UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANAS
LICENCIATURA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
GENÉTICA MOLECULAR LABORATORIO
GRUPO 2651

Informe de la práctica 7 Y 8: Aislamiento y purificación de plásmidos/Digestión de

DNA con endonucleasas de restricción.

Equipo 3
Chaparro Camacho Diana Andrea
Huerta Silva Jesús Eduardo
Vera Maldonado Karol Scarlet
Zavaleta Ojeda Karen Adeydi

FECHA DE ENTREGA: 14 de mayo de 2018

PROFESORES: Dra. María Eugenia Aranda Barradas

Q.F.B. Nydia B. González Ángeles
B.Q.D. Larisa Andrea González Salce
 Aislamiento y purificación del plásmido Pdest 22 por la técnica de Miniprep y su
digestión con enzimas de restricción (EcoRI y Hind III)

Resumen
La ingeniería genética utiliza una serie de técnicas que permiten la modificación de los
ácidos nucleicos que conforman los genes. Un descubrimiento que permitió el surgimiento
de esta rama de la ciencia fue el de los elementos genéticos móviles en bacterias y
levaduras que se encuentran de manera libre en su citoplasma. Entre ellos, ocupando un
lugar destacado, están los plásmidos y las enzimas de restricción. Debido a la importancia
que esto como uno de los pasos previos de trabajos de alta importancia, como
secuenciación y clonación, en el trabajo siguiente se realizó el aislamiento y purificación de
DNA plasmídico de una cepa de E. Coli por lisis alcalina (Miniprep), comprobando ello con
el índice 260/280; posteriormente se llevó a cabo la digestión del mismo usando EcoRI,
HindIII y una mezcla de ambos para observar a través de electroforesis el número y el
tamaño de los cortes producidos. Por medio de esto se obtuvo una purificación exitosa con
un índice 260/280 de 1.82, encontrándose después de la digestión un corte con EcoRI de
2923 pb, dos con Hind III de 6000 y 4000 pb y tres cortes con una mezcla de ambos, de
tamaños 5853, 1077 y 2000 pb, respectivamente.

Palabras clave: Plásmidos, pDEST22, lisis alcalina, enzimas de restricción, EcoRI, Hind III,
indice 260/280, electroforesis, extremos romos, extremos cohesivos.

Abstract
Genetic engineering uses a series of techniques that allow the modification of the nucleic
acids that make up the genes. A discovery that allowed the emergence of this branch of
science was the mobile genetic elements in bacteria and yeasts that are found freely in their
cytoplasm. Among them, occupying a prominent place, are plasmids and restriction
enzymes. Due to the importance of this as one of the previous steps of high-importance
work, such as sequencing and cloning, in the following work the isolation and purification of
plasmid DNA of an E. Coli strain by alkaline lysis (Miniprep) was performed, checking it with
the index 260/280; later digestion was carried out using EcoRI, HindIII and a mixture of both
to observe through electrophoresis the number and size of the cuts produced. By means of
this a successful purification was obtained with an index 260/280 of 1.82, being after the
digestion a cut with EcoRI of 2923 bp, two with Hind III of 6000 and 4000 bp and three cuts
with a mixture of both, of sizes 5853, 1077 and 2000 bp, respectively.

Keywords: Plasmids, pDEST22, alkaline lysis, restriction enzymes, EcoRI, Hind III, index
260/280, electrophoresis, blunt ends, cohesive ends.

