BIOQUÍMICA

INTRODUCCIÓN

En la presente Guía Práctica de Bioquímica se plantea reforzar el aprendizaje de la

asignatura, la cual es de naturaleza teórico-práctica y pertenece al área de formación
Profesional.

Estimado alumno, el objetivo de la presente Guía es proporcionarle una herramienta

didáctica para el desarrollo óptimo de sus prácticas de laboratorio, elaboración de
informes, lecturas científicas y seminarios.

Las guías correspondientes a las prácticas de laboratorio contienen el fundamento

teórico, las reacciones bioquímicas, materiales y cuestionario que facilitarán su
aprendizaje.

Es nuestro propósito al presentarles dicha Guía de Práctica impartirle conocimientos

básicos y fundamentales del metabolismo de las principales biomoléculas de los seres
vivos, que incluyen las reacciones químicas y enzimáticas que se llevan a cabo
durante el proceso de la digestión de los alimentos para obtener los nutrientes.
Destacar algunas alteraciones del metabolismo y sus consecuencias en la
conservación de la Salud.

La Guía está organizada en cuatro unidades didácticas según el silabo:

I UNIDAD : Agua - Equilibrio ácido-base
II UNIDAD : Enzimas y Coenzimas
II UNIDAD : Bioenergética y metabolismo oxidativo
IV UNIDAD : Metabolismo de la glucosa, principales rutas y su control

Estas actividades se desarrollarán con la intención de despertar en ustedes el interés

por la investigación en Bioquímica.

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DISPOSICIONES GENERALES

1. La asistencia a las prácticas es obligatoria.

2. Es indispensable el uso del guardapolvo durante las prácticas.
3. Es obligatorio asistir a las prácticas con los siguientes materiales: Guía de
práctica, calculadora científica, lapiceros de colores: azul, negro y rojo, plumón
para rotular vidrio. Además de hoja de cálculo cuadriculada o papel
milimetrado de acuerdo a la práctica
4. La práctica consistirá en una introducción teórica, luego, el método y
aplicación de la práctica y conclusión. El estudiante incorpora en formatos los
esquemas, dibujos, cuadros sinópticos y/o diagramas que observe y realice en
el laboratorio. Se desechará cualquier otra fuente que no sea la observación
directa.
5. Una vez finalizada la práctica, el profesor revisará la labor del estudiante con
preguntas sobre su trabajo desempeñado en la práctica. En caso de
conformidad con este se le firmará y valorará la práctica. Dicha firma es
requisito indispensable para señalar su asistencia.
6. No se podrá fumar, ni ingerir alimentos dentro del aula.
7. El aula se cerrará 15 minutos después del comienzo de la clase.
8. El alumno trabajará procurando mantener el mayor silencio posible para no
entorpecer la marcha de la práctica.
9. No se permitirá el uso de celulares. No está permitido desplazarse del lugar de
trabajo, ni intercambiar material, sin la previa autorización del docente.
10. La evaluación en el aula será permanente. Se tomará dos prácticas calificadas
sin derecho a ser sustituido.
11. Es responsable de los materiales de vidrio y reactivos que se les asigne, al final
de la práctica deberá entregar los materiales limpios.
12. Su ambiente de trabajo deberá dejarlo limpio.
13. Las lecturas serán discutidos en clase y se evaluará personal y/o grupalmente.
14. Los temas de los foros serán asignados de forma aleatoria, las fechas serán
fijadas por el docente.
15. El seminario será evaluado según Anexo N° 02

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DÍA

Práctica Nº 01: Soluciones porcentuales, molaridad y normalidad

01 - 06
Seminario: Distribución de Seminario

Práctica N° 02: Determinación del pH y concentración de protones. Buffer 08 - 06

Práctica N° 03: Espectrofotometría 15 - 06

Seminario 1: Proteínas: hemoglobina y colágeno 22 - 06

Seminario 2: Enzimas de interés clínico I: AST, ALT, δ glutamil

transferasa, Recuperación

Fosfatasa alcalina y Fosfatasa ácida.

Práctica Nº 04: Factores que afectan la actividad enzimática 06 - 07

Seminario 3: Enzimas de interés clínico II. LDH, CK. Marcadores

13 - 07
cardiacos.

EXAMEN PARCIAL 20- 07

Práctica Nº 05: Hidrólisis enzimática del almidón por la amilasa salival 27- 07

Seminario 4: Trasportadores de glucosa 03 - 08

Práctica Nº 06: Absorción de glucosa en intestino de ratas 10 - 08

Seminario 5: Insulina y glucagón 17 – 08

Caso Clínico 1: Metahemoglobinemia adquirida (tóxica) 24 - 08

Seminario 6: Fibra dietaria 31 - 08

Caso clínico 2 : Diabetes y obesidad 07 - 09

EXAMEN FINAL 14 - 09
21 – 09
EXAMEN SUSTITUTORIO
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PRÁCTICA Nº 01
SOLUCIONES PORCENTUALES, MOLARES Y NORMALES

