Los anticuerpos innatos impulsados por

hormonas sexuales protegen a las

mujeres y los bebés contra la infección
EPEC
Las hembras tienen una ventaja general sobre los machos en la resistencia a las
bacteremias gramnegativas, lo que sugiere un dimorfismo sexual de la inmunidad
durante las infecciones. Aquí, a través de la microscopía intravital, observamos una
diferencia sesgada por el sexo en la captura de bacterias transmitidas por la sangre
por los macrófagos del hígado, un proceso que es crítico para la eliminación de
infecciones sistémicas. La opsonización del complemento fue indispensable para la
captura de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) en ratones machos; sin
embargo, se detectó un proceso independiente del componente 3 del complemento
más rápido que involucraba abundantes anticuerpos preexistentes para EPEC en
ratones hembras. Estos anticuerpos fueron provocados predominantemente en
ratones hembras en la pubertad en respuesta al estrógeno independientemente de
las condiciones de colonización de la microbiota. Los anticuerpos dirigidos por el
estrógeno fueron transferibles maternalmente a la descendencia y se les confirió
protección durante la infancia. Estos anticuerpos se conservaron en humanos y
reconocieron oligosacáridos especializados integrados en el lipopolisacárido
bacteriano y la cápsula. Por lo tanto, una estrategia inmunológica mediada por
anticuerpos innatos impulsada por el estrógeno confirió protección a las hembras y
sus descendientes.

Las infecciones bacterianas en loodstream están en aumento, debido al uso

generalizado de intervenciones iatrogénicas inmunosupresoras, catéteres
intravenosos permanentes y médula ósea.
y trasplantes de células madre. Las bacterias gramnegativas, más específicamente
la E. coli, son los organismos predominantes responsables de las infecciones del
torrente sanguíneo y con frecuencia están involucradas en la sepsis mortal1,2. Se
ha documentado un dimorfismo sesgado por el sexo para las infecciones del
torrente sanguíneo: aunque las mujeres tienen un mayor riesgo que los hombres
para la exposición a E. coli, especialmente a través del tracto genitourinario, tienen
significativamente menos gravedad de la enfermedad y mortalidad por bacteriemia
gramnegativa y sepsis, lo que aumenta la posibilidad de un dimorfismo inmunológico
sesgado por el sexo en el aclaramiento de las bacterias que entran en el torrente
sanguíneo 3-5.
La eliminación de primer paso de las bacterias transmitidas por la sangre es
fundamental para controlar las infecciones del torrente sanguíneo y prevenir la
diseminación sistémica. El hígado realiza la tarea de filtrar la sangre a través de un
mecanismo inmune innato crítico6,7. El hígado captura y elimina la mayoría de las
bacterias que ingresan a la vasculatura a través de su población de macrófagos
residentes, las células de Kupffer. En el hígado, a diferencia de todos los demás
órganos, las células de Kupffer residen directamente dentro de los vasos
sanguíneos (sinusoides hepáticos), donde atrapan selectivamente las bacterias en
el torrente sanguíneo de alta velocidad8,9. Este mecanismo de captura bacteriana
dependiente del corte es distinto de la fagocitosis10, que se produce en condiciones
de ausencia de flujo y está mediada por receptores del complemento bien descritos
(CR1, CR2, CR3 y CR4) y receptores Fc. Las células Kupffer expresan la molécula
CRIg del receptor del complemento de la molécula, que se une al complemento y
los componentes bacterianos a través de las interacciones receptor-ligando que
funcionan a altas fuerzas de cizallamiento, lo que apoya la captura de bacterias. Los
pacientes con insuficiencia hepática a menudo mueren de infecciones, incluyendo
endocarditis infecciosa y meningitis, debido a la diseminación bacteriana sistémica.
Se desconoce si los anticuerpos también contribuyen a la captura de bacterias
transmitidas por la sangre, pero es una pregunta importante para comprender la
inmunidad innata, así como para las aplicaciones de vacunas.
Aquí, mostramos que las células de Kupffer en ratones hembras capturaron E. coli
circulante a alta cizalla mediante un mecanismo que involucra anticuerpos
naturales. La producción de anticuerpos naturales se encontró casi exclusivamente
en ratones hembra, no requirió inmunización manifiesta o colonización microbiana,
y dependió de una vía mediada por hormonas sexuales durante la pubertad. Estos
anticuerpos naturales reconocieron una EPEC que es una causa importante de
diarrea y muerte infantil. Detectamos la transferencia materna de estos anticuerpos
tanto en ratones como en humanos, y en ratones, estos anticuerpos impartieron
protección temporal contra este patógeno específico a los bebés. Por lo tanto, los
anticuerpos naturales impulsados por la horquilla sexual desempeñan un doble
papel protector tanto en las hembras como en sus descendientes durante las
infecciones por EPEC.

Resultados
* La captura de células Kupffer de E. coli circulante muestra sesgo sexual.
Realizamos un seguimiento no invasivo de la distribución bacteriana in vivo a través
de imágenes de todo el cuerpo mediante la inyección intravenosa de la cepa de E.
coli bioluminiscente Xen14. Observamos una rápida acumulación de
bioluminiscencia derivada de E. coli Xen14– en los hígados de ratones macho y
hembra C57BL / 6 20min después de la infección intravenosa (Fig. 1a), lo que indica
que el hígado es fundamental para secuestrar la mayoría de las bacterias
transmitidas por la sangre . Debido a que la opsonización del complemento es
importante para promover la fagocitosis bacteriana, examinamos ratones
deficientes en el componente 3 del complemento (C3 - / -). A través de imágenes
de todo el cuerpo, encontramos que los ratones C3 - / - macho no secuestraron
Xen14 de E. coli en el hígado, mientras que los ratones C3 - / - hembra mostraron
secuestro hepático normal comparable al de los ratones de tipo salvaje C57BL / 6
(Fig. 1b). Aunque los ratones machos y hembras de tipo salvaje parecían ser muy
similares en su capacidad para secuestrar E. coli Xen14 en el hígado (Fig. 1a),
utilizamos microscopía intravital confocal de disco giratorio para visualizar el
proceso dinámico de secuestro de bacterias hepáticas en tiempo real. E. coli Xen14
visualizado con el tinte de ADN permeable a las células Syto60 fue capturado
exclusivamente por células Kupffer F4 / 80 + en el hígado (Fig. 1c), y el agotamiento
de las células Kupffer con liposomas de clodronato eliminó completamente el
secuestro hepático de E. coli Xen14 en ratones de tipo salvaje en comparación con
ratones tratados con liposomas con PBS (Fig. 1a complementaria y video
complementario 1), lo que indica que las células de E. coli Xen14 fueron capturadas
exclusivamente por células de Kupffer. El análisis sistemático minuto a minuto de la
captura bacteriana en el hígado indicó que las células de Kupffer en ratones
hembras capturaron aproximadamente el doble de E. coli Xen14 que las de los
machos en los primeros 2 a 3 minutos después de la infección (Fig. 1d, e). Dado
que la sangre se recircula en todo el cuerpo de los ratones en 15 s (ref. 15), la
ausencia de captura de E. coli Xen14 en los machos en el punto de tiempo de 30 a
60 s puede ser sumamente importante para la diseminación bacteriana temprana. .
De acuerdo con esta hipótesis, los machos tuvieron una mayor diseminación de E.
coli Xen14 circulante a órganos susceptibles, como los riñones, que las hembras
2min después de la infección (Fig. 1f). Por lo tanto, estas observaciones sugirieron
la posibilidad de diferentes mecanismos de captura bacteriana en hombres contra
mujeres.
Las imágenes de hígado intravital in vivo confirmaron que las células Kupffer de
ratones C3 - / - machos no capturaron E. coli Xen14, mientras que no se observó
deterioro en las células Kupffer de ratones hembras (Fig. 1g, hy Video
complementario 2). Las imágenes dinámicas de alta velocidad revelaron que E. coli
Xen14 inyectado en machos C3 - / - circulaba libremente en los sinusoides del
hígado sin interactuar con las células Kupffer y parecía alargado a medida que se
movían a través de los vasos a alta velocidad (Fig. 1i). En contraste, esencialmente
todas las E. coli en el hígado en hembras C3 - / - estaban estacionarias (Fig. 1i).
Después de aumentar la transparencia de las células de Kupffer reconstruidas en
3D, las E. coli que eran invisibles con baja transparencia se hicieron visibles dentro
de las células de Kupffer con mayor transparencia (Fig. 1i), lo que indica que fueron
fagocitadas. Los ratones machos C3 - / - exhibieron diseminación bacteriana
sistémica (Fig. 1b y Video complementario 3) y sucumbieron a la infección por E.
coli en 36 h, mientras que todos los ratones hembra C3 - / - sobrevivieron durante
más de 10 d (Fig. 1j). Estos resultados resaltan la importancia del proceso de
secuestro bacteriano mediado por células Kupffer y la dependencia de este proceso
del complemento en ratones macho.

