Professional Documents
Culture Documents
Студент:
Мирјана Милетић
Биолошки факултет, докторски студијски програм
Молекуларна биологија
1. Увод......................................................................................................................................................................2
расејања..............................................................................................................................................................13
4.4.1. Имунопреципитација........................................................................................................15
5. Закључак............................................................................................................................................................23
6. Референце...........................................................................................................................................................24
2
1. Увод
Раманови спектри представљају вид емисионих спектара који настају расејавањем интензивног
монохроматског зрачења на молекулима супстанце. Већина фотона се на молекулу расејава еластично –
енергија расејаног фотона једнака је енергији упадног фотона, и такво зрачење се назива Рејлијево. Мала
фракција светлости (приближно 10-8 део фотона) се расејава нееластично - енергија емитованог фотона
различита је од енергије упадног фотона. Такво зрачење називамо Рамановим расејањем. Због тога је
интензитет Рамановог зрачења приближно 108 пута нижи од интензитета упадног зрачења, па се за
индуковање овог ефекта користе ласери који производе монохроматско зрачење великог интензитета и, уз
микроскопе у Рамановој микроспектроскопији, обезбеђују велику густину снаге зрачења на веома малом
узорку [1, 2].
Енергетске промене које се детектују Рамановом спектроскопијом одговарају енергијама
ротационих и вибрационих прелаза молекула, тако да су Раманови спектри, према виду кретања
изазваног приликом расејања светлости, вибрациони и ротациони. Код молекула у кондензованим
стањима, какви су и узорци биолошких макромолекула, јављају се само вибрациони спектри [1]. На
слици 1 приказани су механизми различитих процеса расејавања зрачења; Раманово расејање одликују
прелази између два вибрациона нивоа.
3
На собној температури, већина молекула се налази на најнижем енергијском вибрационом нивоу,
тј. у основном стању. Интеракцијом са електромагнетним таласом, електрони прелазе на више енергијско
стање које не одговара ниједном стварном електронском стању (енергија тог стања зависи од енергије
предате молекулу, односно од фреквенције коришћеног извора зрачења) и означава се као виртуелно.
Будући да је такво стање нестабилно, електрони се брзо деексцитују на један од приказаних начина
(слика 1), уз расејање фотона. Рејлијев процес не укључује размену енергије између молекула и фотона и,
с обзиром да се већина фотона расејава на овакав начин, ово ће бити најинтензивнији процес. Стоксово
Раманово расејање подразумева трансфер дела енергије зрачења на молекул: након деексцитације
електрона са виртуелног нивоа, систем остаје у побуђеном вибрационом стању. Расејани фотон тада има
енергију за једну вибрациону јединицу нижу од енергије упадног фотона. Ипак, захваљујући топлотној
енергији, неки молекули и на собној температури могу се наћи у побуђеном вибрационом стању. Расејање
при ком се овакви молекули враћају у основно стање назива се анти-Стоксово Раманово расејање.
Енергија расејаног фотона је у овом случају за једну вибрациону јединицу виша од енергије упадног
фотона [2]. Саме вибрационе фреквенције су карактеристике хемијских веза или група веза и осетљиве су
на локално окружење, тако да Раманов спектар представља „отисак прста― молекула – информише нас о
скупу хемијских веза присутних у молекулу и његовој структури [3].
Релативни интензитет Стоксовог и анти-Стоксовог процеса зависи од попуњености одговарајућих
стања молекула, које се могу извести из Болцманове једначине. На собној температури, број молекула
који се очекује на побуђеним нивоима је веома мали, тако да ће анти-Стоксово расејање бити знатно
слабије, утолико више (слабије) уколико је фреквенција вибрације виша. Са порастом температуре,
интензитет анти-Стоксовог расејања ће расти [2].
Уколико је фреквенција упадног зрачења приближно једнака фреквенцији електронског прелаза
молекула, тј. припада области фреквенција електронске апсорпције, добијене спектре називамо
резонантним Рамановим спектрима. Они осим вибрационих и ротационих укључују и електронске
прелазе молекула, чиме се интензитет расејања појачава за неколико редова величине [1].
Користећи слику 1, може се описати и битна разлика између Раманове и инфрацрвене (енгл.
infrared, IR) вибрационе спектроскопије, такође често примењиване у анализи биолошких молекула.
Инфрацрвена спектроскопија укључује апсорпцију фотона чија фреквенција, односно енергија, тачно
одговара растојању између вибрационих нивоа, што доводи до директног прелаза са основног на
побуђени ниво. Насупрот томе, Раманова спектроскопија користи зрачење много више енергије и мери
разлику у енергији између два вибрациона нивоа, одузимајући енергију расејаног од енергије упадног
фотона [2]. Раманов спектар, дакле, показује померај у енергији у односу на енергију ласера, а приказује
се као релативни интензитет расејаног зрачења ( Irel ) у функцији таласног броја (1/λ) [1].
