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Equipos del laboratorio de cultivo celular

Protección personal (guantes, máscara,...)


Protección del cultivo / operador : Cabinas de flujo laminar (I, IIA, IIB, III)
Equipos de filtración de aire, HEPA
Esclusas de presión

Incubador CO2(temperatura -humedad)


Incubación / Mantenimiento / Manipulación Estufas
Baños termostáticos
Pipetas / pipeteadores
Bunsen (?)

Microscopio (invertido) ------Contraste de fases


Observación / Cuantificación Contadores celulares --------Coulter / automático
Citómetros de flujo
Microscopios especiales (fluorescencia, incubadores,
microinyectores, etc…)

Tema 2 BCA0506

CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA


Equipos diseñados para reducir el riesgo del operador cuando maneja organismos
biológicos de riesgo. No protegen, necesariamente, de todos los riesgos. Definen un
área de contención del agente.

Normativa UNE-EN 12469 define 3 tipos :

Clase I : Cabinas de gases (extracción de gases)

Clase II : Cabinas de flujo laminar

Horizontales (manipulación microbiológica)

Verticales : tipo I
tipo II-A
tipo II-B (B1, B2, B3)

Clase III

“Primary containtment for Biohazards : selection, installation and use of Biological Safety Cabinets” CDC
http://www.nih.gov/od/ors/ds/pubs/bsc/

Tema 2 BCA0506

1
Filtros HEPA

Filtros absolutos que tienen una capacidad


de retención del 99,9999% de las partículas
de 0.12 micrometros

http://tis.eh.doe.gov/hepa/

¡¡¡Necesidad de control!!!

Tema 2 BCA0506

INCUBADORES DE CO2

Tema 2 BCA0506

2
Toma de aire
indicadores

Recinto de acero inoxidable

Control fino de la temperatura


rango 25-27 ºC Insectos
rango 35.5-36.5ºC Mamíferos
estantes (camisas agua / aire)
Control de la concentración de CO2
conductividad (ER)
IRGA (Infra-red Gas Analyzer)
Saturación de humedad
Bandeja de agua
Vaporización
Filtración de la cámara : HEPA
Puerta Camisa de agua
caliente
Puerta de cristal

Tema 2 BCA0506

Estufas
Baños termostáticos
Pipetas / pipeteadores

Bunsen (?)
En una cabina de
seguridad biológica :
distorsiona el flujo laminar
y puede dañar filtro HEPA

Tema 2 BCA0506

3
Centrífugas

Capacidad media
2000 x g
Basculantes
Diferentes tubos (1.5 –50 mL)
Cestillas estancas
Refrigeradas (?)

Tema 2 BCA0506

Microscopio (invertido) ------Contraste de fases

Dispositivo de iluminación

Anillos de fase

Hep- perro

Distancia a la lente frontal

Objetivos /
diafragmas de fase

Prisma óptico

hFb
Tema 2 BCA0506

4
CONTADORES CELULARES

Número de células / ml = ((L1+L2+L3+L4)/4) * 10000

Hemocitómetro
(Cámara de Neubauer)
Tema 2 BCA0506

suspensión celular

cubreobjetos

área de contaje

Tema 2 BCA0506

5
CONTADORES CELULARES vacio

La diferencia de potencial permite


contar las partículas y determinar
su tamaño

http://www.coulter.com

Tema 2 BCA0506

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA CONFOCAL

Tema 2 BCA0506

6
Làmpada

Diafragma d’excitació
Filtre d’excitació

Ocular

Objectiu
Filtre d’emisió

Tema 2 BCA0506

Làser

Excitation Pinhole

Filtre d’excitació

PMT

Objectiu Filtre
d’emisió
Emission Pinhole

Tema 2 BCA0506

7
Tema 2 BCA0506

Secciones ópticas de células COS1 transfectadas

Tema 2 BCA0506

8
MICROINYECTORES, MICRODISECTORES, …

Tema 2 BCA0506

Microscopio Instrumentos para la microinyección


invertido
contraste de fases
incubador
registro de imagen

Tema 2 BCA0506

9
Instrumentos para la microinyección

Microinyector

Tema 2 BCA0506

DESCOMPOSICIÓN DEL MOVIMIENTO EN PARTES FÁCILMENTE


DIFERENCIABLES

• 1) Primera fase de movimiento rápido hasta romper la película superfícial del


líquido.
• 2) Fase de movimiento lento hasta un plano inmediatamente superior a la
célula.
• 3) Fase de micromovimientos lentos en el plano Z.