* Los anticuerpos preexistentes contra E. coli apoyan la captura de bacterias

en las hembras.
Nos propusimos investigar el mecanismo que subyace a la captura rápida de E. coli
en ratones hembra.La preinmunización de machos C3 - / - por infección subcutánea
con E. coli Xen14 durante 14 días restableció la capacidad de las células Kupffer
para capturar rápidamente E. coli Xen14: se detectaron dos o tres bacterias más en
estos ratones C3 - / - inmunizados que en los machos de tipo salvaje en los primeros
2 minutos después de la infección (Fig. 1b complementaria), lo que sugiere que la
rápida captura independiente de C3 de E. coli Xen14 en ratones hembras podría
estar mediada por anticuerpos. En apoyo de esta idea, la captura de E. coli Xen14
en machos C3 - / - se restauró completamente mediante la transferencia de suero
inactivado por calor de ratones hembras C3 - / - o de tipo salvaje (pero no de C3 - /
- o machos de tipo salvaje) (Fig. 2a – c y Video suplementario 4), o cubriendo
previamente la E. coli con suero femenino (Fig. 1c suplementaria). En contraste, la
transferencia de suero inactivado por calor de ratones hembra Rag1 - / -, que
carecen de anticuerpos, no restauró la captura de E. coli en ratones macho C3 - / -
(Fig. 2d).
A través de la citometría de flujo, detectamos anticuerpos IgG e IgM más
abundantes para E. coli Xen14 en el suero de ratones hembras C3 - / - y de tipo
salvaje que ratones machos en estado estable (Fig. 3a-c). Los anticuerpos
preexistentes para E. coli Xen14 en el suero de ratones hembras fueron casi
exclusivamente IgM e IgG3, mientras que IgG1, IgG2b, IgG2a / c e IgA fueron casi
indetectables (Fig. 3d, e y Fig. 2a-c suplementaria) . Los ratones hembra C57BL / 6
y BALB / c o ratones hembras alojados en diferentes instalaciones libres de
patógenos específicos (SPF) tenían abundantes anticuerpos contra E. coli Xen14
(Fig. 2d, e) suplementaria, lo que sugiere que estos anticuerpos se desarrollaron
independientemente de El entorno habitacional o el trasfondo genético.
Para comparar la eficacia de varios isotipos de anticuerpos en el apoyo de la captura
bacteriana, aislamos por separado la IgM y la IgG de ratones inmunizados
subcutáneamente con E. coli Xen14 y los transfirimos por vía intravenosa a
receptores C3 - / - masculinos. La transferencia tanto de IgM como de IgG restauró
la captura bacteriana en machos C3 - /, pero la captura mediada por IgM fue más
eficiente que la captura mediada por IgG (Fig. 2f, g suplementaria). Para explorar
los mecanismos de la captura bacteriana mediada por el cuerpo, tratamos a la
hembra C3 - / -; Fcerg1 - / -; Ratones Fcmr - / -, que carecen de la cadena gamma
del receptor Fc y el fragmento Fc del receptor IgM FCMR además de C3, con
anticuerpos contra Fcα / μR y FcR II / III para eliminar funcionalmente todos los
receptores fagocíticos IgG e IgM Fc conocidos (FcR I – IV, Fcα / μR y FCMR). Estos
ratones, en comparación con los ratones hembra C3 - /, conservaron la capacidad
de capturar E. coli Xen14 (Fig. 2h suplementaria). Debido al potente efecto del
anticuerpo en la deposición de C1q y la contribución de C1q en la fagocitosis,
generamos C3 - / - hembra; Ratones C1q - / -, que carecían de expresión de C3 y
C1q. Después de la infección por E. coli Xen14, la captura de E. coli en C3 - / -; Las
hembras C1q - / - no fueron inferiores a las de los ratones hembra C3 - / - (Fig. 2i
complementaria), excluyendo así el papel de C1q en este proceso. Además, el
bloqueo de los receptores del complemento CR3 y CR4, que facilitan la fagocitosis
de bacterias recubiertas con IgM de una manera independiente del complemento,
no afectó la captura de E. coli Xen14 en hembras C3 - / (Fig. 2j suplementaria).
Estos datos sugieren que las células de Kupffer pueden usar mecanismos
moleculares aún no definidos para apoyar la captura bacteriana mediada por
anticuerpos de la corriente principal de la sangre.

* El estrógeno provoca la producción de anticuerpos innatos contra E. coli.

La microbiota intestinal puede inducir anticuerpos contra bacterias comensales y
algunas bacterias patógenas en estado estable. Debido a que los ratones hembras
pueden tener una composición diferente de microbiota intestinal de los machos,
probamos la posibilidad de que la respuesta de los anticuerpos sexualmente
dimorfos a E. coli pueda ser impulsada por la microbiota. Los ratones hembra C3 -
/ - tratados con antibióticos de amplio espectro a lo largo de la vida prenatal y
postnatal tenían grandes cantidades de anticuerpos contra E. coli Xen14 y
mostraron una captura eficiente de E. coli Xen14 circulante en el hígado (Fig. 4a,
b). Es importante destacar que los niveles séricos de anticuerpos contra E. coli
Xen14 fueron comparables entre ratones hembras de tipo salvaje criados en
instalaciones libres de gérmenes (FG) o FPS (Fig. 4c, d), y no se redujeron
significativamente por la preabsorción sérica con Bacterias comensales aisladas del
colon o del contenido fecal, lo que sugiere una reactividad cruzada baja o nula con
la microbiota (Fig. 4e). Los ratones de tipo salvaje hembra GF alimentados con una
dieta elemental y alojados en una cama sin antígeno sin cenizas, ambos carentes
de lipopolisacáridos (LPS) (es decir, ratones sin antígeno), conservaron la
capacidad de producir estos anticuerpos ( Fig. 4f-h), lo que sugiere que los
anticuerpos femeninos contra E. coli Xen14 no eran anticuerpos "adaptativos"
inducidos por microbiota o antígeno dietético. En cambio, los anticuerpos femeninos
contra E. coli eran independientes de las células T (Fig. 3a suplementaria) y se
derivaron de las células B1, porque estaban ausentes en ratones Cd19 - / - hembra
(Fig. 3b suplementaria), que son deficientes en B1. células pero tienen células B2
normales. Debido a que las células B1 son los principales progenitores de las
células productoras de anticuerpos naturales y porque los anticuerpos femeninos
contra E. coli Xen14 fueron en su mayoría IgM e IgG3, que son los subtipos
principales de inmunoglobulina para los anticuerpos naturales, estos anticuerpos
parecen comportarse como naturales Anticuerpos 'innatos'. La señalización TLR-
Myd88 es crítica para la producción de anticuerpos naturales. Hembra Myd88 - / -
ratones o hembra Tlr2 - / -; Tlr4 - / -; Los ratones Tlr9 - / -, que simultáneamente
carecen de los receptores tipo Toll TLR2, TLR4 y TLR9, tenían cantidades más
bajas de anticuerpo contra E. coli Xen14 en suero que los ratones hembra de tipo
salvaje (Fig. 3c, d). Estos resultados sugieren que múltiples los ligandos de TLR
endógenos, pero no derivados de microbios, activan estos anticuerpos innatos de
manera redundante.
Los títulos de los anticuerpos contra E. coli Xen14 en el suero fueron insignificantes
en ratones C3 - / - o salvajes de edad prepúber (4 semanas de edad) pero
aumentaron con el tiempo durante la pubertad (5 a 8 semanas de edad) y se
estabilizaron en el pospúber edades (10 semanas de edad) (Fig. 5a, b), lo que indica
que la aparición de estos anticuerpos estaba estrechamente asociada con la
progresión de la pubertad. Según se evaluó a través de imágenes hepáticas
intravivales, las células de Kupffer en ratones C3 - / - hembras de 4 semanas de
edad no capturaron E. coli Xen14, mientras que las células de Kupffer en hembras
de 8 semanas de edad lo hicieron (Fig. 5c y Video suplementario 5 ); por lo tanto,
las hormonas sexuales presentes en el momento de la pubertad pueden
desempeñar un papel. Además, los títulos de anticuerpos contra E. coli Xen14
fueron dos veces más altos en los machos C3 - / - castrados que en los machos C3
- / - tratados de manera simulada (IgM MFI 448.0 ± 63.38 versus 249.0 ± 45.68), y
se multiplicaron por cuatro después del estrógeno tratamiento in vivo durante dos
semanas (IgM MFI 964.0 ± 252.3) (Fig. 5d). En particular, la ovariectomía disminuyó
el título de anticuerpos contra E. coli Xen14 en más del 90% en ratones hembras
C3 - / - y de tipo salvaje en comparación con ratones hembras tratados (Fig. 5d, e),
abolió la captura de E . coli Xen14 en el hígado en ratones hembra C3 - / - (Fig. 5f,
gy Video suplementario 6) y anuló la ventaja de supervivencia de ratones hembra
C3 - / - después de la infección por E. coli Xen14 (Fig. 5h). Los anticuerpos contra
E. coli Xen14 en ratones hembra Esr1 - / -, que carecen del receptor de estrógeno
α, disminuyeron a niveles similares a los de los ratones machos de tipo salvaje (Fig.
5i, j). Es de destacar que la deficiencia del receptor β de estrógeno no tuvo efecto
en la cantidad de anticuerpos contra E. coli Xen14 en ratones hembra Esr2 - / - (Fig.
5j). Estos resultados indican que la principal hormona femenina, el estrógeno,
provocó la producción de anticuerpos contra E. coli.
* La transferencia materna de anticuerpos a E. coli confiere protección a la
descendencia. A continuación, probamos si la inducción de anticuerpos contra E.
coli por el estrógeno podría ser una estrategia evolutiva que permita a las hembras
sexualmente maduras proteger a las crías mediante la transferencia de anticuerpos
maternos. Detectamos cantidades sustanciales de anticuerpos IgG contra E. coli
Xen14 en ratones machos y hembras a los 10 a 14 días de edad, que disminuyeron
en 4 semanas de edad (Fig. 6a, b). Estos anticuerpos IgG no se encontraron en
crías nacidas de madres Rag1 - / - deficientes en anticuerpos (Fig. 6c). Los
anticuerpos IgM contra E. coli no fueron detectables en ratones infantiles (Fig. 6a),
de acuerdo con que la IgG es el isotipo principal que se transfiere por vía materna26.
Los anticuerpos maternos pueden ser cruciales para la protección neonatal contra
ciertas infecciones, porque el sistema de complemento todavía es inmaduro en las
etapas postnatales tempranas27. De hecho, los ratones recién nacidos de las
madres Rag1 - / - tuvieron una carga bacteriana incrementada en el hígado, bazo,
riñón, intestino y sangre 24 h después de la infección con E. coli Xen14 (Fig. 6d). La
inmunización pasiva con suero femenino adulto de tipo salvaje aumentó
significativamente el aclaramiento bacteriano en estos ratones, en comparación con
las crías sin transferencia de suero (Fig. 6e). Estos resultados sugieren que los
anticuerpos dirigidos por el estrógeno contra E. coli Xen14 son transmisibles por vía
materna y son protectores contra la infección en los hijos.

