INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

METODOS DE ANALISIS

PRÁCTICA “ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE

AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN METODO
ESPECTROFOTOMETRICO”.

GRUPO: 5QM2 SECCIÓN: 4

ALUMNO:

GÓMEZ NAVAL MAURICIO RAUL

PROFESOR RESPONSABLE:

ACUÑA GONZALES CAROLINA

FECHA DE ENTREGA: 03/04/18

OBJETIVOS.

1. Conocer el efecto que tiene el uso de material común como celdas en un

análisis espectrofotométrico

2. Aprender a calcular el error que genera el uso de material no convencional

en un análisis espectrofotométrico

3. Conocer algunos factores y parámetros que afectan un método

espectrofotométrico
FUNDAMENTO.

¿Qué es el establecer el método espectrofotométrico?

El método espectrofotométrico es la medición de radiación electromagnética en

forma de luz que absorbe una muestra al hacer incidir esta radiación sobre él, el
método se basa en la medición de la intensidad de la luz tanto absorbida como
transmitida basándose en la ley de Lambert ~ Beer, teniendo en cuenta que el
método igual se utiliza para conocer la determinada cantidad de una sustancia
conocida presente en la muestra.

Para establecer un método espectrofotométrico se tienen que tomar diversos

factores a considerar, uno de ellos es el uso de material adecuado con una
superficie que no difracte la luz y esta se mantenga uniforme para incidir en la
muestra, otro punto a considerar es la longitud de onda en la cual se deberá leer el
analito, dado a que varios compuestos presentan un espectro de absorción dentro
de la región no visible, o simplemente presentan

RESULTADOS.

1. SELECCIÓN DE TUBOS COMUNES PARA USARLOS COMO CELDAS

 Tabla 1: Selección de tubos comunes para usarlos como celdas.

Resultados obtenidos al realizar la determinación de % de Transmitancia en los

diferentes tubos seleccionado a 400nm con Agua destilada, y resultados de %T
con sulfato de níquel después de una segunda selección a partir de los resultados
con agua.
 Tubo No. %T400 (H2O)
Tubo No. %T400 (NiSO4)
1 95
2 95.7 3 22.1
3 95 4 21.9
4 95.4 8 22.1
5 95.5 9 22.4
6 95.4 10 21.9
7 96 13 22
8 94.8 14 22.1
9 95.1 15 22
10 95.3 16 22.3
11 95.4 17 22
12 95.6
13 95
14 95.1
15 95.1
16 94.9
17 95.4

a) ¿Qué son las superficies ópticas equivalentes? R= Se refiere a que

varios instrumentos o celdas presenten la misma medición o similar a esta,
con un margen de error de 3% +/- un valor conocido

b) ¿Cómo influye el diámetro de la celda? R= Debido a que es la distancia

que va a recorrer el haz de luz en la muestra se debe de mantener un
diámetro uniforme debido a que en una curva de calibración afecta esta
distancia en los cálculos obtenido a partir de la ecuación general de la
espectrofotometría, y si este se ve afectado se debe realizar el ajuste para
cada medición con celda de diámetro diferente, por ello es importante
mantener un diámetro fijo.
 2. EFECTO DEL TIEMPO EN LA ESTABILIDAD DEL COLOR

 Tabla 2: Estabilidad del Color respecto al Tiempo

Datos obtenidos en las lecturas de la muestra a diferentes tiempos de
lectura, observándose la variación siguiente.

Tiempo (min) A480

0 0.537
30 0.482
60 0.458
90 0.436
120 0.412

0.55

0.5

A
0.45

0.4
0 20 40 60 80 100 120 140

Figura 1: Grafica de la estabilidad del color con respecto al tiempo, los datos
obtenidos se presentan en Tiempo (min) vs Absorbancia (A)

a) ¿Es estable el color? No, debido a que con el avance del tiempo la
absorbancia obtenida era menor debido a la inestabilidad del compuesto
colorido formado.

b) ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas? Explique. R=

Inmediatamente, ya que con el avance del tiempo las lecturas irán
cambiando afectando la confiabilidad de los resultados.
 3. EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL CROMOGENO

 Tabla 3: Efecto de la concentración de SCN- en la determinación de

Fe3+

Resultados obtenidos a partir del cálculo de la concentración de Fe3+ y SCN- de

cada tubo y la relación de estos valores con la absorbancia obtenida.

