ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN CONSTRUIDA EN CÉLULAS UTILIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS

DE PROTEÍNAS DERIVADAS DE ADN-R

I. Introducción
Este documento presenta orientación con respecto a la caracterización de la construcción de expresión para la producción de productos
de proteína de ADN recombinante en células eucariotas y procariotas. Este documento pretende describir los tipos de información que
se consideran valiosos para evaluar la estructura de la construcción de expresión utilizada para producir proteínas derivadas de ADN
recombinante. Este documento no pretende abarcar todo el aspecto de calidad de los medicamentos derivados de rDNA.
La construcción de expresión se define como el vector de expresión que contiene la secuencia codificante de la proteína recombinante.
Los segmentos de la construcción de expresión deberían analizarse usando técnicas de ácido nucleico junto con otras pruebas realizadas
sobre la proteína recombinante purificada para asegurar la calidad y la consistencia del producto final. El análisis de la construcción de
expresión a nivel de ácido nucleico se debe considerar como parte de la evaluación general de la calidad, teniendo en cuenta que esta
prueba solo evalúa la secuencia de codificación de un gen recombinante y no la fidelidad de traducción ni otras características de la
proteína recombinante, tales como estructura secundaria, estructura terciaria y modificaciones postraduccionales

II. Justificación para el análisis de la construcción de expresión

El propósito de analizar la construcción de expresión es establecer que la secuencia de codificación correcta del producto se ha
incorporado a la célula huésped y se mantiene durante el cultivo hasta el final de la producción. La secuencia genética de proteínas
recombinantes producidas en células vivas puede sufrir mutaciones que podrían alterar las propiedades de la proteína con posibles
consecuencias adversas para pacientes. No se puede esperar que ningún enfoque experimental individual detecte todas las
modificaciones posibles en una proteína. Las técnicas analíticas de proteínas se pueden usar para evaluar la secuencia de aminoácidos
de la proteína y las características estructurales de la expresión proteína debido a modificaciones postraduccionales tales como
procesamiento proteolítico, glicosilación, fosforilación y acetilación. Los datos del análisis de ácidos nucleicos pueden ser útiles ya que
los métodos de análisis de proteínas pueden no detectar todos los cambios en la estructura de la proteína que resultan de las mutaciones
en la secuencia que codifica la proteína recombinante. La importancia relativa del análisis de ácidos nucleicos y el análisis de proteínas
variará de un producto a otro. El análisis de ácidos nucleicos se puede utilizar para verificar la secuencia de codificación y el examen
físico estado de la construcción de expresión. El análisis de ácidos nucleicos se realiza para asegurar que la proteína expresada tendrá
la secuencia de aminoácidos correcta, pero no pretende detectar niveles bajos de secuencias variantes. Donde las celdas de producción
tienen múltiples copias integradas de la construcción de expresión, no todas pueden ser transcripcionalmente activo, examinar el
producto de transcripción mismo por el análisis de ARNm o ADNc puede ser más apropiado que el análisis de ADN genómico. Enfoques
analíticos que examinan una población masiva de ácidos nucleicos, como los que se realizan en clones combinados o material amplificado
por la polimerasa reacción en cadena, puede considerarse como una alternativa a los enfoques que dependen de la selección de clones
de ADN individuales. Se podrían considerar otras técnicas que permitan la confirmación rápida y sensible de la secuencia que codifica
la proteína recombinante en la construcción de expresión.
Las siguientes secciones describen la información que se debe proporcionar con respecto a la caracterización de la construcción de
expresión durante el desarrollo y la validación del sistema de producción. Las metodologías analíticas deberían ser
validado para el propósito previsto de confirmación de la secuencia. La documentación de validación debe, como mínimo, incluir
estimaciones de los límites de detección para secuencias variantes. Esto se debe realizar ya sea para ácido nucleico o proteína
métodos de secuenciación La filosofía y recomendaciones para el análisis expresado en este documento debe ser revisado
periódicamente para aprovechar los nuevos avances en tecnología e información científica.

III. Caracterización del sistema de expresión

A. Expression Construct y Cell Clone utilizados para desarrollar el Master Cell Bank (MCB)
El fabricante debe describir el origen de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Esto debería incluir la identificación y la
fuente de la célula a partir de la cual se obtuvo originalmente la secuencia de nucleótidos. Deben describirse los métodos utilizados para
preparar el ADN que codifica la proteína. Los pasos en el ensamblaje de la construcción de expresión se deben describir en detalle. Esta
descripción debe incluir la fuente y la función de las partes componentes de la construcción de expresión, por ejemplo, orígenes de
replicación, resistencia a antibióticos genes, promotores, potenciadores, si la proteína se está sintetizando o no como una proteína de
fusión. Se debe proporcionar un mapa de componentes detallado y una secuencia anotada completa del plásmido, que indique las
regiones que se han secuenciado durante la construcción y los tomados de la literatura. Se deberían indicar otras proteínas expresadas
codificadas por el plásmido. La secuencia de nucleótidos de la región codificante del gen de interés y las regiones flanqueantes asociadas
que están insertado en el vector, hasta e incluyendo las uniones de inserción, debe determinarse por secuenciación de ADN de la
construcción. Se debe proporcionar una descripción del método de transferencia de la construcción de expresión en la célula huésped.
Además, los métodos utilizados para amplificar el constructo de expresión y los criterios utilizados para seleccionar el clon celular para
la producción se deben describir en detalle