Introducción biotecnología, a través de la generación

La ingeniería genética utiliza una serie de
técnicas que permiten la modificación de
los ácidos nucleicos que conforman los
genes. Dichas modificaciones resultan de
gran importancia en la elaboración de
muchas sustancias por medio de la
de organismos transgénicos u organismos
genéticamente modificados, así como
para el aislamiento de determinadas
proteínas para su estudio profundo. Un
descubrimiento que permitió el
surgimiento de esta rama de la ciencia fue
el de los elementos genéticos móviles en
bacterias y levaduras que se encuentran
de manera libre en su citoplasma. Entre
ellos, ocupando un lugar destacado, están
los plásmidos (Rajchenberg, 2008).
Los plásmidos son elementos genéticos
extracromosómicos que se han
encontrado esencialmente en todos los
tipos de bacterias estudiadas hasta la
fecha y tiene un origen de replicación
autónomo. Dependiendo de su tamaño
pueden codificar desde unas cuantas
proteínas hasta cientos de ellas, los
plásmidos varían ampliamente en tamaño,
desde miles a cientos de miles de pares
de bases (un tamaño comparable al
cromosoma bacteriano) y son, con mayor
frecuencia, moléculas circulares de DNA
de doble cadena (Loezada, 2004).
Existen diferentes técnicas para aislar el
DNA plasmídico y uno de los métodos
más usado es el método de extracción por
lisis alcalina. Este método aprovecha las
diferencias en el tamaño y la
superhelicidad que es el grado de torsión
que sufre el DNA plasmídico en contraste
con el cromosomal. La mayoría de los
cromosomas bacterianos, son moléculas
circulares extremadamente grandes que
no se encuentran superenrollados,
mientras que los plásmidos son moléculas
pequeñas y superenrolladas. Durante el
proceso de extracción, se busca
desnaturalizar el DNA plasmídico y el
cromosomal y posteriormente
renaturalizar, con el fin de que el DNA
cromosomal, no se aparee rápidamente y
pueda ser atrapado por complejos
proteicos, los cuales precipitaron; a
diferencia del DNA plasmídico que
rápidamente se renaturaliza y adquirirá su
conformación natural (Checa, 2017).
Durante el decenio de 1970 se encontró
que las bacterias contenían nucleasas
que reconocían secuencias cortas de
nucleótidos dentro de un DNA doble y
dividían la columna central del DNA en
sitios específicos en ambas cadenas de la
hélice doble.
Estas enzimas se conocen como
endonucleasas de restricción o enzimas
de restricción. Las secuencias que la
mayoría de las enzimas reconocen miden
cuatro a seis nucleótidos de largo y se
caracterizan por un tipo particular de
simetría interna. Sin embargo, algunos
producen extremos romos (Karp, 2005).
La DNA ligasa es una enzima que une
DNA. Si dos fragmentos de éste tienen
extremos complementarios, la ligasa
puede unirlos para formar una molécula
única e intacta de DNA.
En la clonación de DNA, se utilizan
enzimas de restricción y DNA ligasa para
insertar genes y otros fragmentos de DNA
en plásmidos.
Esto permite, entre otros usos, realizar
modificaciones en la molécula de DNA, lo
cual tiene muchas aplicaciones en la
biotecnología.
Esto se puede usar para estudiar la
expresión de un gen, para producir
proteínas para tratamientos de
enfermedades, vacunas, y con otros fines.
Debido a la importancia que esto tiene en
varios campos de la genética molecular,
como uno de los pasos previos de
trabajos de alta importancia, en el trabajo
siguiente se tiene como objetivo, realizar
el aislamiento y purificación del DNA
plasmídico de una cepa de E. Coli por lisis
alcalina (Miniprep) y posteriormente llevar
a cabo la digestión del mismo usando
EcoRI, HindIII y una mezcla de ambos
para observar a través de electroforesis el
número y tamaño de los cortes
producidos.
Metodología
Consultar el Manual de Laboratorio de
Genética Molecular, correspondiente a la
práctica 7 y 8: Aislamiento y purificación
3 3406.03 1.828
de plásmidos/Digestión de DNA con
endonucleasas de restricción, págs. 58- 4 3627.25 1.615
70. Cuantificación, así como cálculo de índice
realizada por espectrofotometría en el equipo
Resultados Epoch.

Se llevó a cabo la extracción de plásmidos Fig 1. Electroforesis del plásmido extraído