Tema 2 BCA0506

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El medio de cultivo
Vidrio
1. El sustrato
Plástico (poliestireno)
Materiales
Microsoportes
Recipientes
Sustratos metálicos
2. La fase gaseosa
Superficies tratadas
oxígeno
‘Feeder layers’
dióxido de carbono
Matrices tridimensionales
3. Condiciones físico-químicas y fisiológicas
Interfases
pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad
Haces microcapilares permeables
composición del medio :
Nuevos dispositivos (p. Ej. Opticell)
bss
AA, vitaminas, glúcidos
hormonas, factores de crecimiento
antibióticos, antifúngicos
suero

Tema 2 BCA0506

La fase gaseosa

1. Oxígeno
2. Dióxido de carbono

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-

NaHCO3 Na+ + HCO3-


pH

Tema 2 BCA0506

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Condiciones físico-químicas y
fisiológicas del medio de
cultivo
Condiciones físico-químicas
pH (aprox 7.2)
osmolaridad
temperatura
homeotermos
poiquilotermos
viscosidad

Condiciones fisiológicas
(concentración sustancias en
el medio de cultivo)
BSS
AA, vitaminas, glúcidos
sust. Organicas bajo PM
hormonas, factores crec.
Suero
antibióticos / antifúngicos

Tema 2 DMEM:Dulbeccos modified Eagle’s Medium - InvitrogenBCA0506

El suero Aporta al medio :


hormonas,
proteínas de adhesión y de matriz,
factores de crecimiento,…
Composición compleja y desconocida
Coste elevado

Problemas en la obtención : esterilidad, ética, …


Problemas en la homogeneización entre lotes
Problemas de seguridad biológica

Suero bovino : fetal (terneras no-natas)


adulto
adulto irradiado
Principales Suero equino
tipos de Suero humano : AB
suero pools
empleados inactivado por calor
irradiado
Suero ovino
Suero porcino
Tema 2 BCA0506

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Tratamiento del suero
CHO, COS, MDCK,... HUVEC, BBEC, etc...

Obtención

Alicuotado y congelación

Descongelación
DMEM + 5-10% FCS DMEM + 20-25% FCS

Inactivación del complemento


El % de suero en los medios dependerá de los requerimientos
de las células, siendo mayores en los cultivos más
Alicuotado y congelación especializados, y menores en los más indiferenciados

Descongelación y preparación de medios

Tema 2 BCA0506

Variabilidad lote a lote : validación de lotes

Proliferación medida Proliferacion de células endoteliales


por incorporación de
bromodeoxiuridina o 100
arbitrarias
Unidades

tinción mediante cristal 2 horas


violeta 50
24 horas
0 48 horas
blanco suero 1 suero 2 suero 3 72 horas
Sueros analizados

Capacidad de formación de colonias

Atala, Lanz (2002) “Methods of Tissue Engineering”, Academic Press, p. 61


Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas en el cultivo celular

Técnica aséptica
reactivos : esterilización
reactivos : filtración
test de contaminación

Técnicas de aislamiento celular


disgregación tisular, explantes
perfusión ‘in situ’ Tema 3
Técnicas especializadas

Subcultivo
Clonaje
Caracterización
Descongelación - Congelación

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica


Técnica aséptica
Objetivo : protección del cultivo frente a las contaminaciones

1. En la instrumentación 2. En la manipulación 3. En los reactivos


cabinas de flujo a. Esterilización
salas blancas calor (seco/húmedo)
gas (óxido de etileno)
filtración (0.22 µm)
control de esterilidad
Técnicas de trabajo en
cabinas de seguridad Filtración en condiciones de
biológica (BSL) esterilidad biológica en BSL Test de esterilidad

mov mov mov

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

Contaminaciones

Contaminación bacteriana ANTIBIÓTICOS


Contaminación por micoplasmas ANTIBIÓTICOS
Contaminación por virus
Contaminacion por hongos ANTIFÚNGICOS
Contaminación cruzada (pérdida de la identidad)

El uso constante de antibióticos en un cultivo es una fuente de infecciones crónicas.


