Instituto Politécnico Nacional.

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

1. Laboratorio de Métodos de Análisis.

2. “Determinación de proteínas por el método de Lowry.

Determinación de proteínas por el método de Bradford”.

3. Alumno: Sarabia Hernández Edgar Jasiel.

4. Grupo: 4IM1 5. Sección: II.

6. Profesor: Rogelio Alejandro Benitez Ibarra.

7. Fechas de trabajo experimental: 18 y 21 de Septiembre de 2015.

8. Fecha de entrega: 2 de Octubre de 2015.

9. Situación escolar: Inscrito.

1
Práctica. “Determinación de proteínas por el método de Lowry. Determinación de
proteínas por el método de Bradford”.

 Introducción.
Existen diferentes métodos para determinar la cantidad o concentración de proteínas en una
muestra. La mayoría de ellos se basan en: la propiedad de las proteínas para absorber luz en la
región UV, la formación de complejos coloridos y la formación de derivados químicos. Algunos de
los métodos que se analizaran en la siguiente práctica son el método de Lowry y el método de
Bradford.

 Método de Lowry.

El método de Lowry es un método espectrofotométrico de valoración cuantitativa de proteínas. El

método consta de dos etapas:

1. En medio alcalino, los iones de Cu2+, se unen a los enlaces peptídicos de la proteína (al
menos cuatro). Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul.
2. Los grupos fenólicos de los residuos de tirosina de la proteína reducen al reactivo de Folin-
Ciocalteau (mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato), actuando el cobre como catalizador.
El reactivo es de color amarillo y al ser reducido da lugar a un complejo colorido azul intenso.

 Método de Bradford.

El método se basa en la unión específica del colorante azul de Comassie brillante G250 (CBBG) a
los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las
proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una
absorbancia máxima a 470 nm.

Figura 1. Estructura molecular del colorante Azul brillante de Comassie G-250. Tomada de Wikipedia.

 Resultados.

Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry.

Tubo No. Cantidad de proteína (µg) A590

Serie a Serie b
1 25 0.045 0.046
2 50 0.078 0.076
3 75 0.119 0.118
4 100 0.152 0.148
5 125 0.177 0.178

2
 Absorbancia (590 nm)

0
0 25 50 75 100 125
Cantidad de proteína (µg)

Figura 2. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry.

Ecuación del gráfico: Absorbancia=0.0126 + 0.001348 (Cantidad de proteína)

r=0.9974
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 – 0.0126
Cantidad de proteína=
0.001348

Interpretación de los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación en la

curva de calibración del Método de Lowry.

La ordenada al origen tiene un valor de 0.0126, teóricamente tendría que ser de 0.000 debido a que
es la absorbancia del blanco.

La pendiente o sensibilidad tiene un valor de 0.001348, esto nos indica que la variabilidad de la
absorbancia se da con respecto a la cantidad de proteína.

El coeficiente de correlación es 0.9974 el cual nos muestra que nuestros datos tienen una tendencia
muy aproximada a la linealidad por estar cercano a la unidad.

3
Tabla 1.1 Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford.

Tubo No. Cantidad de proteína (µg) A590

Serie a Serie b
1 25 0.346 0.395
2 50 0.430 0.433
3 75 0.490 0.485
4 100 0.483 0.563
5 125 0.627 0.611

0.7
Absorbancia (595 nm)

0
0 25 50 75 100 125
Cantidad de proteína (µg)

Figura 3. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford.

Ecuación del gráfico: Absorbancia=0.3097 + 0.002354 (Cantidad de proteína)

r=0.9591
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 – 0.3097
Cantidad de proteína=
0.002354

Interpretación de los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación en la

curva de calibración del Método de Bradford.

La ordenada al origen tiene un valor de 0.3097, teóricamente tendría que ser de 0.000 debido a que
es la absorbancia del blanco.

4
La pendiente o sensibilidad tiene un valor de 0.002354, esto nos indica que la variabilidad de la
absorbancia se da con respecto a la cantidad de proteína. Este método presenta mayor sensibilidad
reflejando un valor de pendiente más elevado en comparación del método de Lowry.

El coeficiente de correlación es 0.9591 mostrando que nuestros datos presentan variabilidad en la

tendencia lineal por estar dispar a la unidad.

Tabla 2. Réplicas para el análisis estadístico. Método de Lowry.

Tubo No. A590 Cantidad de proteína (µg)

1 0.112 73.73
2 0.109 71.51
3 0.107 70.02
4 0.115 75.96
5 0.112 73.73
6 0.106 69.28
7 0.113 74.48
8 0.110 72.25
9 0.111 72.99
10 0.115 75.96

Tabla 2.1 Réplicas para el análisis estadístico. Método de Bradford.

