genului

Zymomonas.[Swings şi De Ley, 1977]. Este de aşteptat ca Zymomonas să fie tolerantă
la alcool deoarece a fost izolată din băuturile alcoolice conţinând de la 2% până la
10% etanol. O concentraţie de 5,5% etanol în mediu lichid standard nu este
dăunatoare pentru Zymomonas [Swings şi De Ley, 1977]. Utilizarea sucrozei de
Zymomonas mobilis pentru producţia de etanol ridică două probleme diferite: prima
în stadiul de clivaj al moleculei de sucroză de către levansucrază şi cea de-a doua în
oxidarea directă a glucozei legată de reducerea fructozei pentru a forma sorbitol sau
pentru polimerizarea fructozei la polifructo-oligozaharide. Aceste probleme au dus
la scăderea producţiei de etanol din sucroză comparativ cu cea obţinută din procesul
de conversie a glucozei [2]. Abilitatea de a hidroliza sucroza nu este o caracteristică
comună a Z. mobilis, dar pare a fi dependentă de tulpini. În aceste tulpini capabile de
a hidroliza sucroza s-a stabilit că este implicată enzima levansucraza [2].
Caracterizarea levansucrazei în Z. mobilis a fost impiedicată de problemele
metodologice cauzate de similaritatea activităţii sale cu cea a invertazei, care este
prezentă în acest organism. În plus, invertaza catalizeaza reactii de trans-fructolizare
ducând la formarea de oligozaharide. Spre deosebire de levansucrază, invertaza

7
poate hidroliza oligozaharide conţinând fie resturi de -fructofuranozil, exclusiv,
sau un număr variabil de resturi -fructofuranozil cu o grupare terminală de -
glucofuranozil, dar nu poate catalizată formarea levanului [2].

Structura 3D a levansucrazei de la Zymomonas mobilis

Levanul este un polizaharid linear (2-6)--D-fructofuranozil cu un număr de

legături (2-1)--D-fructofuranozil. Are aplicaţii biotehnologice drept substituent de
plasmă sangvină, sursă de fructoză, un prolongator al efectului medicamentelor şi
un imunomodulator specific. Levanul produs de Z. mobilis a fost estimat a avea o
masă moleculară de 107 kDa [2]. Sucroza trebuie să fie prezentă în mediul de cultură
pentru a iniţia formarea lanţului levanului. Nu s-a observat formarea levanului în
culturile de Z. mobilis crescute pe medii mixte de glucoză şi fructoză sau individual
pe aceste monozaharide [2]. Temperatura şi pH-ul au o influenţă deosebită asupra
producţiei de levan din Z. mobilis. La o temperatură de peste 34 oC, formarea
levanului este inhibată în toate tulpinile de Z. mobilis examinate până acum. Un
număr de autori au raportat că pH-ul optim pentru formarea levanului în culturile

8
de Z. mobilis este de aproximativ 5,0 cu o mică producţie de levan observată la un
pH de 6,5 când rata hidrolizei sucrozei este optimă [2]. Sucroza este hidrolizată la
glucoză şi fructoză extracelular; monomerii sunt apoi transportaţi în interiorul
celulei prin sistemul de transport prin difuzie mediată şi simultan este catabolizată
prin calea Entner-Doudoroff. Z. mobilis are un metabolism anaerob, ce poate suporta
creşterea în prezenţa oxigenului, fără a se observa o scădere a cantităţii de biomasă.
Totuşi se produce o schimbare de la formarea de etanol şi dioxid de carbon, la
formarea de acetaldehidă, acetonă şi alţi produşi [2].

