Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Pólo Avançado de Xerém

MECANOTRANSDUÇÃO
Bruno Rech; Filipe Esteves; João Vitor Belizario; Marcus Aguiar; Tadeu Diniz

PROFESSORA: LEANDRA BAPTISTA

MECANOTRANSDUÇÃO: INTRODUÇÃO

Mecanotransdução:

• Forças mecânicas influenciam o crescimento e a

forma de praticamente todos os tecidos e órgãos do
nosso corpo.

• Sinais mecânicos transduzidos em alterações na

bioquímica celular e na expressão gênica.
MECANOTRANSDUÇÃO: RECEPTORES DE SINAIS

Receptores de superfície:

• Integrinas e Caderinas

• Permitem a adesão do citoesqueleto à Matriz

Extracelular (ECM)

• A partir dessas proteínas que um estímulo

mecânico aplicado à superfície da membrana será
transmitido para o interior da célula.
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS

Integrinas:

• Glicoproteínas transmembrana heterodiméricas

de adesão celular compostas por subunidades α e
β.

• Estão constituição
presentes nado
hemidesmossomo, de modo que esta, une a
placa de ancoragem com a fibrinina (proteína
presente na lâmina basal).
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS

Caderinas:

• Principais moléculas de adesão celular;

• Moléculas de adesão dependentes de cálcio que

permitem a ligação entre células vizinhas;

• Glicoproteínas transmembrana;

• Responsáveis pela adesão célula-célula nos

tecidos dos vertebrados.
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS
 Matriz
Extracelular
MECANOTRANSDUÇÃO: CASCATA DE SINALIZAÇÕES
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
ARTIGO: DISCUSSÃO

Osteoblastos: Sintetizam a parte orgânica da

Tecido Ósseo
matriz óssea e origina os osteócitos.

Osteoclastos: participam dos processos de

absorção e remodelação do tecido ósseo

Osteócitos :manutenção da
integridade da matriz óssea.
ARTIGO: DISCUSSÃO – MEDULA ÓSSEA

Medula Óssea:
• A Medula óssea preenche a cavidade interna de
ossos longos e é responsável pela produção de
hemácias,leucócitos e plaquetas além de possuir
reserva de células tronco.
ARTIGO: MECANOTRANSDUÇÃO MEDIADA POR FAK
ARTIGO: INTRODUÇÃO

Introdução:
• Células – tronco e sua capacidade de
diferenciação;

• Pouca atenção aos estímulos físicos que as células-

tronco sofrem ;

•Efeitos dos estímulos nas decisões dos destinos

destas células;

•Os mecanosensores;
ARTIGO: INTRODUÇÃO

•As questões dessa pesquisa estão voltadas para o

microambiente da cavidade da medula óssea e como
as células-tronco são recrutadas de lá sob efeito de
um estímulo mecânico.

•As células-tronco da medula óssea permanecem

quiescentes até que ocorra uma lesão ou uma
doença afete o organismo. Dessa forma, através de
múltiplas vias de sinalização elas são recrutadas pra
o local da lesão.
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

Materiais e Métodos: Procedimento da cirurgia e

design do implante:

• Camundongos mantidos em um ambiente com luz e

temperatura controladas , alimentados e hidratados;

• Camundongos anestesiados com injeção

intraperitoneal de Ketamina e Xylazina;

• Incisão na tíbia Antero-proximal mantendo a

superfície perióstea preservada;

• Dois buracos foram feitos em ambos córticos com uma

ferramenta de alta velocidade.
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

• Dispositivo de micromoção posicionado e fixado

com dois Retopinos de Titânio;

• Buraco central do dispositivo como guia para a

inserção do implante ;

• Um “cap” foi amarrado no dispositivo para ter

certeza da posição e proteger do deslocamento
acidental por atividade do camundongo;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

(A) Esquema do dispositivo do implante inserido. Uma placa

subcutânea de fixação seguradas por dois parafusos.

(B) O dispositivo de micromoção in vivo na tíbia de murino.

(C) Gráfico do trandutor diferencial linear variável (LVDT) que

relaciona o tempo com o movimento em µm e a força em N
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS - MICROMOÇÃO

Micromoção:

• Gerada por um sistema ativado a mão conectado à

coluna central da placa óssea;

• Placa óssea constituída de um LVDT;

• Uma extremidade conecta com a célula carga e a

outra com uma ponta de 1 mm que passa pelo cap
da placa óssea;

• Produção da de micromoção axial de frequência 1.0

Hz por 60 s em um intervalo de 24h por 3, 7 e 14
dias;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

Processamento do tecido, histologia e imunohistoquímica:

• Camundongos dissecados, epiderme removida e

fixada em formaldeído 4% overnight;

• Descalcificação introduzindo as amostras em

solução 19% EDTA-2Na por duas semanas a 4°C;

• Dispositivo do implante gentilmente puxado do

osso;