I. OBJETIVOS:
 Emplear fórmulas matemáticas para hallar concentraciones físicas y químicas
de diversas soluciones.
 Utilizar la calculadora científica de manera correcta.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La concentración es una magnitud derivada, en donde se relaciona la cantidad de
masa disuelta o dispersa (soluto), en un medio (solvente) conformando una
solución (soluto + solvente).
En la actualidad la tendencia es expresar la concentración de las soluciones tanto
química y biológica en términos químicos con la finalidad de uniformizar las
unidades en el ámbito clínico.
Concentraciones Físicas: Son aquellas que relacionan cantidad de soluto
(expresados por lo general en gramos) contenido en volumen (por lo general en
100 mL de solución), estos pueden ser:
𝑾𝒔𝒕𝒐 𝒙
Sólido en sólido %𝐖/𝐖 = 𝑾𝒔𝒐𝒍
𝒙𝟏𝟎𝟎

Ejemplo: sacarosa disuelta en cloruro de sodio

𝑾𝒔𝒕𝒐 𝒙
Sólido en líquido %𝐖/𝐕 = 𝑽𝒔𝒐𝒍
𝒙𝟏𝟎𝟎

Ejemplo: albúmina en sangre: 3,5g % ó 3,5 g/100 mL ó 3,5 g/dL

𝑽𝒔𝒕𝒐 𝒙
Líquido en líquido: %𝐕/𝐕 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝑽𝒔𝒐𝒍

Ejemplo: ácido acético disuelto en agua (vinagre- ácido acético al 5 %)

𝑽𝒔𝒕𝒐 𝒙
Gas en líquido: %𝐕/𝐕 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝑽𝒔𝒐𝒍

Ejemplo: gases disueltos en sangre (CO2, O2)

Concentraciones químicas: Son aquellas que relacionan la cantidad de materia

disuelta en volumen (litro de solución), entre ellas tenemos:
𝒏 𝑾𝒔𝒕𝒐
Molaridad (mol/L) = 𝑴 = 𝑽(𝑳) 𝒏= 𝑷𝑭

#𝑬𝒒−𝒈 𝑾𝒔𝒕𝒐
Normalidad (eq-g/L) = 𝑵= 𝑽(𝑳)
#𝑬𝒒 − 𝒈 = 𝑷 𝒆𝒒

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III. MÉTODO
 Práctica dirigida

IV. MATERIALES E INSTRUMENTO

 Calculadora científica

V. PROBLEMAS
1. Calcula la concentración W/W de una disolución obtenida al disolver 1,8 g de
NaCl en 200 g de agua.
2. ¿Qué cantidad de Mg (OH)2 se necesita para preparar 375 mL al 0,5% W/V?
3. ¿Cuántos mL de una solución al 5% se preparará con 850 mg de glucosa?
4. En el almacén existe dextrosa al 20%. Se necesita preparar 8 litros de
Dextrosa al 5% a partir de dicho stock. ¿Qué cantidad de la solución de
dextrosa al 20% se debe utilizar?
5. Se tiene alcohol 96%, del cual se quiere preparar 10 litros de alcohol
medicinal (70%). ¿Qué cantidad de alcohol se tiene que utilizar?
6. ¿Qué cantidad de NaCl se necesita para preparar 500 mL a 0,25 mol/L de
dicha sustancia?
7. ¿Cuál es la molaridad de un litro solución de NaCl, en donde se disolvieron
130 g?
8. ¿Qué volumen de FeSO4 al 0,25 mol/L se necesita para preparar 550 mL de
dicha solución al 0,025 mol/L?
9. Se tiene 2 mL de HCl cuya concentración es desconocida, se agrega
fenolftaleína como indicador y se lleva a titular con NaOH 0,1 N, gasto 8 mL
de dicha base. ¿Cuál es la concentración de dicho ácido?
10. Convierta los niveles de glucosa de 110 mg/dL a mmol/L.
11. ¿Cuántos gramos de glucosa habrá recibido un paciente que se le administró
vía parenteral 300 mL al 5%?
12. ¿Cuál de las 2 soluciones es más concentrada? ¿Cuál tiene más soluto? a.
NaCl 9% o b. NaCl 0,1 mol/L.
13. ¿Qué cantidad de una solución concentrada de glucosa al 33%, se deberá
medir para preparar 7,5 litros de glucosa al 5%?
14. Se disuelven 20 g de Ba(OH)2 en 560 g de agua. Calcula: La molaridad y
normalidad de la disolución.
15. ¿Qué cantidad de glucosa, C6H12O6, se necesita para preparar 100 mL de una
disolución 0,2 M?

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16. Se dispone de un ácido nítrico comercial concentrado al 96,73 % en masa y

densidad 1,5 g/mL. ¿Cuántos mL del ácido concentrado serán necesarios
para preparar 0,2 L de disolución 1,5 M de dicho ácido?
17. Calcular el volumen de ácido sulfúrico concentrado H2SO4, de peso específico
1,84 y 98% de pureza en peso que contendrá 40 gramos de ácido sulfúrico
puro.
18. ¿Qué peso de sulfato de Aluminio decaoctahidratado Al2 (SO4)3 18.H2O se
necesitará para preparar 50 mL de una solución acuosa que contenga 40 mg
de ión aluminio Al+3 por mL?
19. Describa como se prepararía 50 gramos de una disolución de BaCl2 al 12%
en peso, con agua destilada y BaCl2. 2 H2O.
20. ¿Qué cantidad de sulfato cúprico (CuSO4) será necesaria para preparar 300
mL de disolución al 0,8mol/L de concentración?