Structura levanului

9
2. Surse de hrană. Substrat fermentativ-sorgul

10
 Sorgul zaharat este o cultură de viitor pentru producţia de biomasă pentru
posibilitatea de a produce la valori înalte etanol, energie şi DDG (biomasă distilată
uscată). După recoltare, sorgul zaharat este separat în biomasă pentru fermentat
(folosită pentru DDG şi producerea de etanol), suc dulce (extras prin presare şi folosit
pentru producerea de etanol) şi bagasă (utilizată pentru de energie). Alte produse ce
se mai pot obţine: CO2 din fermentaţie şi hârtie din bagasă. Impactul asupra
mediului este scăzut deoarece sorgul zaharat este o resursă regenerabilă, fără emisii
de CO2. Utilizarea bioetanolului pentru transport reduce considerabil emisiile, în
comparaţie cu produsele petroliere .

11
 Ciclurile de ardere, performanţa transformărilor ciclice ale metaboliţilor cu
disiparea energiei nete au fost găsite la eucariote şi procariote. Cunoaşterea ciclurilor
de ardere dirijate de ATP sau forţa protonică, sunt responsabile pentru creşterea
necuplată în bacterie, la fel de bine şi în generarea de căldura la câteva specii
animale [Russell şi Cook, 1995; Clark şi colab., 1973]. Se propune un nou tip de
energie aparentă nedispersată redox a ciclului de ardere în respiraţia bacteriei
etalogene Z. mobilis, reducerea simulată a acetaldehidei şi oxidarea etanolului.
În diferiţii producători de etanol ultima reacţie a căii fermentative este o
reducţie ireversibilă a acetaldehidei:
Acetaldehida + NADH+H+ etanol +NAD+ [Burton, 1974].
În Z. mobilis, reacţia este catalizată de izoenzima alcool dehidrogenaza
(ADH), ADH I şi ADH II [Neale şi colab., 1986]. În condiţii aerobe o parte din
NADH generat în calea glicolitică Enter-Daudorff este oxidat prin respiraţie. Lanţul
respirator competiţionează pentru NADH cu reacţia ADH. Condiţiile anaerobe
relative conduc la descreşteri în conţinutul de etanol şi la acumularea acetaldehidei
[Viikari, 1988]. Culturile anaerobe de Z. mobilis produc etanol din glucoză cu un
randament mare cu limita maximă teoretică de 0,51g etanol produs per 1g glucoză
consumat [Rogers şi colab., 1980]. Producţia scăzută de etanol, ca şi acumularea de
bioproduşi oxidează mai mult decât etanolul (acetaldehida, acetonă, acetat),
indicând că în culturile aerobe, în mare parte NADH este oxidat în lanţul respirator
[Kalnenieks şi colab., 2002].

3. Utilizarea NADH în respiraţie

12
 Dacă ambele izoenzime ADH catalizează în sinteza etanolului, activitatea
lanţului respirator va fi prea slabă să combată reacţia ADH. Ambele izoenzime ADH
reprezintă peste 5% din proteinele solubile (Neale şi colab., 1986; Kinoshita şi colab.,
1985] asigurând specificitatea înaltă a etalogenezei la aceasta bacterie. Din datele
furnizate de către Neole şi colab., [1986] se poate estima activitatea totală a
izoenzimelor în extractele celulare de Z. mobilis în direcţia reducerii acetaldehidei la
pH 6,5. Este apropiat de 2,1U sau de 4U (mg proteină totală) -1 cu aproximaţie
contribuţie egală pentru ambele izoenzime. În acelaşi timp activitatea NADH
oxidazei este mult diminuată. Pentru extractele celulare libere valorile sunt cuprinse
între 0,05 şi 0,2U (mg proteină)-1 [Bringer şi colab., 1984; Pankova şi colab., 1988;
Kalnenieks şi colab., 1995].
Mai departe izoenzimele ADH au afinităţi mărite pentru NADH. În creşterea
aerobă a celulelor, izoenzima NADH dehidrogenaza (probabil un omolog pentru E.
coli ndh), Km pentru NADH este aproape de 50-60 M [Kim şi colab., 1995;
Kalnenieks şi colab., 1996], dar pentru ADH I şi ADH II, valorile corespondente (la
saturarea concentraţiei acetaldehidei) sunt 27 M respectiv 12 M [Kinoshita şi
colab., 1985]. Depinzând de intensitatea aeraţiei, acetaldehida în culturile aerobe,
poate mări concentraţiile de la câţiva milimolari la câţiva zeci de milimolari
(aproximativ de la 0,1 până la 2,0 g/l -1) [Viitkari, 1988; Kalnenieks şi colab., 2000], în
timp ce Km pentru acetaldehidă este de doar 86 M pentru ADH I şi 1,3 mM pentru
ADH II [Kinoshita şi colab., 1985].
În celulele aerobe ambele izoenzime operează la saturaţii apropiate ale
concentraţiei de acetaldehidă, şi valorile K m aparente pentru NADH pot fi foarte
apropiate de valorile in vitro. Ambele, ADH şi NADH dehidrogenaza respiratorie
conform cineticii lui Michaelis–Menten [Neale şi colab., 1986; Kinoshita şi colab.,
1985; Kalnenieks şi colab., 1996], lanţul respirator nu se aşteaptă a fi completat din
exterior de către ADH în nici o concentraţie intracelulară. [Kalnenieks şi colab.,
2002].

