Professional Documents
Culture Documents
ABSTRACT
The objective of this study was to identified the development of the immunoreactive follicle stimulating
hormone (ir-FSH) cells in pituitary glands of rats (Rattus norvegicus)in different age using immunohistochemical
(IHC) methods. The pituitary organ that used in this study was collected from eight white female rats aged 2, 4, 6,
and >12 months. Pituitary glands were processed histologically and stained with IHC methods to detect the ir-FSH
cells. The result showed that the ir-FSH cells were observed in pars distalis (PD), pars tuberalis (PT), and pars
intermedia (PI) of adenohypophysis with different number of cells. Furthermore, ir-FSH cells were found
abundantly (+++) in the PT and a few (+) in PD of rats aged two months. In rats aged 4 months those cells were
distributed in slight number (+) in PT and abundant (+++) in PD. In addition, the cells were also found in a great
quantities in rats whose ages were 6 months, (+++) in both PT and PD, but these cells decreased (++) in rats aged
>12 months in PD and absent (-) in PT. In conclusion, the devalopment and distribution of ir-FSH cells were found
in pars tuberalis and pars distalis adenohypophysis in the pituitary glands of rats aged 2 up to >12 months with
different number and distribution patterns.
1
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
sedikit pada awal perkembangan sel-sel fisiologis 0,9 % dan dimasukkan ke dalam
folikel (Partodihardjo, 1980). larutan fiksatif paraformaldehid 4% selama
Studi perkembangan sel-sel 48 jam dan dipindahkan ke dalam alkohol
penghasil hormon FSH pada kelenjar 70% sampai dilakukan proses dehidrasi.
hipofisa dengan teknik IHK merupakan hal Pembuatan preparat histologis kelenjar
menarik untuk dipelajari. Secara umum hipofisa
teknik IHK dapat digunakan untuk Prosedur pembuatan preparat
mempelajari keberadaan bahan-bahan aktif histologis mengacu pada metode Kiernan
dan sel-sel spesifik yang terdapat di jaringan (1990) yang telah dimodifikasi. Organ
(Taylor, 2006). Salah satu sel yang dapat hipofisa yang telah difiksasi dalam larutan
dideteksi keberadaannya adalah sel-sel FSH para-formaldehide 4% dimasukkan ke
yang tergolong sel-sel gonadotrop dalam tissue basket yang telah diberi label.
adenohipofisa. Sel-sel FSH yang terdeteksi Sampel jaringan didehidrasi dengan alkohol
positif dengan antibodi anti FSH yang konsentrasi bertingkat alkohol (80%, 90%,
digunakan dalam pewarnaan IHK disebut 95%, dan absolut) masing-masing selama 2
sebagai sel-sel imunoreaktif FSH (ir- jam. Setelah proses dehidrasi, jaringan
FSH). Penelitian sebelumnya terkait deteksi direndam dalam silol I, II, dan III masing-
sel-sel ir-FSH telah dilakukan pada kelenjar masing selama 1 jam. Tahap berikutnya
hipofisa fetus babi (Sasaki dkk., 1992), adalah infiltrasi jaringan dalam parafin cair
anjing beagle atau anjing pemburu (Sasaki I, II, dan III pada temperatur 60⁰C masing-
dan Nishioka, 1998); ayam (Proudman dkk., masing selama 1 jam dan dilanjutkan dengan
1999); ikan lohan (Cichlasoma dimerus) proses penanaman jaringan di dalam parafin
(Pandolfi dkk., 2006). Berdasarkan uraian (embedding). Blok jaringan disayat dengan
tersebut perlu dilakukan kajian tentang ketebalan 4-5 μm menggunakan mikrotom
perkembangan dan pola sebaran sel-sel ir- dan diletakkan pada gelas objek yang telah
FSH pada adenohipofisa kelenjar hipofisa dilapisi dengan poly L-lysine.