4
1.1.1. Раманови спектри протеина
5
1.2. Површински појачана Раманова спектроскопија
Показало се да SERS, као врло осетљива техника, има велики потенцијал у детекцији биолошких
макромолекула, нарочито у детекцији протеина. Код протеина који немају простетичку групу, SERS
анализе се углавном своде на проучавање модова аминокиселинских остатака или одређених група, на
пример карбоксилних и амино група, адсорбованих на металну површину. Пошто ће само расејање са
група које су у непосредној близини металне површини бити појачано, SERS спектри протеина могу се
потпуно разликовати од њихових нормалних Раманових спектара [13]. Тако је и највећи проблем везан за
детекцију оваквих протеина SERS спектроскопијом постизање репродуцибилности под различитим
експерименталним условима, услед промена конформације и оријентације протеина [14]. Анализа
протеина са хромофоорама знатно се олакшава коришћењем технике SERRS [13].
6
2. Теоријска основа технике SERS
Слика 4. Схематски приказ резонанције површинског плазмона на моделу мале металне сфере
[17]
7
Овим се објашњава електромагнетно појачање Рамановог расејања: молекул је, дакле, према
овој теорији, адсорбован на површину метала или се налази јако близу ње и интерагује са површинским
плазмоном.
Резонантна фреквенција плазмона зависи од врсте метала и природе металне површине.
Плазмони сребра и злата осцилују на фреквенцијама у видљивом делу спектра и због тога су прикладни
за употребу са видљивим и блиским инфрацрвеним ласерским системима, какви се обично користе за
Раманово расејање. На глатким површинама плазмони осцилују само у равни метала и могућа је само
апсорпција зрачења, без расејавања. За расејавање су неопходне осцилације у правцу нормалном на раван
површине, што се постиже ако је површина храпава. Овако се плазмон локализује у „долине‖ храпаве
металне површине и до расејања долази док се плазмонска осцилација креће ка „врховима‖ [2].
Фреквенција површинског плазмона се може одредити мерењем његовог апсорпционог спектра.
Максимум и ширина апсорпционе траке зависе од облика и величине честица, као и од њиховог
хемијског окружења. Код већих честица и агрегата, максимуми се померају према већим таласним
дужинама; уколико се ради о много различитих структура различитих димензија, резултат је апсорпција
широког опсега таласних дужина, док је код приближно монодисперзних колоида опсег који покрива
апсорпциона трака много ужи. Тако се контролом особина наночестица може подесити плазмонска
резонанција, односно припремити супстрати са којих се оптимално расејава зрачење одређене таласне
дужине [18-20].
Најјаче електрично поље настаје на месту где се две металне наночестице додирују. Та места се
називају „вруће тачке‖ (енгл. hot spots). Експериментално је показано да су поља најјача када је размак
између честица 1-2 nm [17].
8
везивања и енергијских стања анализираног молекула, а даје информације о интеракцији између метала и
анализираног молекула [22]. Ипак, овај механизам дефинитивно није основни механизам појачавања
расејања, може се занемарити у случајевима када анализирани молекул није у директном контакту са
површином метала (нпр. у спектроскопији протеинских кофактора) и применљив је само на појединачне
молекуле. Хемијско појачање је генерално слабије од електромагнетног и сматра се да у укупном
појачању учествује са фактором 101-103 [23].
Иако је у многим случајевима изглед SERS спектра одређеног молекула сличан изгледу класичног
Рамановог спектра истог молекула, разлике у интензитету и броју присутних модова су врло честе. Неки
нови модови, којих нема у класичном Рамановом спектру, могу се у SERS спектру појавити, док неки
други модови могу бити слабијег интензитета, или потпуно изостати у SERS спектру [23].
Модови који се могу видети у неком спектроскопском експерименту зависе од симетрије молекула
и дефинисани су селекционим правилима. Према основном селекционом правилу, рамански активне су
само оне вибрације, тј. дозвољени су они прелази између вибрационих нивоа, при којима се мења
поларизабилност молекула. За разлику од Рамановог расејања, инфрацрвено активни прелази су они при
којима се мења диполни момент, при чему за центросиментричне молекуле важи и правило искључења:
вибрације које су рамански активне не могу бити и инфрацрвено активне, и обрнуто [1].
Према селекционим правилима за молекуле на површини метала, вибрације поларизоване
усправно на површину дају најинтензивније расејање, док вибрације поларизоване паралелно са
површином не доприносе расејавању. Осим тога, адсорпцијом молекула на површину метала, геометрија
молекула се мења и долази до промена нормалних вибрација. То је најизраженије код центросиметричних
молекула, код којих правило искључења више не важи, па се у SERS спектру јављају и траке оних
вибрација које су иначе само инфрацрвено активне. Молекулска симетрија се може променити на
различите начине у зависности од оријентације молекула на површини [23]. Такође, промене у
интензитету појединих трака у зависности од концентрације узорка често су нелинеарне, јер
распоређивање молекула на површини, односно њихова оријентација, зависи од концентрације. Јасно је
да због свега наведеног SERS спектре није лако интерпретирати. Међутим, управо овако специфична
селекциона правила и омогућавају широку примену SERS технике. Велико појачање расејања и
могућност детекције само оних молекула који се налазе близу металне површине чине SERS
осетљивијом и селективнијом техником у односу на класичну Раманову спектроскопију [24].