• Desidratação por etanol para parafinizar;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

• Secções longitudinais de todas as amostras

coletadas em lâminas de histologia;

• Imunohistoquímica para PCNA (proliferating cell

nuclear antigen ) foi feita em lâminas adjacentes
usando DAB como substrato;

• Hibridização foi feita usando sondas marcadas

com digoxigenina de forma complementar aos
cDNAs para sox9 e col1;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

• Tecidos corados com corante acídico, vermelho

de picrosirius;

• Corante discrimina moléculas de colágeno

muito empacotadas das alinhadas;

• Sob luz polarizada as moléculas de colágeno

fibrilar apresentam cores de comprimentos de
onda maior para alinhadas e menor para
menos organizadas;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – INATIVAÇÃO DA FAK

Inativação da FAK:
• Camundongo nocaute da FAK gerado pelo
cruzamento do Crc com um carregando o
alelo floxed fak;

• O genótipo CollCre +/+ ; FAK fl/fl foi

confirmado por PCR;

• Nocaute condicional definido pela ausência

do segundo domínio da FAK;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – MEDIDAS HISTOMORFOMÉTRICAS

Medidas histomorfométricas:

• Tibias coletadas no dia 7 pós-cirurgia para

determinar o volume do novo osso;

• Tecidos corados com azul de anilina após o

“emblocamento”;

• A região do implante nas condições

estacionária controle, estimulada ; estacionária
FAK mutada; estimulada foi representada por
cortes de 8 µm de espessura;
ARTIGO: RESULTADOS

• 72h do início dos estímulos. Células da medula

óssea adjacentes ao implante deslocado
exibiram um aumento sutil de proteoglicanos
na MEC;

• 7º dia de estímulos mecânicos , células da

medula óssea sujeitas a estímulos mecânicos
difereciaram em osteoblastos;

• As células não estimuladas reteram uma

aparência fibroblastóide;
ARTIGO: RESULTADOS

• Cortes histológicos do dia 3 e dia 7 mostrando

os efeitos dos estímulos e a falta deles.
ARTIGO: RESULTADOS

• 14 dias de estímulos mecânicos as células da

medula óssea estimuladas diferenciaram em
osteócitos;

• Encoberta em um corpo maduro de matriz

óssea interlaçadas com vasos sanguíneos;

• Células de um ambiente não estimulado

diferenciaram em osteoblastos com um atraso
considerável;
ARTIGO: RESULTADOS

• Cortes histológicos do dia 14 de estímulos (esquerda) pelo

implante (im) e estacionário (direita).
ARTIGO: RESULTADOS

• Hipótese inicial: osteogênese induzida por

estímulos mecânicos é a proliferação celular
aumentada na medula óssea;

• Análise de PCNA não confirmaram a hipótese;

• Número de células PCNA-positivas foram quase

equivalente na hora 72 do início dos estímulos.
ARTIGO: RESULTADOS

• Fatores de transcrição Sox9 e Runx2

responsáveis pelo destino osteogênico das
células.

• Sox9 expresso em todas as células

osteocondroprogenitoras;

• Runx2 “up” regulado em células que iniciaram a

diferenciação em osteoblastos.
ARTIGO: RESULTADOS

• Sox9 foi largamente expresso nas cavidades da

medula óssea estacionárias e estimuladas;

• Presença de células osteocondroprogenitoras em

ambos os sítios;

• Conjunto de células sox9-positivas expressaram

runx2;

• Runx2 expresso por poucas células adjacentes ao

implante estacionário;

• Runx2 expresso por células ao longo da cavidade da

medula óssea estimulada;
ARTIGO: RESULTADOS

• Células localizadas distantes do estímulo do

implante expressaram runx2;

• Capacidade de sentir o estímulo a distância;

• Matriz extracelular deformada pelo

deslocamento do implante;

• Maior deformação em torno das fendas

circunferenciais e na base do implante
ARTIGO: RESULTADOS

• Respostas moleculares e celulares . (A,B) Nenhuma

diferença na proliferação das células. Ambiente
estimulado (C) e estacionário (D) expressam sox9 por
toda a cavidade.
ARTIGO: RESULTADOS

(E) Runx2 é fortemente expresso na região do peri

implante enquanto que (F) estímulos físicos induzem a
restrição dos transcritos de runx2 às células adjacentes
ao implante.
ARTIGO: RESULTADOS

• Um estímulo breve é suficiente para induzir a

reorganização da MEC da cavidade da medula
óssea;

• Em resposta ao deslocamento do implante as

células da medula óssea up regularam o runx2;

• Em poucos dias diferenciaram em osteoblastos

ARTIGO: RESULTADOS

• Feito um teste se o sinal da integrina foi

essencial para a mecanotransdução das células
da cavidade da medula óssea;

• Não houve deleção de integrina;

