ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA AMILASA SALIVAL

INTRODUCCIÓN

En todo ser vivo se producen constantemente innumerables reacciones químicas. Muchas de

ellas tienden a trasformar las sustancias introducidas con los alimentos a fin de obtener energía y
materia prima para la síntesis de nuevas estructuras moleculares. Un catalizador es un agente capaz
de acelerar una reacción química, sin formar parte de los productos finales, ni desgastarse en el
proceso. En los medios biológicos se desempeñan como catalizadores macromoléculas denominadas
Enzimas. La mayoría de las enzimas son de naturaleza proteica, pero además de las proteínas, ciertas
moléculas de ARN, llamadas Ribozimas tienen también actividad catalítica. Como todo catalizador las
enzimas actúan disminuyendo la energía de activación (Ea) de una reacción, acelerando la velocidad
de reacción. Las sustancias sobre sobre las cuales actúa una enzima reciben el nombre de sustrato. La
especificidad de una enzima le permite distinguir con gran selectividad entre diferentes sustancias y
aun entre isómeros ópticos.

Estructura de las enzimas

Según su composición pueden ser de dos tipos:

• Enzimas: Formadas por una o varias cadenas proteínicas,

• Holoenzimas: Poseen una parte proteica llamada apoenzima y otra no proteica denominada cofactor

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

El cofactor puede ser una molécula inorgánica, (iones metálicos como Fe, Cu, Zn, Mn, Mg,…) o puede
ser una molécula orgánica. En este caso, si la unión al apoenzima es covalente se denomina grupo
prostético y si no es covalente coenzima.
Propiedades de las enzimas

• Especificidad: Como consecuencia de la estructura del sitio activo las enzimas presentan un alto
grado de especificidad por el sustrato, puesto de manifiesto por su habilidad para discriminar entre
moléculas muy similares.
• Reversibilidad: Reversibilidad: Una enzima actúa igual sobre una reacción química sea cual sea el
sentido de la reacción. No modifican el sentido de la reacción.

Sacarosa + H2O Glucosa + Fructosa

• Eficacia: Se necesitan en muy poca cantidad. Una sola molécula de enzima puede catalizar la
reacción de miles de moléculas de sustrato ya que la enzima no se consume en el proceso sino que
se recupera al final.
• Gran poder catalítico: Multiplican la velocidad de las reacciones por un millón de veces o más.
• No se consumen en las reacciones.

Actividad o acción enzimática

En toda reacción enzimática el sustrato es transformado en producto para lo cual la enzima se

une al sustrato formando un complejo enzima-sustrato. Luego la enzima permanece inalterado y el
sustrato transformado en producto.

E+S [E + S] E+P

Enzima + Sustrato Complejo Enzima-Sustrato Enzima + Producto

Sitio activo:

Cada enzima independientemente de la reacción que catalice o de su estructura particular

contiene dentro de alguna parte de su estructura terciaria un grupo característico de aminoácidos que
forman el sitio activo donde ocurre el evento catalítico del cual esa enzima es responsable. El sitio
activo es un surco o bolsillo real con propiedades químicas y estructurales que le permiten la
acomodación adecuada y especifica al sustrato.

Inhibidores:

Son moléculas que impiden el normal funcionamiento de las enzimas o las inutilizan, ya que
disminuyen o anulan la actividad enzimática. Constituyen un mecanismo de control de las reacciones
metabólicas. La inhibición puede ser:

a) Inhibición irreversible: Envenenamiento del enzima. El inhibidor se une al centro activo de la enzima
de forma permanente mediante un enlace covalente, con lo que la enzima queda inutilizada. Ej:
fármacos y tóxicos. El ión cianuro se une a la citocromo-oxidasa que es clave en la respiración.

b) Inhibición reversible: No se inutiliza el centro activo sino que impide temporalmente su normal
funcionamiento. No se une mediante enlaces covalentes. Puede ser de dos tipos:

• Inhibición reversible competitiva: El inhibidor es una sustancia semejante al sustrato y compite

con él para unirse al centro activo. Sin embargo la enzima no puede romperlo y no podrá actuar
hasta que se libere de él. Disminuye la velocidad de reacción. Se puede anular su inhibición
aumentando la concentración de sustrato.
• Inhibición reversible no competitiva: El inhibidor se une a la enzima en un lugar distinto al centro
activo, pero lo modifica e impide el acoplamiento del sustrato o bien hace fijo al complejo enzima-
sustrato.
OBJETIVOS:

• Demostrar la actividad enzimática de la amilasa salival.

• Determinar los factores que afectan la actividad enzimática.

MATERIALES

Solución de amilasa salival, tubos de ensayo, vaso de precipitado, pipetas, baño María, mechero de
alcohol almidón al 1%, sacarosa al 20 %, reactivo de Fehling, soluciones amortiguadoras con pH 3, 6.8
y 9.8, lugol. Muestra biológica: saliva

PROCEDIMIENTO

El método se basa en la hidrolisis del almidón (sustrato) en condiciones de pH y temperatura

fisiológicos, por acción de la amilasa presente en la saliva .Cuando se hidroliza el almidón se rompen
las uniones glucosídicas dando lugar a oligosacáridos de diferente longitud (dextrinas). Las de mayor
tamaño amilodextrinas dan azul con lugol, las siguientes eritrodextrinas, dan coloración rojiza, y las
acodextrinas, de menor tamaño, dan negativa a la reacción de lugol. Si la hidrolisis prosigue, se forman
maltotriosas, isomaltosas y maltosas, productos de degradación no evidénciales con el reactivo de
lugol (pero si con el Fehling).