У случају молекула са хромофорама, комбинација резонантног и површинског појачања (SERRS)
постиже се коришћењем упадног зрачења чија фреквенција одговара фреквенцији електронског прелаза
хромофоре. Када се молекул са хромофором која флуоресцира адсорбује на металну површину,
9
флуоресценција се, услед преноса енергије са молекула на метал, готово потпуно гаси. Као резултат,
SERRS је могуће применити на много шири спектар молекула него резонантну Раманову спектроскопију
или флуоресценцију, а молекули који се нормално сматрају флуорорфорама могу се детектовати техником
SERRS [2].
10
3.1. Колоидне металне наночестице
11
3.2. Металне електроде
Металне електроде су коришћене као супстрати за SERS у анализи протеина као што су
цитохроми, миоглобин, говеђи албумин серума, лизозим. Посебно је ефикасан директан пренос
наелектрисања између хема протеина и подлоге, који се може користити и као модел-систем за
проучавање електрон-транспортних механизама у биолошким системима. Храпавост површине металних
електрода постиже се електрохемијски, сукцесивним циклусима оксидације и редукције. Таква
површинска храпавост није униформна, већ приближно одговара полусферичним структурама различите
дистрибуције величине честица. Услед тога, спектрални регион који обухвата резонантне фреквенције
површинских плазмона је веома широк [23].
12
3.4. Спектроскопијa „tip-enhanced” Рамановог расејања
13
4. Детекција естрогенског рецептора бета спектроскопијом површински појачаног
Рамановог расејања
Два основна правца у дизајну SERS експеримента за детекцију протеина, као и других биолошких
макромолекула, у литератури се најчешће означавају као директна и индиректна детекција. Директна
детекција (или метода без обележавања - енгл. label-freе) подразумева директну адсорпцију протеина од
интереса на SERS-активан супстрат и мерење његовог Рамановог спектра. Индиректан приступ
подразумева детекцију циљног протеина мерењем SERS спектра репортерског молекула - обележивача,
који се везује за молекул протеина и у непосредном је контакту са металном наночестицом [13]. Постоји
много типова обележивача за специфичне примене; сваки појединачни експеримент захтева пажљив
одабир обележивача и осмишљавање стратегије обележавања. Развијен је велики број биосензора који се
заснивају на овој методи детекције [23, 34-37].
Обе методе (или, тачније, групе метода) имају своје предности и ограничења. Спектар добијен
индиректном детекцијом не носи информације о хемијским особинама и структури самог аналита
(протеина од интереса), због чега се ова метода може сматрати мање поузданом од директне детекције
протеина: неспецифична адсорпција у комплексним смешама смањује однос сигнала и шума и доводи до
лажно позитивних идентификација. Ипак, SERS обележивачи дају јак и специфичан сигнал, због чега је
осетљивост ове методе генерално већа него у случају детекције без обележавања. Осим ниске
осетљивости, која је последица слабијег интензитета расејања са протеина, али често и неефикасне
адсорпције протеина на површину металне наночестице, у проблеме везане за label-free детекцију
протеина спада и опасност од денатурације протеина у контакту са металним супстратом. Бројна
савремена истраживања имају за циљ развијање високо осетљивих, биокомпатибилних и
репродуцибилних СЕРС-активних супстрата, метода за припрему узорка и нових инструмената
комбинованих са Раман спектрометрима, којима би се наведена ограничења превазилазила [36].
Истраживачка група Хана и сарадника [38] је развила технику која се базира на SERS детекцији
протеина претходно електрофоретски раздвојених и пребачених на нитроцелулозну мембрану, на начин
карактеристичан за методу „Western blot‖. Међутим, за разлику од „Western blot‖-а, овде након трансфера
на мембрану не следи корак имунодетекције. Уместо тога, мембрана са протеинима се боји колоидом
сребра, који уједно представља подлогу за SERS. Као комбинација ове две конвенционалне методе, нова
техника је названа „Western-SERS‖. У експерименту Хана и сар. коришћена је смеша комерцијално
14
набављених протеина (миоглобина и говеђег албумина серума). Колоид сребра којим је мембрана
третирана је интераговао са протеинима на мембрани и визуелизовао протеинске траке. Након тога су
успешно измерени Раманови спектри протеина и одређен праг детекције. Шта више, интензитети
појединих модова у спектру миоглобина су показали линеарну зависност од концентрације, што отвара
могућност и за квантитативне аналазе. По аналогији са овим експериментом, применили смо исту
технику у циљу детекције изоформи хуманог естрогенског рецептора бета (ERβ).