* Los anticuerpos innatos contra E. coli reconocen antígenos O específicos

en EPEC.
A continuación, describimos las respuestas de anticuerpos a diferentes patógenos
gramnegativos en ratones hembra para identificar la especificidad del antígeno. La
especificidad de los anticuerpos contra E. coli en el suero femenino de tipo salvaje
se restringió a las cepas EPEC, incluidas Xen14 y E2348 / 69. No detectamos
respuestas de anticuerpos robustos contra otras bacterias Gram-negativas,
incluyendo E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli patógena (UPEC), Citrobacter
rodentium, Salmonella enterica var. Typhimurium o Pseudomonas aeruginosa (Fig.
7a). Las respuestas de anticuerpos séricos femeninos hacia la EPEC no fueron
inhibidas significativamente por la preabsorción con ninguna de estas cepas
bacterianas (Fig. 4a suplementaria), lo que indica que estos anticuerpos son
relativamente específicos, a diferencia de los anticuerpos naturales convencionales
que son ampliamente polirreactivos a través de patógenos.
El análisis de inmunotransferencia indicó que la inmunoglobulina del suero femenino
era inmunorreactiva hacia los extractos de membrana de las cepas de EPEC (Fig.
7b), lo que sugiere una reactividad de los anticuerpos contra LPS, como se refleja
en un patrón de unión tipo escalera (Fig. 7b) Generalmente asociado con LPS28.
De hecho, el LPS extraído de EPEC pero no de EHEC absorbió significativamente
los anticuerpos contra E. coli Xen14 en el suero femenino (Fig. 4b complementaria).
Debido a que la especificidad serológica del LPS varía en sus cadenas laterales de
oligosacáridos (antígenos O) 29, probamos si estos anticuerpos podrían reconocer
un antígeno O único en la EPEC. La preabsorción con LPS-O127, que tiene el
mismo antígeno O que el EPEC E2348 / 69, inhibió completamente las respuestas
de anticuerpos contra EPEC en suero de ratones hembras de tipo salvaje, mientras
que el LPS contenía otros antígenos O (O26, O55, O111 y O128). ) no tuvo ningún
efecto (Fig. 7c y Supplementary Fig. 4c). Los antígenos O están presentes no solo
en LPS sino también en la cápsula de cepas de EPEC30. E2348 / 69 ΔwaaLΔg fcA,
que carecía de expresión de antígenos O tanto en LPS como en la cápsula, en
comparación con la cepa de tipo salvaje E2348 / 69, perdió la capacidad de unirse
a la IgG e IgM séricas de ratones hembras de tipo salvaje (Fig. .7d y Fig. 4d
suplementaria, e). Estos resultados indicaron que ciertos antígenos O, como el LPS-
O127, pero no la estructura conservada del LPS, fueron reconocidos por los
anticuerpos EPEC provocados por el estrógeno. La producción de anticuerpos para
LPS-O127 se detectó principalmente en el suero de ratones hembras C3 - / - o de
tipo salvaje, en comparación con sus homólogos masculinos (Fig. 5a
suplementaria), y se eliminó en Esr1 - / - o ratones hembra ovariectomizados (Fig.
5b, c). Por el contrario, no se detectaron respuestas de anticuerpos robustas ni
diferencias de sexo en la producción de anticuerpos contra LPS-O111 (Fig. 5a
suplementaria), incluso cuando los ratones fueron alimentados con agua potable
que contenía LPS-O111 entre las 4 y 8 semanas de edad (Suplementos Fig. 5d).
Estos resultados sugirieron que los anticuerpos contra LPS-O127 se derivaron
naturalmente en lugar de ser inducidos por el reconocimiento afín de LPS (por
ejemplo, de LPS derivado de la dieta). Aproximadamente dos veces más
anticuerpos IgM contra LPS-O127 se detectaron en el suero en mujeres adultas que
en hombres (Fig. 7e), lo que indica que la producción sesgada de anticuerpos hacia
LPS-O127 también ocurrió en humanos. Además, se detectaron anticuerpos IgG
contra LPS-O127 en la leche materna humana y en el suero infantil (Fig. 7f, g).

Después de la infección con EPEC Xen14 o E2348 / 69, los ratones machos
desarrollaron lesiones necróticas marcadas en los hígados y elevaron la cantidad
de aminotransferasa en suero, mientras que las hembras infectadas estaban en
gran parte protegidas (Fig. 6a-d suplementaria), sugiriendo así que - los anticuerpos
innatos dirigidos por el gen para LPS-127 pueden aliviar potencialmente la lesión
inflamatoria del tejido en la sepsis bacteriana gramnegativa. La lesión hepática
inducida por EPEC E2348 / 69 ΔwaaLΔgfcA deficiente en antígeno O fue similar a
la causada por E2348 / 69 de tipo salvaje en ratones macho (Fig. 6e suplementaria),
lo que sugiere que EPEC E2348 / 69 ΔwaaLΔgfcA no mostró hígado atenuado
toxicidad. Sin embargo, EPEC E2348 / 69 ΔwaaLΔgfcA y EHEC, que no son
reconocidos por los anticuerpos contra LPS-O127, indujeron daño hepático y
toxicidad similares en ratones machos y hembras (Fig. 6f, g suplementaria),
demostrando así que la resistencia a EPEC la lesión hepática inducida en ratones
hembra fue mediada por anticuerpos contra LPS-O127. Para probar directamente
el papel protector de los anticuerpos contra LPS-O127, sometimos a ratones
hembras de tipo salvaje a endotoxemia por inyección intravenosa de LPS-O127 o
LPS-O111. Mientras que los ratones hembra inyectados con LPS-O111 tenían una
mortalidad> 50%, todos los ratones expuestos a LPS-O127 sobrevivieron (Fig. 6h
suplementaria). De manera similar, los ratones hembra C3 - / - sucumbieron a la
infección por EHEC tan rápidamente como los machos C3 - / (Fig. 6i
complementaria). En particular, el aumento de la patología hepática en ratones
macho de tipo salvaje en comparación con hembras no se correlacionó con las tasas
de mortalidad: los ratones macho de tipo salvaje tuvieron tasas de supervivencia
similares a las de las hembras de tipo salvaje después de la infección por EPEC
(Fig. 6j complementaria), posiblemente porque La captura bacteriana mediada por
el complemento fue suficiente para proteger a los hombres de infecciones letales.
Por lo tanto, en las hembras adultas, los anticuerpos contra LPS-O127 podrían
disminuir la lesión inflamatoria del tejido, mientras que confieren una protección para
salvar vidas a los bebés.