B. Sistema de banco de células

La producción de la proteína recombinante debe basarse en bancos de células maestras y de trabajo bien definidos. Un banco de células
es una colección de ampollas de composición uniforme almacenadas en condiciones definidas, cada una de las cuales contiene una parte
alícuota de un solo grupo de células. El Master Cell Bank (MCB) generalmente se deriva del clon celular seleccionado que contiene el
constructo de expresión. El Working Cell Bank (WCB) es derivado por la expansión de una o más ampollas del MCB. La historia de la
línea celular y la producción de los bancos de células se deben describir en detalle, incluidos los métodos y reactivos utilizados durante
el cultivo, la edad celular in vitro y las condiciones de almacenamiento. Todos los bancos de células deben caracterizarse por marcadores
fenotípicos y genotípicos relevantes que podría incluir la expresión de la proteína recombinante o la presencia de la construcción de
expresión.

La construcción de expresión en el MCB debe analizarse como se describe a continuación. Si la prueba no puede llevarse a cabo en el
MCB, debe llevarse a cabo en cada WCB.
El mapeo de la endonucleasa de restricción u otras técnicas adecuadas deberían usarse para analizar el constructo de expresión para el
número de copias, para las inserciones o eliminaciones, y para el número de sitios de integración. Para sistemas de expresión
extracromosómicos, debe determinarse el porcentaje de células hospedadoras que retienen la construcción de expresión.
La secuencia de codificación de proteínas para el producto de proteína recombinante del construcción de expresión debe ser verificada.
Para sistemas de expresión extracromosómicos, la construcción de expresión se debe aislar y la secuencia de nucleótidos que codifica
el producto se debe verificar sin más clonación. Para celdas con copias cromosómicas de la construcción de expresión, la secuencia de
nucleótidos que codifica el producto podría verificarse por reclonación y secuenciación de copias cromosómicas. Alternativamente, la
secuencia de ácido nucleico que codifica el producto podría ser verificada por técnicas tales como la secuenciación de clones de ADNc
combinados o material amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa. La secuencia de ácido nucleico debe ser idéntica, dentro
de los límites de detección de la metodología, a la determinada para la expresión construir como se describe

C. Límite para la edad de las células in vitro para la producción

El límite para la edad de las células in vitro para la producción debe basarse en los datos derivados de las células de producción
expandidas bajo una escala de planta piloto o en condiciones de escala completa a la edad propuesta de células in vitro o más. En general,
las celdas de producción se obtienen por expansión del Working Cell Bank; el Master Cell Bank podría usarse para preparar las celdas
de producción con la justificación adecuada.
La construcción de expresión de las células de producción debe analizarse una vez para el MCB como se describe en la Sección III.B.,
excepto que la secuencia de codificación de proteínas del constructo de expresión en las células de producción podría verificarse
mediante cualquiera de los ácidos nucleicos prueba o análisis del producto proteico final. Los aumentos en el límite definido para la
edad de la célula in vitro para la producción deberían estar respaldados por datos de células que se han expandido a una edad celular in
vitro que es igual o mayor que el nuevo límite para la edad celular in vitro.

IV. Conclusión
La caracterización de la construcción de expresión y la proteína purificada final son importantes para garantizar la producción constante
de un producto derivado de ADN recombinante. Como se describió anteriormente, se considera que los datos analíticos derivados tanto
del análisis de ácido nucleico como de la evaluación de la proteína purificada final deberían evaluarse para garantizar la calidad de un
producto de proteína recombinante.

GLOSARIO DE TÉRMINOS
Construcción de expresión
El vector de expresión que contiene la secuencia codificante de la proteína recombinante y los elementos necesarios para su expresión.
Regiones de control de flanqueo
Secuencias de nucleótidos no codificantes que son adyacentes al extremo 5 'y 3' de la secuencia codificante del producto que contienen
elementos importantes que afectan a la transcripción, traducción o estabilidad de la secuencia codificante. Estas regiones incluyen, por
ejemplo, promotor, potenciador y secuencias de empalme y no incluyen los orígenes de la replicación y los genes de resistencia a
antibióticos.
Sitio de integración
El sitio donde se integra una o más copias del constructo de expresión en el genoma de la célula huésped.
Edad celular in vitro
Medida de tiempo entre el deshielo del vial (s) de MCB para la cosecha del buque de producción medido por el tiempo cronológico
transcurrido en cultivo, por el nivel de duplicación de la población del células, o por nivel de paso de las células cuando se subcultivan
mediante un procedimiento definido para la dilución del cultivo