Tubo No. A595 Cantidad de proteína (µg)

1 0.584 116.52
2 0.575 112.70
3 0.597 122.04
4 0.587 117.79
5 0.586 117.37
6 0.562 107.17
7 0.544 99.53
8 0.577 113.55
9 0.581 115.25
10 0.561 106.75

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico. Método de Lowry.

ẋ S S2 %C.V. µ
72.991 2.1512 5.1422 2.9473 72.991 ± 1.538

Tabla 3.1 Resultados del análisis estadístico. Método de Bradford.

ẋ S S2 %C.V. µ
112.867 6.2922 43.9914 5.5749 112.867 ± 4.500

5
Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry.

Tipo de
Cantidad de
Tubo No. Sustancia. A590 interferencia
proteína (µg)
generada.
1 Tris 1 M, pH 7.0 0.123 81.89 Positiva.
No es
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.111 72.99
interferencia.
Detergente comercial
3 0.131 87.83 Positiva.
al 1%
4 SDS al 1% 0.106 69.28 Negativa.
No es
5 TCA al 5% 0.111 72.99
interferencia.
6 Fenol al 1% 1.230 903.11 Positiva.
Mercaptoetanol al
7 0.122 81.15 Positiva.
0.1%
8 Tris 1 M, pH 10.0 0.096 61.86 Negativa.
9 Urea al 5% 0.124 82.64 Positiva.
10 (NH4)2SO4 0.141 95.25 Positiva.

Tabla 4.1 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Bradford.

Tipo de
Cantidad de
Tubo No. Sustancia. A595 interferencia
proteína (µg)
generada.
1 Tris 1 M, pH 7.0 0.508 84.23 Negativa.
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.488 75.74 Negativa.
Detergente comercial
3 0.442 56.20 Negativa.
al 1%
4 SDS al 1% 0.446 57.90 Negativa.
5 TCA al 5% 0.535 95.70 Negativa.
No es
6 Fenol al 1% 0.567 109.30
interferencia.
Mercaptoetanol al
7 0.495 78.71 Negativa.
0.1%
8 Tris 1 M, pH 10.0 0.527 92.31 Negativa.
9 Urea al 5% 0.530 93.58 Negativa.
10 (NH4)2SO4 0.454 61.29 Negativa.

Tabla 5. Comparación estadística entre el método de Lowry y el método de Bradford.

Método de Lowry Método de Bradford (µg) Diferencia (µg)

Tubo No.
(µg) [Referencia] [Prueba] [Referencia - Prueba]
1 73.73 116.52 -42,79
2 71.51 112.70 -41,19
3 70.02 122.04 -52,02
4 75.96 117.79 -41,83
5 73.73 117.37 -43,64
6 69.28 107.17 -37,89
7 74.48 99.53 -25,05
8 72.25 113.55 -41,3
9 72.99 115.25 -42,26
10 75.96 106.75 -30,79

6
 ẋDiferencia. SDiferencia.
-39,876 6.9978

−39.876
|𝑡𝑐 | = = 18.0198
2.2128

43.9914
𝐹𝑐 = = 8.5549
5.1422

tt=2.262 ; Ft=4.03

Si tc ≥ tt se acepta Hi (hipótesis alterna).

Si Fc ≥ Ft se acepta Hi (hipótesis alterna).

Por lo tanto, existen diferencias estadísticamente significativas tanto en la exactitud (t c ≥ tt) como en
la precisión (Fc ≥ Ft).

Tabla 6. Comparación de los métodos para determinar proteínas.

Método. Ventajas. Desventajas.

Métodos
espectrofotométricos.

 Los ácidos nucleicos también

 No se pierden las muestras. absorben en la región de 280
 No requiere esperar tiempos nm, por lo que pueden causar
Absorción a 280 nm. de incubación. interferencias.
 No utiliza reactivos  La solución debe ser clara e
adicionales incolora. La turbidez puede
producir resultados erráticos.
Métodos
Colorimétricos.
 Bastante específico para
proteínas.  Tiene poca sensibilidad
Biuret.  Muestra pocas (Concentraciones pequeñas
interferencias. de proteína)
 Es barato.
 La intensidad de color
depende del contenido de Tyr
y Trp en la muestra.
Lowry.  Tiene bastante sensibilidad.
 Muestra interferencias como
detergentes no iónicos y
soluciones básicas.

7
  Muestra interferencias con
 El complejo colorante-
detergentes.
proteína tiene un alto
 El colorante Azul brillante de
coeficiente de extinción lo
Comassie G-250 se une
Bradford. cual es imprescindible para
fuertemente a las celdas de
aumentar la sensibilidad en
cuarzo. Por esto se
la medición de proteínas.
recomienda usar celdas de
vidrio o de polipropileno.

Discusión.