Muchos microorganismos son detenidos pero no eliminados por los antibióticos.
Pueden por tanto permanecer en el cultivo en modo oculto y aparecer periódicamente
debido a cambios ambientales o a fluctuaciones de la población parásito-huésped. Es
importante que se mantengan periódicamente los cultivos en medios libres de
antibióticos de otra forma las contaminaciones crípticas persistirán, serán difíciles de
identificar e imposibles de erradicar.

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

Prevención de las contaminaciones

a. Técnica aséptica
b. Controles rutinarios
test de esterilidad (cultivos bacterianos o/n)
control de micoplasmas
tinción orceína
tinción con Hoechst 33258 / DAPI
test de crecimiento 6-MPDR
sondas DNA
kits de detección
control de virus
antígenos virales
PCR

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

Detección de micoplasmas : tinción de DNA (orceína / DAPI / Hoechst)

Tinción directa

Tinción indirecta (células indicadoras)

Indicator cells : 3T6 or Vero cells

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

Técnicas de detección de micoplasmas

Tinción DAPI Cultivo en agar Detección por PCR

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

¿…y si se contamina?

En general …. Perder el cultivo

Si es muy crítico :
Tratamientos antibióticos
Antifúngicos
Antimicoplasmas
Paso por animales

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Técnica aséptica

Contaminaciones
cruzadas

Atala, Lanz (2002) “Methods of Tissue Engineering”, Academic Press, p. 62

En la historia del cultivo celular se han aislado algunas lineas celulares que presentan
un tiempo de duplicación corto y una eficiencia de plaqueo elevada. Estas lineas, que
son herramientas experimentales valiosas, son también una fuente importante de
contaminación de otras líneas. Numerosas líneas celulares han sido contaminadas o
incluso reemplazadas por células HeLa.

Precauciones para evitar la contaminación cruzada

1.Obtener siempre las células de bancos de células reputados (ATCC, ECACC)


2.No mantener abiertos frascos de más de una línea a la vez
3. Manipular las líneas de crecimiento rápido las últimas.
4. Nunca usar la misma pipeta para diferentes lineas
5. No usar la misma botella de medio, PBS, etc.. para diferentes lineas
6. No introducir nunca en una botella de medio, PBS, etc.. una pipeta que ha estado
en contacto con células
7. Comprobar las carácterísticas de la linea regularmente, especialmente si se observan
cambios en la tasa de crecimiento, morfología, etc..

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Subcultivo

Técnicas de subcultivo

¿cuándo?
Agotamiento del medio : cambio de medio (cambios de color)
Agotamiento del espacio (inhibición por contacto)

¿cómo?
Desorganizando la malla de proteínas Medios mecánicos : raspado
que forman la matriz extracelular y/o las Medios químicos : (-Ca2+/Mg2+)
proteínas de unión/adhesión Medios enzimáticos
Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Subcultivo

Tripsinización de un cultivo

1. Sacar el frasco. Comprobar contaminaciones


2. Introducir el frasco en la cabina.
3. Quitar el tapón, eliminar el medio sin distor-
sionar la monocapa celular
4. Añadir PBS, sin distorsionar la monocapa.
5. Aspirar el PBS
6. Añadir tripsina a 37ºC
7. Eliminar la tripsina a los 30 seg, antes de que
las células se redondeen.
8. Cerrar el frasco e incubar a 37ºC.
9. Comprobar hasta que las células se redondeen y se suelten.
10. Colocar el frasco en la cabina, añadir 5 ml de medio de cultivo con suero.
11. Pipetear hasta resuspender toda la monocapa.
12. Contar una fracción de la suspensión celular en hemocitómetro o con un contador
electrónico
13. Calcular la dilución correcta y transferir el volumen apropiado de suspensión celular
a un frasco ya marcado con 5 ml de medio.
14. Tapar sin cerrar completamente y colocar en incubador de CO2 o gasear (CO2) e
incubar en sala de incubación (37ºC)
Tema 2 BCA0506