13
 În continuare, pentru a se înţelege paradoxul interpus între reacţia alcool
dehidrogenazei şi respiraţia în Z. mobilis a fost efectuat un studiu al cineticii ADH in
vivo în condiţii standardizate.

Se propune schema pentru ciclul etanolului, prezentând rolul ADH II în respiraţie.

NAD(P)H e generat în reacţia glucozo-6-fosfatdehidrogenazei şi posibilele sale contribuţii în
majoritate prin cuplări intracelulare, nu sunt indicate [Kalnenieks şi colab., 2002].

4. Rolul NADH dehidrogenazei în celula bacteriană şi homeostazia

celulelor

14
 Pentru a se înţelege mai bine rolul NADH dehidrogenazei s-au efectuat o
serie de studii cu inhibitori de cianură pentru respiraţia celulară concluzionându-se că
acesta stimulează creşterea aerobă la Zymomonas mobilis. Bacteria este gram-negativă
aerotolerantă producătoare de etanol posedă un lanţ respirator [Kalnenieks şi colab.,
1998], alături de activitatea fosforilării oxidative [Kalnenieks şi colab., 1993]. Oricum,
celelalte roluri fiziologice ale respiraţiei în Z. mobilis sunt încă neelucidate. Z. mobilis
catabolizează rapid zahărul la etanol, în timp ce, concomitent, doar o mică fracţie a
substratului de carbon este convertită în biomasă [Kalnenieks şi colab., 2000].

Se competiţionează pentru utilizarea echivalenţilor reduşi între lanţul respirator şi

alcool dehidrogenază în cursul catabolizării aerobe a glucozei în Zymomonas mobilis.
Consumul respirator de NAD(P)H limitează reducerea acetaldehidei la etanol. Inhibarea
respiratorie este, dimpotrivă, cauzată de acumularea de acetaldehidă. [Kalnenieks şi colab.,
2000]

Această creştere a Z. mobilis este cunoscută ca o creştere energetică necuplată

[Belaich şi Senez, 1965; Jones şi Doelle, 1991]. Respiraţia la Z. mobilis este clar că nu
serveşte ca sursă de energie pentru creşterea biomasei în condiţii aerobe, în funcţie
de cum se face respiraţia, în majoritate anaerobă, sau facultativ aerobă [Bringer şi
colab., 1984; Pankova şi colab., 1985], aceasta judecând după graficele de biomasă
aerobe. Raporturile înalte ale valorilor graficului de biomasă pentru Z. mobilis sunt,
în general, de 20g biomasă uscată per mol de glucoză, obţinut pentru cultura în
chemostrat aerobă la o rată înaltă, concentraţie mică de glucoză şi ventilaţie