tikus (Rattus norvegicus) pada beberapa Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)
tingkat umur menggunakan teknik IHK. Metode IHK yang digunakan dalam
penelitian ini adalah metode tidak langsung
MATERI DAN METODE dua tahap (immunoperoxidase bridge
methods) (Key, 2009). Prosedur pewarnaan
Pengambilan kelenjar hipofisa tikus mengacu pada prosedur yang tercantum
Sampel yang digunakan dalam dalam manual kit IHK (Vector Lab., 2014)
penelitian ini adalah organ hipofisa dari dengan sedikit modifikasi. Tahap awal
tikus putih (Rattus norvegicus) betina dimulai dengan proses deparafinisasi dan
berumur 2 bulan, 4 bulan, 6 bulan, dan >12 rehidrasi jaringan dalam larutan silol lalu
bulan. Setiap tingkat umur digunakan dua dilanjutkan dengan proses rehidrasi, yaitu
ekor tikus. Sebelum dikorbankan dan perendaman preparat di dalam larutan
dikoleksi kelenjar hipofisanya, tikus-tikus alkohol absolut, alkohol 95%, 90%, 80%,
tersebut dianastesi dengan kloroform secara 70%. Preparat selanjutnya dibilas dalam air
inhalasi. Pengambilan organ hipofisa mengalir dan dilanjutkan dengan akuades.
diawali dengan pembedahan di bagian Pewarnaan IHK diawali dengan
cranium. Organ hipofisa yang diperoleh proses blocking endogenous peroxidase
selanjutnya dicuci dengan larutan NaCl menggunakan campuran larutan hidrogen
2
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
peroksida (H₂O₂) 3% dan metanol dengan dan 4) jumlah >11 sel (+++/banyak). Setelah
perbandingan 1:9. Selanjutnya preparat diamati, preparat hasil pewarnaan
jaringan (slide) dibilas dengan larutan TBS didokumentasikan menggunakan mikroskop
dan diinkubasi dengan normal horse serum cahaya yang dilengkapi dengan alat
2,5 % selama 30 menit dalam inkubator mikrofotografi.
suhu 37⁰C. Setelah proses inkubasi, slide Analisis Data
dibilas kembali dengan TBS. Tahap Data hasil penelitian tentang
berikutnya adalah inkubasi slide dengan perkembangan dan sebaran sel-sel ir-FSH
antibodi primer (anti FSH) dan dimasukkan pada kelenjar hipofisa tikus putih dianalisis
ke dalam refrigerator pada temperatur 4⁰C secara deskriptif.
selama 1 malam (overnight). Slide untuk
kontrol negatif hanya diinkubasi dengan HASIL DAN PEMBAHASAN
normal horse serum 2,5%. Keesokan
harinya, slide dibilas kembali dengan TBS Pola sebaran dan perkembangan sel-
lalu diinkubasi dengan antibodi sekunder sel ir-FSH pada kelenjar hipofisa tikus umur
dalam inkubator temperatur 37⁰C selama 30 2, 4, 6, dan >12 bulan disajikan pada Tabel
menit dan dicuci dengan TBS. 1. Adapun hasil pewarnaan IHK ditampilkan
Tahapan berikutnya adalah proses pada Gambar 1 dan 2. Kelenjar hipofisa
visualisasi hasil pewarnaan dengan tikus yang diamati pada penelitian ini
meneteskan kromogen diaminobenzidine terbagi atas pars tuberalis (PT), pars distalis
(DAB) selama 3-4 menit pada jaringan (PD) dan pars intermedia (PI), sedangkan
sambil diamati di bawah mikroskop. Reaksi neurohipofisa hanya terdiri dari satu bagian
positif ditandai dengan terbentuknya warna yang disebut dengan pars nervosa (PN).
coklat pada jaringan yang mengindikasikan Hasil pengamatan tersebut sesuai dengan
adanya ikatan antigen (sel-sel ir-FSH) dan pernyataan Hullinger dan Andrisani (2006)
antibodi (anti FSH). Selanjutnya slide bahwa dari anterior ke posterior
dibilas dengan akuades dan dilanjutkan adenohipofisa dibagi menjadi tiga bagian
dengan proses pewarnaan latar jaringan yaitu bagian pars tuberalis (PT), pars
(counterstain) menggunakan larutan intermedia (PI), dan pars distalis (PD).