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Agitación (sacudidas a la placa) Se separan las células que están en mitosis y
Más agresivo las adheridas ligeramente
Tripsina (0.01-0-5%) en PBS,
5 a 15 min, 37ºC La mayoría de las líneas celulares
Prelavado con PBS, Tripsina
0.25% en PBS, 37ºC Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente,
y muchas líneas celulares a pases bajos
Prelavado con EDTA 1mM,
Tripsina 0.25 % en PBS, 37ºC Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas
Dos lavados con EDTA 1mM,
dejando en EDTA 1 mM,
1 ml/5 cm2 Células epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles
Prelavado con EDTA, Células fuertemente adheridas, especialmente
Tripsina 0.25% con EDTA epiteliales y algunas tumorales. Hay que tener
presente la posible toxicidad del EDTA.
Prelavado con EDTA 1mM, Cultivos gruesos formados por múltiples capas de
Tripsina 0.25% y colagenasa 200 U/ml en células, especialmente en cultivos productores decolágeno
PBS o EDTA/PBS
Rascar ('scraping') Todos los cultivos, aunque puede producir daño
mecánico y usualmente no produce una buena
suspensión celular.
Añadir dispasa (0.1-1 mg/ml) o Suspenderá la mayor parte de las células, pero
pronasa (0.1-1 mg/ml) al medio hasta requiere la centrifugación de la suspensión para
que las células desadhieran eliminar el enzima no inactivado por el suero. Puede
ser dañino para algunas células. requiere la centrifugación de la suspensión para
. Tema 2 BCA0506

Clonaje Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje

Aislamiento de una subpoblación según algún criterio, con el fin de reducir


la hetereogeneidad de la población celular.

Criterios : Metabólicos
Fenotípicos
Genotípicos
--centrifugación
Técnicas : - Separación física --citometria de flujo
--cromatografía de afinidad
- Clonaje por crecimiento
-- en suspensión (agar /methocel)
-- en placa (anillos de aislamiento)
Obtención de clones en agar

Aislamiento
mov mov
de clones
Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje

Otro ejemplo de clonaje…


obtención de lineas de
hibridomas productoras Ratón inmunizado
con el antígeno X Linea celular mutante
de anticuerpos monoclonales derivada de un tumor
de linfocitos B

Células que produce, Crecen indefinidamente en


entre otros, anticuerpos medio normal y mueren en
Obtención del hibridoma anti-antígenoX( ) medio selectivo
mediante fusión celular (limfocitos B que moriran a
los pocos dias de cultivo)

fusión
Productos cultivados en múltiples pocillos

Selección de los
Solo los hibridomas
hibridomas crecen en medio selectivo

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje

100.000 células por pocillo


1 2 3
10000 cel/pocillo
antígeno X
1000 cel/pocillo
CLONAJE

100 cel/pocillo
1 2 3 n medio de cultivo 1,2,...
10 cel/pocillo

Anticuerpo secundario 1 cel/pocillo


1 2 3 n acomplejado a peroxidasa
0,1 cel/pocillo
Los pocillos positivos son
sustrato de la peroxidasa clones que secretan anti-X
1 2 3 n (OPD por ej.)
Elisa directo

Tema 2 Pocillos 2, 3 positivos, contienen anti-X BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Clonaje

Y un tercer ejemplo… obtención de lineas eucariotas


con expresión estable de una construcción de DNA

Celulas a densidad media-baja

transfección

Selección (geneticina-G418) Vector de expresión


sobreviven las células transfectadas eucariota con marcadores
de selección (neor)
anillo o cilindro
de clonaje

clon1 clon2

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Caracterización de las células

Problema : ¿cómo determinar el origen de una célula?


¿cómo controlar su linaje?