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PRÁCTICA Nº 02
DETERMINACIÓN DEL pH - CONCENTRACIÓN DE PROTONES - BUFFER

I. OBJETIVOS:
 Hallar el pH de las soluciones a través de fórmulas.
 Determinar la concentración de protones de las soluciones biológicas.
 Valorar el rol de los buffer en el mantenimiento del pH.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Potencial de hidrogeniones (pH): Es una escala creada con la finalidad de
evaluar las concentraciones de H+ (protones) presente en los fluidos biológicos a
una temperatura de 25º C. La escala va desde 0 a 14, donde menor de 7
corresponde a soluciones ácidas mayor de 7 a soluciones alcalinas o básicas y 7
a soluciones neutras como el agua.
Para soluciones de ácidos o base fuerte se utiliza la siguiente fórmula matemática:

pH = - log [H+] pOH = - log [OH-]

pKw = pH + pOH
El pH se determina Es esencial pues, que los organismos vivos tengan algún
sistema para controlar el pH de las mezclas acuosas en las cuales actúan las
enzimas. Estos “controles de pH” deberán evitar fluctuaciones grandes de la
acidez del medio ambiente cuando se presentan especies químicas conocidas
como ácidos y bases.

Por ejemplo, la sangre se mantiene a un pH aproximado de 7,4; rara vez este

valor varía en más de 0,1 unidades de pH, una variación de ±0,4 unidades o más
podría causar la muerte.

BUFFER O AMORTIGUADORES

Son disoluciones acuosas que resisten cambios de pH es decir tienen la

propiedad de absorber grandes cantidades de ácidos o bases, los buffer,
amortiguadores o tampón fisiológicos están formados por un ácido débil y su sal
conjugada. Ejemplo del ácido acético/ acetato; difosfato/ monofosfato; acido
carbónico/ bicarbonato.

Los organismos vivos durante su metabolismo liberan sustancias ácidas, los

amortiguadores neutralizan a los protones o hidrogeniones liberados.

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III. MÉTODO
 Práctica dirigida

IV. MATERIALES
 Calculadora científica

V. PROBLEMAS
1. ¿Cuál es el pH de una solución 0,03 M de HCl?
2. ¿Cuál es el pH del H2SO4 0,15 M?
3. ¿Cuál es el pH de una disolución si mezclamos 200 mg de NaOH con H2O
c.s.p. para 60 mL?
4. Una solución de Al (OH)3 contiene 3,9 g de soluto por cada 180 mL de
solución. ¿Cuál sería su molaridad? ¿Cuál su normalidad? ¿Cuál será su pH?
5. Se toman 200 mL de una disolución de MgCl2 de concentración 1 M y se
mezclan con 400 mL de otra, también de MgCl2, 2,5 M. Finalmente se añade al
conjunto 400 mL de agua. Suponiendo que los volúmenes son aditivos y la
densidad final es 1,02. ¿Cuál es la molaridad resultante? ¿Cuál es su pH?
6. El pH de una disolución acuosa es 12,6. ¿Cuál será la OH– y el pOH a la
temperatura de 25ºC?
7. Calcula la molaridad resultante y el pH de una disolución que se prepara
mezclando 50 mL de H2SO4 0,136M con 70 mL de H2O y 90 mL de H2SO4 de
concentración 0,068 M.
8. Si el pH de la sangre es de 7,42 ¿Cuál es la concentración de protones?
9. Si la concentración de protones libres en la saliva es de 1,585 x 10-7 mol/L,
determine el pH de la saliva.
10. Si el pH de la orina es de 6,5 determine la concentración de protones libres

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PRÁCTICA N° 03:
FOTOCOLORIMETRÍA

I. OBJETIVOS
 Interpretar la Ley de Lambert y Beer.
 Determinar una curva de calibración.
 Interpretar los datos experimentales de diferentes muestras.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

El método fotocolorimétrico es un método óptico de absorción molecular que nos
permite cuantificar sustancias. Está basado en la medida de la intensidad de la
luz monocromática, transmitida a través de soluciones naturalmente coloreadas o
que se han generado mediante reacciones químicas.
Para calcular la concentración de que tiene una muestra problema se emplea:
1. Método del Factor de Calibración, la cual es la cantidad de una sustancia
(peso) de concentración conocida que corresponde a una lectura del
espectrofotómetro. Se obtienen dividiendo la concentración del estándar
entre su lectura o densidad óptica.

Fc =  St  / Absst Abs = Absorbancia

2. Método de la Curva de Calibración, se emplea varios estándares con sus
respectivas densidades ópticas o absorbancias, se construye una gráfica en
un sistema de coordenadas.
Abs /  St 

LEY DE LAMBERT.- Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia

de una solución coloreada la distancia que recorre el haz de luz monocromática
en ella (sin variación de la concentración).
LEY DE BEER.- Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de
una solución coloreada y la concentración de esta en un haz de luz
monocromática (sin variación de la longitud que recorre el haz.
LEY DE LAMBERT Y BEER.- Cuando un rayo de luz monocromática con
intensidad I0 atraviesa una solución, parte de la luz es absorbida por las
moléculas de la solución coloreada de manera que la intensidad de la luz
transmitida I es menor que la inicial I0.

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La absorbancia (Abs) de una solución diluida es directamente proporcional a su

concentración.