Tubo No. SCN- (µg/mL) Fe3+ (µg/mL) SCN-/Fe3+ A480

1 290 4.2 69.04 0.290
2 870 4.2 207.14 0.384
3 2900 4.2 690.47 0.535
4 5800 4.2 1380.95 0.612
5 8700 4.2 2071.42 0.675
6 11600 4.2 2761.90 0.695
7 14500 4.2 3452.38 0.738

*Cálculos de las Concentraciones

Fe3+ (0.00025M) PM= 55.8 (Tubo 1) SCN- (0.5M) PM= 58 (Tubo 1)
 55.8 g/L ~ 1M  58 g/L ~ 1M
 X ~ 0.00025M  X ~ 0.05M
X= 0.014g X= 29g
 0.014g ~ 1000mL  29g ~ 1000mL
 X ~ 1.5mL  X ~ 0.05mL
X= 2.1x10-5 X= 1.45x10-3
 (2.1x10-5) (1’000,000) = 21µg  (1.45x10-3) (1’000,000) = 1450µg
 (21µg) / (5mL) = 4.2µg/mL  (1450µg) / (5mL) = 290µg/mL
 0.8

0.6

0.4
A
0.2

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Figura 2: Grafico de la relación entre las concentraciones de SCN-/Fe3+ vs la

absorbancia obtenida en las lecturas de los diferentes tubos.

a) ¿Qué concentración de SCN se recomienda? ¿Por qué? R= A partir de

la concentración de 8,700 µg/mL dado que a partir del aumento en esta
concentración no se ve un aumento considerable debido a la capacidad de
interaccionar con el Fe disponible.

4. EFECTO DEL PH SOBRE LA RELACION ENTRE Fe3+ Y SCN-

 Tabla 4: Efecto del pH sobre la absorbancia obtenida y estabilidad de

la reacción.

Tubo No. pH A480

1 0 0.838
2 1 0.888
3 2 0.888
4 4 0.809
5 8 0.017

1
0.8
0.6
0.4 A
0.2
0
0 2 4 6 8 10

Figura 3: Espectro de Absorción obtenido calculando la Absorbancia con los datos

de la Tabla 2
 a) ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido? R= A pH alcalino
se presenta una absorbancia menor debido a la inestabilidad.

b) ¿Cuál es el pH recomendado para que efectúe la reacción Fe3+ ~ SCN-?

R= pH acido entre 0~2 dado a que se presenta los valores máximos de
absorbancia.

5. EFECTO DE ALGUNOS ANIONES SOBRE LA ABSORBANCIA

ABSOLUTA

 Tabla 5: Efecto de algunos aniones en la reacción Fe3+ ~ SCN-

Anión A480 Inicial A480 Final ∆A480

Fluoruro 0.800 0.185 0.615
Oxalato 0.809 0.110 0.699
Tartrato 0.813 0.763 0.050
Fosfato 0.807 0.715 0.092

0.8

0.6 A480 I

0.4 A480 F
∆ A480
0.2

0
Fluoruro Oxalato Tartrato Fosfato

Figura 4: Grafico de barras a partir de los valores de la tabla 5 donde se muestra

la (A) a 480nm Inicial, Final y la diferencia entre ambas para cada anión evaluado.
a) ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción entre el
ion férrico y el tiocianato? R= Presenta un descenso de la absorbancia
siendo el fluoruro y el oxalato los que presentan un cambio en la
absorbancia más grande.

b) ¿A qué se debe este efecto? R= Debido a la electronegatividad, siendo

elementos como el fluoruro más electronegativo y afín a elementos
oxidantes como el fierro.
 6. PARAMETROS OPTIMOS PARA EL METODO DEL SULFOCIANURO DE
AMONIO PARA DETERMINAR FIERRO FERRICO

 Tabla 6: Intervalo Dinámico Lineal de la Concentración

Datos obtenidos a partir de la realización de la curva de calibración, y su
posterior lectura en el espectrofotómetro.

Parámetro Valor Optimo

pH 1-2
Tiempo Inmediatamente
Concentración de SCN- 8,700 µg/mL
Límites de Concentración con %Ep mínimo 13.49%
Aniones que interfieren Tartrato, Fosfato. Fluoruro, Oxalato.
Límite de detección del método (LDD) 0.121

7. CURVA DE CALIBRACION

 Tabla 7: Curva de Calibración de Fe3+ por el método de NH4SCN

Tubo No. Fe3+ (µg/mL) A480 A ajustada A,A’ (A-A’)2
1 0.11 0.035 0.058 0.046 5.29x10-4
2 0.35 0.072 0.093 0.082 4.41x10-4
3 0.70 0.119 0.143 0.131 5.76x10-4
4 1.16 0.205 0.209 0.207 1.6x10-5
5 1.75 0.297 0.294 0.295 9x10-6
6 2.33 0.363 0.378 0.370 2.25x10-4
7 2.91 0.470 0.461 0.465 8.1x10-5
8 3.50 0.566 0.546 0.556 4x10-4
9 4.08 0.673 0.630 0.651 1.84x10-3
10 4.66 0.737 0.713 0.725 5.76x10-4
11 5.83 0.898 0.881 0.889 2.89x10-4
12 8.16 1.243 1.217 1.230 6.76x10-4
13 12.83 1.841 1.889 1.865 2.30x10-3