Razones :
a. Correlacionar con el tejido de origen
1. Identificar la linea de procedencia
2. Posicionar las células en la linea de diferenciación
3. ¿Transformada?
b. Comprobación de su estabilidad y variación
c. Contaminación cruzada
d. Identificación de lineas con características únicas

Atala, Lanz (2002) “Methods of Tissue Engineering”, Academic Press, p. 62

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Caracterización
Todo vale (dependerá de la finalidad buscada)

Los métodos clásicos :

- asignación de especie : --estudio cromosómico


--isoenzimas

- asignación de linaje : --antígenos de superficie (CD)


--filamentos intermedios
---CK - epidermis
---Vim - mesodermo
---GFAP - astrocitos…
--productos diferenciados
--enzimas
--funciones especializadas,...

Masters (2001) PNAS 98:8012-8017 y Lawler (2001) TCB 11:364

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Obtención de un preparado de cromosomas

1. Cultivo en crecimiento activo (mitad de fase log)


2. Añadir colchicina o colcemida (detienen las células en mitosis)
3. Incubar de 4 a 6 horas
4. Eliminar medio, tripsinizar las células
5. Añadir una solución de citrato hipotónica
6. Sacar las células en solución de citrato hipotónica, incubar a 37ºC 5-30 min
7. Fijar alicuotas en metanol-acetico frio (4ºC) con agitación constante
8. Centrifugar, eliminar sobrenadante y resuspender en metanol-acético frio (4ºC)
9. Centrifugar, eliminar sobrenadante y resuspender en 2 gotas de metanol-
acético frio (4ºC)
10. Dejar caer gotas sobre el un portaobjetos. Secar rápidamente por decantación.
11. Teñir con Giemsa

12. Observar al microscopio, contando el número de cromosomas por metafase,


entre 50 y 100 metafases. Construir el histograma. Construir el cariotipo.

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Finite glial cell line

Continuous cell line


from transformed glia

Metastatic melanoma

Ejemplo de distribución de cromosomas en 3 lineas


celulares humanas (Freshney 3th edit)
Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

Determinación de patrones de isoenzimas

Atala, Lanz (2002) “Methods of Tissue Engineering”, Academic Press, p. 77

Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Caracterización celular

DNA fingerprint

El DNA contiene regiones de secuencia repetida no transcrita que son muy


variables entre individuos. El patrón de dianas de restricción es específico
de cada individuo, es su DNA fingerprint.

Todas las lineas celulares con el mismo origen (especie, individuo)


comparten su DNA fingerprint.

1. Preparación de DNA total de la linea


2. Digestión con una batería de enzimas
de restricción
3. Electroforesis en gel agarosa y Southern
blot
4. Hibridación con sondas radiactivas

DNA fingerprint de varias lineas celulares


de Freshney 4th edit, edic. electronica
Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks

Congelación de lineas celulares : stocks

Colecciones internacionales
de líneas celulares

Líneas celulares obtenidas,


caracterizadas y libres de contaminación Seed stock
Protegido
expansión No disponible para uso general

Using stock
Colección de alicuotas registradas

Usuario ocasional Usuario frecuente Personal stock


Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks

Congelación de lineas celulares : stocks

Congelación

1. Preparación de una suspensión celular


(tripsinización,etc…)
2. Centrifugación, eliminación de
sobrenadante
3. Resuspensión en solución de congelación
(presencia de criopreservantes
como glicerol o dimetilsulfóxido)
solución de preservación : 90%
Suero bovino fetal (FBS) 10% DMSO
4. Congelación gradual : -20ºC, -80ºC, -192ºC
5. Almacenamiento en nitrógeno líquido Descongelación
sumergidos o en la fase gaseosa
6. Anotar en la base de datos 1. Sacar del nitrógeno líquido
2. Descongelar en agua a 37ºC
3. Pasar el contenido a un frasco
4. Diluir lentamente con medio
BASE DE DATOS DE ALMACENAMIENTO 5. Cambiar el medio al dia siguiente

Tema 2 BCA0506

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Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks

…necesidad de mantener un registro de


las líneas congeladas...
Tema 2 BCA0506

Técnicas básicas de cultivo celular : Congelación y stocks

Tema 2 BCA0506

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