FÓRMULA DO = E = A = l. c. e

En donde: DO = densidad óptica, E = extinción, A = absorbancia, l = longitud que

atraviesa el haz de luz monocromática, c = concentración y e = coeficiente de
extinción molar.
No es válida para: Soluciones muy coloreadas o concentradas o para soluciones
que dispersan la luz.

RELACIÓN ENTRE ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA

A = Log I0 / I1
En donde: A = absorbancia, I0 = luz incidente, I1 = luz transmitida

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Gradillas y tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 5 mL y 2 mL
Solución patrón de KMnO4 4 mg%
Agua destilada
ESPECTROFOTÓMETRO

IV. PROCEDIMIENTO
3.1 CURVA DE CALIBRACIÓN.
Rotular cinco (5) tubos de ensayo, según tabla inferior.

Tubos 1 2 3 4 5
mL KMnO4 4 mg % 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
mL H2O destilada 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
Concentración

Absorbancia

1. Homogenizar y leer los tubos a la longitud de onda de 525 nm.

2. Determinar el factor de calibración para cada una de los tubos.

Fc =  KMnO4  / Abs

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 BIOQUÍMICA

3. Determinar el promedio de todos los tubos (n) Fc =  Fc /n

4. Eliminar el Fc que no coincida con la mayoría de Fc.
5. Grafique en un papel milimetrado los datos obtenidos para obtener la curva de
calibración.

3.2 CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA PROBLEMA (MP).

1. Medir 1,5 mL de una MP y agregar 3,5 mL de agua destilada, homogenizar.
2. El color debe de estar dentro de los tubos del procedimiento 3.1, o si no
agregar agua, considerar la dilución.
3. Leer a 520 nm para hallar la absorbancia
4. Aplicar la siguientes fórmulas
Dilución Factor de dilución
d = Vol MP / Vol total Fd = 1 / d

5. Determinar la concentración de la muestra problema

 MP  = Fc x Abs MP x Fd

V. CUESTIONARIO:
1. Defina: absorbancia y transmitancia
2. Transforme las absorbancias de la práctica a porcentaje de transmitancia y
realice la gráfica de la curva de calibración.
3. Si una sustancia tiene una densidad óptica de 0,350 en una cubeta de 1 cm,
¿Cuál será su absorbancia si la cubeta es 0,5 cm de paso de luz?
4. Defina coeficiente de extinción molar

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 BIOQUÍMICA

DESARROLLO DE LOS SEMINARIOS

SEMINARIO 1
Hemoglobina
Estructura de la proteína y Grupo Hem. Tipos de hemoglobina: F, A S. Transporte de
O2 y CO2. Efecto alostérico. Efecto Rapoport-Luebering. Efecto Bohr.

Colágeno
Estructura química. Síntesis. Modificación post-traduccional. Tropocolágeno. Tipos de
colágeno. Rol de la vitamina C durante la modificación post-traduccional.

SEMINARIO 2
Enzimas de interés clínico I
AST, ALT, Gamma glutamil transferasa, Fosfatasa alcalina y Fosfatasa ácida
Estructura química. Función. Significado clinico.

SEMINARIO 3
Enzimas de interés clínico II
LDH, CK. Marcadores cardiacos.
Estructura química. Función. Significado clinico.

SEMINARIO 4
Transportadores de glucosa
Definición. Clasificación. Estructura. Función. Localización.

SEMINARIO 5
Insulina y glucagón
Síntesis. Estructura química. Funciones. Receptores.

SEMINARIO 6
Fibra dietaria.
Definición. Clasificación. Nueva clasificación. Función.
Fibra y diabetes.
Rol de la Fibra dietaria en el cáncer de colon

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 BIOQUÍMICA

SEMINARIO

Dinámica del seminario:

1. Se formarán dos equipos de trabajo integrados por tres alumnos cada uno.
2. Se les asignará el tema correspondiente, el cual lo desarrollará de manera
independiente. Tiempo de exposición del equipo es de 40 minutos.
3. Ambos equipos deberán estar preparados para la exposición, con su respectivo
material didáctico, balotario de preguntas y resumen (4 ejemplares).
4. El mismo día se sorteará el rol a desempeñar de cada equipo: expositores y
panelista.
5. Concluida la participación de los expositores, el grupo panelista realizará la crítica
sobre el tema expuesto, solicitará aclaraciones si fuera necesario y vendrá luego la
rueda de preguntas.
6. La audiencia participará solicitando aclaraciones sobre puntos específicos del tema
expuesto tanto al equipo expositor como al equipo de panelistas, o aportando
información complementaria, dicha participación será bonificada en su foro,
dependiendo de la calidad de su participación.
7. Concluida esta segunda etapa el equipo expositor realizará la repreguntas hacia el
equipo panelista.
8. La evaluación estará a cargo de dos docentes y dos dicentes.