* Las células peritoneales B1 y los macrófagos modulan la producción de

anticuerpos contra EPEC.
Finalmente, exploramos los mecanismos que subyacen a la producción de
anticuerpos inducidos por estrógenos para EPEC. Un ensayo de inmunospot ligado
a enzimas específicas de antígeno (ELISPOT) mostró que la mayoría de las células
que formaban espontáneamente anticuerpos para LPS-O127 se encontraban en la
cavidad peritoneal en ratones hembras y no se encontraron en ratones machos (Fig.
8a, b). Los principales productores de anticuerpos contra LPS-O127 en el peritoneo
fueron identificados como CD19 + CD11b + CD5 + B1a y CD19 + CD11b + CD5-
B1b, pero no como células CD19 + CD11b– B2 (Fig. 8c). Estas células B1a y B1b
eran más abundantes en el peritoneo en ratones hembras que en ratones machos
(Fig. 8d). La transferencia adoptiva de células CD19 + CD11b + B1 peritoneal de
ratones de tipo salvaje a ratones hembra Rag1 - / - o Cd19 - / - reconstituyó
eficientemente los anticuerpos contra LPS-O127 en el suero 2 semanas después
de la transferencia (Fig. 8e, f). La transferencia de células CD19 + CD11b + B1 del
donante reconstituyó estos anticuerpos en ratones hembras receptoras pero no en
receptores masculinos, independientemente del sexo de los ratones donantes (Fig.
8e), lo que indica que se requiere estrógeno en los ratones receptores para la
producción de Anticuerpos contra LPS-O127 después del injerto de células B1. Los
ratones hembra Cd19 - / - transferidos con células B CD19 + peritoneales
(aproximadamente el 70% de los cuales fueron CD19 + CD11b + células B1) se
protegieron de la infección letal con EPEC, en comparación con los ratones hembra
Cd19 - / - sin injerto de células B (Fig. 8g ).
La transferencia adoptiva de células B CD19 + peritoneales Esr1 - / - rescató la
producción de anticuerpos contra LPS-O127 en ratones Rag1 - / - hembra (Fig. 8h),
lo que indica que el estrógeno no actúa directamente sobre las células B1 y, por lo
tanto, estimula la producción de Anticuerpos contra LPS-O127. Probamos si los
macrófagos peritoneales, la mayor población de células inmunes residentes en la
cavidad peritoneal, estaban involucrados mediante el uso de ratones
Lyz2CreGata6fl / fl, que tienen una cantidad muy reducida de macrófagos
peritoneal31. Los ratones hembra Lyz2CreGata6fl / fl tuvieron una producción
significativamente menor de anticuerpos contra LPS-O127thantheirGata6fl /
fllittermates (Figura 7.a, b). El agotamiento de los macrófagos peritoneales por
inyección intraperitoneal de liposomas de clodronato en ratones hembras de tipo
salvaje también redujo las cantidades de anticuerpos contra LPS-O127 en el suero,
en comparación con el número de ratones hembras de tipo salvaje tratados con
PBS-liposoma (suplementario Fig. 7c, d), lo que sugiere que el estrógeno promovió
la producción de anticuerpos contra LPS-O127 a través de macrófagos
peritoneales.
A continuación, medimos las cantidades de citocinas que soportan células B,
incluidas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, mediante macrófagos peritoneales de ratones
hembras de tipo salvaje in vitro. Observamos un aumento marcado en la producción
de IL-10 en macrófagos peritoneales después de la estimulación con estrógenos,
sin efecto en los esplenocitos (Fig. 7e, f). Los anticuerpos contra IL-10 disminuyeron
parcialmente la producción de anticuerpos contra LPS-O127 inducidos por el
tratamiento con estrógenos exógenos en ratones C3 - / - machos en comparación
con ratones tratados con isotipo-anticuerpo (Fig. 7g suplementaria). Por otra parte,
la estimulación de estrógenos in vitro aumentó la expresión de Tnfsf13b y
A continuación, medimos las cantidades de citocinas que soportan células B,
incluidas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, mediante macrófagos peritoneales de ratones
hembras de tipo salvaje in vitro. Observamos un aumento marcado en la producción
de IL-10 en macrófagos peritoneales después de la estimulación con estrógenos,
sin efecto en los esplenocitos (Fig. 7e, f). Los anticuerpos contra IL-10 disminuyeron
parcialmente la producción de anticuerpos contra LPS-O127 inducidos por el
tratamiento con estrógenos exógenos en ratones C3 - / - machos en comparación
con ratones tratados con isotipo-anticuerpo (Fig. 7g suplementaria). Además, la
estimulación de estrógenos in vitro aumentó la expresión de los ARNm de Tnfsf13b
y Tnfsf13, que codifican los reguladores de la activación y proliferación BAFF y
APRIL de células B1, respectivamente, en macrófagos peritoneales de ratones
hembras de tipo salvaje en comparación con macrófagos peritoneal tratados con
vehículo ( Fig. 7h suplementaria). Por lo tanto, la interferencia mediada por los
estrógenos entre los macrófagos de la cavidad peritoneal y las células B1 modula
la producción de anticuerpos innatos contra LPS-O127 y también puede ser
importante por la alta afinidad y especificidad de estos anticuerpos.

Discusión
Aquí informamos que los anticuerpos dirigidos por hormonas sexuales con alta
afinidad por LPS-O127 apoyaron la captura bacteriana por células de Kupffer en el
hígado en condiciones de flujo y brindaron una ventaja en la respuesta inmune
contra ciertas infecciones bacterianas en ratones hembras. Estos anticuerpos
reconocieron los epítopos de glicanos presentados en la pared celular de una cepa
EPEC típica, se indujeron en ratones hembras en la pubertad y se transfirieron a
través de la leche a crías.
La EPEC es una causa importante de diarrea infantil, que representa 1.3 millones
de muertes de niños por año. La inducción selectiva de anticuerpos innatos
reactivos a EPEC en la pubertad en hembras puede ser una estrategia evolutiva
que permita la transferencia materna de anticuerpos IgG para proteger a los hijos
de una infección potencialmente mortal en los bebés. De acuerdo con esta
posibilidad, la infección por EPEC es clínicamente poco frecuente en los lactantes
alimentados con leche materna, y la lactancia materna se ha implicado como una
medida preventiva eficaz para la diarrea infantil. Los epítopos microbianos
reconocidos por los anticuerpos naturales se encuentran comúnmente en los auto-
antígenos. La reactividad cruzada frente a los autoantígenos también puede ocurrir
con los anticuerpos EPEC dirigidos por estrógenos, lo que contribuye
potencialmente al aumento de la prevalencia de enfermedades autoinmunes en las
mujeres. Las altas cantidades de estos anticuerpos en mujeres en edad fértil
podrían aumentar el riesgo de unirse a los autoantígenos y podrían conducir a la
autoinmunidad, pero podrían conferir protección contra las infecciones en los bebés.
En consecuencia, la estrategia inmunológica antimicrobiana impulsada por
hormonas sexuales sería ventajosa para proteger la continuidad de las especies.
La producción de anticuerpos contra EPEC dirigida por estrógenos se detectó en
ratones libres de antígeno y GF y en ausencia de estimulación de antígenos
foráneos, lo que sugiere que son anticuerpos naturales. Los anticuerpos naturales
muestran una especificidad inherente contra ciertos patógenos virales y bacterianos
a través de sus regiones V codificadas en la línea germinal y se cree que se
seleccionan por presión evolutiva. La secuenciación de los receptores de células B
de las células B1 productoras de anti-EPEC y las comparaciones con los genes de
la línea germinal deberían proporcionar una visión más mecánica de su desarrollo
y adquisición de alta afinidad. El repertorio de anticuerpos innatos dirigidos por
estrógenos puede ser más diverso que los anticuerpos contra EPEC. Aunque no
detectamos una reactividad cruzada amplia en estos anticuerpos, probamos solo
unas pocas bacterias gramnegativas patógenas. Además, el cultivo in vitro de esas
bacterias puede no reproducir por completo las moléculas superficiales encontradas
durante las infecciones in vivo (por ejemplo, cápsulas o pili). Además, como el
estrógeno estimula indirectamente y no selectivamente la producción de anti-EPEC,
también se pueden evocar otras células B1 peritoneales con diferentes
especificidades de antígeno para producir anticuerpos que reconocen otros
microbios.
La captura casi instantánea de bacterias recubiertas de anticuerpos por las células
de Kupffer es un mecanismo muy efectivo para secuestrar bacterias transmitidas
por la sangre y puede tener importantes implicaciones para el diseño de vacunas y
anticuerpos terapéuticos. Encontramos que la IgM fue mejor que la IgG en la
promoción de la captura bacteriana por las células de Kupffer, lo que sugiere una
posible aplicación de anticuerpos IgM en el tratamiento de las bacteriemias.
Además, debido a que los anticuerpos pueden eliminar de manera eficiente las
bacterias circulantes en ausencia de complemento, los anticuerpos diseñados sin
sitios de unión al complemento pueden mejorar la eficacia de la terapia con
anticuerpos al conservar su capacidad para eliminar las bacterias sin exacerbar la
inflamación adversa.

Métodos
Ratones. C57BL / 6, C3 - / -, C1q - / -, Rag1 - / -, Esr1 - / -, Esr2 - / -, Tcrb - / -, Cd19
- / -, Myd88 - / -, Tlr2 - / -, Tlr4 - / - y Tlr9 - / - los ratones se obtuvieron del Laboratorio
Jackson. Los ratones Fcerg1 - / - se obtuvieron de Taconic Farms. Los ratones Lyz2-
Cre × Gata6-floxed eran de R. M. Medzhitov (Universidad de Yale). Los ratones
Fcmr - / - eran de T. Mak (Universidad de Toronto). Las colonias de ratones se
mantuvieron en las instalaciones de SPF en la Universidad de Calgary a menos que
se especifique lo contrario. Los ratones GF C57BL / 6 se obtuvieron de Taconic
Farms o se criaron y se mantuvieron en aisladores de película flexible en el Centro
Internacional de Microbiomas de la Universidad de Calgary. Se generaron ratones
libres de antígenos alimentando ratones GF C57BL / 6 con una dieta elemental a
partir de 2 días después del nacimiento, como se describió anteriormente37. Todos
los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de
Animales de la Universidad de Calgary (protocolos AC12-0162 y AC16-0148) y se
realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense para
el Cuidado de Animales.

