DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA VIDA Y AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA

SANTO DOMINGO

Asignatura: Fitopatología.

Estudiante: José Luis Bermeo; Karol Moreno; Jayerlin Porozo.

Nivel: Cuarto “A”

Docente: Ing. Gustavo Núñez J. M.Sc

Práctica: N° 2

Fecha: 15/11/2016

Grupo: 5

Tema: Aislamiento de patógenos provenientes del material

vegetal.

Período
Octubre 2016 – Febrero 2017
 I. TEMA: Aislamiento de patógeno provenientes de material vegetal.

II. INTRODUCCIÓN

La mayoría de las enfermedades se diagnostican al observarlas a simple vista o

mediante el microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del patógeno.
Sin embargo, hay muchas enfermedades bacterianas y fungosas en las que es
imposible e identificar al patógeno que ya se encuentra mezclado con uno o más
contaminantes, porque aún no ha producido sus cuerpos fructíferos
característicos y esporas, debido a que una misma enfermedad puede deberse a
uno o varios patógenos morfológicamente semejantes o tal vez a algún factor del
ambiente, o bien a que la enfermedad sea causada por un nuevo patógeno hasta
ese momento desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse (Delgado, 2011).

Para controlar una enfermedad es indispensable conocer su agente causal de lo

contrario cualquier estrategia de control podría ser infructuosa o eventualmente
agravar el estado sanitario del cultivo, si no se conoce el fitopatógeno (causante
dela enfermedad) podría estarce utilizando un mecanismo inapropiado contra
algo desconocido. Un correcto diagnostico provee una cantidad considerable
de información básica para seleccionarlos acordes métodos al organismos o
condición que está causando el problema. Un diagnóstico preciso se inicia
siempre: con una muestra representativa y la observación apropiada del entorno
dela planta. En el laboratorio la muestra es sometida a diferentes análisis en
busca de evidencias, pistas o la identificación definitiva del agente causal
(Hernández, 2000).

En muchos casos los exámenes simples responden a la incógnita pero a veces se

requiere realizar procedimientos específicos (aislamiento de microorganismos)
para obtener el resultado preciso. Como los que se muestran en el presente
informe que se basa en el aislamiento de patógenos causales de enfermedades en
Cultivos (en este caso PDA).

III. OBJETIVOS:

2.1 Objetivo general

 Aislar patógenos provenientes de material vegetal.

2.2 Objetivos específicos

 Obtener un patógeno de cultivos de la zona.

 Emplear técnicas necesarias para aislar el patógeno del material vegetal.
 Identificar el tipo de patógeno adquirido (hongo o bacteria) basándose en
claves.
 Determinar la enfermedad que ocasiona en el cultivo el agente causal
mediante los postulados de Koch.
IV. REVISIÓN DE LITERATURA

Organismos patógenos
Los agentes que causan enfermedades en las plantas se caracterizan por ser infecciosos
(bióticos o vivos) y no infecciosos (abióticos o no vivos). Los agentes infecciosos
incluyen las bacterias, hongos, micoplasmas, nemátodos y virus. Los agentes no
infecciosos incluyen, desbalances nutricionales, estrés ambiental y toxicidad química
(causada por plaguicidas y contaminantes del aire. Para propósito de esta publicación
vamos a hablar de los agentes infecciosos (Almodóvar, 1996).
Importancia de las enfermedades en las plantas y su influencia en la
productividad.

La enfermedad en plantas es cuando una o varias de sus funciones son alteradas por
patógenos o por determinadas condiciones del ambiente en que se desarrolla. Esta
alteración llega a ser significativa y continua. Las células y tejidos afectados
comúnmente se debilitan y/o destruyen a causa de los agentes que producen la
enfermedad, por lo tanto, la capacidad de estas células para llevar a cabo sus funciones
normales disminuye o se anula por completo, como resultado la planta muere o
disminuye su crecimiento. Para que se produzca la enfermedad se requiere de la
interacción de tres factores a través del tiempo:

Figura 1. Triángulo de la enfermedad (Pineda, 2011).

Hospedante: Planta.
Patógeno: Agente causante de la enfermedad.
Ambiente: Entorno físico químico.

Las enfermedades de las plantas son uno de los principales problemas que se tiene que
afrontar en la agricultura porque reducen las cosechas, desmejoran la calidad del
producto, limitan al mismo tiempo la disponibilidad de alimentos y materias primas
para una serie de industrias. (Pineda, 2011).

Identificación
Hay muchos factores que influencian el desarrollo de enfermedades. Sin embargo, las
enfermedades no pueden ocurrir a menos que estén presentes los siguientes elementos:
una planta susceptible, un patógeno y un ambiente favorable. Algunas enfermedades no
ocurren si no hay un vector que las transmita, lo que es común en las enfermedades
causadas por virus, las cuales pueden transmitirse por insectos o nematodos
(Almodóvar, 1996).

