Professional Documents
Culture Documents
Tema 2 BCA0506
Verticales : tipo I
tipo II-A
tipo II-B (B1, B2, B3)
Clase III
“Primary containtment for Biohazards : selection, installation and use of Biological Safety Cabinets” CDC
http://www.nih.gov/od/ors/ds/pubs/bsc/
Tema 2 BCA0506
1
Filtros HEPA
http://tis.eh.doe.gov/hepa/
¡¡¡Necesidad de control!!!
Tema 2 BCA0506
INCUBADORES DE CO2
Tema 2 BCA0506
2
Toma de aire
indicadores
Tema 2 BCA0506
Estufas
Baños termostáticos
Pipetas / pipeteadores
Bunsen (?)
En una cabina de
seguridad biológica :
distorsiona el flujo laminar
y puede dañar filtro HEPA
Tema 2 BCA0506
3
Centrífugas
Capacidad media
2000 x g
Basculantes
Diferentes tubos (1.5 –50 mL)
Cestillas estancas
Refrigeradas (?)
Tema 2 BCA0506
Dispositivo de iluminación
Anillos de fase
Hep- perro
Objetivos /
diafragmas de fase
Prisma óptico
hFb
Tema 2 BCA0506
4
CONTADORES CELULARES
Hemocitómetro
(Cámara de Neubauer)
Tema 2 BCA0506
suspensión celular
cubreobjetos
área de contaje
Tema 2 BCA0506
5
CONTADORES CELULARES vacio
http://www.coulter.com
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
6
Làmpada
Diafragma d’excitació
Filtre d’excitació
Ocular
Objectiu
Filtre d’emisió
Tema 2 BCA0506
Làser
Excitation Pinhole
Filtre d’excitació
PMT
Objectiu Filtre
d’emisió
Emission Pinhole
Tema 2 BCA0506
7
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
8
MICROINYECTORES, MICRODISECTORES, …
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
9
Instrumentos para la microinyección
Microinyector
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
10
El medio de cultivo
Vidrio
1. El sustrato
Plástico (poliestireno)
Materiales
Microsoportes
Recipientes
Sustratos metálicos
2. La fase gaseosa
Superficies tratadas
oxígeno
‘Feeder layers’
dióxido de carbono
Matrices tridimensionales
3. Condiciones físico-químicas y fisiológicas
Interfases
pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad
Haces microcapilares permeables
composición del medio :
Nuevos dispositivos (p. Ej. Opticell)
bss
AA, vitaminas, glúcidos
hormonas, factores de crecimiento
antibióticos, antifúngicos
suero
Tema 2 BCA0506
La fase gaseosa
1. Oxígeno
2. Dióxido de carbono
Tema 2 BCA0506
11
Condiciones físico-químicas y
fisiológicas del medio de
cultivo
Condiciones físico-químicas
pH (aprox 7.2)
osmolaridad
temperatura
homeotermos
poiquilotermos
viscosidad
Condiciones fisiológicas
(concentración sustancias en
el medio de cultivo)
BSS
AA, vitaminas, glúcidos
sust. Organicas bajo PM
hormonas, factores crec.
Suero
antibióticos / antifúngicos
12
Tratamiento del suero
CHO, COS, MDCK,... HUVEC, BBEC, etc...
Obtención
Alicuotado y congelación
Descongelación
DMEM + 5-10% FCS DMEM + 20-25% FCS
Tema 2 BCA0506
13
Técnicas básicas en el cultivo celular
Técnica aséptica
reactivos : esterilización
reactivos : filtración
test de contaminación
Subcultivo
Clonaje
Caracterización
Descongelación - Congelación
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
14
Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica
Contaminaciones
Tema 2 BCA0506
a. Técnica aséptica
b. Controles rutinarios
test de esterilidad (cultivos bacterianos o/n)
control de micoplasmas
tinción orceína
tinción con Hoechst 33258 / DAPI
test de crecimiento 6-MPDR
sondas DNA
kits de detección
control de virus
antígenos virales
PCR
Tema 2 BCA0506
15
Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica
Tinción directa
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
16
Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica
¿…y si se contamina?