* Muestras de suero humano.

La recolección y análisis de muestras humanas fue aprobada por la Junta de Ética
de Investigación en Salud Conjunta de la Universidad de Calgary (ID de ética
REB15-0348 y REB16-0511). Todas las regulaciones éticas relevantes fueron
seguidas en este estudio. Las muestras de suero congeladas de varones sanos y
hembras sanas de edades similares (edades 18–45) se obtuvieron de los Cuidados
Epidemiológicos de Cuidados Críticos
y recurso de tejido biológico (CCEPTR). Se obtuvieron muestras de suero de
lactantes humanos de la Red de Alberta Sepsis como se describió anteriormente38.
Esta cohorte incluyó a 17 pacientes con sepsis (0 a 6 meses de edad) del servicio
de urgencias pediátricas; y 2 bebés (3 y 11 meses de edad, respectivamente) del
mismo servicio de urgencias pediátrico sin una infección (es decir, sin antecedentes
de fiebre dentro de las 2 semanas y sin evidencia clínica de infección). El
consentimiento informado o la aprobación se obtuvieron de todos los participantes
humanos o cuidadores de bebés antes de participar en el estudio. La sangre se
recogió mediante punción venosa en tubos recubiertos de sílice, se procesó para
obtener suero y se conservó a –80 ° C hasta su uso.

* Las bacterias y la infección.

E. coli Xen14, una cepa bioluminiscente derivada de E. coli WS2572
enteropatógena se obtuvo de PerkinElmer. EPD E2348 / 69 (O127: H6), EHEC
EDL933 (O157: H7), aislamiento clínico de UPEC 09.077 y C. rodentium DBS10
fueron proporcionados por R.D. S. Typhimurium se obtuvo de K. Poon (Universidad
de Calgary). P. aeruginosa PA01 se obtuvo de S. Lewenza (Universidad de
Calgary). Los mutantes de EPEC E2348 / 69 ΔwaaL, ΔgfcA y ΔwaaLΔ gfcA fueron
generados por H.L.M. Todas las cepas se cultivaron en medio LB durante la noche,
luego se subcultivaron hasta la fase logarítmica (OD660 nm = 1,0). Se usó
kanamicina para el cultivo de Xen14 a una concentración de 25 µg / ml. La
estreptomicina se utilizó para cultivar mutantes de EPEC 2348/69 a una
concentración de 50 μg / ml. Para estudios de supervivencia, se inyectó una dosis
infecciosa de 1 x 108 UFC de bacterias por vía intravenosa, a menos que se indique
lo contrario. Se introdujo un sistema de puntuación de sepsis de ratón39 para
controlar a los ratones en función de su apariencia, nivel de conciencia, actividad,
respuesta a estímulos,
Ojos, y frecuencia y calidad de la respiración (de 0 a 4 puntos para cada criterio).
Una puntuación global de 18 o una puntuación de 4 en cualquiera de los siguientes
criterios se consideró un punto final humanitario: nivel de conciencia, actividad,
respuesta al estímulo, tasa de respiración y calidad de la respiración. Para
evaluación de carga bacteriana tisular, órganos.
fueron cosechados, pesados y homogeneizados en 1 mL de PBS. La suspensión
de tejido se colocó en placas de LB que contenían antibióticos en diluciones en
serie. Las UFC se contaron entre 16 y 20 h después de la incubación a 37 ° C.

* Anticuerpos y reactivos.
Los anticuerpos utilizados para la microscopía intravital fueron los siguientes: Alexa
Fluor (AF) 750 conjugado anti-ratón F4 / 80 (2 μg / ratón; clon BM8; AbLab); F4 / 80
anti-ratón conjugado con PE (1,6 µg / ratón; clon BM8; BD Pharmingen); CD31 anti-
ratón conjugado con AF647 (1.6 μg / ratón; clon 390; Biolegenda). Los anticuerpos
utilizados para la citometría de flujo fueron los siguientes: IgM anti-ratón conjugada
con PE (clon RMM-1, Biolegend); IgG anti-ratón conjugado con AF647 (Poly4053,
Biolegend); IgG1 anti-ratón conjugado con AF647 (RMG1-1, Biolegenda); IgG2a
anti-ratón conjugado con PE (RMG2a-62, Biolegend); IgG2b anti-ratón conjugado
con PE (RMG2b-1, Biolegend); FITC conjugado anti-ratón
IgG3 (R40-82, BD Pharmingen); IgA anti-ratón conjugada con FITC (mA-6E1,
eBioscience); IgG antihumana conjugada con PE (HP6017, Biolegend); AF647 - IgM
antihumana conjugada (MHM-88, Biolegend); IgG1 anti-ratón conjugado con biotina
(clon RMG1-1, Biolegenda); IgG2a anti-ratón conjugado con biotina (clon RMG2a-
62, Biolegenda); IgG2b anti-ratón conjugado con biotina (clon RMG2b-1,
Biolegenda); IgG3 anti-ratón conjugado con biotina (clon RMG3-1, Biolegend); Anti-
estreptavidina conjugada con PE (clon 3A20.2, Biolegenda); CD19 anti-ratón
conjugado con PE (clon 1D3, BD Pharmingen); PE-Cy7- CD11b conjugado (clon M1
/ 70, eBioscience); CD5 conjugado con APC (clon 53-7.3, Biolegenda); y CD45 anti-
ratón conjugado con AF780 (clon 30-F11, eBioscience). Para el agotamiento de las
células de Kupffer, se inyectaron por vía intravenosa 200 μL de liposomas de
clodronato por ratón 24 h antes de la infección. Para el agotamiento a largo plazo
de los macrófagos peritoneales, se inyectaron por vía intraperitoneal 50 μL de
liposomas de clodronato por ratón cada 2 semanas. Para el bloqueo del receptor,
se inyectaron 50 μg de anti-FcRα / μ (clon TX57, Abnovo), 100 μg de anti-CD16 /
32 (clon 2.4G2, célula Bio X) o 100 μg de anti-CD18 (clon M18 / 2, Biolegend) por
vía intravenosa 10 minutos antes de la infección bacteriana para bloquear FcRα / μ,
FcγRIII / II o CR3 / CR4, respectivamente. Para la neutralización de IL-10, se
inyectaron por vía intraperitoneal 200 μg de anti-IL-10 (clon JES5-2A5, célula Bio X)
por ratón una vez cada 3 días durante 15 días.

* Microscopía intravital de captura bacteriana en el hígado.

Para la imagen intravital confocal en hilado del hígado de ratón, los ratones se
anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg / kg de peso
corporal; Bayer Animal Health) y xilazina (10 mg / kg de peso corporal; Bimeda-
MTC). La vena de la cola se canuló para permitir el suministro de anticuerpos
conjugados de forma fluorescente y anestésicos adicionales y para la infección
bacteriana intravenosa. Después de realizar una incisión en el abdomen medio, se
colocó el ratón en una posición lateral derecha, y el lóbulo más grande del hígado
se exteriorizó en un cubreobjetos de vidrio en la etapa de microscopio invertido y se
cubrió con toallitas de laboratorio humedecidas con solución salina para restringir el
movimiento. El escenario se mantuvo a 37 ° C para mantener la temperatura
corporal del paciente. Luego se tomaron imágenes del hígado con un microscopio
confocal de disco giratorio invertido (Olympus IX81). Los comportamientos
dinámicos de las células y las bacterias se visualizaron con cuatro longitudes de
onda de excitación con láser (491 nm, 561 nm, 643 nm y 730 nm; Cobalto) en
combinación con los filtros de paso de banda apropiados (Semrock). La
fluorescencia se detectó con una cámara de dispositivo acoplado de carga de
multiplicación de electrones adelgazada (512 × 512 píxeles, C9100-13;
Hamamatsu). Las imágenes fueron adquiridas en el software Volocity 6.1
(Improvision).
Para la obtención de imágenes in vivo de la captura bacteriana en el hígado, las
células de Kupffer se visualizaron por i.v. Inyección de anti-F4 / 80 conjugado con
fluoróforo inmediatamente antes de la preparación del hígado. E. coli Xen14 se
marcó con el colorante de ADN permeable a las células Syto 60 (5 μM, Life
Technologies) y se pasó varias veces a través de una jeringa 30-G para producir
una suspensión de células individuales. Se inyectaron un total de 2 x 107 UFC de
E. coli en un volumen de 100 µl. Para los experimentos de transferencia de suero,
se inyectó E. coli Xen14 simultáneamente con 200 μl de suero inactivado por calor
aislado. Las imágenes de lapso de tiempo se registraron desde 1 minuto antes de
la infección hasta 20-30 minutos después de la infección a una velocidad de dos a
tres cuadros por minuto. Se registraron un total de cinco a siete campos de visión
para cada ratón con un objetivo de microscopio de 10 ×. Se aplicó una grabación
rápida de ocho a diez cuadros por minuto para comparar las eficiencias de captura
bacteriana entre hombres y mujeres WT. Los videos e imágenes complementarios
se exportaron como archivos .avi y.tiff, respectivamente, se procesaron y analizaron
en el paquete de software de análisis Volocity (v. 6.3 Improvision). Los números de
bacterias capturadas por campo de visión se calcularon con la función "Buscar
objeto" en el software Volocity para cada punto de tiempo. Las bacterias que
permanecieron asociadas con las células de Kupffer durante más de 2 minutos se
consideraron capturadas. Para cada ratón, se contabilizaron de cinco a siete
campos de visión, y el promedio se consideró como n = 1. La reconstrucción en 3D
se realizó con la función "Opacidad 3D" en Volocity.