Mayer’s hematoksilin. Tahap terakhir adalah Gambaran pembagian daerah PD dan PT
proses dehidrasi, clearing, dan mounting pada hipofisa tikus putih pada penelitian ini
dengan bahan perekat Entellan®. mirip dengan pembagian hipofisa babi
Pengamatan hasil pewarnaan (Sasaki dkk., 1992) dan anjing pemburu
Hasil pewarnaan diamati (Sasaki dan Nishioka, 1998).
menggunakan mikroskop cahaya dengan Ekspresi sel-sel ir-FSH terdeteksi
perbesaran lensa objektif 10 kali dan 40 kali. positif di bagian PD dan PT adenohipofisa
Pengamatan perkembangan sel-sel ir-FSH tikus dan tidak ditemukan pada bagian PI.
pada bagian adenohipofisa dilakukan Tidak ditemukannya sel-sel ir-FSH pada
berdasarkan adanya reaksi positif (warna bagian PI menandakan bahwa bagian
coklat) pada bagian tersebut. Penghitungan tersebut tidak mensintesis hormon FSH.
jumlah sel-sel ir-FSH dilakukan pada semua Menurut Hullinger and Andrisani (2006)
bagian adenohipofisa dengan kriteria bagian PI terdiri dari sel-sel melanotrop
sebagai berikut: 1) tidak ditemukan sel-sel yang mengsekresikan α-melanocyte-
ir-FSH (-/negatif); 2) jumlah 1-5 sel stimulating hormone (α-MSH) dan β-
(+/sedikit); 3) jumlah 6-10 sel (++/sedang); lipotropin (β-LPH).
3
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
Tabel 1. Pola sebaran dan perkembangan sel-sel ir-FSH pada adenohipofisa kelenjar hipofisa
tikus.
PT=pars tuberalis, PI=pars intermedia, PD= pars distalis; (-) tidak ditemukan sel- sel ir-FSH; (+)
sedikit; (++) sedang; (+++) banyak.
Gambar 1. Kontrol negatif (K) kelenjar hipofisa tikus putih. Pars distalis (PD). Inset (K1): tidak
terdeteksi sel-sel ir-FSH. Pewarnaan IHK. Skala garis 200 µm (K) dan 30 µm (K1)
4
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
Gambar 2. Perkembangan dan sebaran sel-sel ir-FSH pada hipofisa tikus putih. Hipofisa tikus
umur 2 bulan (A), umur 4 bulan (B), umur 6 bulan (C), dan umur >12 bulan (D). Inset: Sel-sel ir-
FSH terdeteksi positif (tanda panah) pada adenohipofisa tikus umur 2 bulan (A1), umur 4 bulan
(B1), umur 6 bulan (C1, C2), dan umur >12 bulan (D1). PD= pars distalis, PT= pars tuberalis,
PI= pars intermedia, PN= pars nervosa. Pewarnaan imunohistokimia. Skala garis 200 µm (A, B,
C, D) dan 30 µm (A1, B1, C1, C2, D1).
5
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
Reaksi positif antara sel-sel FSH dan dan 2B1), sedangkan di bagian medial dari
antibodi FSH yang digunakan pada hipofisa masih jarang. Selain itu distribusi
penelitian ini ditemukan di bagian sel-sel tersebut belum merata dan
sitoplasma sel-sel gonadotrop (sel-sel FSH intensitasnya masih agak lemah. Pada tikus
dan LH) sedangkan bagian inti sel (nukleus) yang berumur 4 bulan, pola sebaran sel ir-
tidak menunjukkan hasil positif. Hal tersebut FSH masih menyerupai pola sebaran sel
mengindikasikan bahwa hormon FSH yang tersebut pada tikus berumur 2 bulan, namun
tergolong hormon glikoprotein disintesis dan pada umur tersebut telah ditemukan
disimpan di bagian sitoplasma sel bukan di peningkatan jumlah sel terutama di bagian
inti sel. Hal tersebut sesuai dengan distal adenohipofisa dengan intensitas kuat
pernyataan Reimers (2003), bahwa hormon (+++) yang berbatasan dengan bagian
FSH merupakan hormon glikoprotein yang caudo- anterior pars intermedia (PI),
dihasilkan oleh sel-sel gonadotrop sedangkan di bagian PT jumlahnya masih
adenohipofisa yang mengandung reseptor sedikit (Gambar 2C dan 2C1).