Si es muy crítico :
Tratamientos antibióticos
Antifúngicos
Antimicoplasmas
Paso por animales
Tema 2 BCA0506
Contaminaciones
cruzadas
En la historia del cultivo celular se han aislado algunas lineas celulares que presentan
un tiempo de duplicación corto y una eficiencia de plaqueo elevada. Estas lineas, que
son herramientas experimentales valiosas, son también una fuente importante de
contaminación de otras líneas. Numerosas líneas celulares han sido contaminadas o
incluso reemplazadas por células HeLa.
Tema 2 BCA0506
17
Técnicas básicas de cultivo celular : Subcultivo
Técnicas de subcultivo
¿cuándo?
Agotamiento del medio : cambio de medio (cambios de color)
Agotamiento del espacio (inhibición por contacto)
¿cómo?
Desorganizando la malla de proteínas Medios mecánicos : raspado
que forman la matriz extracelular y/o las Medios químicos : (-Ca2+/Mg2+)
proteínas de unión/adhesión Medios enzimáticos
Tema 2 BCA0506
Tripsinización de un cultivo
18
Agitación (sacudidas a la placa) Se separan las células que están en mitosis y
Más agresivo las adheridas ligeramente
Tripsina (0.01-0-5%) en PBS,
5 a 15 min, 37ºC La mayoría de las líneas celulares
Prelavado con PBS, Tripsina
0.25% en PBS, 37ºC Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente,
y muchas líneas celulares a pases bajos
Prelavado con EDTA 1mM,
Tripsina 0.25 % en PBS, 37ºC Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas
Dos lavados con EDTA 1mM,
dejando en EDTA 1 mM,
1 ml/5 cm2 Células epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles
Prelavado con EDTA, Células fuertemente adheridas, especialmente
Tripsina 0.25% con EDTA epiteliales y algunas tumorales. Hay que tener
presente la posible toxicidad del EDTA.
Prelavado con EDTA 1mM, Cultivos gruesos formados por múltiples capas de
Tripsina 0.25% y colagenasa 200 U/ml en células, especialmente en cultivos productores decolágeno
PBS o EDTA/PBS
Rascar ('scraping') Todos los cultivos, aunque puede producir daño
mecánico y usualmente no produce una buena
suspensión celular.
Añadir dispasa (0.1-1 mg/ml) o Suspenderá la mayor parte de las células, pero
pronasa (0.1-1 mg/ml) al medio hasta requiere la centrifugación de la suspensión para
que las células desadhieran eliminar el enzima no inactivado por el suero. Puede
ser dañino para algunas células. requiere la centrifugación de la suspensión para
. Tema 2 BCA0506
Criterios : Metabólicos
Fenotípicos
Genotípicos
--centrifugación
Técnicas : - Separación física --citometria de flujo
--cromatografía de afinidad
- Clonaje por crecimiento
-- en suspensión (agar /methocel)
-- en placa (anillos de aislamiento)
Obtención de clones en agar
Aislamiento
mov mov
de clones
Tema 2 BCA0506
19
Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje
fusión
Productos cultivados en múltiples pocillos
Selección de los
Solo los hibridomas
hibridomas crecen en medio selectivo
Tema 2 BCA0506
100 cel/pocillo
1 2 3 n medio de cultivo 1,2,...
10 cel/pocillo
20
Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje
transfección
clon1 clon2
Tema 2 BCA0506
Razones :
a. Correlacionar con el tejido de origen
1. Identificar la linea de procedencia
2. Posicionar las células en la linea de diferenciación
3. ¿Transformada?
b. Comprobación de su estabilidad y variación
c. Contaminación cruzada
d. Identificación de lineas con características únicas
Tema 2 BCA0506
21
Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular
Caracterización
Todo vale (dependerá de la finalidad buscada)
Tema 2 BCA0506
Tema 2 BCA0506
22
Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular
Tema 2 BCA0506
Metastatic melanoma
23
Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular
Tema 2 BCA0506
DNA fingerprint
24
Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks
Colecciones internacionales
de líneas celulares
Using stock
Colección de alicuotas registradas
Congelación
Tema 2 BCA0506
25
Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks
Tema 2 BCA0506
26