15
eficientă, asigurând bioproduşii metabolici inhibitori volatili [Zikmanis şi colab.,
1997]. În plus, catabolismul fermentativ al Z. mobilis este bine echilibrat, 2 moli de
etanol per mol de glucoză catabolizată via calea Entner-Doudoroff [Viikari, 1988]. Z.
mobilis blochează alte căi, ca în ciclul Krebs [Bringer-Meyer şi Sahm, 1989], pentru a
suplini adiţionarea echivalenţilor reducători la lanţul respirator. În cultura aerobă,
lanţul respirator competiţionează pentru NAD(P)H cu reacţia alcool dehidrogenazei,
acesta cauzând acumularea precursorului metabolic toxic al etanolului, acetaldehida
[Bringer-Meyer şi Sahm, 1988; Ishikawa şi colab., 1990; Viikari, 1988].
Acetaldehida, ca şi alţi metaboliţi acumulaţi în cultura aerobă (precum
dihidroxiacetona şi acetatul), au fost descrişi ca inhibitori de creştere pentru Z.
mobilis [Bringer şi colab., 1984; Ishikawa şi colab., 1990; Viikari, 1988; Wecker şi Zall,
1987.
Pentru înţelegerea rolului respiraţiei în creşterea aerobă a lui Z. mobilis s-a
examinat creşterea aerobă în condiţiile în care respiraţia celulelor este inhibată de
concentraţii submilimolare de cianură. Cianura a fost aleasă deoarece este unul din
puţinii inhibitori solubili în apă, capabil să traverseze membrana plasmatică a Z.
mobilis, permiţând ca acesta să fie folosit în creşterea celulelor intacte. Inflamaţia
adiţională poate proveni din faptul că ramurile taxonomice rezistente şi sensibile la
cianură ale lanţului respirator diferenţiază în eficienţă şi conservarea energiilor
proprii [Poole, 2000; Poole şi Cook, 2000].
Bacteria Z. mobilis, aerotolerantă, anaerob producătoare etanol prezintă o
înaltă capacitate de respiraţie. Disecţia căilor respiratorii pentru alte bacterii a fost de
mare folos pentru construirea mutantelor şi analiza acestora, dar mai mult
apropierile genetice sunt în mod curent indisponibile sau dificil de utilizat în studiile
lanţului transportor de electroni la Z. mobilis. S-a folosit cianura pentru a se observa,
pe de altă parte, rolul respiraţiei în fiziologia şi creşterii acestui organism. S-a constat
că cianura stimulează creşterea lui Z. mobilis, în timp ce cultura aerobă devine
inhibată de acumularea de acetaldehidă. În timpul agitării culturilor, o mare parte a
acetaldehidei generate nu se evaporă din cultura lichidă şi la sfârşitul cultivării
concetraţia sa poate atinge 2g/l. Acumularea acetaldehidei în mediu pare a fi prima