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PRÁCTICA N° 04
EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y TEMPERATURA EN LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

I. OBJETIVOS:
 Explicar el cambio de la actividad enzimática por los factores de concentración
de sustrato y temperatura
 Determinar y explicar el significado de Vmax y Km

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza por lo general proteica,
constituidas en la mayoría de ellas por una fracción proteica (apoenzima) y otra no
proteica denominado cofactor, que puede ser de naturaleza orgánica o metálica;
esta unidad activa se denomina holoenzima. Estos biocatalizadores tienen una
relativa alta especificidad, así encontramos enzimas que tienen especificidad para
un grupo de sustratos o para un único sustrato. Estos sustratos pueden
identificarse frente a una enzima mediante la constante de Michaelis (KM).
La actividad de las enzimas por su naturaleza proteica está sujeta a una serie de
factores que la modifican de forma reversible o irreversible.
Los principales factores que afectan la actividad van hacer la variación de pH,
temperatura, concentración de sustrato y enzimas.
La variacion de la concentración del sustrato tambien va a modificar la actividad
enzimatica tal como se muestra en la
A. Enz.
gráfica en el sector (Y) la actiuvidad
Vmax X
enzimatica aumenta de manera
proporcional a la concentración de
½ Vmax
sustrato, reaccion del primer orden,
sin embargo cuando en medio de la
Y
reacción el sustrato esta a niveles Km
[S]
saturante la actividad deja de ser
proporcional, y se mantiene constante (X) alcanzando su maxima velocidad
(Vmax), reacción de orden cero.
La actividad biológica de una enzima se debe a la secuencia de aminoácidos
establecida, va a predecir el tipo de estructura secundaria y terciaria y con ello la
actividad catalítica. Si las estructuras son modificadas de forma parcial o total eso
va a significar una desnaturalización y como consecuencia una pérdida de la
actividad, esto sucede cuando existen cambios bruscos de temperatura.

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 BIOQUÍMICA

Cada enzima tiene un punto de temperatura

Actv.
donde va expresar su máxima actividad a B
condiciones constante de pH, sustrato,
enzima, concentración iónica, etc. Así tenemos A C
enzimas que son activas prácticamente a un
punto cercano a la congelación del agua ºC
(enzima de los crustáceos que viven en la
Antártida), enzimas que expresan una actividad alta a la temperatura corporal de
los mamíferos y aves, y a temperaturas muy altas como los musgo que crecen en
cenca de baños termales.

Es sabido que una reacción química aumenta el doble cuando la temperatura se

incrementa 10ºC, esto también puede ser aplicado en una reacción mediada por
enzima, sin embargo tiene un límite, debido a su naturaleza proteica las enzimas
pueden modificar de manera parcial o total su estructura y con ello su actividad,
esto sucede principalmente cuando la temperatura aumenta (C), sin embargo
cuando esta disminuye por debajo de la temperatura optima (B) la actividad
decrece debido a un menor movimiento molecular y con ello una menor
probabilidad de coalición entre enzima y sustrato (A).

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Gradilla y tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 2 y 10 mL
Baño maría a 4ºC, 37ºC y 100ºC
Solución de glucosa 20mg%
Reactivo enzimático de Glucosa oxidasa
ESPECTROFOTÓMETRO

IV. PROCEDIMIENTO

4.1 Efecto de la concentración del sustrato

1. Preparar una batería de 7 tubos de la siguiente manera:

Tubos Bl 1 2 3 4 5 E
mL Sol. glucosa 20 mg% -- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 --
mL Agua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 --
mL Sol. Enzima -- -- -- -- -- -- 8

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 BIOQUÍMICA

2. Incubar todos los tubos por 5 minutos a baño María 37° C. Luego agregar 1
mL de la enzima a los tubos del 1 al 5 incluyendo el blanco.
3. Incubar todos los tubos por 8 minutos en baño María a 37ºC.
4. Leer en el espectrofotómetro a 520 nm.
5. Confeccionar la gráfica en papel milimetrado, determinar la velocidad máxima y
Km en la hipérbola.

4.2 Efecto de temperatura

1. Rotular Los tubos de la siguiente manera:

Tubos Bl S1 E1 S2 E2 S3 E3 S4 E4

mL Sol. Glucosa 20mg% -- 0,5 -- 0,5 -- 0,5 -- 0,5 --

mL Água destilada 0,8 0,3 -- 0,3 -- 0,3 -- 0,3 --
mL Enzima 1,0 -- 1,0 -- 1,0 -- 1,0 -- 1,0

2. Llevar a pre-incubar por 5 minutos los tubos a las siguientes temperaturas:

S1 y E1 a baño de hielo (2° C)
S2 y E2 a temperatura ambiente (20° C)
S3 y E3 a Temperatura corporal (37° C)
S4 y E4 a Baño María hirviente (100° C)

3. Transcurrido el tiempo indicado, verter los tubos “E” a los tubos “S”
respectivamente, homogenizar y colocar a las temperaturas en que se
encontraban, por un tiempo de 8 minutos.
4. Concluido el tiempo homogenizar y leer a 520 nm.
5. Confeccionar la gráfica en un papel milimetrado.

V. CUESTIONARIO

1. ¿Por qué a menor temperatura existe menor actividad de la enzima?

2. ¿Cómo afecta el tiempo de incubación en los resultados?

3. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de KM de un sustrato para una

determinada enzima? Muestre un ejemplo.

4. Exprese las concentraciones del sustrato y enzima de la práctica en unidades

mol/L.