* Citometría de flujo bacteriano.

Las bacterias recién subcultivadas se lavaron con PBS y se ajustaron a una
concentración de 2 x 107 UFC / ml. Se incubó un total de 100 µl de suspensión que
contenía 2 x 106 CFU de bacterias con suero (dilución 1:20 a menos que se indique
lo contrario) a temperatura ambiente (RT) durante 3 h. Las células se lavaron luego
dos veces y se tiñeron con anticuerpos anti-ratón secundarios conjugados con
fluorocromo a RT durante 2 horas o a 4ºC durante la noche. Las células bacterianas
se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón de fijación (PFA al 1%) y se
sometieron a citometría de flujo con un citómetro de enfoque acústico Attune (Life
Technologies). El análisis se realizó en el software FlowJo (V10, TreeStar). Para los
experimentos de absorción de suero, las muestras de suero (10 µl) se incubaron
con 2 × 107 UFC de bacterias recién subcultivadas o bacterias comensales recién
aisladas a temperatura ambiente durante 3 horas o 4 ° C durante la noche en
condiciones de agitación (60–80 r.p.m.). Los sobrenadantes se recogieron después
de girar a 10.000 g durante 3 min y se sometieron a citometría de flujo bacteriano
mediante la adición de 2 x 106E, coli Xen14 o EPEC E2348 / 69. Se aislaron
bacterias comensales a partir de gránulos fecales o contenido cecal. En resumen,
los sedimentos fecales o los contenidos cecales se homogeneizaron en PBS estéril,
se filtraron a través de un filtro de células de 40 μm y se separaron de los desechos
mediante centrifugación a 200 g durante 5 min. Los sobrenadantes que contenían
bacterias comensales se lavaron con PBS tres veces. Para los experimentos de
absorción de LPS, las muestras de suero (10 µl) se incubaron con 20 µg de LPS
que contenían diferentes antígenos O (LPS-O26: B6, LPS-O55: B5, LPS-O111: B4,
LPS-O127: B8 y LPS- O128: B12, Sigma-Aldrich) a 4 ° C durante la noche con
agitación. Las muestras de suero absorbidas se sometieron luego a citometría de
flujo bacteriana como se describe anteriormente.

* Imagen de cuerpo entero de la diseminación bacteriana.

Las imágenes no invasivas de todo el cuerpo se realizaron con un microscopio
InVivoXtreme 4-MP (Bruker, anteriormente Carestream). La excitación de 650 nm y
las longitudes de onda de emisión de 700 nm se utilizaron para visualizar la cepa
de E. coli bioluminiscente Xen14 in vivo. Los ratones se afeitaron y el rastrojo
restante se eliminó con una crema depilatoria 24 h antes de obtener imágenes para
disminuir la extinción y la interferencia de la autofluorescencia. Durante el
procedimiento de imagen, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se
mantuvieron a 37 ° C en una cámara de imagen ventilada y se imaginaron
ventralmente desde el inicio hasta 60 minutos después de la infección bacteriana
en intervalos de 15 minutos. El protocolo de imágenes para cada punto de tiempo
contenía cuatro pasos: (i) imágenes de reflectancia (tiempo de exposición de 2 s),
(ii) imágenes de fluorescencia a 650/700 (tiempo de exposición de 5 s), (iii)
imágenes de bioluminiscencia a intervalos de 4 × 4 (Tiempo de exposición de 10 s)
y (iv) imágenes de rayos X (tiempo de exposición de 10 s).
Para generar una impresión cualitativa en 3D, creamos imágenes de ratones con el
sistema de rotación de animales multimodal (MARS) de InVivoXtreme. El protocolo
de imágenes para cada ángulo de 20 ° del giro de 360 ° contenía dos pasos:
imágenes de bioluminiscencia (tiempo de exposición de 60 s) e imágenes de rayos
X (tiempo de exposición de 10 s). Las imágenes se cuantificaron en el software de
imágenes moleculares Bruker (versión 7.1.3.20550) con una región ventral
constante de interés para todos los animales, que cubrió el área abdominal ventral
superior en la región anatómica del hígado del ratón.

* Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas.

E. coli Xen14 cultivado durante la noche se destruyó térmicamente a 65 ° C durante
1 hora y se ajustó a una concentración de 5 × 107 UFC / ml en tampón de
recubrimiento de carbonato. Placas de poliestireno de alta unión de fondo plano de
96 pocillos (Costar) se recubrieron con 100 μl de suspensión bacteriana o 10 μg /
mL de LPS a 4 ° C durante la noche. Las placas se lavaron luego con tampón PBST
(1 x PBS arena Tween-20 al 0,05%) cinco veces y se bloquearon con BSA al 5%
durante 2 horas a 37ºC. Las muestras de suero de ratón se agregaron a una dilución
de 1: 200 a menos que se indique lo contrario, luego se incubaron durante 3 horas
a 37 ° C. Se utilizaron pocillos sin muestras de suero como controles en blanco.
Después del lavado, detección de suero anti-E. Se realizó coli o anti-LPS con IgG
anti-ratón de cabra conjugada con HRP (policlonal, 1: 5,000, Abcam, ab6789) o IgM
anti-ratón de cabra (policlonal, 1: 2,500, Santa Cruz, sc-2064) durante 1 h a 37 ° C.
El valor
de OD450 se midió utilizando TMB (Sigma-Aldrich) como sustrato para cuantificar
los niveles de anticuerpos. Para la detección de subtipos de IgG, IgG1 anti-ratón
conjugado con biotina (clon RMG1-1), IgG2a / c (clon RMG2a-62), IgG2b (clon
RMG2b-1) e IgG3 (clon RMG3-1; 1: 2,000, todos de Biolegend) se utilizaron en
combinación con estreptavidina conjugada con HRP (1: 5,000, Abcam, ab7403).
Para la detección de anticuerpos humanos, las concentraciones totales de IgM e
IgG se midieron primero en muestras de suero con kits ELISA de IgM e IgG
humanos (eBioscience). Estas muestras de suero se normalizaron luego a 100 µg /
ml de IgM o 10 µg / ml de IgG, respectivamente, para la detección de IgM e IgG anti-
LPS-O127 con IgM anti-humana de conejo (1: 5,000, Abcam, ab97210) o cabra IgG
antihumana (1: 2,500, Santa Cruz, sc-2907).

* Ensayos de inmunoespasis ligados a enzimas.

Se adquirió un kit ELISPOT de IgG de ratón de Mab-tech. El día 1, se activó una
placa de membrana de PVDF estéril de 96 pocillos (Millipore) con etanol al 35%
durante 30 s. Después de un lavado suficiente, la placa se recubrió con 15 μg / ml
de anticuerpo de captura de IgG anti-ratón a 4 ° C durante la noche. El día 2, la
placa se lavó con tampón PBST cinco veces y se bloqueó con medio RPMI-1640
que contenía FBS al 10% durante 2 h. Se prepararon células de diferentes órganos
(es decir, médula ósea, bazo, ganglio linfático inguinal o cavidad peritoneal) de
forma estéril y se agregaron a la placa a 5 × 105 células por pocillo.
Alternativamente, se agregaron 2 x 105 células B clasificadas. Las células se
cultivaron durante 20 horas a 37ºC. El día 3, las células se descartaron y la placa
se lavó cinco veces. Se añadió LPS-O127 conjugado con biotina a 10 µg / ml y se
incubó a 37 ° C durante 2 h. Después de lavarse, la placa se incubó con
estreptavidina-fosfatasa alcalina (ALP) durante 1 hora a 37 ° C. Luego, las manchas
se desarrollaron con sustrato BCIP / NBT-plus (Mab-tech) y se lavaron con agua del
grifo. Las AFC específicas de antígeno se visualizaron y se contaron con un
estereomicroscopio. Para confirmar que las AFC eran específicas para el antígeno
O127 pero no para la estructura conservada de LPS, las AFC también se detectaron
con LPS-O111 conjugado con biotina como control. La conjugación con biotina de
LPS se realizó con un kit de biotinilación Sulfo-NHS de enlace EZ (Thermo
Scientific).

* Inmunotransferencia.
Se lisaron 1 x 109 UFC de bacterias en 1 ml de tampón de lisis NP-40 en hielo
durante 30 min, luego se sonicaron durante diez ciclos (10 s en y 10 s en hielo). El
sobrenadante se mezcló 1: 1 con tampón de muestra Laemmli y se desnaturalizó a
95ºC durante 5 min. Los extractos de membrana bacteriana se aislaron de 1 × 109
UFC de bacterias con un método de extracción basado en Tris-sacarosa-EDTA
(TSE), como se informó anteriormente40. Se separaron lisados completos o
extractos de membrana en un gel de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a
membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5%
durante 2 horas a temperatura ambiente e inmunotransferencia con ratones C3 - / -
hembra o macho (dilución 1: 200) a 4 ° C durante la noche con agitación. Los
anticuerpos séricos se detectaron con IgM anti-ratón de cabra conjugada con HRP
(1: 2.500, Santa Cruz, sc-2064) o IgG (1: 5.000, Abcam, ab6789) y sustrato de
quimioluminiscencia mejorada (Bio-Rad).