15
4.4. „Western-SERS” детекција ERβ
4.4.1. Имунопреципитација
Из ћелијских лизата ткива карцинома дојке изолована је укупна протеинска фракција, након чега
су ERβ имунопреципитирани специфичним антителима. Имунопреципитација је метода која се користи
за издвајање циљног протеина из смеше на основу његовог везивања за специфично антитело. У смешу
се, осим специфичног антитела, додаје агароза конјугована са бактеријским протеином А, G или L, за које
се антитела везују са високим афинитетом. Исход ових процеса је преципитација формираног
имунокомплекса на агарозним сферама. Протеини који се нису везали за агарозне сфере, односно за
специфично антитело, се након тога испирају, а нековалентне интеракције између антигена (протеина) и
антитела се затим раскидају поступком који се означава као елуција, а који подразумева испирање
агарозне подлоге са везаним имунокомплексима пуфером одређених карактеристика [47]. У овом
експерименту елуција је вршена на два начина, најпре 0.2 М глицинским пуфером рН 2.8, а затим су
преостали агарозни талози, на којима се претпоставља да је и после благе глицинске елуције заостала
одређена концентрација протеина, инкубирани на 95ºС у пуферу Laemmli [48].
С обзиром да се епитоп коришћеног антитела налази у N-терминалном региону ERβ, који је
заједнички за све изоформе, очекивало се да су на овај начин све изоформе присутне у ћелијском лизату
издвојене. Пошто је маса свих изоформи изузев ERβΔ5 блиска, експеримент је пре свега био усмерен на
детекцију ERβΔ5 и евентуалну дистинкцију његовог SERS спектра од спектра смеше осталих изоформи
сличне масе.
По аликвот сваког узорка одвојен је за проверу присуства протеина методом „Western blot―:
узорци су нанети на полиакриламидни гел и, након SDS-PАGE (енгл. sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis) раздвајања протеина на основу њихове масе, пребачени су на
нитроцелулозну мембрану. Мембрана са протеинима је третирана примарним антителима, а затим
секундарним, која се везују за примарна и конјугована су са пероксидазом рена. Таква мембрана, преко
које је стављен фотографски филм, је затим инкубирана у супстрату пероксидазе рена. Током инкубације
у мрачној соби, дошло је до ензимске реакције пероксидазе и њеног супстрата, чија је коначна последица
била емисија фотона који су осветлили филм. Филм приказан на слици 8 добијен је на овај начин и он
показује позиције које су имунопреципитирани протеини заузели на гелу након електрофорезе. Отисци на
филму одговарају протеинима масе ~ 55 kDa; мања изоформа овом методом није детектована ни у једном
узорку.
16
Слика 8. Резултати „Western blot” анализе узорака имунопреципитираних антителом ERβ (H-150):
sc-8974 (Santa Cruz Biotechnology). У бунаре 2-5 нанети су узорци елуирани глицинским пуфером, а у
бунаре 6-9 узорци елуирани Laemmli пуфером. У бунар 1 нанета је смеша референтних протеина
познатих молекулских маса (маркер), од којих је видљива једино трака која одговара протеину масе 90
kDa. У бунар 10 нанет је контролни узорак, припремљен инкубацијом агарозе и антитела без ћелијског
лизата.
Преостали (већи) део узорака даље је припреман за детекцију спектроскопијом SERS. Протеини
су на идентичан начин денатуришућом електрофорезом на полиакриламидном гелу раздвојени према
својој маси, а затим са гела пребачени на нитроцелулозну мембрану, поступком за трансфер који
омогућава да протеини на мембрани задрже своје релативне позиције које су заузели током
електрофорезе. Међутим, након овог корака није уследила имунодетекција. Уместо тога, мембрана је
третирана колоидом сребра, припремљеним редукцијом сребро-нитрата тринатријум-цитратом, према
Lee-Mеisel протоколу [49]. Након двадесетоминутне инкубације у суспензији и троструког испирања
пуфером Tris-HCl pH 7.1 и дестилованом водом, мембрана је осушена на собној температури.
Упркос очекивањима на основу претходних резултата Хана и сарадника, протеинске траке на
мембрани нису након бојења постале видљиве. Узрок томе могла бити веома ниска концентрација
протеина у узорку, као и неоптималне карактеристике колоида сребра, те би свакако методологију у овом
смеру требало оптимизовати.
Ипак, на основу позиције маркера (смеше протеина познатих маса за које су везане различите
боје, тако да се може пратити њихово кретање кроз гел и, након трансфера, заузете позиције на
мембрани), означена су места на којима се очекивало налажење протеина масе ~ 55 kDa, односно ~ 35
kDa. Мембрана је исечена на траке, тако да једна трака одговара једном „бунарићу‖ за електрофорезу,
односно једном узорку, и на обележеним регионима су мерени SERS спектри.
За индуковање Рамановог ефекта као побуда је коришћена линија ласера таласне дужине 532 nm.
Најпре су измерени референтни спектри подлоге, тј. нитроцелулозне мембране. На делу мембране који
17
одговара молекулској маси од 55 kDa измерени су спектри протеина, како у глицинским (слика 9, табела
1), тако и у Laemmli елуатима (слика 10, табела 1).
Слика 9. SERS спектар протеина молекулске масе ~ 55 kDa (црно) из глицинског елуата. На слици је
приказан и референтни спектар нитроцелулозне мембране третиране колоидом сребра (наранџасто).
Слика 10. SERS спектар протеина молекулске масе ~ 55 kDa из Laemmli елуата.
18
Табела 1. Фреквенције модова у SERS спектрима протеина молекулске масе (MW) 55 kDa.