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 BIOQUÍMICA

PRACTICA Nº 05
HIDROLISIS ENZIMÁTICADEL ALMIDÓN POR LA AMILASA SALIVAL

I. OBJETIVOS
 Demostrar experimentalmente la digestión del almidón, apreciando el efecto
que ejerce el cambio de pH en el medio de reacción.
 Observar el efecto del activador alostérico.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El almidón es un polisacárido, polímero de glucosa unido mediante enlaces
glucosídicos, es la base de la alimentación mundial ya que cubre el 55% de las
calorías de la dieta, está integrado por dos polisacáridos: amilosa y
amilopectina. La amilosa es una cadena lineal, en donde sus unidades de
glucosa se unen mediante enlace glucosídicos  (1 - 4) y la amilopectina de
cadena lineal y ramificada, presenta dos tipos de enlaces glucosídicos:  (1 - 4)
en las partes lineal y  (1 - 6) en los puntos de ramificación, este polisacárido se
ramifica cada 18 a 28 unidades de glucosa.

La digestión del almidón se inicia a nivel de la boca, por acción de la enzima -

amilasa salival, que hidroliza el almidón, esta digestión solo va significar un 15%
de todo el proceso digestivo de este polisacárido, debido a la poca permanencia
de la comida en la boca y la inactivación de la enzima cuando llega al estómago.
Esta enzima también llamada ptialina, tiene un pH óptimo de 6,8 y es activado por
la presencia de iones cloruro (Cl-), pero se inactiva a un pH ácido (como del
estómago) o un pH sumamente alcalino.

La amilasa salival solo hidroliza los enlaces  (1 - 4) de la amilosa y amilopectina,

nunca actúan sobre los enlaces  (1 - 6) y aquellos enlaces (1 - 4) que rodean al
punto de ramificación.

Los productos de la digestión son azucares cuyo carbono anomérico están libres,
esto quiere decir que van a tener la propiedad de ser reductores, los principales
azúcares reductores de esta digestión son: Maltosa, maltotriosa, dextrina limite,
maltodextrina y escaso cantidad de glucosa.

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 BIOQUÍMICA

Dichos azúcares van a reaccionar con el ión cúprico (Cu+2) del reactivo de
Benedict (color turquesa), en un medio alcalino y a una temperatura de ebullición
(>100° C), tornándose a rojo ladrillo, ión cuproso (Cu+1). Los polisacáridos
(almidón) sin embargo van a reaccionar con el reactivo de Lugol (color marrón
claro) tornándose un color azul oscuro.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Gradillas y tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 1 mL y 2 mL
Vasos de precipitado
Baño María
HCl 0,5 N
NaCl 5%
Buffer fosfato pH 6,8 a 0,1 mol/L
Solución de almidón al 2%
Reactivo de Benedict
Reactivo de Lugol

IV. PROCEDIMIENTO
4.1 Recolección de la saliva: Lavarse la boca tres veces con agua, luego
cerrar la boca y juntar saliva sin formar espuma, viértalo en un beacker.
Mida 1 mL de saliva y agregue 4 mL de agua destilada en un tubo,
HOMOGENIZAR bien.

4.2 Preparación de los digeridos: Prepare la siguiente batería añadiendo los

siguientes reactivos según el orden que se presenta:

Tubos D1 D2 D3
mL Almidón 2% 2 2 2
mL Buffer fosfato pH 6,8 1 --- ---
mL HCl 0,5 N --- 1 ---
mL NaCl 5% --- --- 1
mL Saliva diluida 1 1 1
Llevar a baño maría por 37° C por 10 minutos.

18
 BIOQUÍMICA

4.3 Determinación:
4.3.1 Para azucares reductores:

Tubos B1 B2 B3
mL D1 1 --- ---
mL D2 --- 1 ---
mL D3 --- --- 1
mL Benedict 1 1 1

Llevar a baño María hirviente por tres minutos, anotar los resultados

4.3.2 Para polisacáridos:

Tubos L1 L2 L3
mL HCl 0,5N 0,5 0,5 0.5
mL Lugol 1 1 1
mL D1 1 --- ---
mL D2 --- 1 ---
mL D3 --- --- 1

Anotar los resultados.

V. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento químico de la reacción de Benedict?

2. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de Lugol?

3. ¿Qué otro tipo de amilasa se conoce y que órgano lo producen?

4. La amilasa salival según su función, a qué grupo de enzima pertenece?

5. ¿Cuál es el activador enzimático de la amilasa salival, mencione que otros

factores afectarían la actividad de la enzima utilizada en la práctica?

19
 BIOQUÍMICA

PRÁCTICA Nº 06
ABSORCIÓN INTESTINAL DE LA GLUCOSA EN RATAS

I. OBJETIVOS
 Explicar el proceso de la absorción de glucosa por la mucosa intestinal

II. MARCO TEÓRICO

Los carbohidratos se empiezan a digerir a nivel de la boca por acción de la
amilasa salival con un pH óptimo de 6,8, hidroliza enlaces glucosídicos  (1-4) de
la amilosa y de la amilopectina, luego se detiene a nivel del estómago por la
acidez presente, la digestión se reinicia a nivel del duodeno por acción de la
amilasa pancreática, para luego continuar, por acción de las disacaridasas que se
encuentra en la microvellosidades del enterocitos, tales como:
Sacarasa
Sacarosa fructosa + glucosa