Inoculación de una enfermedad

El término “inoculación” se refiere a la incorporación de una sustancia en un
organismo. Puede realizarse para trasmitir una enfermedad o proporcionar medios de
defensa o inmunidad a dicho organismo.
Algunos de los microorganismos involucrados pueden mantener relaciones simbióticas
con los cultivos a los que son destinados y en virtud de ello ambos “asociados” se
benefician. Si bien el efecto más marcado es a nivel de la nutrición de las plantas,
muchos inoculantes microbianos como es el caso de los hongos micorrícicos, además
incentivan el crecimiento de las mismas por estimulación de la producción de
hormonas.Los primeros ensayos de eficiencia de un inoculante puede llevarse a cabo
mediante “pruebas in vitro”, esto significa utilizar en medios estériles y en condiciones
de asepsia la inoculación en pequeña escala con la finalidad de observar los efectos que
se producen entre los componentes de un inoculante microbiano y microorganismos
patógenos. (Naranjo, 2006)

Postulados de koch
Los postulados de Koch fueron formulados por Robert Koch, a partir de experimentos
con el Mycobacterium tuberculosis. Fueron aplicados para establecer la etiología de la
tuberculosis, pero ha sido generalizado para el resto de las enfermedades infecciosas
con objeto de saber cuál es el agente participante (Orellana, 2010).

Postulados Originales de Koch:

1.- El microorganismo debe encontrarse en todos los pacientes con la enfermedad en

cuestión y su distribución en el cuerpo debería corresponder a las lesiones
observadas.

2.-El microorganismo no debe aparecer en otra enfermedad de forma fortuita o

saprófita.

3.- El microorganismo debe aislarse de las lesiones de una persona infectada y se

debe obtener un cultivo puro.

4.- El cultivo puro inoculado en animales experimentales debe producir la

enfermedad.

5.- El microorganismo deberá aislarse en un cultivo puro a partir del animal

infectado intencionalmente.

Nota importante: La mayoría de las bacterias que causan enfermedad en el humano

se ajustan a los postulados de Koch con algunas excepciones, como
el Mycobacterium leprae que no cumple con el tercer enunciado de Koch (Orellana,
2010).
El aislamiento
Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que
le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio de cultivo
sólido adecuado dispuesto en una placa de Petri. El éxito del aislamiento, de la
separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha
distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías posible.
En las estrías finales deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento
requiere un reducido inóculo de partida (Granada, 2015).

Un cultivo puro

Es aquel formado por células provenientes de una sola inicial y por tanto perteneciente a
la misma especie y cepa. Es una situación artificial ya que en la Naturaleza los
microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas y heterogéneas. Es un
artificio obligado para estudiar cada especie y cepa de microorganismo en particular,
(Argeneau, 2015).

Medio más utilizado para cultivar hongos “PDA”

Este medio es recomendado para realizar el recuento colonial. También puede ser
utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. La
base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulación y la producción de
pigmentos en algunos dermatofitos. Uno de los sistemas más importantes para la
identificación de microorganismo es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. Para que las bacterias crezcan adecuadamente
en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxigeno adecuado, así como un grado
correcto de acidez o alcalinidad (Rodríguez, 2013).

Manejo de una enfermedad

Involucra la aplicación de medidas tendientes a eliminar al organismo causal de una
enfermedad. Este concepto ha sido remplazado por el de “Manejo de enfermedades”,
que implica un proceso continuo de eventos consistentes en la selección y uso de
técnicas orientadas a reducir las enfermedades a un nivel tolerable. Los pilares que
sostienen al Manejo de enfermedades son: diagnóstico, monitoreo y determinación de
umbral de daño. Este último está definido como el valor de enfermedad a partir del cual
comienza a producirse daño económico si no se aplican medidas de control. Las
técnicas más utilizadas para el manejo de las enfermedades son: el manejo cultural,
control biológico, resistencia genética y el uso racional de agroquímicos (Sosa, 2013).
V. MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos

 Estufa de incubación
 Estufa de esterilización
 Cámara de flujo laminar
 Estufa

Materiales
 Mechero de alcohol
 Caja Petri
 Bisturí
 Aguja de disección
 Papel de despacho
 Pinzas
 Papel filtro
 Sacabocados # 3

Reactivos e insumos

 Agua destilada
 Alcohol
 Hipoclorito de sodio
VI. PROCEDIMIENTO

Durante la fase de laboratorio se realizó lo siguiente:

1. Se tomó un pequeño trozo del material vegetativo de la hoja de arroz el cual

constaba de 3 regiones: Región infectada, media infectada y sana, luego la
dividimos en 4 partes equitativas con ayuda del bisturí.

2. En 4 Cajas Petri, con ayuda de una pipeta volumétrica en la primera caja

agregamos Hipoclorito de sodio al 10%, en la segunda Alcohol (Etanol) al 70%,
en la tercera y cuarta caja se agregó Agua destilada.