Порекло и тип вибрација повезаних са датим модовима приказане су у последњој колони.
ν – истезање, δ – савијање, γ – љуљање.
Фреквенција
(cm-1) Порекло и тип вибрације
спектар протеина MW 55 kDa, спектар протеина MW 55 kDa, [38, 50-55]
глицински елуат глицински елуат
374 383 подлога
409 подлога
427 437 подлога
479
495 ν (S-S)
565 подлога
630 подлога
674 подлога
723 721 Trp/ δ (COO-)
730 γ (CH2)
784 782 Тrp
846 855 подлога (цитрат)
939 950 ν (C-C)/ цитрат
975 975 Ser/ ν (C-C)/ ν (C-O)
1052 подлога
1068 подлога
1110 1110 подлога
1130 подлога
1160 подлога/ Tyr/ Phe
1177 цитрат
1208 подлога
1235 1243 амид III
1281 подлога
1308 1305 γ(CH2)
1352 подлога/ Trp
1404 подлога/ цитрат
1422 Тrp/ δ(CH3)/ δ (CH2)
1458 подлога/ δ (CH2 )
1483 подлога
1525 Lys/ δ (NH3+)
1567 1575 Тrp/ Рhe
1605 1590 Phe/ Trp/ Tyr, ν прстена
1645 1640 амид I
19
Спектри протеина измерени на 55 kDa садрже неколико модова карактеристичних за вибрационе
спектре протеина. Фреквенција амидне траке I, која потиче од вибрација полипептидне окоснице
(највећим делом од истезања С=О веза) указује на то да је протеин на нивоу секундарне структуре
организован у виду β-плоча или насумично испресавијаног ланца. Фреквенције другог важног маркера
полипептидног ланца, амидне трака III (истезање C-N и савијање N-H) такође указују на малу
заступљеност α-хеликса у протеину и претежно организовање у β-плоче или насумичне, неуређене
структуре [50]. Познато је да у секундарној структури нативног ERβ изразито доминира α-хеликс [41].
Измерени спектри потврђују да се денатурацијом протеина (до које је је морало доћи током поступка
припреме узорака за SDS-PAGE, с обзиром да овај вид електрофорезе подразумева да се молекули
протеина у комплексу са SDS-ом кроз гел крећу као исправљене, штаполике структуре) његова
хеликоидна структура губи, али такође указују на успостављање нових водоничних веза, којима настају
интермолекулске и/или интрамолекулске β-плоче и различити видови неуређених структура. Бројна
истраживања потврђују да многи термички денатурисани протеини задржавају мањи или већи део
уређене секундарне структуре, често различите од структуре нативног протеина [56].
Модови који се, осим амидних трака, такође појављују у оба спектра могу се повезати са
вибрацијама група из ароматичних аминокиселина, као и са вибрацијама С-С и СН2 група. За разлику од
њих, модови на фреквенцијама 479, 495, 730, 1422 и 1525 cm-1 снимљени су у само једном од ова два
спектра. Испољавање различитих модова, као и разлике у релативном интензитету и ширини истих
модова у различитим спектрима, објашњава сама природа SERS-а: ефекат појачања Рамановог расејања
зависи, осим од структуре анализираног молекула, и од карактеристика металног супстрата и удаљености
између молекула и површине метала. Може се очекивати да наночестице сребра у припремљеном
колоиду нису биле исте морфологије, као и да су се на различит начин (у агрегатима различите величине
и облика) распоређивале на мембрани и селективно појачавале Раманово расејање на оним деловима
молекула који су им били ближи. У циљу добијања спектара боље репродуцибилности, требало би
тестирати различите колоиде сребра (варирањем концентрације и врсте редукционог средства, додавањем
агенаса за агрегацију; показано је чак да морфологија наночестица, а тиме и ефекат појачања, зависи од
брзине додавања редукционог средства [57]).
Значајан број модова из сваког од спектара приписан је подлози на којој су спектри мерени
(мембрани третираној колоидом сребра), од којих неки потичу од вибрација у молекулу нитроцелулозе
[58], док се за неке може претпоставити повезаност са цитратним јоном из колоида сребра [55]. Mноги
модови из измереног спектра подлоге могу се повезати са вибрацијама атомских група различитих
аминокиселина, али, пошто није познато да ли и у којој мери дате аминокиселине доприносе њиховој
појави, читав спектар подлоге је означен као референтни спектар и изузет из разматрања и поређења.
Додатне информације о вибрацијама повезаним са овим модовима могу се добити анализом спектара ERβ
измереним на другој подлози, као што је PVDF (поливинил-дифлуорид) мембрана, такође уобичајено
20
коришћена у анализи протеина.
SERS спектар протеина масе ~ 35 kDa, за који се претпоставља да представља изоформу ERβΔ5,
успешно је измерен само у узорцима добијеним елуцијом Laemmli пуфером (слика 11, табела 2). Вeћа
запремина, односно мања концентрација протеина у глицинском него у Laemmli елуату (што су
подразумевали примењени протоколи за елуцију, који у овом раду нису детаљно дати) може бити
одговорна за изостанак детекције овог протеина у глицинском елуату.