16
cauză a creşterii inhibiţiei sugerând că generarea a fost în exces a acetaldehidei
intracelular decât acumularea acesteia în exteriorul celulelor. Observaţia este
susţinută de datele conform cărora cultura bine aerisită continuu, în care
acetaldehida a fost eficient eliminată extracelular, cianura nu a stimulat creşterea.
Aparent în ambele medii de cultivare cianura previne acumularea acetaldehidei
intracelulare, arătată de YEtOH şi de scăderea consumului de glucoză [Kalnenieks şi
colab., 2000]. O concluzie a acestor date este aceea că rata crescută de respiraţie în Z.
mobilis nu este necesară pentru creşterea biomasei: respiraţia rapidă nu suplineşte
orice surplus energetic pentru biosinteză şi creştere, generează rapid acetaldehida.
Respiraţia poate fi prea rapidă pentru nevoile de protecţie respiratorie, o altă funcţie
fiziologică vitală presupusă în respiraţia Z. mobilis [Pankova şi colab., 1988].
Creşterea fazei de lag la concentraţii crescute de cianură poate fi explicată în parte
de către hipotensiunea protecţiei respiraţiei. Creşterea în culturile tratate cu cianură
are loc până când rata respiraţiei specifice a fost aproape de zero. Oricum, culturile
tratate cu cianură au debutat în creşterea exponenţială la o rată specific înaltă când
nivelul oxigenului a fost mai mic de jumătatea acestei rate în controlul culturii.
Efectul inhibitor al cianurii în rata de consum a glucozei, poate contribui la mărirea
fazei de lag în proba analizată [Kalnenieks şi colab., 2000].
Un component sensibil la cianură a activităţii NADH oxidazei, a fost raportat în
membranele de creştere aerobă de la Z. mobilis [Toh şi Doelle, 1997], dar fără efect în
membrană asupra activităţii NADH oxidazei. Această discrepanţă poate fi explicată
de tehnicile diferite de disrupere celulară utilizate în fiecare caz. Toh şi Doelle (1997)
au disrupt celulele cu o presă French, care poate permite retenţia membranelor de
legătură cu ramurile sensibile la cianură. S-a utilizat sonicarea pentru probele
inhibate cu cianură. Probele din extracte din celulele libere de creştere pe glucoză, de
E. coli sonicate pot prezenta dehidrogenaze din membrană într-o fracţie „solubilă”
cu pierdere consecventă a funcţiei energiei de translocaţie (ex: ATP dependent de
reducerea NAD+) [Poole şi Haddock, 1974]. S-a arătat că o mare parte din respiraţie
a fost rapid inhibată de concentraţii mici de cianură. Rolul său energetic în celulele
de Z. mobilis este ambiguu. Inhibarea parţială a respiraţiei celulare cu cianură nu a

17
determinat o creştere semnificativă a biomasei, contrar cu ceea ce fusese anticipat în
aceste descoperiri, acest potenţial al căii sensibile la cianură a fost un bypass de
energie neregenerată. Oricum, inhibarea respiraţiei de concentraţii scăzute de
cianură este bifazică cu un compartiment rapid şi altul redus. Poate fi esenţial să se
diferenţieze între “cianura sensibilă” şi inhibarea rapidă de către cianură ”părţi ale
respiraţiei” la Z. mobilis. Primul a fost inhibat pe parcursul creşterii în prezenţă de
concentraţii mici de cianură care s-a putut observa ulterior a fi ATP-negenerat în
experimentul cu celule întregi. Natura acestei “inhibări rapide cu cianură”, aparent
energia negenerată, în calea respiratorie a celulelor de Z. mobilis şi este posibil să
existe o relaţie cu hemul b compus ce a fost găsit conţinut în supernatantul
extractului de celule libere, se cere a se clarifica [Kalnenieks şi colab., 2000].
Rolul fiziologic al respiraţiei rapide în creşterea aerobă a celulelor de Z. mobilis
este altul decât asigurarea biomasei. Este tentant să se creadă că producţia
metaboliţilor inhibitori, precum acetaldehida, este o strategie a creşterii competitive
a celulelor aerate de Z. mobilis. Aceasta poate prefera producţia de substanţe
inhibitorii pentru această bacterie în schimbul creşterii masei propriilor sale celule.
În cazul culturilor anaerobe, strategia de creştere competitivă a lui Z. mobilis poate fi
bazată în parte pe raportul foarte înalt al nivelelor specifice în producţia etanolului
împreună cu toleranţa etanolului, aceasta existând şi în alte microorganisme
[Viikari, 1988].

5. Scopul lucrării : identificarea enzimei NADH dehidrogenaza in

conditia cresterii bacteriene pe sorg

18
 Materiale si metode

 mediul complet de creştere a fost realizat după Galani şi colab., (1985), acesta
a conţinut yeast extract (drojdie) 0,5%, glucoză sau zaharoză 2%, ((NH4)2SO4
0,5%, KH2PO4 1%, MgSO4 0,5%.
 S-a folosit ca mediu de cultură extractul de sorg din următoarele soiuri: 64A,
66B, 68B, 68C, 70A şi 70B obţinut prin fierbere.
 S-au utilizat următoarele tulpini bacteriene ATCC 10988, NCIB 11163, 11163-
70, 11163-71, 11163-74, 11163-76, CP4PR, CP4PR3.