Lactasa
Lactosa galactosa + glucosa

Maltasa
Maltosa glucosa + glucosa

Isomaltasa
Isomaltosa glucosa + glucosa

Una vez que se ha terminado el proceso de la digestión, se inicia la absorción,

esto se realiza a nivel del yeyuno. La fructosa ingresa al enterocito siguiendo la
gradiente de concentración por medio de canales proteicos (GLUT 5), mediante
difusión facilitada. El GLUT- 5 presenta un Km muy alto para la glucosa y
galactosa sin embargo un Km bajo para la fructosa, por lo tanto la glucosa tendrá
que transportarse por un mecanismo más eficiente (Km bajo).
La glucosa ingresará por medio de transportadores de glucosa dependiente de
sodio (SGLT-1), este transportador lo va hacer en contra de la gradiente de
concentración de la glucosa, pero favorecido por la gradiente de concentración de
Na+, que también ingresa junto con la glucosa por transporte activo secundario,
por un mecanismo SIMPORT.
Los SGLT-1 que están localizados en la parte apical de los enterocitos, realizan
cotransporte activo dependiente de sodio para la D-glucosa y D-galactosa, desde
la superficie luminal de los enterocitos con borde en cepillo.

20
 BIOQUÍMICA

La energía para el transporte se obtiene de la diferencia de potencial de

membrana con respecto al Na+, esta gradiente se mantiene mediante la bomba
Na+/K+ ATPasa que se encuentra en el lado basolateral del enterocito, el cual
mantiene niveles bajos de Na+ dentro del enterocito, la glucosa que está dentro de
la célula sale hacia la sangre por el GLUT- 2.

Para la determinación de glucosa en el medio de la solución se utilizará el reactivo

enzimático específico para la glucosa el cual tiene la siguiente reacción
bioquímica:

GOD
Glucosa + H2O Ácido glucónico + H202

H2O2 + 4-aminofenazona + fenol POD Quinona coloreada + H2O

GOD: Glucosa oxidasa

POD: Peroxidasa

III. MATERIALES
3.1 El alumno deberá traer:
3.2 Vaso de precipitado
Una rata albina macho de 250 g y deberá estar en ayuna de 24 horas.
Materiales de disección completa.
Suero fisiológico (NaCl 0,9%)
Guantes, mascarilla, bolsas.

IV. PROCEDIMIENTO
4.1 Obtención del intestino: La rata deber estar en un ayuno de 24 horas,
sacrificar al animal por dislocación cervical, previa anestesia con vapor de
cloroformo, luego realizar laparotomía para extraer la porción del yeyuno (10
cm), lavar con suero fisiológico y mantenerlo en ella, luego con una tijera
realizar un corte longitudinal y lavarlo suavemente con suero fisiológico.
4.2 Proceso de absorción: En un tubo de ensayo colocar 3 mL de la solución de
glucosa 100 g % en suero fisiológico y luego sumerja el intestino por 30
minutos a 37° C. A los 25 minutos agitar el tubo y luego manténgalo en
reposo.
4.3 Determinación: Preparar una batería de 3 tubos de la siguiente manera:

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 BIOQUÍMICA

Blanco Basal Absorción

mL Glucosa 100 mg% en S.F. --- 0,02 ---
mL Liquido de la absorción --- --- 0,02
mL Agua destilada 1 1 1
mL Reactivo enzimático 1 1 1

El Rvo. Enzimático lo agregará el profesor

Incubar por 8 minutos a temperatura ambiente, luego leer en el

espectrofotómetro a una longitud de onda de 525 nm.
Analizar las absorbancia.

V. CUESTIONARIO
1.- ¿Qué otros transportadores para la glucosa existen y en que tejidos?
2.- ¿Cómo es la absorción de la galactosa y fructosa?

CASO CLÍNICO N° 01

METAHEMOGLOBINEMIA ADQUIRIDA (TÓXICA)

Un bebé de 26 semanas fue ingresado en la clínica pediátrica por letargia y

cianosis progresiva. El bebé había nacido con un buen estado de salud y la madre
había intentado la lactancia al pecho. Al quedarse la madre prácticamente sin leche,
el médico le recomendó una fórmula de leche maternizada.

Se tomó una muestra de sangre y se obtuvo un resultado positivo en la prueba

de la metahemoglobinemia. El bebé comenzó a ser tratado con ascorbato y azul de
metileno por vía intravenosa.

En dos días el niño mostraba un estado normal de alerta y la cianosis había

desaparecido. El niño fue dado de alta, facilitándose a la madre las debidas
instrucciones sobre la preparación de la fórmula de leche con agua destilada.

CUESTIONARIO

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 BIOQUÍMICA

1. ¿Cuál es la diferencia química entre hemoglobina y metahemoglobina y cómo se

comparan sus capacidades transportadoras de oxísgeno?
2. ¿Cuál es el significado de cianosis progresiva y letargia?
3. ¿Qué mecanismos impiden en condiciones normales la acumulación de
metahemoglobina en la sangre?
4. ¿Cuál es la base bioquímica del tratamiento de la metahemoglobinemia tóxica con
ascorbato y azul de metileno por vía intravenosa?