A. RECOLECCION DE LA MUESTRA DE SALIVA Y PREPARACION DE LA SOLUCION DE ENZIMA

Primero se tiene que recolectar la muestra de saliva para obtener una solución de enzima. Para
ello el alumno debe enjuagarse la boca varias veces con agua corriente y proceda a recoger en un vaso
de precipitado limpio aproximadamente 2 ml de saliva. Luego adiciónele a la muestra recogida 10 ml
de agua destilada y mezclar.

1. Especificidad enzimática

Los enzimas, además de ser unos catalizadores muy eficaces, presentan un alto grado de
especificidad química, es decir, son capaces de inducir la transformación de un sólo tipo de moléculas
y no de otros que también se encuentran presentes en el medio de reacción. Un enzima es capaz de
discriminar entre dos sustancias que potencialmente podrían actuar como sustratos.

Prepare el siguiente sistema:

1 2 3
Solución de almidón 3 ml 3 ml -
Solución de sacarosa - - 3 ml
Solución de enzima 2 ml 2 ml 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar e incubar durante 20 min. En baño maría (37° C)
Lugol 5 gotas - -
Reactivo de Fehling - 2 ml 2 ml
Calentar Calentar

2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática:

Fundamento: Cada enzima tiene una temperatura óptima en la cual la velocidad de reacción es
máxima. Las enzimas en el cuerpo humano tienen una temperatura óptima de 37°C. Si aumenta
mucho, la enzima se desnaturaliza. El calor aumenta la energía cinética con lo que aumenta la
movilidad de las moléculas facilitando su encuentro.

Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3
Buffer 6.8 2 ml 2 ml 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Solución de enzima 1 ml 1 ml 1 ml
Colocar c/ tubo durante 10 min. en sus diferentes baños: 1. Baño de hielo
2. Baño María 37°C
3. Llevar a ebullición
Solución de almidón 3 ml 3 ml 3 ml
Incubar 20 min. mas en sus respectivos baños
Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Los tubos deben estar en sus respectivos baños por un laxo de 30 minutos en total
3. Sensibilidad al pH

Fundamento: Cada enzima presenta unos valores de pH entre los que son efectivos. Entre ambos
existe un pH óptimo en el que la velocidad de la reacción es máxima. Fuera de los límites la enzima se
desnaturaliza. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras
proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos.

Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3
Buffer pH 3.8 2 ml - -
Buffer pH 6.8 - 2ml -
Buffer pH 8.9 - - 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Solución de almidón 3 ml 3 ml 3 ml
Solución de enzima 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar durante 20´ en baño María a 37° C
Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

4. Identificación del Cofactor e Inhibidor de la Amilasa Salival

Fundamento: La enzima α amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de los iones cloruros,
sin embargo, los metales pesados como sulfato de cobre y nitrato de plata causan precipitación de la
enzima inhibiendo su actividad catalítica.

Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3
Cloruro de sodio 2 ml - -
Sulfato de cobre - 2 ml -
Nitrato de plata - - 2 ml
Buffer pH 6.8 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Solución de almidón 3 ml 3ml 3ml
Solución de enzima 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar durante 20 minutos en baño María (37°C)
Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Observe, esquematice y analice sus resultados

5. Efecto de la concentración de la enzima y sustrato
Fundamento: La reacción enzimática puede ser medida en relación a la cantidad de sustrato gastado,
o de producto formado. Por esta razón, la velocidad de reacción depende de la concentración de
enzima y de sustrato presentes en el medio.

Para este experimento, preparar dos soluciones:

- Solución de almidón diluido (1 ml de solución en 20 ml de agua destilada)
- Solución de enzima diluida (1 ml de solución en 20 de agua destilada)

Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3 4
Solución de almidón 3 ml - 3 ml -
Solución de almidón diluido - 3 ml - 3 ml
Solución de enzima 1 ml 1 ml - -
Solución de enzima diluida - - 1 ml 1 ml
Buffer pH 6.8 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar e incubar durante 10 minutos en baño María (37°C)
Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Observe, esquematice y analice sus resultados.

Cuestionario

1. Observe la siguiente reacción enzimática de la hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la enzima

lactasa.

Lactasa+ H2O → Glucosa + Galactosa

a. Represente la acción enzimática según el modelo de llave-cerradura.
b. ¿A qué grupo de la clasificación enzimática pertenece y donde actúa?

2. La síntesis de ADN necesita ácido fólico. El metotrexato es un análogo del ácido fólico utilizado en
el tratamiento de algunos cánceres.

a. ¿Por qué este fármaco se utiliza para el tratamiento del cáncer?

b. ¿Qué efectos secundarios tiene el fármaco?
c. Defina inhibición y que tipos de inhibición existen.

3. Con relación a las siguientes enzimas describa:

Tejido donde se
Enzima Reacción que cataliza Aplicación clínica
localiza
Amilasa
Creatina quinasa
Alanina aminotransferasa
Lactato deshidrogenasa
4. Complete el cuadro sobre aplicaciones terapéuticas de inhibidores enzimáticos.

Agente terapéutico Enzima inhibida Modo de inhibición Uso clínico

Captopril
Lovastatin
Paracetamol
Ciprofloxacina
Cafalosporina

5. Explique mediante un cuadro comparativo la clasificación de las enzimas y mencione un ejemplo de

cada una de ellas.