• Inativação da tirosina kinase (FAK) involvida

na transdução do sinal de sítios ricos em
integrina
ARTIGO: RESULTADOS

• Camundongos mutantes de FAK formaram osso

em torno do implante tanto quanto os
camundongos controle;

• Foram submetidos ao protocolo do deslocamento

do implante;

• Camundongos controle tiveram resposta

osteogênica alta;

• Camundongos mutados de FAK não tiveram

nenhuma resposta osteogênica.
ARTIGO: RESULTADOS

• 93 % menos matriz de osso depositadas em

comparação com o controle;

• Deposição evidente na superfície perióstea

distante do estímulo mecânico;

• Nenhuma evidência de matriz mineralizada na

cavidade da medula óssea;
ARTIGO: RESULTADOS

• Marcadores de diferenciação de osteoblasto

como colágeno I e osteocalcina expressos em
mutantes FAK;

• Deleção de FAK não preveniu a diferenciação

em osteoblasto;

• Bloqueio da sensação do estímulo das células

da medula óssea;

• Repressão rápida da deposição de matriz

mineralizada em osteoblastos;
ARTIGO: RESULTADOS

A
Inativação da FAK bloqueia
específicamente a osteogênese
mecânicamente induzida in vivo.

(A) Marcas da expressão de Col1

(colágeno I) nas células peri-
impalnte.

(B) Incluindo as justaposicionadas

ao implante (im).
ARTIGO: RESULTADOS

C) Animais controle em 7 dias de

estímulo resultaram formação de osso
abundante.

(D) Matriz óssea recém depositada

corada com azul de anilina interlaçada
por vasos sanguíneos
ARTIGO: RESULTADOS

(E) Estímulos mecânicos falharam em induzir a osteogênese no

camundongos FAK mutados. (F) O azul de Anilina mostra a completa
ausência de tecido mineralizado no sítio peri-implante. (G) Crescimento
vascular interno não impediu a deleção da FAK. (H,I,J,K) Mutantes de FAK
expressam sox9 , runx2, col I e osteocalcina indicando que a perda da FAK
não acaba com o recrutamento de células osteocondroprogenitoras pra o
sítio peri-implante.
ARTIGO: RESULTADOS

(L) Ensaio quantitativo histomorfométrico da matriz recém depositada

nas cavidades da medula óssea não estimuladado controle (wt) (branco),
na estimulada (cinza claro) , medula óssea FAK mutada estacionária
(cinza) e estimulada (preto)
ARTIGO: DISCUSSÃO

Discussão:

• Foi investigado a base genética para

mecanotransdução usando como modelo a
cavidade da medula óssea por conter altas
quantidades de células tronco.

• Forças físicas ativaram a expressão de dois

fatores de transcrição(sox9 e runx2)
requeridas para tornar células tronco em uma
linhagem esquelética
ARTIGO: DISCUSSÃO

• Desativação da FAK(kinase de adesão focal)

– A resposta a estímulos físicos foi eliminada devido a falta

de sinalização de integrinas com o ambiente intracelular .

• A falta da mecanotransdução teve como

conseqüência:

– Falta de up-regulagem de genes esqueletogênicos;

– Fíbrilas de colágenos permaneciam;
desorganizadas;
– Resposta osteogênica induzida mecanicamente foi
perdida;
ARTIGO: DISCUSSÃO: MICROMOÇÃO

• Micromoção:

O ambiente mecânico tem um papel crítico

no reparo do tecido ósseo e a micromoção é
vista como um estímulo oesteoindutivo;

A micrimoção descontrolada leva a um

atraso no reparo de uma fratura, falhas no
enxerto ósseos e perda de implante;
ARTIGO: DISCUSSÃO

• A mecanosensibilidade do esqueleto é atribuído em

partes a variedade das células do esqueleto e a
resposta destas influenciadas por estímulos físicos;

• Diversas respostas em diversas células para o

mesmo estímulo mecânico;

• O estimulo físico é uma fonte de incertezas devido a

variáveis de transmissão de força como: tipo e
magnitude da tensão resultante e rigidez do
substrato;
ARTIGO: DISCUSSÃO

• O modelo da regeneração óssea possui visões

de como as células progenitores do tecido
ósseo sentem,interpretam e responde a uma
força mecânica alterando o seu
comportamento
ARTIGO: DISCUSSÃO

• O deslocamento do implante faz com que

células migrem e se alinhem ao longo da
matriz extracelular tensionada e fibras de
colágenos secretadas por essas células também
tornem-se orientadas paralelas às trajetórias
da tensão.
ARTIGO: DISCUSSÃO

• Parte dessas células são osteoprogenitoras e

parecem explorar a matriz rica em colágeno
para sentir seu ambiente mecânico.

• Se encaixam na MEC via integrinas de

superfície que são dependentes da FAK para
transduzir este estímulo em um sinal biológico
OBRIGADO!!!