Los métodos colorimétricos para la cuantificación de proteínas se basan en medir la absorbancia del
complejo colorido que se forma tras la reacción de la proteína con el colorante. Para un método
colorimétrico se necesita una curva patrón, también llamada curva de calibración, la cual es un marco
de referencia que se construye con cantidades conocidas de proteína, esta se utiliza para determinar
cantidad de proteína presente en una muestra desconocida. En las determinaciones colorimétricas,
existe una relación directamente proporcional entre la intensidad de color y la cantidad de proteína
que la provoca.

Con el desarrollo de la práctica se obtuvo como primer punto la curva de calibración para cada uno
de los métodos realizados, en el método de Lowry se observa una mejor tendencia lineal de los
datos, siendo observable en el coeficiente de correlación 0.9974, en comparación de la curva de
calibración del método de Bradford, coeficiente de correlación igual a 0.9591, asi mismo la pendiente
es mayor en el método de Bradford, 0.002354, indicando una mayor sensibilidad del método, esto
∆𝐴
debido a la siguiente interpretación: la pendiente matemáticamente es , con lo que
∆𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
se deduce que en la misma cantidad de proteína la absorbancia es mayor, y que en menores
concentraciones de proteína el método las puede detectar con una absorbancia considerable.

Como todo método, al medir la absorbancia en el espectrofotómetro, se tiene un error, el cual se

denomina error fotométrico que es la incertidumbre en una medida (absorbancia); error en la
transmitancia provoca un error en la absorbancia arrojando un dato incorrecto en la concentración.
A bajos y altos valores de transmitancia el error fotométrico es máximo, esto debido a que en esos
puntos se tiene una concentración alta y baja de proteína respectivamente, motivo por el cual es que
se trabaja con la parte central de la curva (tubo 3) para realizar el análisis estadístico de cada uno
de los métodos. Se observa una menor desviación en el método de Lowry, indicando que se trabajó
mejor en comparación con el método de Bradford que es el que muestra una variación de datos
mayor, como se expone en la tabla 3 y 3.1.

El análisis estadístico del método de Bradford muestra precisión en cuanto a los datos pero no
exactitud, debido a que la cantidad de proteína esperada era alrededor de 75µg, lo cual nos exhorta
a ser más cuidadosos en el manejo de las preparaciones para tener mejores resultados.

Existen sustancias que pueden interferir en el resultado esperado, esto debido a que el colorante
puede reaccionar de una u otra manera dando un falso resultado. Se evaluaron distintas sustancias
que determinaron si eran interferencias al método o no, usando el intervalo de confianza que nos
proporcionó el análisis estadístico. Para el método de Lowry se observa que se tienen inferencias
positivas al usar Tris 1M pH7, detergente comercial al 1%, fenol al 1%, Mercaptoetanol al 0.1%, urea
al 5% y sulfato de amonio 3%, esto debido a que estos agentes producen la reducción del reactivo,
por ejemplo el fenol es un análogo estructural de la tirosina la cual es un aminoácido que reduce al
reactivo de Folin-Ciocalteau.

8
El método de Bradford de acuerdo a nuestros límites de confianza no muestra interferencias, esto
es incorrecto pues se puede atribuir este error al proceso de manipulación de las sustancias al medir
sus volúmenes, ya que estos eran muy pequeños, la agitación no fue la adecuada lo que no permitió
la completa reacción entre la proteína y el reactivo azul brillante de Comassie G-250 y el uso de
distintas celdas que presentaron una desviación en la absorbancia.

Conclusiones.

La elaboración de la curva de calibración nos permite cuantificar la cantidad de proteínas presentes

en una muestra conociendo su absorbancia, para obtener resultados con mayor precisión es
recomendable medir los volúmenes de manera cuidadosa ya que en el mal desarrollo de la medición
es donde se encuentran las alteraciones de los resultados.

Gracias al análisis estadístico de los métodos de Bradford y Lowry podemos deducir que si existe
diferencia estadísticamente significativa tanto en la precisión como en la exactitud, siendo
constatables en los resultados expuestos.

Algunas sustancias no proteínicas presentan interferencias en el desarrollo de color, esto es debido

a la reacción que tienen al entrar en contacto con el colorante dando un falso error en la cantidad de
proteína.

Al momento de la elección del método para la cuantificación de proteínas es necesario tener presente
los objetivos, costos, insumos disponibles, tiempo así como analizar los errores que pueden influir
en el método a utilizar, pues de ello dependerá la eficiencia y eficacia de los resultados.

Bibliografía.

 Métodos para la cuantificación de proteínas, Fernández, E. y Galván, A., consultado el día

29 de Septiembre de 2015, del sitio: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
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 Material de apoyo para los estudiantes del curso Bioquímica experimental (0141), Sánchez,
S., consultado el día 30 de Septiembre de 2015, del sitio:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22427.p
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 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.

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