GnRH pada membran sel tersebut. Sintesis Pada tikus berumur 6 bulan, densitas
gonadotropin oleh sel-sel gonadotrop dan intensitas pewarnaan sel-sel ir-FSH
hipofisa diawali dari proses transkripsi semakin meningkat dan sudah memiliki pola
deoxyribonukleat acid (DNA) menjadi sebaran yang merata, baik di bagian PT
messenger-ribonuklead acid (mRNA) di maupun PD. Tikus umur 6 bulan tersebut
dalam inti sel. Selanjutnya terjadi proses sudah tergolong dewasa kelamin. Hal
translasi mRNA menjadi prohormon dalam tersebut sesuai dengan pernyataan Larasaty
ribosom yang terdapat di sitoplasma sel. (2013) bahwa rentang umur dewasa kelamin
Pola sebaran sel-sel ir-FSH pada tikus betina adalah umur 4 – 6 bulan.
memperlihatkan hasil yang berbeda pada Pada tikus berumur >12 bulan, ditemukan
setiap bagian adenohipofisa tikus (Tabel 1). perubahan pola sebaran dimana sel-sel
Sebaran sel-sel ir-FSH dengan variasi tersebut tersebar sedang (++) di bagian PD
jumlah sel tersebut menandakan adanya namum tidak ditemukan (-) di bagian PT.
bagian-bagian tertentu yang menghasilkan Berdasarkan uraian tersebut diduga sel-sel
hormon FSH dalam jumlah banyak penghasil hormon FSH telah ada sebelum
dibandingkan bagian lain dari kelenjar tikus berumur 2 bulan. Hal tersebut sesuai
hipofisa. Brown (1994), menyatakan bahwa dengan pernyataan Hafez (2000) bahwa
sel-sel endokrin (FSH dan LH) pada hipofisa usia dewasa kelamin atau pubertas pada
ditemukan pada bagian PD, sedangkan tikus berkisar antara 50-72 hari.
Reimers (2003); Hullinger dan Andrisani Adanya variasi pola sebaran sel ir-
(2006) menyatakan sel-sel tersebut berada di FSH di PT dan PD jaringan hipofisa tikus
PD dan PT kelenjar hipofisa. Menurut Inoue berumur 2 bulan sampai >12 bulan,
dan Kurosumi (1984) sebaran sel-sel ir-FSH menunjukkan adanya perbedaan aktivitas
dan ir-LH pada tikus tersebar pada berbagai sel dalam menghasilkan hormon FSH pada
tingkat umur. Hasil tersebut sedikit berbeda setiap bagian adenohipofisa, dan jumlahnya
dengan hasil penelitian ini bahwa selain di mulai menurun pada tikus berumur > 12
PD, sel-sel ir-FSH juga ditemukan di PT bulan. Kondisi tersebut diduga sebagai
adenohipofisa tikus. faktor penuaan dan usia produktif tikus
Keberadaan sel-sel ir-FSH telah betina. Pada usia tua diduga sel-sel
teramati pada tikus berumur 2 bulan, gonadotrop (sel-sel FSH) mengalami
terutama di bagian PT dan PD (Gambar 2B degenerasi yang jumlahnya sudah berkurang
6
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
7
Jurnal Medika Veterinaria Patrick Flaggellata, dkk
5th ed. Mauricio H. Pineda and Micheal P. cells in the fetal porcine adenohypophysis. The
Dooley. Lowa State Press, USA. Anatomical Record. 233:135-142.
Rose, M.P., E.G.D. Rose, and H.B. Adam. 2000. Definition Taylor, C.R. 2006. Techniques Of Immunohistochemistry:
and measurement of follicle stimulating hormone. Principles, Pitfalls and Standardization. In Dabbs
Endocrine Reviews. 21(1):5–22. D (Ed). Diagnostic Immunohistochemistry. 2nd
Sasaki, F. and S. Nishioka. 1998. Fetal development of the ed. Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia.
pituitary gland in the beagle. The Anatomical Vector Lab. 2014. Instruction For Immunohistochemical
Record. 251:143-151. Staining Using Goat Primary Antibodies.
Sasaki, F., Y. Ichikawa, and S. Yamauchi. 1992. http://www.vectorlabs.com. (27 November
Immunohistological analysis in the distribution of 2015).