de bacterias de Escherichia coli por el y su correspondiente digestión
método miniprep, cada equipo de trabajo
extrajo DNA plasmídico correspondiente a
Pdest22, se determinó la concentración
de este por espectrofotometría en
microplaca así como índices 260/280, Se
realizaron 3 digestiones con
endonucleasas, 2 simples y una doble, se
hizo correr una electroforesis en gel de
agarosa al 1% del DNA plasmídico sin
digerir y con su correspondiente digestión La concentración del gel de agarosa es al 1%, en
donde se observaron bandas para el rojo se tiene lo colocado en cada pozo, M marcador
DNA del plásmido con un peso de peso molecular de 10000 a 1000 pares de bases,
aproximado de 9000 pb y para el material Pl plásmido extraído, el número corresponde al
digerido sencillamente con la equipo que lo llevó a cabo, D es la correspondiente
endonucleasa EcoRI, una banda digestión, en morado digestión sencilla de PL1 con
aproximadamente 8000 pb, con HindIII EcoRI, en amarillo PL2 digestión sencilla con
HindIII, En azul digestión doble de PL3 y PL4 con
dos bandas la primera a los 6000 pb y la
EcoRI e HindIII, en rosa y en verde se observan
segunda a los 4000 pb aproximadamente,
bandas poco definida características de
con respecto a la digestión doble llevada contaminación con proteínas.
a cabo con las enzimas anteriores se
observan 3 bandas la primera a 6000 pb Fig 2. Mapa genético del plásmido Pdest22
la segunda 3000 pb y la tercera a 1000 pb
aproximadamente.
Se realizó un análisis bioinformático
apoyándose de la base de datos
NEBcutter que permite realizar
digestiones teóricamente y de esta forma
contrastar resultados experimentales.

Tabla 1. Concentración e índices 260/280

de los plásmidos extraídos
Equipo Concentración índice
en ng/uL 260/280
Mapa obtenido de la base de datos NEBcutter
donde se observa sitios de origen de replicación,
1 2389.9 1.914 “a”:Ampicilina “e”:pUC “g”:pADH1 “d”:ADH1TT
“c”:F1ori “h”: TRP1 “b”: ARS/CEN. así como los
2 3455.05 1.572
sitios y enzimas de restricción que pueden digerir el Fig 5. Mapa genético de Pdest22 digestión
plásmido. sencilla con HindIII

Fig 3. Mapa genético de Pdest22 digestión

sencilla con EcoRI

Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos

NEBcutter donde se observa sitios de origen de
replicación, la endonucleasa HindIII corta entre
Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos los nucleótidos 868,869 y entre 4540,4541 dando
NEBcutter donde se observa sitios de origen de
como resultado dos fragmentos de 5251 pb y 3672
replicación, la endonucleasa EcoRI corta entre los
pb.
nucleótidos 1851 y 1852 dando como resultado un
fragmento lineal

Fig 6. Electroforesis teórica de la digestión

Fig 4. Electroforesis teórica de la digestión
de Pdest22 con la endonucleasa HindIII
de Pdest22 con la endonucleasa EcoRI

Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la

Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la
base de datos NEBcutter donde se observa una
banda con un peso de 8923 pb. cuando se digiere
Pdest22 con la endonucleasa EcoRI.
base de datos NEBcutter donde se observan dos
bandas con un peso 5251 pb y 3672 pb cuando se
digiere Pdest22 con la endonucleasa HindIII.
Fig 7. Mapa genético de Pdest22, digerida
doblemente con EcoRI y HindIII
Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos
NEBcutter donde se observa sitios de origen de
replicación, la endonucleasa HindIII corta entre
los nucleótidos 868,869 y entre 4540,4541 y la
endonucleasa EcoRI corta entre los nucleótidos
1851 y 1852 dando como resultado tres fragmentos
de 5251pb, 2689 pb y 983pb.
Fig 8. Electroforesis teórica de la
digestión doble de Pdest22 con las
endonucleasas HindIII y EcoRI
Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la
base de datos NEBcutter donde se observan tres
bandas con un peso 5251 pb, 2689 pb y 983pb
cuando se digiere Pdest22 con las endonucleasas
HindIII y EcoRI.
Discusión
El uso de antibiótico se hace para poder
seleccionar aquella colonia (s) que tengan
el plásmido, en este caso pDEST22 de
8923 pb contiene un gen que les confiere
la resistencia a la ampicilina. Por ello, el
crecimiento de las células transformadas
(células que han recibido el plásmido) se
puede identificar sobre un medio de agar
que contenga el antibiótico.
El método de Miniprep aprovecha las
diferencias entre el DNA cromosómico y el
plasmídico por sus diferencias en tamaño,
pudiendo fragmentar y desnaturalizar el
DNA cromosómico de forma selectiva y
finalmente renaturalizar el DNA
plasmídico en el sobrenadante junto con
el RNA, es por esto que en uno de los
pasos posteriores fue necesario agregar
RNAsa para obtener el DNA plasmídico lo
más puro posible.
El índice 260/280 obtenidos, permiten
comprobar que no hay presencia de
impurezas, restos de los reactivos durante
la lisis alcalina o RNA, que pueda interferir
en la digestión del DNA, los únicos
valores que se encuentran fuera del rango
corresponden al equipo 2 y 4 (tabla 1)
sabiendo que el índice debe ir de 1.8 a
1.9 para considerar una muestra pura, los
valores de estos índices puede deberse
por algunos restos de proteínas que
acompañe al plásmido ya que los valores
son menores a 1.8 y esteefecto se ve
provocado por que las proteínas tienen
absorbancia a 280 lo que hace que al
hacer la relación el valor de este índice
baje (Bancoadn,2016).
Los fragmentos generados a través de la
digestión por las enzimas de restricción se
analiza por electroforesis en gel de
agarosa al 1%.las enzimas trabajadas
fueron EcoRI y HindIII, la endonucleasa
EcoRI reconoce y corta este sitio
G-A ATTC en sentido 5’-3’, mientras que
HindIII reconoce y corta la secuencia A-
AGCTT en sentido 5’-3’ ,siempre lo hacen
en un patrón muy específico, la
endonucleasa EcoRI permite tener
extremos cohesivos y la endonucleasa
HindIII extremos romos.
EcoRI solo produce un corte, mientras
que HindIII produce dos cortes, por lo cual
en la electroforesis (Fig 1) se observa este
patrón D1 muestra una sola banda de
9000 pb ya que fue donde se realizó la
digestión simple con EcoRI, donde el DNA
sólo se linealizó, por lo cual se muestra
este patrón de corrimiento que era el
esperado fig 4. Mientras que cuando se
realizó la digestión simple con HindIII en
la electroforesis se observan las dos
bandas una de 6000 y otra 4000 pb, lo
que permite obtener dos fragmentos de
menor tamaño que pueden migrar hacia el
ánodo de forma distinta, corrimiento
esperado fig 6.
Al realizar una digestión con las dos
enzimas sobre el plásmido el resultado
son tres bandas, por los cortes que realiza
cada enzima que en total son 3, las
bandas tienen distintos tamaños debido al
sitio donde corta cada enzima, por lo cual
se muestra este patrón de corrimiento (D3
y D4 de la Fig 1) que era el esperado Fig
8.
Los cortes van a provocar que el DNA se
enrolle en mayor o menor medida, esto
provoca diferentes corrimientos en el gel.
En esta electroforesis se puede apreciar
que Pl2 y Pl 4 muestran bandas no del
todo definidas esto porque no se puede
realizar el corrimiento de forma adecuada
por que existe contaminación con
proteínas que son más afines al cátodo lo
que justifica el punto anterior de la
discusión de los índices 260/280.
Es importante mencionar que existen
otros factores que permiten que una
digestión sea exitosa o no y que deben
cuidarse por que van desde un correcto
manejo del material de laboratorio,
factores como pH, temperatura, nutrientes
en el caldo que permitirán el crecimiento
de las cepas, posteriormente
concentración de antibiótico y medio
adecuado para que se puedan
seleccionar a las células transformadas,
para la extracción del plásmido, así como
agregar la enzima RNasa para degradar
el RNA presente, la concentración de
sales en buffer, temperatura así como pH
puesto que un aumento del pH de la
reacción produce la ausencia de cationes
monovalentes que provoca actividades
alternativas. Estos tres factores
permitirán que las endonucleasas trabajen
de forma correcta en condiciones óptimas
y así se obtenga la digestión esperada.
Conclusiones
El uso de lisis alcalina es un método
eficaz en la purificación y aislamiento de
DNA, lo cual se pudo corroborar con el
índice 260/280 y los resultados de
electroforesis en el cual no se observó
presencia importante de residuos de los
reactivos usados durante el aislamiento o
por RNAsas. ASí, los resultados
mostraron un corte con EcoRI, dos cortes
con HindIII y tres con una mezcla de
ambos.
Referencias
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control de calidad de muestras.
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