Други разлог би могао лежати у томе што су у овој траци на мембрани, осим очекиване изоформе
ERβΔ5, детектовани и лаки ланци имуноглобулина G (IgG), који можда на неки начин олакшавају
детекцију, односно обезбеђују боље појачање расејања са молекула изоформе. Наиме, овај спектар
великим делом чине модови који припадају SERS спектрима IgG [54], што говори о присуству лаких
имуноглобулинских ланаца, тј. фрагмената антитела коришћеног за имунопреципитацију, доспелих у
узорак нежељеном елуцијом са агарозних сфера. Модови на фреквенцијама 948, 1283, 1344, 1561, 1603
cm-1 заједнички су спектрима снимљеним на 55 kDa, мада се неки од њих такође појављују у спектру
IgG. Међутим, спектар измерен на 35 kDa богат је модовима који се нису појављивали у спектрима ERβ,
нити су део спектра IgG. Изоформа ERβΔ5 краћа је од wtERβ за преко 200 аминокиселина у С-
терминалном региону, услед чега би могла остваривати нешто измењен контакт са наночестицама сребра.
Осим тога, могуће је да ову изоформу карактерише другачији образац посттранслационих модификација,
као што је фосфорилација, које би и саме по себи (увођењем нових атомских група у молекул протеина),
и преко промена конформације читавог протеина, могле утицати на изглед Рамановог спектра
21
Табела 2. Фреквенције модова у SERS спектрима протеина молекулске масе (MW) 35 kDa
(Laemmli елуат) и са њима повезане молекулске вибрације.
ν – истезање, δ – савијање, γ – љуљање.
* модови који се појављују и спектру IgG [54]
ν(CN)/Тrp/ Тyr, ν
1092* 1561* Trp/ Тyr, ν прстена
прстена
22
Важно је подсетити да „Western blot― анализом узорака чији су SERS спектри измерени нису
детектоване протеинске траке на висини која одговара молекулској маси 35 kDa. Може се претпоставити
да је концентрација ове изоформе, уз слабу осетљивост антитела, била недовољна да би детекција
имуноблотовањем била могућа. Лимит детекције протеина „Western blot― методом је, у идеалном случају,
100 pg/ml, што је читав ред величине изнад лимита детекције бојењем гела сребром [59]. Међутим, у
пракси је ова бројка директно одређена осетљивошћу и специфичношћу антитела. С друге стране,
површински појачана Раманова спектроскопија, уз одговарајуће експерименталне услове и комбиновање
са другим методама, може бити техника знатно веће осетљивости [60]. Експерименти описани у овом
раду показали су, макар према критеријуму осетљивости, предност SERS технике у односу на класичну
методу имуноблотовања. Даља оптимизација методологије у циљу добијања репродуцибилних спектара,
као и њихова нумеричка анализа, свакако је неопходна.
5. Закључак
23
6. Референце
2. Smith E, Dent G. Modern Raman Spectroscopy - A Practical Approach. Hoboken, NJ: J. Wiley; 2005.
3. Online Materials Science Learning Resources: DoITPoMS [Internet]. Cambridge: University of
Cambridge; 2004-2015. Raman scattering [цитирано 3. окт. 2016]. Доступно на:
http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/raman/raman_scattering.php
4. Tuma, R. Raman spectroscopy of proteins: from peptides to large assemblies. J. Raman Spectroscopy.
2005;36:307–19.
5. HORIBA – Explore future [Internet]. Horiba Ltd; 1996-2016. Raman spectroscopy for proteins
[цитирано 3. окт. 2016]. Доступно на:
http://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Documents/Raman/HORIBA_webinar_proteins.pdf
6. Thomas GJ Jr. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annu Rev Biophys Biomol
Struct. 1999;28:1-27.
7. Wackerbarth H, Klar U, Günther W, Hildebrandt P. Novel Time-Resolved Surface-Enhanced
(Resonance) Raman Spectroscopic Technique for Studying the Dynamics of Interfacial Processes:
Application to the Electron Transfer Reaction of Cytochrome c at a Silver Electrode. Appl. Spectrosc.
1999;53(3):283-91.
8. Soldatova V, Ibrahim M, Olson S, Czernuszewicz S, Spiro G. New light on NO bonding in Fe(III) heme
proteins from resonance Raman spectroscopy and DFT modeling. J Am Chem Soc. 2010;132(13):4614-
25.
9. Feng M, Tachikawa H. Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopic Characterization of the
Protein Native Structure. J. Am. Chem. Soc. 2008;130:7443–8.
10. Petry R, Schmitt M, Popp J. Raman spectroscopy - A prospective tool in the life sciences.
Chemphyschem. 2003;4(1):14-30.
11. Stiles P, Dieringer J, Shah N, Van Duyne R. Surface-Ennanced Raman Spectroscopy. Annual Review of
Analytical Chemistry. 2008;1:601-26.
12. Xu W, Ling X, Xiao J, Dresselhaus MS, Kong J, Liu Z, Zhang J. Surface enhanced Raman spectroscopy
on a flat graphene surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012;109(24):9281-6.