Tulpinile bacteriene au fost crescute in mediu lichid complet la 30 gr C. Inoculul,

aflat in faza exponentială de creştere, a fost însămantat in mediu lichid, iar cresterea
celulară a fost monitorizată turbidimetric, pană la atingerea fazei tarzii exponentiale
de crestere, prin urmarirea densitatii optice la 600 nm. O valoarede 0,9 a densitatii
optice corespunde la 0,35 mg substanta uscata/mL.
Celulele au fost sedimentate prin centrifugare (8 000 g/ 20 minute) dupa care au
fost disrupte cu ajutorul unui ultrasonator. Materialul celular a fost apoi centrifugat
timp de 15 minute/12 000g penru separarea extractului celular de celule nedisrupte.
Supernatantul colectat a fost apoi ultracentrifugat (100 000g, timp de 2 ore),
retinandu-se sedimentul membranar.
NAD(P)H dehidrogenaza (NDH, NAD(P)H oxidaza) a fost extrasa din membrana
bacteriana prin efect “salting-in”, dupa care a fost partial purificată prin precipitare
cu (NH4)2SO4, 30-60% saturatie urmata de dializă faţă de tampon Tris-acetat,
0,05M, pH 6, care a continut 1 mM EDTA. In continuare fractia cu activitate
enzimatica a fost supusa evidenţierii postelectroforetice.
Concentratia proteica s-a determinat dupa metoda Lowry avand albumina
serica bovina drept standard.

19
 Rezultate si discutii

Pentru a putea caracteriza enzimele complexului NA(P)H dehidrogenazic

este necesara o extractie prealabila a enzimei din membrana celulara. Utilizarea
detergentilor neionicide tipul Triton X-100, Tween-80 sau a detergentilor ionici
precum deoxicolatul de sodium conduc la pierderea activitatii NADH oxidazice.
Datele obtinute confirma faptul ca preparatele enzimatice ale complexului
NAD(P)H oxidazic din Zymomonas mobilis sunt complet inhibate in conditiile
solubilizarii sub actiunea detergentilor. Aceasta proprietate este o caracteristică
generala a NADH de tip I , dupa cum s-a raportat in cazul NADH-ubiquinon
oxidoreductazei prezente in membrana bacteriei P. denitrificans. De altfel, numai
NADH de tip I din E.coli a fost purificată pană la omogenitate in forma stabilă.
Complexul I mitocondrian este de asemenea inhibat de către detergenti neionici de
tipul Triton X-100 .

 S-a pregătit un preinocul în care fiecare tulpină de Z. mobilis s-a însămânţat pe

fiecare tip de mediu.
 S-a făcut apoi un inocul care s-a lăsat să crească până când a ajuns la
densitatea optică de 0,4-0,5 la 600 nm.
 S-a centrifugat la 4000rpm, 30 min, 4 gr C.
 S-a resuspendat sedimentul în ser fiziologic steril.
 S-a centrifugat la 4000rpm, 30 min, 4 gr C.
 S-a resuspendat sedimentul în ser fiziologic steril, în cantitate dublă densităţii
optice.
 Din aceasta s-a însămânţat un volum egal în flacoane cu mediu steril:
- ptr curbe de creştere se citeşte DO la 600nm din oră în oră timp de minim 16 ore
- ptr curbe de consum s-au pus câte 500 microlitri ulei de parafină strelizat şi
s-au cântărit la balanţa analitică din oră în oră, timp de minim 72 ore.

20
CURBE DE CREŞTERE

21
22
23
Probele au fost citite cosiderand ca blank DO a mediului de cultură.

24
25
26
CURBE DE CONSUM

27
28
29
30
Pentru electoforeză in gel de poliacrilamidă:
 S-a folosit detergent Nonidet P40 Substitute sol 10%
 S-a lucrat cu gel de poliacrilamidă concentratie 29%
Developarea gelurilor de PAA s-a efectuat astfel:
1. colorare 2 ore cu amestec coomasie blue / acid acetic / methanol / apă
distilată (1/4/5, v/v/v)
2. decolorare de mai multe ori in reprize de cate o oră până când se evidenţiază
foarte clar benzile electroforetic cu soluţie de acid acetic-metanol- apă distilată
(1/4/5, v/v/v).