 Calculo de A ajustada
 Calculo de Sb
A ajustada= 0.1439 (C) + 0.043 𝛴(𝐴−𝐴′ )2
Sb= √ 𝑛−2
A= 0.1439 (0.11) + 0.043= 0.058
7.971𝑥10−3
Sb= √ = 0.026
11
*Cálculo de concentración de Fe3+
 Calculo de LDD
Fe3+ (0.00025M) PM= 55.8 (Tubo 1)
LDD= yb + 3 Sb
 55.8 g/L ~ 1M
LDD= 0.043 + 3 (0.026) = 0.121
 X ~ 0.00025M

X= 0.014g  Calculo dé %Ep

(203.3)(∆ log 𝐶)
 0.014g ~ 1000mL %Ep= ∆% 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
 X ~ 0.05mL
(203.3)(−0.50)
%Ep= = 13.49%
7.53
X= 7x10-7

 (7x10-7) (1’000,000) = 0.7µg

 (0.7µg) / (6mL) = 0.11µg/mL

2
y = 0.1439x + 0.043
1.8
R² = 0.9975
1.6 R= 0.9987
1.4
1.2
1 A

0.8 Linear (A)

0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 14

Figura 5: Curva de calibración donde se muestra la concentración de Fe 3+ en

µg/mL vs la absorbancia a 480nm
 8. METODO DE RINGBOM

 Tabla 8: Datos para aplicar el Método de Ringbom en la determinación

de Fe 3+ por el método del SCN

Tubo No. Fe3+ (µg/mL) Log [ Fe3+ ] A480 %T Absortancia

1 0.11 -0.95 0.035 92.25 7.75
2 0.35 -0.45 0.072 84.72 15.28
3 0.70 -0.15 0.119 76.03 23.97
4 1.16 0.064 0.205 62.37 37.63
5 1.75 0.24 0.297 50.46 49.54
6 2.33 0.36 0.363 43.35 56.65
7 2.91 0.46 0.470 33.88 66.12
8 3.50 0.54 0.566 27.16 72.84
9 4.08 0.61 0.673 21.23 78.77
10 4.66 0.66 0.737 18.32 81.68
11 5.83 0.76 0.898 12.64 87.36
12 8.16 0.91 1.243 5.71 94.29
13 12.83 1.10 1.841 1.44 98.56

 Calculo dé %T
 Calculo de Absortancia
%T= 10 –A x100
Absortancia= 100 - %T
%T= 10-0.035 x 100= 92.25%
Absortancia= 100 – 92.25 = 7.75

120
100
80
60
Absortancia
40
20
0
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

Figura 6: Representación gráfica del método de Ringbom a partir de la tabla No. 8

DISCUSIÓN.
Los diversos factores que afectan a un método espectrofotométrico en este caso
son relacionados con la difracción de la luz y la diversidad entre cada uno, los
materiales para la realización de un experimento espectrofotométrico están
compuestos de materiales en los cuales al incidir un haz de luz este no se
dispersa y tienen una superficie de contacto en la muestra uniforme, por ello es
indispensable elegir los tubos de que se utilizaran como celdas en este
procedimiento. En la tabla 1, se observan los tubos que fueron evaluados con
agua y a partir del 95% de T, se tomó un margen de error de +/- 3% de
Transmitancia; esto con fines de minimizar la variación correspondiente a las
lecturas tomada sin embargo el material con el que están hechos dichos tubos
presentan imperfecciones y daños no visibles ante los ojos, pero si ante el detector
del espectrofotómetro.
A partir de lo anterior se seleccionan los 10 tubos que se utilizaran como celdas,
sin embargo se implementa una reacción con la formación de un compuesto
colorido ante la mezcla de FeCl3 con NH4SCN, para ello se realiza la prueba de
estabilidad con el tiempo, denotándose como se observa en la figura 1 que el
compuesto formado no permanece estable teniendo lecturas e absorbancia
menores, esto se debe a que la formación de un compuesto de coordinación con
el Fe se ve afectada ate la presencia de oxígeno y diversos elementos con una
mayor afinidad, tales como la presencia de sales y halógenos que pueden
interactuar fácilmente con el Fe, un elemento oxidante y capaz de interactuar
fácilmente con el oxígeno.
Al igual la reacción se ve afectada por el cambio de pH, a un pH alcalino es
fácilmente afectada por el ambiente desprotonado en el que se encuentra, los
enlaces del elemento de coordinación son de unión simple y fácilmente alterados
por una perturbación,
CONCLUSIONES.
 El pH óptimo para la reacción de FeCl3 con NH4SCN es entre 1 y 2
 Los aniones que interfieren con la estabilidad del color, son por la
electronegatividad y su afinidad al compuesto colorido.
 Las lecturas de la reacción de FeCl3 con NH4SCN deben realizarse
inmediatamente debido a la estabilidad del compuesto.

BIBLIOGRAFÍA.
 Autor Desconocido (2017) “Espectrofotometría” Disponible en:
https://elespectrofotometro.com/espectrofotometria
 Facultad de Farmacia y Bioquímica (2016) “Espectrofotometría” Disponible
en:
http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/book/view.php?id=67407&chapterid=1055
Consultados en (03/2018)