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3. Luego se introdujo las muestras del material vegetal (Arroz) en las distintas
soluciones, durante 1 minuto y medio, los dos primeros cortes y los otros dos
cortes durante dos minutos, secuencialmente en cada uno de los solutos.

4. Con la ayuda de una pinza retiramos las muestras y las colocamos sobre un papel
filtro.

5. Se colocó las cuatro muestras en la caja Petri para ello se esterilizó la aguja de
disección con la que se tomó la muestras y procedió a sembrar en el medio de
cultivo (PDA).
6. Procedimos a rotular la caja Petri y finalmente se colocó en la Estufa.

7. Del medio de cultivo presente con el hongo sembrado se procedio a estraer la

parte infectada para saber que tipo de hongo se esta sembrando en el interior de la
caja petri.

8. Se procedió a extraer con el sacabocados # 3 la parte infectada del hongo del

medio de cultivo PDA y nuevamente se procedió a sembrar.

9. Se rotuló la caja petri con sus respectivos datos.

VII. RESULTADOS

 Se realizó el aislamiento del patógeno del tejido afectado en una hoja

extraída del cultivo de arroz (Oryza sativa)
 Se empleó técnicas necesarias para aislar el patógeno del órgano afectado
incluyendo partes de la planta donde la enfermedad se encontraba en
diferentes etapas de desarrollo.
 Se aplicó el segundo postulado de Koch para posteriormente determinar
el elemento o patógeno causal de las enfermedades presentes en la
muestra tomada del campo del cultivo de arroz (Oryza sativa) “El
organismo o agente Fitopatógeno debe sr aislado en cultivo puro, natural
o artificialmente y deben estudiarse sus caracteres específicos”

VIII. CONCLUSIONES

 Mediante los postulados de Koch para la identificación de las

enfermedades de los cultivos, se logró realizar la recolección de muestras
frescas las cuales se aisló en laboratorio, en medios de cultivo de PDA, al
relacionar al patógeno que se espera obtener con la enfermedad se
adquirió diferentes tipos de muestra en las cajas Petri, algunas resultaron
contaminadas, lo cual se procedió a realizar la purificación de las cajas
contaminadas.

 Se aprendió que el medio de cultivo de PDA se conserva en 28º en la

incubadora esto es solo para hongos, y que el Muller y McConkey se
conserva 36º para bacterias

 Además se pudo aprender cómo se siembra un microorganismo en

diferentes medios de cultivos.

IX. RECOMENDACIONES

 Es recomendable investigar temas afines previos a la práctica, conocer

sobre los cultivos (PDA, Macconkey y muller), cuales son las
manipulaciones correctas para evitar inconvenientes con el fin de lograr
mayor eficiencia en el desarrollo de la práctica.
 Es importante tener suficiente cuidado en la manipulación tanto los
equipos como los materiales. Para el uso de los materiales se necesita
tomar las precauciones adecuadas, uso de mascarilla, guantes y pantuflas,
 saber cuáles materiales se pueden esterilizar y cuales no con el propósito
de evitar afectar al cultivo.
 Es necesario tomar notas al momento de realizar la práctica de cultivo, el
mismo que nos ayudara a identificar cuál es el proceso más viable y tomar
las medidas de precaución más idóneas en la realización del cultivo.

X. BIBLIOGRAFÍA

Almodóvar, W. (10 de 1996). Clinica al día. Obtenido de Enfermedades en las plantas:

http://www.uprm.edu/agricultura/sea/clinica/CLDIAEnfPlan.pdf
Argeneau, K. (21 de Mayo de 2015). Obtenido de
http://es.slideshare.net/KaryHerondale/microbiologa-prctica-3-aislamiento-de-
microorganismos-por-estra-cruzada
Delgado, C. (2011). Aislamiento de hongos fitopatogenos. Obtenido de
https://books.google.com.ec/books?id=vMCRb6rUpZMC&pg=PA14&lpg=PA1
4&dq=aislamiento+de+pat%C3%B3genos&source=bl&ots=7J5-
feZ12N&sig=jwWpCTk7WQlXnPghf3iDn1RPzEk&hl=es&sa=X&ved=0ahUK
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Orellana. (2010). Microbiologia. Obtenido de
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Rodríguez, D. M. (2013). CATÁLOGO DE HONGOS EN SEMILLAS DE FRIJOL.
Proyecto "Apoyo a la Producción de Semillas de Granos Básicos para la
Seguridad Alimentaria ", 6-11.
Sosa, A. (2013). Guia de reconocimiento de enfermedades. INTA, 31.
XI. ANEXOS

Materiales que se utilizó durante la Corte de la área afectada de la hoja de

practica arroz (Oryza sativa)

Se colocó las el material vegetal de la Con la ayuda de una pinza retiramos

área afectadas de la hoja de arroz en las muestras y las colocamos sobre un
cada una de las soluciones. papel filtro.

Se sembró la muestra vegetal infectada Rotulación de la caja petri y rotulación

en el medio de cultivo PDA. del hongo causante de la enfermedad