31
 REZULTATE

1. Activităţile enzimatice ale NADH dehidrogenazei la diferite tulpini de Z.

mobilis crescute pe soiuri diferite de sorg: 1, NCIB 11163-76/suc; 2, ATCC
10988/suc; 3, CP4 PR MUT3/suc; 4, CP4PR/64A; 5, PR3/66B.
2. Activităţile enzimatice ale NADH dehidrogenazei la diferite tulpini de
Z. mobilis crescute pe soiuri diferite de sorg: 6, CP4 PREVENTOL
REZISTANT MUT3/66B; 8, CP4PR/64A; 9, NCIB 11163-71/68B.
3. Activităţile enzimatice ale NADH dehidrogenazei la diferite tulpini de
Z. mobilis crescute pe soiuri diferite de sorg: 10, CP4 PR MUT3/70B; 11, CP4
PR MUT3/64A; 12, CP4 PR MUT3/70B; 13, CP4PR/68C.
4. Activităţile enzimatice ale NADH dehidrogenazei la diferite tulpini de
Z. mobilis crescute pe soiuri diferite de sorg: 14, CP4PR/68C; 15, NCIB
11163-76/70A; 16, CP4PR/70A; 17, NCIB 11163/70B.

Activitatea ADH

32
Activitatea NADH-Dehidrogenazei

33
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII LEVANSUCRAZEI

• Activitatea enzimatică a levansucrazei a fost determinată tot prin aplicarea

metodei descrise de Vigants şi colab. (1998) fiind urmărită prin creşterea
concentraţiei de levan.
• Calcularea activităţii enzimatice a fost realizată cu ajutorul formulei:
• A.E.=(D.O.finală- D.O.iniţială)/10* ε330*5
• Unde: D.O. a fost citită la 330 nm ; 10 a fost folosit pentru a aduce la
echivalenţă cu 1 minut, iar 5 pentru a aduce la echivalenţă cu 1 ml
• Polifenoli din extractele de sorg au fost determinaţi printr-o metodă descrisă
de Folin-Ciocalteu, iar drept etalon s-a utilizat curba acidului galic.

Soiul de sorg Conc polifenoli Soiul de sorg Concentraţia de

(echivalenţi acid zaharoză (%)
galic/ml extract) 64A 19,52
64 A 143,8 66B 14,14
66 B 104,93 68B 9,76
70 A 72,5 68C 16,74
70 B 105,9 70A 11,95
68 B 78,64 70B 13,5
69 B 149,77
68 C 91,38

34
 CONCLUZII

• Compuşi fenolici din extractul de sorg par a intervini în procesele

metabolice de transformare a sucrozei în etanol, polifructani şi dioxid
de carbon, procesul de inhibiţie mamifestându-se la tulpini bacteriene
specifice.
• Tulpina CP4PR pare a poseda mecanisme ce concură la contracararea
efectelor toxice ale polifenolilor din extractul de sorg.
• Soiul de sorg 70B pare a fi cel mai bine fermetat la etanol şi dioxid de
carbon.
• După analizarea concentraţiilor de levan produse de diferite tulpini de
Zymomonas mobilis pe diferite soiuri de sorg s-a observat faptul că :
• 11163/76/70B, PR3/sucroză, 11163/sucroză, 11163/71/64A, CP4PR/70B,
CP4PR/66B, 11163/70B, 11163/71/66B produc o cantitate mare de levan.
• Totodată analizarea activităţilor enzimatice ale levansucrazei produse a
dus la concluzia că :
• 11163/70B, CP4PR/66B, 11163/66B, CP4PR/70B, 11163/64A,
CP4PR/sucroză produc cea mai mare cantitate de levansucrază.

35