* Gonadectomía.
Se sometieron ratones macho o hembra de 3 semanas de edad a castración u
ovariectomía, respectivamente. Brevemente, los ratones se anestesiaron con
isoflurano y las gónadas se expusieron y se extirparon con una unidad de cauterio
térmico de mano. Se utilizaron ratones con incisiones en la piel y solo suturas como
controles falsos. Las imágenes intravitales y la recolección de sangre se realizaron
5 semanas después de la cirugía. En algunos experimentos, los ratones machos
castrados C3 - / - se trataron por vía intraperitoneal con 0,5 mg / kg de 17-β-estradiol
(E2, Sigma-Aldrich) cada dos días durante 2 semanas.

* Tratamiento antibiótico.
Los ratones reproductores hembra C3 - / - fueron tratados con antibióticos de amplio
espectro (ampicilina, 1 mg / ml; vancomicina, 0.5 mg / ml; neomicina, 1 mg / ml; y
metronidazol, 1 mg / ml) en agua potable por lo menos 4 semanas antes del parto y
permaneció en tratamiento hasta 3 semanas después del parto. Las crías hembras
continuaron el tratamiento con antibióticos administrados en el agua potable hasta
las 8 semanas de edad, momento en el que se utilizaron para la obtención de
imágenes intravitales y la recolección de suero.

* Aislamiento celular, clasificación, reconstitución de anticuerpos in vivo y

detección de citoquinas in vitro.
Los exudados peritoneales de ratones hembra C57BL / 6 se recogieron mediante
inyección intraperitoneal de 10 ml de PBS frío. Las células peritoneales se lavaron
y se tiñeron con anti-CD19, anti-CD11b, anti-CD5, anti-CD45 y anti-F4 / 80. Las
poblaciones CD11b + CD5 + y CD11b + CD5– dentro de las células CD45 + CD19
+ F4 / 80– se clasificaron con un citómetro de flujo BD FACSAria II (BD Pharmingen)
con una pureza> 90%. Los macrófagos peritoneales se clasificaron y se cultivaron
en medio sin estrógenos (RPMI1640 sin fenol rojo + 10% de FBS sin carbón) en
presencia o ausencia de estimulación con estrógenos. Los sobrenadantes del
cultivo se recogieron 24 h más tarde, y se detectaron las concentraciones de IL-4,
IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 con un ensayo de perlas citométricas (BD Pharmingen).

* Extracción, purificación y cuantificación de LPS.

El LPS se aisló con el método de extracción con fenol caliente / agua41 con
modificaciones. Brevemente, las cepas EPEC Xen14 o EHEC EDL933 se cultivaron
en medio LB durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación y
se resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 40 mM, pH 7,0, que contenía
EDTA 5 mM. Las células se trataron durante la noche con lisozima a 4ºC, después
de lo cual se añadió un volumen igual de fenol. La suspensión fue calentada.
a 70 ° C, se incubaron durante 30 minutos con agitación y posteriormente se
enfriaron a 10 ° C, después de lo cual las fases se separaron por centrifugación
durante 20 minutos a 4.000 g. Se recogió la fase superior y se repitió la extracción
después de la adición de un volumen igual de agua destilada a la fase inferior. Las
dos fases superiores se combinaron, se dializaron contra agua corriente hasta que
desapareció el olor a fenol, se liofilizaron y posteriormente se disolvieron en agua
destilada. El LPS se sedimentó por centrifugación durante 3 horas a 100.000 g y se
disolvió en agua destilada, después de lo cual se eliminaron otros contaminantes
mediante tratamiento con 50 μg / ml de ADNasa y ARNasa durante 4 horas y el
tratamiento con 50 μg / ml de proteinasa K a 37 ° C. . El LPS se sedimentó
nuevamente por centrifugación durante 3 horas a 100.000 g y se disolvió en agua
destilada. El rendimiento de aislamiento se midió después de la liofilización. Para la
cuantificación de LPS, el lecho, el alimento de comida molida o el contenido cecal
se pesaron, se resuspendieron en agua libre de endotoxinas y se agitaron
vigorosamente durante 30 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se midieron
con un ensayo de Lysate Amebocyte Lysate (LAL) según las instrucciones del
fabricante (Pierce).

* PCR cuantitativa en tiempo real.

La extracción y purificación de ARN se llevó a cabo con un kit de aislamiento
RNeasy mini RNA (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN
se transcribió en ADNc con transcriptasa inversa M-MLV y cebadores aleatorios
(Promega). Se realizó una PCR semicuantitativa en tiempo real con un sistema de
PCR en tiempo real más el Paso uno con tinte verde SYBR (Applied Biosystems).
Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar los genes de interés: sentido
de abril (5'-TCA CAA TGG GTC AGG TGG TATC-3 ') y abril antisentido (5'-TGT
AAA TGA AAG ACA CCT GCA CTG T-3'); Baff sense (5'-TGC TAT GGG TCA TGT
CAT CCA-3 ') y Baff antisentido (5'-GGC AGT GTT TTG GGC ATA TTC-3'); y
sentido Actb (5′-TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G-3 ') y Actb antisentido (5′-
TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3').

* Aislamiento de IgM e IgG a partir de suero.

Para aislar las fracciones que contienen IgM o IgG, se cargaron 250 µl de suero HI
en una columna Superdex 200 10 / 300GL (GE Healthcare) equilibrada con PBS.
La columna se calibró con un kit de calibración de HMW (GE Healthcare) que
contiene tiroglobulina (669 kDa), ferritina (440 kDa), aldolasa (158 kDa),
conalbúmina (75 kDa) y ovalbúmina (43 kDa). El contenido de proteína se midió a
OD280 nm en un explorador AKTA (Amersham), y se recogieron fracciones de 0,5
ml para un análisis adicional. El contenido de IgG o IgM de cada fracción se midió
con ELISA. IgG se purificó adicionalmente a partir de fracciones de suero ricas en
IgG con columnas de Proteína A / G (HiTrap, GE Healthcare).

*Análisis estadístico.
A menos que se indique lo contrario, los datos se analizaron con un ANOVA general
de una vía con la prueba de Tukey para comparaciones múltiples o la prueba t de
Student no pareada para la comparación entre dos grupos, en GraphPad Prism 6.0.
La tasa de supervivencia se analizó con una prueba de log-rank de dos caras. * P
<0.05; ** P <0.01; *** P <0,001; NS, sin importancia.
Figura 1 complementaria: el anticuerpo apoya la captura bacteriana
rápida por las células de Kupffer.
( a ) Análisis de imágenes de hígado intravital de la captura de E. coli por células de
Kupffer en ratones WT machos tratados con clodronato-liposoma o PBS-liposoma
24 horas antes de la infección. n = 3 ratones por grupo. ( b ) Análisis de imágenes
de hígado intravital de la captura de E. coli por células de Kupffer en ratones WT
machos (n = 4), ratones C3 - / - machos (n = 2) o ratones C3 - / - machos que fueron
preinmunizados con E .Coli Xen14 (n = 4). ( c ) Análisis de imágenes de hígado
intravital de la captura de E. coli Xen14 sérica previamente recubierta en ratones C3
- / - (n = 2 ratones por grupo, excepto el grupo de suero masculino C3 - / - , donde
n = 1 como control negativo) . Cada símbolo representa un ratón individual ( c ), las
líneas horizontales pequeñas ( a, b ) indican la media (± sem).
Figura 2 complementaria: perfil de los subtipos de inmunoglobulina
de anticuerpos anti- E. coli preexistentes.

( a ) Diagrama de citometría de flujo del suero anti- E. coli Xen14 IgM e IgG3 en
ratones WT. ( b ) ELISA que muestra los anticuerpos IgG1, IgG2a / c, IgG2b e IgG3
contra E. coli Xen14 en el suero de ratones WT. n = 5 ratones por grupo. ( c )
Diagrama de citometría de flujo de IgA anti- E. coli sérica en ratones hembras. ( d )
Citometría de flujo que muestra IgM e IgG anti- E. coli en suero en ratones Balb / c
y C57BL / 6 hembras adultas de la misma edad; o ( e ) en ratones C57BL / 6 hembras
adultas de edad similar que se alojaron en las instalaciones de SPF de la U de
Calgary o de los Laboratorios Jackson. ( f ) Validación citométrica de flujo de las
fracciones de suero de IgG e IgM que se aislaron de sueros de ratones inmunizados
con E. coli Xen14. ( g ) Análisis de imágenes de hígado intravital de la captura de
E. coli Xen14 por células de Kupffer en ratones macho C3 - / - que recibieron
transferencia de fracción de suero IgG o IgM. n = 3 ratones por grupo. Análisis de
imágenes de hígado intravital de la captura de E. coli por células de Kupffer en ( h )
C3 - / - Fcegr1 - / - Fcmr - / - ratones hembra (n = 2), ratones hembra tratados con
anti-Fcα / µR más anti-CD16 / 32 anticuerpos bloqueadores (n = 3) o controles
femeninos C3 - / - (n = 2); ( i ) C3 - / - ratones C1q - / - (n = 3 de cada sexo) o ratones
hembra C3 - / - . n = 3 ( j ) C3 - / - ratones hembra que fueron tratados con anti-
CD18 (bloque CR3 / CR4) o isotipo IgG. n = 5 ratones. Cada símbolo representa un
ratón individual ( b, hj ); las líneas horizontales pequeñas ( b, g ) indican la media
(± sem); * p <0.05, ** p <0.01 (prueba t de Student bilateral no pareada ). Agrupar
datos de dos experimentos en ( i, j ). Los datos son representativos de al menos
tres experimentos independientes ( ag ).
Figura complementaria 3: los anticuerpos anti- E. coli preexistentes
son células T independientes pero células B1 y TLR dependientes.