CASO CLÍNICO N° 02

DIABETES MELLITUS Y OBESIDAD

D. M., un estudiante universitario de 24 años de 178 cm de estatura fue visto

en una consulta ambulatoria de diabetes. Sus síntomas principales eran fatiga,
pérdida de peso y aumento del apetito, sed y frecuenta de la micción. Se encontró
bien hasta 6 meses antes de la visita. En ese momento se cansaba con facilidad y
tendía a quedarse dormido en clase especialmente después de comer. Él atribuía todo
esto al exceso de trabajo, la tensión de un proyecto de investigación difícil y el ritmo
acelerado de vida.

Durante los dos meses previos a visita, había perdido aproximadamente 6,8 kg
de su peso normal de 72,7 kg a pesar de su buen apetito. Durante las tres a cuatro
últimas semanas había tenido una sed excesiva y orinaba con frecuencia y 3-4 veces
durante la noche. Con la pérdida de peso debilidad muscular, fatiga y micción
frecuente continuada, D.M. se dio cuenta de que su forma de vida no era la causa de
estos problemas. El seguro médico del estudiante le remitió a la consulta ambulatoria
de diabetes.

Sus antecedentes familiares fueron significativos. Su abuelo materno había

tenido diabetes mellitas y había muerto de un infarto de miocardio a los 50 años. La
hermana del paciente, de 40 años, era obesa y había sido diagnosticada
recientemente de diabetes de inicio en el adulto.

Desde los 15 años el paciente sufría episodios frecuentes de debilidad que

siempre se producía varias horas después de una comida. En esos momento tenía
sensaciones de temblor y desmayo síntomas que él aliviaba comiéndose un caramelo.

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 BIOQUÍMICA

Una exploración física a los 18 años reveló indicios de azúcar en su orina. Su

médico le realizó una determinación postprandial de la glucemia, que fue normal 90
mg/dL (5 mmol/L). Los análisis de orina de seguimiento no revelaron glucosuria. Los
análisis iniciales se atribuyeron a la contaminación del envase de la orina y se
desecharon.

La exploración física del paciente estuvo en general dentro de los límites

normales. Los estudios de laboratorio mostraron un recuento sanguíneo normal. El
análisis de orina mostró un densidad de 1,04 y fue positivo 4 + para la glucosa
utilizando un comprimido clinitest; el contenido de glucosa en orina de 24 horas fue de
0,19 moles (35 gramos) el valor de hemoglobina glucosilada fue de 14%. La orina
también mostró una cantidad moderada de cuerpos cetónicos. Se realizó una prueba
de tolerancia de la glucosa y se analizó la muestra de sangre para otras sustancias,
como se indica a continuación.

Paciente D.M. Normal

Prueba de tolerancia a la
glucosa
En ayunas 160 mg/dL 60 – 100 mg/dL
30 minutos 240 mg/dL < 180 mg/dL
60 minutos 325 mg/dL < 180 mg/dL
90 minutos 305 mg/dL < 140 mg/dL
120 minutos 285 mg/dL < 120 mg/dL
Electrolitos
Na+ 140 mmol/L 136 – 145 mmol/L
K+ 4,1 mmol/L 3,5 – 5 mmol/L
Cl- 98 mmol/L 100 – 106 mmol/L
CO2 total 25 mmol/L 24 – 30 mmol/L
Creatinina 0,9 mg/dL 0,7 – 1,5 mg/dL

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la hemoglobina glucosilada?

2. ¿Qué significan los niveles elevado de hemoglobina glucosilada en este paciente?
3. Elabore un listado de signos y síntomas del paciente.
4. ¿Cómo justificaría usted el signo de la polifagia y polidipsia?

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 BIOQUÍMICA

5. Elabore la gráfica de los resultados de la tolerancia oral a la glucosa.

6. ¿Qué significa la presencia de glucosa en orina?
7. ¿Qué niveles de glucógeno tisular (muscular) esperamos encontrar es este
paciente a su ingreso en el hospital?
8. ¿Por qué encontramos cuerpos cetónicos en la orina del paciente?
9. Por los signos y síntomas, ¿Cuál es el tipo de diabetes del paciente?

ANEXO N° 01
Las partes que debe tener el reporte de laboratorio:
a. Cálculos y/o Resultados
b. Conclusión

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 BIOQUÍMICA

c. Cuestionario (deberá estar resuelto para el día de la práctica)

ANEXO N° 02
Los puntos a evaluar durante el desarrollo del FORO:

Ausente Deficiente Regular Bueno Sobresaliente

Dominio del tema (nota
0 1 2 3 4
individual)
Presenta material
0 2
didáctico.
Uso de material
0 1 2 3 4
didáctico
Aclaración a las
preguntas asignadas 0 1 2 3 4
(nota individual)
Presentación del
0 2
resumen
Trabajo en equipo (nota
0 1 2 3 4
de equipo)

ANEXO N° 03
Los puntos del resumen del foro son los siguientes:
a. Resumen no mayor de dos páginas
b. Margen lateral 2, superior e inferior 2
c. Tipo de letra: arial 12 a un espacio
d. Contenido: introducción, marco teórico, conclusión.
e. Fuentes de información

CONTROL DE ASISTENCIA

Alumno (a)…………………………………………………………………………………
Grupo ……….

Semana 01 Semana 02 Semana 03 Semana 04

26
 BIOQUÍMICA

Semana 05 Semana 06 Semana 07 Semana 08

Semana 09 Semana 10 Semana 11 Semana 12

Semana 13 Semana 14 Semana 15 Semana 16

27