13. Han XX, Zhao B, Ozaki Y. Surface-enhanced Raman scattering for protein detection. Anal. Bioanal.
Chem. 2009;394:1719-27.
14. Han XX, Zhao B, Ozaki Y. Label-free detection in biological applications of surface-enhanced Raman
spectroscopy. Trends Anal. Chem. 2012;38:1683-9.
15. Fleischmann M, Hendra PJ, McQuillan AJ. Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode.
Chem Phys Lett. 1974;26(2):163–6.
16. McNay G, Eustace, D, Smith E, Faulds K, Graham D. Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) and
Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering (SERRS): A Review of Applications. Appl. Spectrosc.
2011;65(8):825-37.
17. Le Ru EC, Blackie E, Meyer M, Etchegoin PG. Surface Enhanced Raman Scattering Enhancement
Factors: A Comprehensive Study. J. Phys. Chem. C. 2007;111:13794-803.
18. Lance KK, Coronado E, Zhao LL, Schatz GC. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The
Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. J. Phys. Chem. B. 2003;107(3):668–677
24
19. Barnes WL, Dereux A, Ebbesen TW. Surface plasmon subwavelength optics. Nature.
2003;424(6950):824-30.
20. Lin XM, Cui Y, Xu YH, Ren B, Tian ZQ. Surface-enhanced Raman spectroscopy: substrate-related
issues. Anal Bioanal Chem. 2009;394(7):1729-45.
21. Brolo A, Irish DE, Smith BD. Applications of surface enhanced Raman scattering to the study of metal-
adsorbate interactions. J. Mol. Struct. 1997;405(1):29-44.
22. Kambhampati P, Child CM, Foster MC, Campion A. On the chemical mechanism of surface enhanced
Raman scattering: Experiment and theory. J. Chem. Phys. 1998;108:5013-26.
23. Chen L, Cai L, Ruan W, Zhao B. Surface-enhanced Raman Spectroscopy (SERS): Protein Application.
Encyclopedia of Analytical Chemistry. 2014;1-23.
24. Kneipp J, Kneippa H, Kneippac K. SERS — a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics.
Chem. Soc. Rev. 2008;37:1052-60.
25. Banholzer MJ, Millstone JE, Qin L, Mirkin CA. Rationally designed nanostructures for surface-
enhanced Raman spectroscopy. Chem Soc Rev. 2008;37(5):885-97.
26. Cañamares MV, Garcia-Ramos JV, Sanchez-Cortes S, Castillejo M, Oujja M. Comparative SERS
effectiveness of silver nanoparticles prepared by different methods: a study of the enhancement factor
and the interfacial properties. J Colloid Interface Sci. 2008;326(1):103-9.
27. Aroca RF, Alvarez-Puebla RA, Pieczonka N, Sanchez-Cortez S, Garcia-Ramos JV. Surface-enhanced
Raman scattering on colloidal nanostructures. Adv Colloid Interface Sci. 2005;116(1-3):45-61.
28. Lee PC, Meisel D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys.
Chem. 1982;86 (17):3391-5.
29. S. Schlüker. Surface Enhanced Raman Spectroscopy: Analytical, biophysical and life scienc
applications. Weinheim: Wiley-VCH Verlag; 2011.
30. Chen R, Lina J, Fenga S, Huanga Z, Chena G, Wanga J, Lia Y, Zeng H. Applications of SERS
Spectroscopy for Blood Analysis. У: Ghomi M, уредник. Applications of Raman Spectroscopy to
Biology. Amsterdam: IOS Press; 2012. стр. 72-105.
31. Alvarez-Puebla RA, Arceo E, Goulet PJ, Garrido JJ, Aroca RF. Role of nanoparticle surface charge in
surface-enhanced Raman scattering. J Phys Chem B. 2005;109(9):3787-92.
32. Peters RF, Gutierrez-Rivera L, Dew SK, Stepanova M. Surface enhanced Raman spectroscopy detection
of biomolecules using EBL fabricated nanostructured substrates. J Vis Exp. 2015;97.
33. Zhang R, Zhang Y, Dong ZC, Jiang S, Zhang C, Chen LG, Zhang L, Liao Y, Aizpurua J, Luo Y, Yang JL,
Hou JG. Chemical mapping of a single molecule by plasmon-enhanced Raman scattering. Nature.
2013;498(7452):82-6.
34. Sharma B, Frontiera R, Henry AI, Ringe E, Van Duyne R. SERS: Materials, applications, and the future.
Materials today. 2012;15(1-2):16-25.
35. Domenici F, Bizzarri R, Cannistraro S. Surface-enhanced Raman scattering detection of wild-type and
mutant p53 proteins at very low concentration in human serum. Anal Biochem. 2012;421(1):9-15.
36. Schlücker, S. SERS Microscopy: Nanoparticle Probes and Biomedical Applications. ChemPhysChem.
2009;10:1344-54.
25
37. Lin CC, Yang ZM, Chen YF, Yang TS, Chang HC. A New Protein A Assay Based on Raman Reporter
Labeled Immunogold Nanoparticles. Biosens. Bioelectron. 2008;24:178–83.