Citometría de flujo que muestra anticuerpos anti- E. coli Xen14 IgM e IgG en suero
en ( a ) ratones WT o Tcrb - / - hembra de 8 semanas de edad; ( b ) ratones WT o
CD19 - / - hembra de 8-10 semanas de edad. ( c ) Cuantificación por citometría de
flujo de suero IgM e IgG anti- E. coli en ratones WT y Myd88 - / - de 8-10 semanas
de edad. n = 3 por grupo para cada sexo. ( d ) Análisis ELISA que muestra suero
anti- E. coli Xen14 lgG e IgM en ratones WT macho (n = 5), ratones WT hembra (n
= 3), ratones Tlr2 - / - (n = 5), Tlr4 - / - ratones (n = 4), ratones Tlr9 - / - (n = 4) y
ratones Tlr2 - / - Tlr4 - / - Tlr9 - / - (n = 5). Cada símbolo representa un ratón individual
( c, d ); pequeñas líneas horizontales ( c, d ) indican la media (± sem); *** p <0.01
(ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey). Los datos son representativos
de tres experimentos independientes ( a, b ).

Figura 4 complementaria . Los anticuerpos contra E. coli innatos reconocen

específicamente el LPS-O127.

Citometría de flujo que muestra anticuerpos contra E. coli Xen14 IgG e IgM en
muestras de suero de ratones WT hembras que fueron ( a ) preabsorbidas con
EPEC 2348/69, EHEC, UPEC, C. rodentium (CR), S. typhimurium (ST) ) o P.
aeruginosa (PA), o con PBS como control; o ( b ) preabsorbido con LPS extraído
de EPEC Xen14 o EHEC. ( c ) ELISA que muestra IgG e IgM anti- E. coli Xen14
en muestras de suero de ratones hembras WT que fueron preabsorbidos con LPS
que contiene diferentes antígenos O. n = 5 ratones. ( d ) Cuantificación
citométrica de flujo de suero IgG e IgM contra WT EPEC E2348 / 69, E2348 / 69
69 waaL , E2348 / 69 Δ gfcA y E2348 / 69Δ waaL Δ gfcA en ratones WT
hembra. n = 4. ( e ) Inmunotransferencia de extractos de membrana de WT EPEC
E2348 / 69 o EPEC E2348 / 69Δ waaL Δ gfcA utilizando suero femenino C3 - / - y
IgG anti-ratón. Cada símbolo representa un ratón individual ( c, d ); * p <0.05, **
p <0.01, *** p <0.001 (ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey).

Figura 5. El anticuerpo anti-LPS-O127 complementario recapitula el fonotipo

de anticuerpo anti- E. coli .
( a ) ELISA que muestra IgM e IgG en suero contra LPS O127 y LPS O111 en
ratones indicados. n = 5 por grupo. ( b ) ELISA que muestra IgM e IgG en suero
contra LPS O127 en ratones WT y Esr1 - / - hembras de 8-10 semanas de edad, n
= 3 por grupo; o en ( c ) ratones C3 - / - hembra (n = 6) o ratones C3 - /
- ovariectomizados (n = 4). ( d ) Análisis ELISA de suero anti-LPS-O127 y anti-

LPS-O111 IgM (panel izquierdo) e IgG (panel derecho) en ratones W T de 4

semanas de edad que fueron alimentados con agua potable normal (n = 7 ratones
por sexo ) o LPS-O111 que contiene agua para beber (1 mg / L, n = 5 ratones
macho, n = 4 ratones hembra) durante 4 semanas consecutivas. Cada símbolo
representa un ratón individual ( anuncio ); pequeñas líneas horizontales ( ad )
indican la media (± sem); NS ., Sin importancia, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001
(prueba t de Student de dos caras no pareada ( b, c ); ANOVA de una vía seguida
de la prueba de Tukey ( d )).
Figura 6 complementaria Papel protector de los anticuerpos anti-O127
durante la bacteriemia EPEC.

( a ) Imágenes representativas del hígado de ratones WT infectados con E.

coli Xen14 durante 24 h. ( b ) Las áreas necróticas en el lóbulo más grande del
hígado se cuantificaron como el porcentaje del área total de ese lóbulo hepático. n
= 11 por sexo. ( c ) Niveles séricos de ALT a las 24 horas de la infección. n = 9
por sexo. ( d ) Imágenes representativas del hígado de ratones WT infectados
con E. coli E2348 / 69 durante 24 horas. ( e ) Imágenes representativas del
hígado de ratones WT macho infectados con E2348 / 69 WT o E2348 / 69
Δ waaL Δ gfcA . Se cuantificaron los porcentajes de áreas necróticas en el lóbulo
más grande del hígado. n = 5 ratones por grupo. ( f ) Niveles séricos de ALT en
ratones WT a las 24 horas post E2348 / 69 Δ waaL infectioninfección por gfcA (n
= 11 por sexo), o ( g ) post infección por EHEC EDL933 (n = 4 por sexo). ( h )
Análisis de supervivencia de ratones hembra WT inyectados iv . con 3,5 mg / kg
de peso corporal LPS-O111 o LPS-O127. n = 13 por grupo. ( i ) Análisis de
supervivencia de ratones C3 - / - macho (n = 4) y hembras (n = 5) infectados con
EHEC EDL933 (1 × 10 8 CFU). ( j ) Análisis de supervivencia de ratones WT
infectados con 1 × 10 8 CFU (n = 5 por sexo), 2 × 10 8 CFU (n = 10 por sexo) o 4
× 10 8 CFU (n = 5) EPEC Xen14. Cada símbolo representa un ratón individual
( b , c , por ejemplo ); pequeñas líneas horizontales ( b , c , eg ) indican la
media (± sem); NS ., Sin importancia, ** p <0.01, *** p <0.001 (prueba t de Student
de dos caras no pareada ( b, c, f, g ), prueba de Logrank de dos caras ( h, i, j ).
datos de dos ( b, c, f, j ) y tres ( h ) experimentos independientes. Representantes
de dos experimentos independientes se mostraron en a , d .
Figura 7 complementaria. Los macrófagos peritoneales promueven la
producción de anti-O127.

( a ) Citometría de flujo y ( b ) ELISA que muestra los niveles séricos de IgG e

Xen14 anti- E. coli en suero o IgM o IgG anti-LPS O127
en ratones hembras Lyz2Cre + Gata6 fl / fl (n = 6) y compañeros de camastro Cre
(n = 5). ( c ) Citometría de flujo y ( d ) ELISA que muestra los niveles séricos de
anti- E. coli Xen14 o anti-LPS O127 IgG e IgM en ratones WT que fueron
tratados ip . con clodronato-liposoma a las 5 semanas de edad. El ensayo se
realizó a las 9 semanas de edad. n = 5 ratones. ( e ) Ensayo de matriz de perlas
citométricas (CBA) que muestra los niveles de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 en el
sobrenadante de cultivos de macrófagos peritoneales en ausencia o presencia de
β-estradiol (E2) durante 24 h. Las células se agruparon de 5 ratones hembras, n
= 3 repeticiones técnicas. ( e ) Ensayo de CBA que muestra los niveles de IL-10
en el sobrenadante de cultivos de células peritoneales o células de bazo. Las
células se agruparon de 3 ratones hembras, n = 3 réplicas técnicas. ( g ) ELISA
que muestra IgM en suero anti-LPS O127 e IgG en ratones machos C3 - / - que
fueron tratados con E2 más anticuerpo anti-IL10, anticuerpo contra isotipo E2 más
o sin tratamiento. n = 3 ratones por grupo. ( h ) QPCR detección de la expresión
del ARNm de Tnfsf13b y Tnfsf13en macrófagos peritoneales aislados de ratones
WT (izquierda, n = 3 ratones por sexo), o in vivo macrófagos peritoneales
estimulados con E2 (derecha, n = 4 muestras de células del tratamiento con
vehículo) , n = 6 muestras de células del tratamiento con E2). Cada símbolo
representa un ratón individual ( a , b , d , g ) o una réplica individual ( e , f ); las
líneas horizontales pequeñas ( a , b , d , g , h ) indican la media (± sem); * p
<0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 (prueba t de Student bilateral no pareada . Los
datos son representativos de dos experimentos independientes ( c , e , f ).