38. Han X, Jia H, Wang Y, Lu Z, Wang C, Xu W, Zhao B, Ozaki Y. Analytical technique for label-free multi-
protein detection based on Western blot and surface-enhanced Raman scattering. Anal Chem. 2008;
80(8):2799-804.
39. Swedenborg E, Power KA, Cai W, Pongratz I, Rüegg J. Regulation of estrogen receptor beta activity and
implications in health and disease. Cell Mol Life Sci. 2009;66(24):3873-94.
40. Leung YK, Mak P, Hassan S, Ho SM. Estrogen receptor (ER)-β isoforms: A key to understanding ER-β
signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103(35):13162-7.
41. UniProt [Internet]. UniProt Consortium; 2002-2016. ESR2 - Еstrogen receptor beta – Homo sapiens
(Human) – ESR2 gene & protein [цитирано 3. окт. 2016]. Доступно на:
http://www.uniprot.org/uniprot/Q92731.
42. Inoue S, Ogawa S, Horie K, Hoshino S, Goto W, Hosoi T, Tsutsumi O, Muramatsu M. & Ouchi Y. An
estrogen receptor beta isoform that lacks exon 5 has dominant negative activity on both ERalpha and
ERbeta. Biochem Biophys Res Commun. 2000;279:814-9.
43. Poola I, Abraham J, Liu A. Estrogen receptor beta splice variant mRNAs are differentially altered during
breast carcinogenesis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2002;82:169-79.
44. Mandušić V, Nikolić-Vukosavljević D, Tanić N, Kanjer K, Neškovic-Konstantinović Z, Čeleketić D. &
Dimitrijević B. Expression of estrogen recepor β wt isoform (ERβ1) and ERβΔ5 splice variant mRNAs
in sporadic breast cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2007;133:571-9.
45. Vrtačnik P, Ostanek B, Mencej-Bedrač S, Marc J. The many faces of estrogen signaling. Biochemia
Medica. 2014;24(3):329-42.
46. Wu X, Subramaniam M, Negron V, Cicek M, Reynolds C, Lingle L, Goetz P, Ingle N, Spelsberg C,
Hawse R. Development, characterization, and applications of a novel estrogen receptor beta monoclonal
antibody. J Cell Biochem. 2012;113(2):711-23.
47. Antibodies, Proteins, Kits and Reagents for Life Science [Internet]. Abcam plc; 1998-2016.
Immunoprecipitation protocol [цитирано 3. окт. 2016]. Доступно на: http://www.abcam.com/protocols/
immunoprecipitation-protocol-1.
48. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature. 1970;227(5259): 680-5.
49. Lee C, Meisel D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys.
Chem. 1982;86(17):3391-5.
50. Tu AT. Raman spectroscopy in biology: principles and applications. New York: Wiley; 1982.
51. Xu L, Zong C, Zheng C, Hu P, Feng J, Ren, B. Label-Free Detection of Native Proteins by Surface-
Enhanced Raman Spectroscopy Using Iodide-Modified Nanoparticles. Anal. Chem. 2014;86(4):2238-45.
52. Zhou Z, Huang G, Kato T, Ozakia Y. Experimental parameters for the SERS of nitrate ion for label-free
semi-quantitative detection of proteins and mechanism for proteins to form SERS hot sites: a SERS
study. J. Raman Spectrosc. 2010;42:1713-21.
53. Lv Y, Qin Y, Svec F, Tan T. Molecularly imprinted plasmonic nanosensor for selective SERS detection
of protein biomarkers. Biosens Bioelectron. 2016;80:433-41.
54. Grabbe E, Buck R. Surface-enhanced Raman spectroscopic investigation of human immunoglobulin G
adsorbed on a silver electrode. J. Am. Chem. Soc. 1989;111(22):8362-6.
55. Kerker M, Siiman O, Bumm A, Wang S. Surface enhanced Raman scattering (SERS) of citrate ion
adsorbed on colloidal silver. Appl Opt. 1980;19(19):3253-5.
26
56. Seshadri S, Oberg A, Fink L. Thermally denatured ribonuclease A retains secondary structure as shown
by FTIR. Biochemistry. 1994;33(6):1351-5.
57. Stiufiuc R, Iacovita C, Lucaciu C, Stiufiuc G, Dutu A, Braescu C, Leopold N. SERS-active silver
colloids prepared by reduction of silver nitrate with short-chain polyethylene glycol. Nanoscale Res Lett.
2013;8(1):47.
58. Castro K, De Vallejuelo SFO, Astondoa I, Goni FM. Analysis of confiscated fireworks using Raman
spectroscopy assisted with SEM-EDS and FTIR. J. Raman Spectrosc. 2011;42(11):2000-5.
59. Sasse J, Gallagher SR. Staining proteins in gels. У: Curr Protoc Mol Biol. 2009;10.6.1-10.6.27.
60. Lee M, Lee S, Lee H, Lim W, Seong H, Lee K, Chang I, Oh CH, Choo J. Highly reproducible
immunoassay of cancer markers on a gold-patterned microarray chip using surface-enhanced Raman
scattering imaging. Biosens Bioelectron. 2011;26(5):2135-41.
27